HU176133B - Process and reagent for determining mb-creatinase-activity in body-liquid-samples - Google Patents
Process and reagent for determining mb-creatinase-activity in body-liquid-samples Download PDFInfo
- Publication number
- HU176133B HU176133B HU76ME2027A HUME002027A HU176133B HU 176133 B HU176133 B HU 176133B HU 76ME2027 A HU76ME2027 A HU 76ME2027A HU ME002027 A HUME002027 A HU ME002027A HU 176133 B HU176133 B HU 176133B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- creatine kinase
- activity
- antibodies
- creatine
- enzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Description
| Feltalálók: | Szabadalmas: |
| dr. Würzburg Uwe, immunológus, Darmstadt, dr. Hennrich Norbert, biokémikus, Darmstadt, dr. Orth Hans-Dieter, biokémikus, Darmstadt, dr. Láng Hermann, biokémikus, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság | Merek Patent Gesellschaft mit beschrankter Haftung Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság |
Eljárás és szer az MB-kreatinkináz aktivitásának meghatározására testfolyadék-mintákban
2
A találmány tárgya eljárás és szer az MB-kreatinkináz aktivitásának emberi testfolyadékban történő meghatározására.
A kreatinkináz (ATP-kreatin-foszfotranszferáz, E. C. 2.7.3.2; rövidítve: CK) aktivitásának a szérumban való meghatározását tekintik a legérzékenyebb laboratóriumi módszernek a váz- és szívizomzat megbetegedéseinek, különösen a szívizom-infarktusnak a diagnosztikájában. Nehézséget okoz azonban a váz- és szívizomzat traumatizálódásának megkülönböztetése, különösen a szívizom-infarktus differenciális diagnosztikájában. A kreatinkináz összaktivitásának meghatározásával nem lehet bizonyossággal történő differenciálást biztosítani. Ezért megkísérelték már a kreatinkináz-aktivitás meghatározásának diagnosztikai értékét oly módon növelni, hogy mérték a különféle enzimek aktivitását a szérumban és a kapott mérési eredményeket korrelációba hozták egymással, például a kreatinkináz-aktivitás és a glutamát-oxálacetát-transzamináz-aktivitás hányadosának képzése útján. Az ilyen hányadosok azonban más okokból nem alkalmasak a szív- és tüdő-infarktus diagnosztikai megkülönböztetésére, valamint a szívinfarktus és a sokk-következmények megkülönböztetésére sem.
A kreatinkináz a szervezetben három izoenzim alakjában fordul elő, ezek a következők: a főként az izomzatban előforduló és így izom-kreatinkináz-enzimnek is nevezhető MM-kreatinkináz, a például az agyban előforduló BB-kreatinkináz és a hibrid MB-kreatinkináz, amely utóbbi egy M-alegységből és egy B-alegységből áll és például a szívizomban fordul elő. A vérben (szé rumban) fellépő kreatinkináz-aktivitás normális körülmények között az MM-kreatinkináz-izoenzimre vezethető vissza, mert a BB-kreatinkináz-izoenzim nem lép át a likvor-vér-korláton, az MB-kreatinkináz-izoenzim 5 jelenléte pedig bizonyos szervekre, például a szívizomra van korlátozva. A szívizom sérüléseinél, például szívinfarktus esetében azonban a vérben (szérumban) is felszabadul az MB-kreatinkináz-izoenzim és ezen a helyen ki is mutatható.
Ennek az MB-kreatinkináz izoenzimnek az MMkreatinkináz-izoenzim melletti kimutatása a szérumban a legérzékenyebb és differenciális diagnosztikai szempontból leginkább jellemző laboratóriumi módszer a szívinfarktus kimutatására. A szívizom mellett ugyan 15 még néhány további szerv (például a hasnyálmirigy, a rekeszizom, az aorták, a tüdő és a méh) is tartalmaz MB-kreatinkináz-izoenzimet, ennek aktivitása azonban ezekben a szervekben körülbelül százszor kisebb, mint a szívizomban, úgyhogy az említett további szervekből 20 esetleg szabaddá váló MB-kreatinkináz-aktivitás a kimutathatósági határ alatt marad.
Az MB-kreatinkináz-izoenzim-aktivitás meghatározásának eddig szokásos módszerei lényegében három eljárásra vezethetők vissza:
1. Különféle hordozókon lefolytatott elektroforézis. Ilyen eljárást ismertet például A. F. Smith, Clin. Chim. Acta, 39, 351—359 (1972) továbbá Roberts R. és munkatársai, Am. J. Cardiol., 33, 650—654 (1974). Az így 30 kapott eredmények olykor ellentmondóak; gyakran
176J53 xeritrittel, glutationnal, ciszteinnel, ditio-treittel, és/vagy ^-(^mifeo-etil)-izotiurónium-bromid-hidrobromiddal akfrvált·emberi MM-kreatinkinázzal beoltunk és a képződött antitesteket izoláljuk, és amely antitestek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljes gátlást tudnak kifejteni. E szer egyik előnyös kiviteli alakját az jellemzi, hogy az abban jelenlevő antitestek 2500 egység/liter koncentrációig képesek a meghatározandó mintában gátolni az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének az enzjmatikus aktivitását.
A találmány szerinti szer előnyösen alkalmazható az MB-kreatinkináz-izoenzim aktivitásának az MM-kreatinkináz-izoenzim jelenlétében történő meghatározására, valamint diagnosztikai segédeszközként különösen a szívizom-infarktus és/vagy a szívizom más megbetegedéseinek illetőleg sérüléseinek a diagnózisára. Jól alkalmazhatók továbbá e szerek a kreatinkináz-Összaktivitásnak és az MB-kreatinkináz-aktivitásnak a testfolyadékmintákban egyidejűleg történő meghatározására.
Testfolyadékként a találmány-szerinti eljárásban elsősorban a humán-szérum jön tekintetbe. Tekintetbejöhet azonban más testfolyadék is, mint például a teljes emberi vér, plazma, vizelet», köpet vagy verejték, valamint analóg állati testfolyadékok is. A találmány szerinti eljárás kivitelezése során a BB-kreatinkináz jelenléte zavarja a meghatározást és ezért ennek az izoenzimnek neirrszabadjeleirtennie-a-vizsgálandé-testfolyadékban.
A találmány szerinti eljárás lefolytatásához szükséges antitesteket, állatokból nyerhetjük, MM-kreatinkináz-antigénckkeí történő beöltás írtján. Antigénként erre a több sáv mutatkozik, mini ahány izoenzim jelen-'van (artefaktumok).
2. Kromatografálás különféle adszorbensekkel töltött oszlopokon; ilyen eljárást például Mercer D. W. Clin. Chem. 20, 36—40 (1974) ismertet. Ez a módszer hosszadalmas, több órai tényleges munkaidőt igényei és ruflftvizsgálatokra nem alkalmas. A különböző vizsgálatok eredményei gyakran ellentmondóak.
3. Immunológiai meghatározás lecsapó antitestekkel. Ezt a módszert a 21 28 670,és 22 58 822 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátási iratok ismertetik; ez a módszer jó eredményeket nyújt például az aldoláz és alkalikus; foszfatáz izoenzimek menynyiségi meghatározásában; A kreatinkináz viszonylag csekély aktivitásának meghatározására — különösen az MB-kreatinkináz-izoenzim esetében — azonban ennek a módszernek az érzékenysége nem elegendő.
Valamennyi említett eljátás emellett hosszadalmas és körülményes, a kivitelezés Sok időt igényel és ezért különösen a szívinfarktus gyors diagnosztizálására teljésen alkalmatlan. ’
A találmány célkitűzését tehái az a feladat képezte, hogy egy egyszerű, reprodukálható és gyorsan kivitelezhető eljárást és ehhez alkalmas szert dolgozzunk ki az MB-kreatinkináz-aktivitásnak a testfolyadék mintáiban történő meghatározására.
Ezt a feladatot ázálfáröfdoffük még, hogy egy eddig' ismeretlen eljárást bocsátunk rendelkezésre, amely spe, qílkg^aníit^^tejc^eft dalgfpk',’ yzpjcga specifikus-antitestek teljesen gátoljak az M-alegység enzimatíkus ak- _ tivitását az MM- és MB-kreatinkii^z-izóénzsmdctíeá célra á ktU^^ös^i emberi MM-kreatinkináz alkalmas. Alkalmazható azonban állati MM-kreatinkináz is, ha az ezzel előállított antiszérumok teljesen gátolni képesek az M alegység enzimatíkus aktivitását az emberi MM-kreatinkináz és MB-kreatinkináz izoenzimekben, adott esetben kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is. Az MM-kreatínkináz-antigének szolgáltatására alkalmas állatokként elsősorban a különböző majomfajták, különösen a Rhesus-majmok és csimpánzok, továbbá háziállatok, mint sertés, ló, szarvasmarha, nyúl, tengerimalac, valamint egyéb állatok, mint patkány, egér, valamint madarak, mint liba, kacsa vagy tyúk jönnek tekintetbe.
Az antitestek előállítására felhasználásra kerülő MM-kreatinkiúáz-antigénnek mentesnek kell lennie az MB- és BB-kreatinkináz-aktivitástól. Ennek a tisztasági követelménynek érzékeny kritériumát nyújtja az előnyösen diffúziós vagy elektroforézises módszerrel végzett immunológiai analízis. Emellett jól alkalmazhatók korong-elektroforézisesés-poliakrilamidgél-elektrofókuszálási analitikai módszerek is. E módszerek alkalmazása során elsősorban az MB és BB-kreatinkináz-izoenzimek esetleges jelenlétének kimutatása az elsődleges. Emellett kevésbé fontos a másfajta fehérjék esetleges jelenléte, ami a két legutóbb említett analízis módszerrel szintén megállapítható. A kreatinkináz-izoenzim-típusok mikroheterogenitása, amely például az egyes izoenzimek aminosav-Összetételében mutatkozó csekély különbségekben nyilvánulhat meg, tisztasági követelményként általában nem játszik szerepet.
Immunizálás céljaira olyan állatokat alkalmazunk, amelyek az aktivált MM-kreatinkináz-antigénekkel történő beoltás után az MM- és MB-kreatinkináz M alegységének enzimatíkus aktivitását teljesen gátló antitestek képzésére képesek, anélkül hogy az így képezett anti10
3G anélküT, hogy egyidejűleg gátolnák az esetleg jelenlevő MB-kreatinkináz-izoenzim B-alegységének az enzimatikus aktivitását is.
A találmány tárgya tehát új eljárás az MB-kreatinkináz-izóenzim aktivitásának testfolyadék -riiintákban történő méghatárózásáfa, amelyet az jellemez, hogy a mintát kreatinkináz-szubsztrát'ürhok jelenlétében olyan antitestekkel inkubáljtik', aihelyek áz MM-kreatinkinázés MB-kreatinkináz-izoenzihíek M-alegységének enzimaktivitását teljesen gátolják, anélkül, hogy ugyanakkor az adott esetben jelenlevő MB-kreatinkináz B-alegységének enzim-aktivitását inaktiválnák, és amelyek úgy állíthatók elő, hogy állatokat az SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló anyagokkal, célszerűen N-acetil-ciszteinnel, merkapto-etanollal, ditio-eritrittel, glutationnal, cisztéinriel, ditio-treittel, és/vagy S-(2-amino-etil)-izotiuróniüm-bromid-hidrobromiddal aktíváit emberi MM-kreatinkinázzal beoltunk és a képződött antitesteket izoláljuk, majd az irikubálást követően a mintában az MB-kreatinkináz B-alegységének aktivitását kreatinkináz-szubsztrátumok hozzáadása után, erre alkalmas segédreakciókat követő fotometriás méréssel meghatározzuk.
A találmány további tárgya egy ugyancsak új szer az MB-kreatinkináz-izoenzim aktivitásának testfolyadékmintákban történő meghatározására, amelyet az jellemez, hogy olyan antitesteket tartalmaz, amelyek az MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenzimek Malegységénck enzim-aktivitását teljesen gátolják, anélkül,, hogy ugyanakkor; áz adott esetben jelenlevő MBkreátinkináz B-hlegyáégének énzim-;aktivitását inaktivSlnák, és amelyek úgy állíthatók elő, hogy állatokat az SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló1 anyagokkal, célszerűen N-acetil-ciszteinnel, merkapto-etanollal, ditio35 testek egyidejűleg gátolnák az esetleg jelenlevő MB-kreatinkináz B alegységének enzimatikus aktivitását is. Erre a célra különösen a kecskék alkalmasak. Tekintetbejöhetnek azonban más állatok is, különösen gerinces állatok, például majom-fajok, lovak, szarvasmarhák és hasonlók, juhok, kutyák, sertések, nyulak, madarak, mint tyúk, pulyka, liba és kacsa, továbbá patkányok, egerek és tengeri malacok. A kecskék különösen az olyan antitestek indukciójára alkalmazhatók, amelyek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen gátolni képesek az MM- és MB-kreatinkináz M alegységének az aktivitását.
A kísérleti állatok immunizálását a találmány értelmében aktivált emberi vagy állati MM-kreatinkinázzal végezzük. Az MM-kreatinkináz aktiválása ismert reagensekkel történik, amelyek az SH-csoportokat stabilizálják és aktiválják és/vagy kétértékű fémionokkal; különösen pedig az említett reagensek és fémionok kombinációi alkalmasak erre az aktiválásra. SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló reagensekként előnyösen például N-acetil-cisztein, merkapto-etanol és ditio-eritrit, továbbá glutation, cisztein, ditio-treit, S-(2-amino-etil)-izotimónium-bromid-hidrobromid (AET) és/vagy tioglikolsav alkalmazhatók. Kétvegyértékű fémionként különösen a magnézium, továbbá a mangán, kalcium és/vagy kobalt vízben oldódó sóiból, például kloridokból vagy acetátökból származó ionok alkalmasak. Az ilyenfajta aktiválási módszerek elvileg már ismeretesek más területekről és kivitelezésük a szakember számára nem jár nehézséggel.
Az immunizálás további lefolytatása és az antiszérumokká, illetőleg antitestekké történő feldolgozás ismert módon történik. A kapott antiszcrumok illetőleg antitestek további feldolgozása és tárolása ugyancsak az immunológiában jól ismert módszerekkel történhet.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható antitestek főként az IgG-immungJebulin-osztályba (brvalens antitestek) sorolhatók. Molekulasúlyuk körülbelül 130 000 és 210-000 közé esik, előnyösen 160000 körül van; ülepedése állandójuk megközelítőleg 6 S és 8 S között, előnyösen 7 S körül van; szénhidrát-részük az összsúly körülbelül 3%-át teszi ki. Az említett IgG-antitestek mellett egy vegyértékű IgG-fragmensek (=Fab) és IgM-antiteslek is alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban.
A találmány értelmében alkalmazásra kerülő antitesteknek teljesen gátolniok kell a kreatinkináz M alegységének az enzim-aktivitását. A „teljes gátlás” alatt itt oly mértékű gátlást értünk, amely mellett legfeljebb 5 egység/liter, előnyösen legfeljebb 3 egység/liter mértékig marad meg a mintában jelenlevő MM- és MB-kreatinkináz-izeenzimek M alegységének, az enzim-aktivitása.
További követelmény, hogy az antitestek ne befolyásolják az MB-kreatinkináz-izóenzim B alegységének az enzim-aktivitását. Ezen azt kell érteni, hogy a mintában jelenlevő MB-kreatinkináz-izoenzim B- alegységének legfeljebb 10 egység/liter, előnyösen legfeljebb 5 egység/liter része legyen gátolva.
A- találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja esetében, amely abból áll, hogy a vizsgálandó testfolyadék-Jűintót éa az. antitesteket kxeatinkináz-szubsztrálumok jelenlétében iakísháljuk, az. antitesteknek még azzala. ttaajdoEtóggal is rendelkezniük keik hogy az MM- U MB-kieatinkináz-izoeiiziinek M alegységének enzim-aktivitását gátló hatásukat kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen ki kell fejteniök, anélkül, hogy ugyanakkor befolyásolnák az esetleg jelenlevő MB-kreatinkináz-izoenzim B alegységének enzim-aktivitását is. Ez a tulajdonság fennáll például az olyan antitestek esetében, amelyeket kecskékből nyertünk teljesen aktivált MM-kreatinkináz-izoenzimmel történő immunizálás útján; ugyanakkor az ilyen antitestek rendelkeznek a fentebb említett egyéb követelményeket kielégítő tulajdonságokkal is. A találmány szerinti eljárás szokásos kiviteli módja (először inkubálás antitestekkel, majd a kreatinkináz-szubsztrátum hozzáadása és fotometriás mérés) esetében azonban az utóbb említett különleges tulajdonság nem feltétlen követelmény.
Kreatinkináz-szubsztrátumként bármely, a szokásos módon alkalmazásra kerülő szubsztrátum illetőleg ettek tor alkalmazható. A találmány szerinti eljárás esetében elsősorban kreatin, kreatin-foszfát, adenozin-difoszfát, adenozin-trifoszfát és magnézium-ionok jönnek erre a célra tekintetbe.
A kreatinkináz és izoenzimjei aktivitásának illetőleg maradék-aktivitásának a meghatározása elvileg bármely ismert, gyorsan és pontosan kivitelezhető eljárással történhet. Alkalmasak erre a célra, például az olyan ismert eljárások, amelyek lehetővé teszik, a kreatinkináz-aktivitásnak kreatinkináz-szubsztrátumok hozzáadása után, segédreakciókat követő fotometriás meghatározással történő mérését. Erre a célra kolorimetiiás módszerek jöhetnek tekintetbe, amilyeneket például a „Methoden dér enzymatischen Analyse” című mű 1. kötete (H. U. Bergmeyer, 3. kiadás, 1974) a 145. és következő oldalakon ismertet. Különösen előnyösek azonban az olyan kinetikai módszerek, amelyek során az enzimaktivitást az ibolyántúli tartományban, például 334, 340 vagy 366 nm-nél végzett spektrofotometriás méréssel határozzák meg. így elsősorban például az a standard-módszer alkalmazható, amellyel a kreatinkinázt kreatin-foszfát és adenozin-difoszfát alkalmazásával határozzák meg (Z. Kiin. Chem. Kiin. Biochem., 8. köt. 658. és Jcöv. old., 1970; 10.5.182. old., 1972). A kreatinkináz-aktivitás e módszerrel történő meghatározására szükséges segédanyagok egységcsomagokban szerezhetők be a kereskedelemben.
Egy másik ismert meghatározási módszer esetében fluorometriás úton határozzák meg a kreatinkináz-aktivitását. Kreatinkináz segítségével a kreatin-foszfátból kreatin szabadítható fel, amelyet azután R. B. Conn — Clin. Chem. 6. köt. 537. és köv. old. (1960) — eljárása szerint, ninhidrinnel erősen alkalalikus oldatban történő reagáltatás útján fluorometriásan határoznak meg; vö.: Sax és munkatársai, Clin. Chem., 11. köt. 951. és köv. old. (1965).
A találmány szerinti eljárás egy célszerű kiviteli módját az alábbiakban részletesen szemléltetjük:
A vizsgálandó testfolyadék-mintához, előnyösen humán-szérum-mintához olyan mennyiségben adunk MM-kreatinkináz-antitesteket, amennyi elegendő ahhoz, hogy az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimekben az M-alegység aktivitását 2500 egység/liter, előnyösen körülbelül 1000 egység/liter szintig teljesen gátolja. Nagyobb kreatinkináz összaktivitású testfolyadékok esetében a tényleges meghatározás lefolytatása előtt a mintát célszerű körülbelül 1000 egység/liter aktivitásig hígítani. Ezt az előzetes hígítást azután figyelembej kell venni a meghatározás eredményeinek kiszámítása során. A min tát az antitestekkel összekeverjük és körülbelül 1—30 percig, előnyösen körülbelül 5 percig inkubáljuk +10 °C és +40 °C közötti, előnyösen a szobahőmérséklet körüli, különösen pedig 25—30 °C hőmérsékleten. Ezután a reakcióelegy visszamaradó enzim-aktivitását valamely ismert eljárással, célszerűen a fentebb leírt UV spektrofotometriás mérési módszerrel meghatározzuk. Egy ismert összetételű enzim-koenzim-szubsztrátum elegyhez, amely a módszer kiviteléhez szükséges valamennyi enzimet, koenzimet és szubsztrátumot tartalmazza, hozzáadjuk a szérum-antitest elegyet, majd elegendő mennyiségű puffer-oldatot, hogy a pH-érték körülbelül 7 legyen. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető szokásos készítmények, például heterokináz, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz, adenozin-difoszfát és nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát elegyét tartalmazzák enzim-koenzim elegyként, szubsztrátumként pedig kreatin-foszfátot és glükózt.
Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy a szérum
-antitest-elegyet a koenzim és enzim elegyéhez adjuk 20 (vagy fordítva), majd ezt követően adjuk hozzá egy puffer és a szubsztrátum elegyét. E reakcióhoz semleges pufferek alkalmasak, például előnyösen trietanol-aminvagy imidazol-acetát-pufferek, továbbá egyebek között morfolin-propánszulfonsav- és morfolin-etánszulfonsav-pufferek. Az anyagok összekeverése .után az elegyet 1—10 percig, előnyösen 5 percig inkubáljuk 10—40 °C, előnyösen 25 vagy 30 °C hőmérsékleten, majd például szobahőmérsékleten meghatározzuk az extinkció változását. Ebből azután kiszámítható az MB-kreatinkináz-izoenzim B alegységének az aktivitása.
Ennek az eljárásnak egyik előnyös kiviteli alakja esetében a fent leírt munkamenetet oly módon változtathatjuk meg, hogy a vizsgálandó testfolyadék mintáját az antitestekkel és a kreatinkináz-szubsztrátumokkal 35 valamely puffer és a kimutatási reakciókhoz szükséges anyagok jelenlétében együtt inkubáljuk (a vizsgálandó minta és az antitestek elegyének előzetes külön inkubálása nélkül). Az eljárás e kiviteli módjához az antitestek egy további tulajdonsága szükséges: képeseknek kell 40 lenniük az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének enzim-aktivitását kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen gátolni. Ezzel a tulajdonsággal például az olyan antitestek rendelkeznek, amelyeket kecskékből, teljesen aktíváit MM-kreatínkináz- 45 -izoenziín segítségével nyertek. Az ilyen antitestek lehetővé teszik a találmány szerinti eljárás egyszerűbb és gyorsabb kivitelezését a következő módon:
Az előzőleg valamely ismert, a kimutatási reakcióhoz alkalmas koenzim-enzim-szubsztrátum eleggyel együtt 50 1 iofilizált alakba vitt antitesteket például valamely pufferoldat meghatározott mennyiségében oldjuk, hozzáadjuk a meghatározandó testfolyadékot, például szérumot, majd meghatározzuk az MB-kreatinkináz-izoenzim B alegységének aktivitását. Ennek az eljárásnak az egyik 55 változata oly módon is kivitelezhető, hogy az antitesteket csupán a koenzimek és enzimek elegyével visszük liofilizált alakba, a szubsztrátumokat pedig a pufferoldathoz adjuk.
Az eljárás egy további előnyös kiviteli alakja esetében 60 a kreatinkináz-összaktivitást és az ' MB-kreatinkináz-aktivitást egyidejűleg határozzuk meg a fent leírt előnyös módszerrel, egyetlen műveletben. így például oly módon dolgozhatunk, hogy előbb a minta kreatinkináz-összaktivitását határozzuk meg valamely ismert foto- 65 metriás eljárással, azután ugyanehhez az elegyhez egy, az MM-kreatinkináz-antitestekből álló, vízben oldott liofilizátumot adunk. Ezután körülbelül 1—10 percig, előnyösen 5 percig inkubálunk, majd fotometriás eljá5 rással meghatározzuk a visszamaradó aktivitást. Ennél a kiviteli módnál is fennáll az az előfeltétel, hogy az antitesteknek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljesen gátolniuk kell az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének enzim-aktivitását.
Az antiszérumok antitest-kapacitását a találmány szerinti eljárás ilyen előnyös kiviteli alakjai esetében úgy állíthatjuk be, hogy azok 2500 egység/liter, előnyösen körülbelül 1000 egység/liter szintig teljesen gátolhassák az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységé15 nek az aktivitását. Ha a megvizsgálandó minta kreatinkináz-összaktivitása túlságosan nagy ahhoz, hogy az antitestek ilyen gátlási kapacitása elérhető legyen, akkor ezeknek az eljárás-változatoknak az esetében is előzetes hígítást kell végezni, például olyan mértékben, hogy az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének az aktivitása körülbelül 1000 egység/liter legyen.
A találmány szerinti eljárás igen lényeges előnyöket mutat az eddig ismert eljárásokkal szemben. Ezek között elsősorban az eredmények nagy pontossága, továb25 bá a kivitelezés gyorsasága és egyszerűsége említendő.
A találmány szerinti eljárás pontossága arra vezethető vissza, hogy az alkalmazásra kerülő antitestek specifikusan az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének aktivitását gátolják, ezért lehetővé teszik az 30 MB-kreatinkináz-aktivitás testfolyadékban, például humán-szérumban történő közvetlen meghatározását.
Ezzel szemben a 21 28 670 és 22 58 822 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi közrebocsátást iratokban ismertetett immunológiai eljárás az izoenzimek mennyiségi meghatározására különféle hátrányokat mutat. Az itt leírt eljárás szerint a kreatinkináz izoenzimjeit izoenzim-specifikús precipitáló antitestekkel csapják le, majd az immun-lecsapás szupernatáns folyadékában megmaradó enzim-aktivitást határozzák meg. Eltekintve attól, hogy ez az eljárás körülményes, több specifikus antiszérum előállítását teszi általában szükségessé, minden esetben legalább két különböző meghatározást kell lefolytatni, nevezetesen a kreatinkináz-összaktivitás meghatározását és a lecsapás után megmaradó kreatinkináz-aktivitás meghatározását. Az MB-kreatinkináz-aktivifást tehát csak különbség-mérés alapján lehet kiszámítani. Az eredményt ezért a hibaszámítás általános szabályainak megfelelően mindkét mérés bizonytalansága terheli. A találmány szerinti eljárás esetében viszont nem következik be a hiba-összegeződés, minthogy egy közvetlen mérést kell csak végezni.
Az ismert lecsapásos eljárás további hátránya, hogy az immun-lecsapás szekunder reakcióként viszonylag sok időt (körülbelül 60 perctől több óráig) igényel és így ez az eljárás gyors vizsgálatokra egyáltalán nem alkalmas.
A Clin. Chim. Acta, 58. köt., 223—232 old. (1957) ismertet már a kreatinkináz-izoenzimekkel szemben gátló képességű antitesteket. Ezek az antitestek az MM-kreatinkináz-izoenzim 100%-os gátlása mellett 80%osan gátolják az MB-kreatinkináz-izoenzimet is. így tehát az MB-kreatinkináz-izoenzim M-alegységének gátlása mellett lényeges részben gátolják ezek az antitestek á B= alegység aktivitását is. (Az MB-kreatinkináz-izoenzira 'M- és B-alegységeinek aktivitása mindkét alegység esetében úgy aránylik áz izoenzim összaktivitásához, mint körülbelül 50:100.) Még ha az ilyen antitestek alkalmazása esetén talált körülbelül 20% megmaradó aktivitás reprodukálható is lenne, az így kapott értékek túlságosan alacsonyak lennének az MB-kreatinkináz-izoenzim pontos mérésére, minthogy az ilyen alacsony értékek nem mérhetők pontosan, a kreatinkináz-összaktivitás pedig már magában a szérumban is viszonylag alacsony. Az idézett itodalmi közleményben leírt gátló antitesteket ennek megfelelően nem is alkalmazták a kreatinkináz-izoenzimeknek a gátlás i elveti alapuló meghatározására. A találmány szerinti eljárással viszont az MB-kreatinkináz-aktivitás körülbelül 5Ö%-a (tehát körülbelül a B alegység teljes aktivitása) rendelkezésre áll a mérés céljaira. Ez nagy mértékben növeli a módszer elérhető pontosságát és így igen számottevő haladást jelent.
A találmány szerinti- eljárás igen fontos előnye a gyors kivitelezhetőség. Ez különösen fennáll annak az előnyös kiviteli módnak az esetében amely szerint az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alcgységcnek gátlását, valamint a megmaradó aktivitás mérését egyetlen műveletben végzik. Ennek a kiviteli módnak az esetében igen rövid idő alatt, például 5—30, előnyösen 5—15 perc alatt már pontos vizsgálati eredmény áll rendelkezésre a diagnosztizálás céljaira.
A találmány szerinti eljárás további fontos előnye az egyszerű kivitelezhetőség. A vizsgálati módszert nagyobb intézetekben vagy klinikákon, a szokásos mechanizált enzimaktivitás-meghatároző készülékekkel lehet lefolytatni, kisebb intézetekben vagy orvosi laboratóriumokban már egy egyszerű fotométerrel is végrehajtható a meghatározás.
Az egyes meghatározások céljaira olyan előre összeállított reagens-csomagok alkalmazhatók, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez szükséges valamennyi reagenst, így például egy szokásos koenzim-enzim-szubsztrátum keveréket a találmány szerinti MM-kreatinkináz-antitesteket és egy pufferoldatot. Az ilyen vagy hasonló vizsgálati reagens-csomagok elkészítése lehetővé teszi az MB-kreatitikinázdzoenzim igen egyszerű módon és a lehető legkevesebb kellékkel kivitelezhető meghatározását.
A technika jelenlegi állása alapján nem volt várható, hogy az MB-kreatinkínáz-izoenzim meghatározásának problémája egy ilyen egyszerű és gyorsan kivitelezhető eljárással oldható meg, mint a találmány szerinti eljárás, így nem volt előre látható, hogy olyan specifikus antiszérumok állíthatók elő, amelyek ugyan teljesen gátolják az MM- és MB-kreatínkináz-izoenzimekben jelenlevő M-alegység enzim-aktivitását, azonban nem befolyásolják az MB-kreatinkináz-izoenzim B-alegységének az enzim-aktivitását. Csak az ilyen, eddig nem ismert tulajdonságokkal rendelkező antitestek alkalmazása tette lehetővé a találmány szerinti reakció lefolytatását.
Meglepő volt az is, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő antitestek szubsztrátumok jelenlétében is megtartják teljes gátló hatásukat. Ez egyáltalán nem magától értetődő. így az irodalom — Ann: N. Y. Acad. Sci., 103. köt. 858—889. old. (1963) — oly antitesteket ismertet, amelyek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében már nem gátolják 100%-osan az MM-kreatinkioáz-izoenzirn aktivitását. Az ilyen túlajdonságokat mutató antitestek teljesen használhatatlanok lennének a találmány szerinti eljárás oly előnyös kiviteli módjainak a lefolytatására, amelyeknél az antitestekkel történő gátlás és a kreatirtkínáz-szubsztrátutnok hozzáadása egyidejűleg történt. Az M-aktivitások nem gátolt része félrevezető módon növelné az ΜΈ-kreatínkinúz-izoenzimre kapott mérési érteket, esetleg egyáltalán jelen nem levő MB-kreatinkináz-aktivitások jelenlétét mutatná és így hamis laboratóriumi vizsgálati eredményeket szolgáltatna a diagnosztizálás céljaira.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő antitesteknek az a meglepő tulajdonsága, hogy teljesen gátolják az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M alegységének enzim-aktivitását, anélkül, hogy befolyásolnák az MB izoenzim B alegységének az enzim-aktivitását is, továbbá hogy teljes gátló hatásukat az MM- és MB-kreatinkináz-izoenzitnek M alegységével szemben szubsztrátumok jelenlétében is megtartják, lehetővé teszi az MB-kreatinkináz-aktivitásnak az eddig immunológiai módszerekkel teljesen elérhetetlen gyorsasággal és pontossággal történő meghatározását. Ezáltal új út nyílik a gyakorlat számára, az MB-kreatinkináz-aktivitás gyors vizsgálati módszerrel történő meghatározására.
Lehetővé válik az is, hogy a beteg Személynél a kreatinkináz-aktivitás megnövekedését mutató laboratóriumi vizsgálati eredményt megkülönböztetően értékeljék abból a szempontból, hogy a vázizomzatnak vagy a szívizomzatnak a megbetegedése illetőleg sérülése áll-e fenn. Ezáltal igen fontos új adatok válnak hozzáférhetőkké a szívinfarktus differenciális diagnózisa (például a tüdőinfarktustól és/vagy a sokk-következményektől való megkülönböztetése), valamint a szív más megbetegedéseinek illetőleg sérüléseinek a diagnosztizálása számira.
Ezen túlmenően az MB-kreatinkináz-aktivitás specifikus és pontos meghatározása alapján megállapítások tehetők a szívizomnak az egyéb éxtrakatdiális betegségi folyamatokban (például mérgezések vagy balesetek esetében) való részvételére illetőleg sérüléseire vonatkozólag, terápiás behatások (például újraélesztés esetén) vagy diagnosztikus behatások (például szív-katéterezések vagy koszotúér-angiográfiák) esetében.
Az alábbi példák szemléltetik közelebbről a találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelt módjait. A példákban „M” illetőleg „ftiM” a mól/liter illetőleg millimól/littr egységekben megadott koncentrációkat jelenti. A példákban alkalmazandó reagensként említett valamennyi enzimkészítmény és egyéb reagens a darmstadti (NSZK) E. Merek cég és részben más vállalatok által is gyártott, kereskedelmi forgalomban beszerezhető készítmény.
1. példa
MM-, MB- és BB-kreatinkináz-izoenzimek gátlása anti-humán-MM-kreatinkináz által
Egy, a saját kreatinkináz-aktivitás tekintetében inaktivált humán-szérumhoz tiszta MM-, MB- vagy BB-kreatinkináz-izoenzimet (az E. Merek darmstadti cég által gyártott, kereskedelmi forgalomban levő készítmények) adunk és meghatározzuk az egyes minták kreatinkináz-aktivitását. Ezután 0,1 ml mintához 0,1 ml anti-MM-kreatinkináz-oldatot — előállítva az alábbi B példa a) bekezdése szerint — adunk, összekeverjük és 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk. Ezután ismert módon (a darmstadti E. Merek cég által gyártott és 3383. cikkszám alatt forgalomba hozott „Merek—Test ί76133
CK” készítmény alkalmazásával) meghatározzuk a megmaradó kreatinkináz-aktivitást. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja:
A kreatinkináz-izoenzimek megmaradó aktivitása gátló hatású anti-humán-MM-kreatinkináz jelenlétében történő inkubálás után (mindenkor 5 meghatározásból kapott átlagértékek ± 1 s; s=standard eltérés):
| Izoenzim | A hozzáadott izoenzim aktivitása | Megmaradó aktivitás inkubáció után |
| (egység/liter) | ||
| MM-kreatinkináz | 98 ±1,9 1043 ±22 | 0,3 ±2,1 0,5 ±2,5 |
| MB-kreatinkináz | 103 ±2,0 410 ±7,8 | 53 ±1,7 206 ±6,2 |
| BB-kreatinkináz | 197 ±3,8 | 199 ±4,1 |
A fenti adatok azt mutatják, hogy az MM-kreatinkináz-izoenzim aktivitásának gátlása a mérési pontosságon belül 100%, a BB-kreatinkináz-izoenzimé 0% és az MB-kreatinkináz-izoenzimé (annak megfelelően, hogy 50% M-alegységet tartalmaz) 50%. Ezek az eredmények a hozzáadott izoenzim-aktivitás széles érték-tartományában állandóak.
2. példa
I. vizsgálat az MB-kreatinkináz-aktivitás testfolyadékokban történő mennyiségi meghatározására
a) A vizsgálati reagens-csomag összetétele
Az alábbi Összetételű reagens-csomagot készítjük el a vizsgálat céljaira. (Egy ilyen reagens-csomag 10 aktivitás-meghatározásra elegendő.) A csomag egy palack pufferoldatot, 10 meghatározásra elegendő oldat-menynyiséggel, 10 palack koenzim-enzim-szubsztrátum elegyet és egy palack anti-MM-kreatinkináz reagenst [előállítva a B példa a) bekezdése szerint] tartalmaz.
A palackokban levő koenzim-enzim-szubsztrátum elegy összetétele:
kreatin-foszfát-dinátriumsó-hexahidrát 27,24 mg glutation, redukált 6,4 mg (vagy N-acetil-cisztein 3,4 mg) adenozin-difoszfát-dinátriumsó-hexahidrát 1,25 mg nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-dinátriumsó 1,7 mg adenozin-monofoszfát-dinátriumsó 8,47 mg hexokináz 5 E glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 3 E glükóz 8,32 mg magnézium-acetát ' 4,52 mg
A pufferoldatot tartalmazó palack tartalma: trietanolamin-acetát (vízben) 105 mM
A liofilizált antitesteket 2 ml desztillált vízben oldjuk. A kapott antitest-oldatot úgy állítjuk be, hogy az 1000 E/l-ig teljesen gátolja az MM kreatinkináz aktivitását. Igen nagy kreatinkináz-összaktivitású szérumok esetében a szérumot ezért körülbelül 1000E/l-re kell előzetesen hígítani. A fenti módon készített antitestoldat +4 °C hőmérsékleten legalább 7 napig eltartható.
b) Az MB-kreatinkináz-aktivitás-meghatározásának kiviteli módja új) A vizsgálat lefolytatása:
Egy reakcióedénybe pipettával bemérünk 0,1 ml szérumot és 0,1 ml antitest-oldatot. Az edény tartalmát jól összekeverjük, 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd az így kapott reakcióelegyből 0,1 ml-t, valamint 2,0 ml pufferoldatot bemérünk egy palackba, amely ko10 enzim, enzim és szubsztrátum elegyet tartalmazza.
A palack tartalmát összekeverjük, 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd egy küvettába öntjük és 25 °C hőmérsékleten mérjük az extinkciót és ezt követően meghatározzuk az extinkció percenkénti változását, 15 334,340 vagy 366 nm-en, 1 cm rétegvastagságú oldattal.
b2) Az eredmény kiszámítása:
A minta fenti módon meghatározott kreatinkináz-aktivitását
a) a hígítási faktorral (2) és
b) az MB-kreatinkináz-hibridfaktorral (2) kell szorozni (a vizsgálatban csak az MB-kreatinkináz-B-alegységeinek aktivitását mértük).
A kapott percenkénti extinkció-különbségekből (Extinkciókülönbség/perc) átlagértéket képezünk és ezt be25 helyettesítjük a megfelelő számítási képletbe:
mérés 334 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc X 4 x 3500 E/l mérés 340 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc x4 X 3376 E/l mérés 366 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc X 4 x 6364 E/l.
3. példa
II. vizsgálat az MB-kreatinkináz-aktivitás testfolyadékokban történő mennyiségi meghatározására
a) A vizsgálati reagens-csomag összetétele
A reagens-csomag 30 aktivitás-meghatározásra elegendő. A csomag egy palack pufferoldatot tartalmaz 30 meghatározásra elegendő oldat-mennyiséggel, továbbá 30 palack liofilizált elegyet, amely koenzimet, en45 zimet, szubsztrátumot és az la) példa szerinti anti-MM-kreatinkináz-reagenst tartalmaz.
A pufferoldatot tartalmazó palackban levő trietanolamin-acetát mennyisége megfelel a 2a) példában megadott mennyiségnek. A koenzim, enzim, szubsztrátum 50 és anti-MM-kreatinkináz-elegyet tartalmazó egyes palackok a három első komponens tekintetében ugyancsak megfelelnek a 2a) példában megadott összetételnek és emellett további adalékként annyi anti-MM-kreatinkinázt tartalmaznak, amennyi 1000 E/l-ig teljesen gátolja 55 az MM-kreatinkináz-aktivitást.
b) Az MB-kreatinkináz-aktivitásának meghatározása bt) A vizsgálat kiviteli módja.
Egy koenzim, enzim, szubsztrátum és anti-kreatinkináz-MM-elegyét tartalmazó palack tartalmához pipettával hpzzámérünk 2,0 ml .pufferoldatot és 1,0 ml szérumot. A palack tartalmát összekeverjük, 25 °C hőmérsékleti» inkubáljuk 5 percig, majd egy küvettába 65 öntjük és 25 °C hőmérsékleten 5 percig méijük az extink ció-értékeket. Hullámhossz: 334, 340 vagy 366 nm; rétegvastagság: 1 cm.
b2) Az eredmény kiszámítása
A kapott percenkénti extinkció-különbségekből (Extinkciókülönbség/perc) átlagértéket képezünk és ezt behelyettesítjük a megfelelő számítási képletbe:
mérés 334 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc x 7000 E/l mérés 340 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc X 6752 E/l mérés 366nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás= Extinkciókülönbség/perc x 12 728 E/l.
4. példa
A kreatinkináz-összaktivitás és MB-kreatinkináz-aktivitás egyidejű meghatározása
a) A vizsgálati reagens-csomag összetétele
A vizsgálati csomag összetétele megegyezik a 2a) példában megadottal.
b) A kreatinkináz-összaktivitás és az MB-kreatinkináz-aktivitás meghatározása MB kreatinkinázban bj A vizsgálat kiviteli módja
A koenzimet, enzimet és szubsztrátumot tartalmazó palackba pipettával bemérünk 2,0 ml pufferoldatot és 0,1 ml szérumot illetőleg hígított szérumot. A palack tartalmát összekeverjük, 25 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd egy küvettába öntjük és 25 °C hőmérsékleten 2 perc eltelte után mérjük az extinkció-változást (ΔΕνΙ). Ezután 0,1 ml antitest-oldatot adunk hozzá, azonnal összekeverjük és további 3 perc eltelte után mérjük 25 ÖC hőmérsékleten az extinkció-változást (ÁEv2). Hullámhossz: 334, 340 vagy 366nm; rétegvastagság: 1 cm.
ú2/ Az eredmény kiszámítása
A kreatinkináz-összaktivitás számítása a következő képletek alapján történik: mérés 334 nm-nél: kreatinkináz-össz-volumenaktivitás=
ΔΕνΙ /perc x 3500 E/l mérés 340 nm-nél: kreatinkináz-össz-volumenaktivitás=
ÁEvl /perc x 3376 E/l mérés 366 nm-nél: kreatinkináz-össz-volumenaktivitás=
ΔΕνΙ /perc x 6364 E/l
Az MB-kreatinkináz-aktivitás számítása az alábbi képletek alapján történik:
mérés 334 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás=
AEv2/perc x 7350 E/l mérés 340 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás =
AEv2/perc x 7090 E/l mérés 366 nm-nél: MB-kreatinkináz-volumenaktivitás=
AEv2/perc x 13 364 E/l.
5. példa
Az MB-kreatinkináz-aktivitás meghatározása szívinfarktusos és szívinfarktus nélküli pácienseknél, a 3. példa szerinti vizsgálati reagens-csomaggal.
a) Kreatinkináz-aktivitás különböző páciens-csoportoknál
| Esetek száma | Átlagértékek össz-kreatinkináz(E/l) | MB-kreatinkináz (E/l) | |
| Páciensek megnövekedett kreatinkináz-aktivitással, szívinfarktus nélkül | 48 | 480 | <1,7 |
| Páciensek szívinfarktussal | 5 | 510 | 44 |
A fenti táblázat mutatja, hogy a találmány szerinti meghatározási módszerrel gyorsan és egyszerű módon lehet a szívinfarktus jelenlétére következtetni.
b) Az MB-kreatinkináz-aktivitás időbeli alakulása egy szívinfarktusos páciensnél
| Órák a szív-infarktus bekövetkezése után | MB-kreatinkináz E/l |
| 3,5 | <5 |
| 4,5 | <5 |
| 5,5 | 6 |
| 7,5 | 22 |
| 8,5 | 23 |
| 9,5 | 29 |
| 10,5 | 50 |
| 11,5 | 46 |
| 13,5 | 56 |
| 15,5 | 55 |
| 17,5 | 64 |
| 21,5 | 62 |
| 25,5 | 50 |
| 29,5 | 42 |
| 33,5 | 25 |
| 43,5 | 18 |
| 53,5 | <5 |
| 61,5 | <5 |
A fenti táblázatban megadott számértékek mutatják a szívinfarktusos páciens esetében az MB-kreatinkináz-aktivitás e találmány szerinti eljárással meghatározott értékeinek időbeli emelkedését, majd újbóli csökkenését.
Az alábbi példák a találmány szerinti eljárásban alkalmazott kiindulási anyagok előállítási módját szemléltetik.
A) MM-kreatinkináz előállítása
a) 1,2 kg mélyhűtött emberi vázizmot szobahőmérsékletre engedünk felmelegedni, majd gépi úton felaprítjuk. Az így kapott felaprított szövetet 2,5 liter hideg 0,05 mólos, 8,0 pH-értékű trisz-(hidroxi-metil)-amino metán-hidroklorid pufferoldatban, amely 0,01 mól kálium-kloridot, 1 millimól etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 millimól ditio-eritritet is tartalmaz, szuszpendáljuk és keverőkészülékben homogenizáljuk. Az így kapott homogenizátumot jéggel történő hűtés közben 45 percig keverjük, majd 60 percig centrifugáljuk 12 000g-nél (itt g a gravitációs gyorsulási faktort jelenti). A centrifugálás után kapott 2,680 liter tiszta szupernatáns folyadékot 8,0 pH-értéknél ammónium-szulfáttal történő frakcionálásnak vetjük alá, 45—75%-os telítettségi fokú oldatokkal. A 75%-os telítettségnél kapott csapadékot 0,04 mól trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal (pH=8,0) felvesszük és ugyanilyen pufferoldattal szemben dializáljuk. A mioglobin és a savanyú ballaszt-fehérjék adszorbeáltatása céljából 500 g nedves, bázisos ioncserélőt (térhálósított dextrán, az említet pufferoldattal egyensúlyba hozva) adunk hozzá. 30 percig állni hagyjuk, majd az ioncserélőt szívatással kiszűrjük és 400—400 ml 0,04 mólos trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal (pH=8,0), amely 0,02 mól nátrium-kloridot is tartalmaz, kétszer mossuk. A szűrletet az így kapott mosófolyadékokkal egyesítjük és ammónium-szulfáttal 75%-os telítettségre hozzuk.
A képződött csapadékot centrifugálássalelkülönítjük, 100 ml 0,04 mólos trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldatban (pH=8,0) oldjuk és ugyanezzel a pufferoldattal szemben dializáljuk, mindaddig, míg ammónium-szulfát már nem mutatható ki az oldatban. A kapott tiszta dializátumot egy 6 x 60 cm méretű, térhálósított dextrán-alapú bázisos ioncserélőt (ugyanezzel a pufferoldattal egyensúlyba hozva) tartalmazó oszlopra visszük. Az oszlopot a kezdeti pufferoldattal mindaddig mossuk, míg az eluátum fehérje-mentes nem lesz. Ezután az enzimet 0,04 mólos, 8,0 pH-értékű, 0,02 mól nátrium-kloridot, 1 millimól etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 millimól ditio-eritritet is tartalmazó trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldattal eluáljuk az oszlopról. A legalább 20 E/ml enzimet tartalmazó frakciókat egyesítjük, ammónium-szulfáttal 80%-ig telítjük és az így kicsapott enzimet centrifugálással elkülönítjük. A kapott enzimet azután végső tisztítás céljából még egyszer kromatografáljuk ugyanebben a rendszerben, de kisebb térfogatú oszlopon. Az egyesített aktív frakciókból azután az enzimet 80%-os telítettségű ammónium-szulfát-oldattal kicsapjuk, 50 ml 0,04 mólos, 8,0 pH-értékű, 0,02 mól nátrium-kloridot, 1 millimól etiléndiamin-tetraecetsavat és 1 millimól ditio-eritritet is tartalmazó trisz-(hidroxi-metil)-aminometán-hidroklorid pufferoldatban oldjuk, oly mennyiségű pufferoldatot alkalmazva az oldáshoz, hogy koncentrált enzim-oldatot kapjunk, ezt sterilre szűrjük és ammónium-szulfáttal ismét 80% telítettségi fokig telítjük. Ily módon egy 4 °C hőmérsékleten stabil MM-kreatinkináz-enzim-szuszpenziót kapunk, amelynek kreatinnal, mint szubsztrátummal, 25 °C hőmérsékleten mért fajlagos aktivitása 26—30 E/mg.
Akapott termék térfogata 86 ml; aktivitása 316 E/ml; fehérjetartalma 11,8 mg/ml; a szerv-kivonatra számított hozam: körülbelül 30%.
b) A fenti a) szakaszban leírthoz hasonló módon különíthető el az MM-krcatinkináz-enzim állatok, például Rhesus-majom, sertés vagy szarvasmarha izomszöveteiből is.
B) Anti-MM-kreatinkináz-előállítása
a) Az emberi izomból nyert MM-kreatinkináz-izoenzimet 0,07 mólos trietanol-amin-oldattal tompított, 7,0 pH-értékű fiziológiás konyhasó oldattal szemben, amely 10 millimól merkapto-etanolt és 10 millimól magnézium-kloridot is tartalmaz, dializáljuk. Az enzimoldatot ultracentrifugálással mentesítjük az aggregátumoktól, fehérjetartalmát pedig az említett dialízis-pufferrel 2mg/ml-re állítjuk be. Az így kapott oldat 1 ml-ét 1 ml komplettírozott Freund-féle adjuvánssal (2 mg elölt M-tuberkulózis-bacilust tartalmazó vízásványolaj-szuszpenzió) emulgeáljuk. A kapott emulziót egy kecskének adjuk be intramuszkuláris injekcióban. Három további ugyanilyen injekciót adunk be az állatnak háromhetes időközökben, majd három Boosterinjekciót, 16—16 hetes időközökben, azután az utolsó injekciót követő 21. napon vért veszünk az állattól. E vérből az ismert módszerrel nyert szérum pH-ját 3% juh-szérum-albumint és 0,1% nátrium-azidot 0,1 mólos borát-pufferoldatban tartalmazó eleggyel 8,4 értékre állítjuk be, majd sterilre szűrjük. Az így kapott oldatot, amely humán izom anti-MM-kreatinkinázt tartalmaz, 0,5 ml-es adagokban barna üvegpalackokba töltjük és liofilizáljuk. A kapott antitestek molekulasúlya körülbelül 160 000 és 180 000 között van.
b) Az a) szakaszban leírt módon kapott humán-izom MM-kreatinkináz-oldatot egy 0,1 mól imidazollal tompított, 6,8 pH-értékű, 7,5 millimól N-acetil-ciszteint és 25 millimól magnézium-acetátot is tartalmazó fiziológiás nátrium-klorid-oldattal szemben dializáljuk. Ezután az enzim-oldatot ultracentrifugálással mentesítjük az aggregátumoktól, fehérjetartalmát pedig az említett dialízis-pufferoldattal 0,2mg/ml-re állítjuk be. Az így kapott oldat 1 ml-ét 1 ml komplettírozott Freund-féle adjuvánssal emulgeáljuk. Az így kapott emulziót intradermális injekcióban egy ürünek adjuk be. Ezt követően 3 és 6 hét múlva két további intramuszkuláris injekciót adunk be ugyanebből az injekcióból, majd további három Booster-injekciót adunk be az állatnak, 14—14 hetes időközökben. Az utolsó injekció után 19 nappal vért veszünk az állattól és ezt a B) példa a) szakaszában leírthoz hasonló módon dolgozzuk fel. így liofilizált alakban kapjuk a humán-izom anti-MM-kreatinkinázt A kapott antitestek molekulasúlya körülbelül 160 000 és 180 000 között van.
c) Rhesus-majom-izomból nyert MM-kreatinkináz-izoenzimet egy 0,15 mól imidazollal tompított, 6,8 pHértékű, 25 millimól ditio-eritritet és 15 millimól mangán(II)-kloridot tartalmazó fiziológiás nátrium-kloridoldattal szemben dializálunk. Az aggregátumokat ultracentrifugálással eltávolítjuk, a fehérjetartalmat pedig az említett dialízis-pufferoldattal 5 mg/ml-re állítjuk be. Az így kapott oldat 1 ml-jét 1 ml komplettírozott Freund-féle adjuvánssal emulgeáljuk. Az injekciók beadása, a vérvétel és a feldolgozás a B) példa a) szakaszában leírt módon történik. így liofilizált alakban kapjuk a Rhesus-majom-izom MM-kreatinkináz-antitesteket. A kapott termék szedimentációs állandója körülbelül 7 S.
d) Sertés-izomból kapott MM-kreatinkináz-izoenzimet a B) példa b) szakaszában leírt módon aktiválunk és a kapott antigén-emulziót (komplett Freund-féle adjuvánssal emulgeálva) nyulaknak adjuk be injekcióban. Három hét múlva egy további szubkután antigén-injek ciót adunk be, ezt további három hét múlva megismételjük, majd 19 nap múlva vért veszünk az állatoktól. A feldolgozás a B) példa a) szakaszában leírt módon történik. így liofilizált alakban kapjuk a sertés-izom MM-kreatinkináz-antitesteket, amelyek molekulasúlya körülbelül 160 000 és 180 000 között Van.
Teljesen egyező módon állítjuk elő a marha-izom MM-kreatinkináz-antitesteket szarvasmarha-izomszövetből. Az így kapott marha-izom MM-kreatinkináz-antitestek molekulasúlya szintén körülbelül 160 000 és 180 000 között van.
6. példa
III. vizsgálat MB-kreatinkínáz aktivitásának mennyiségi meghatározására testfolyadékokban
A vizsgálati csomag 1 palackban 30 meghatározáshoz elegendő puffer-szubsztrát-oldatot és 30 palack koenzim-enzim-antitest elegyet tartalmaz.
A vizsgálatnál a komponensek a következő töménységben vannak:
100 mM trietanolamin-puffer, pH-értéke 7,0 mM kreatin-foszfát mM glükóz mM glutation mM magnézium-acetát mM ADP (adenozin-difoszfát)
0,6 mM NADP (nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát) mM AMP (adenozin-monofoszfát) >-1200 egység/1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz > 1200 egység/1 hexokináz
800 egység/1 kecskében termelt, emberi MM-kreatinkinázt gátló antitest.
palack koenzim-enzim-antitest elegyhez 2 ml puffer-szubsztrát oldatot és 0,1 ml friss és nem hemolizált szérumot pipettázunk, az oldatot összekeverjük és 7 percig 25 °C-on állni hagyjuk. Ezután 5 percenként mérjük az extinkció növekedését; a hullámhossz 334, 365 vagy 340 nm, a rétegvastagság 1 cm.
Volumenaktivitások kiszámítása:
334 nm-nél: ΔΕ/5 perc x 1359 [egység/1]
340 nm-nél: ΔΕ/5 perc x 1333 [egység/1]
365 nm-nél: ΔΕ/5 perc x2400 [egység/1].
7. példa
ÍV. vizsgálat az MB-kreatinkináz mennyiségi meghatározására testfolyadékokban
A vizsgálati csomag 1 palack, 25 meghatározáshoz elegendő (185 ml) puffer oldatot, 25 palack koenzim-enzim-antitest elegyet és 5 palack kreatin-foszfátot (indító reagenst) tartalmaz.
A vizsgálatnál a komponensek a következő töménységben vannak:
100 mM imidazol-acetát puffer, pH-értéke 6,7 mM kreatin-foszfát mM glükóz mM N-acetil-cisztein mM magnézium-acetát mM EDTA (etilén-diamin-tetraacetát)
2mMADP
2mM NADP mM AMP μΜ adenozin(5')-pentafoszfo-(5')adenozin
S1500 egység/1 glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz ^ 2500 egység/1 hexokináz
1000 egység/1 kecskében termelt, emberi MM-kreatinkinázt gátló antitest palack koenzim-enzim-antitest elegyhez 2,5 ml 15 puffer-oldatot adunk (1. oldat); egyidejűleg kreatin-foszfátból (indító reagensből) 1 palack tartalmát 1 ml pufferben feloldjuk (2. oldat).
Az 1. oldat 2,5 ml-éhez 0,1 ml szérum-mintát pipettázunk, az oldatot összekeverjük és 10 percig 25 °C-on 20 állni hagyjuk. Ezután a 2. oldatból 0,1 ml-t hozzáadunk, az oldatot újra Összekeverjük és 2 percig 25 °C-on állni hagyjuk. Ezt követően 5 percen keresztül, percenként mérjük az extinkció növekedését. Hullámhossz: 334, 365 és 340 nm, réteg vastagság lem.
A B-kreatinkináz alegység volumenaktivitásának kiszámítása:
334 nm-nél: ΔΕ/perc x 4369 [egység/1]
340 nm-nél: ΔΕ/perc x 4286 [egység/1]
365 nm-nél: ΔΕ/perc x7714 [egység/1].
A B-kreatinkináz alegységek aktivitását 2-vel megszorozva kapjuk az MB-kreatinkináz aktivitását a min35 tában.
A következő értékeknél nagy valószínűséggel szívizomkárosodás áll fenn:
Teljes kreatinkináz-aktivitás: > 160 egység/1
MB-kreatinkináz-aktivitás: > 10 egység/1 40 MB-kreatinkináz részaránya: >- 6%
Nagy valószínűséggel vázizom-károsodás történt, ha az MB-kreatinkináz részaránya kisebb 6%-nál.
Claims (13)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás az MB-kreatinkináz izoenzim-hibrid aktivitásának testfolyadék-mintákban MM-kreatinkináz 50 (izom-kreatinkináz) jelenlétében történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy állatokat SH-csoportokat stabilizáló és aktiváló anyagokkal, célszerűen N-acetil-ciszteinnel, merkapto-etanollal, ditio-eritrittel, glutationnal, ciszteinnel, ditio-treittel és/vagy S-(2-amino-etil)55 -izotiurónium-bromid-hidrobromiddal aktivált emberi MM-kreatinkinázzal beoltunk és a képződött antitesteket izoláljuk, a mintát kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében az így kapott antitestekkel inkubáljuk, amelyek az MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenzi60 mek M-alegységének enzim-aktivitását teljesen gátolják anélkül, hogy ugyanakkor az adott esetben jelenlevő MB-kreatinkináz B-alegységének enzim-aktivitását inaktiválnák, majd az inkubálást követően a mintában az MB-kreatinkináz B-alegységének aktivitását kreatinki65 náz-szubsztrátumok hozzáadása után, arra alkalmas segédreakciókat követő fotometriás méréssel meghatározzuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy kecskéknek az 1. igénypontban megadott módon történő beoltása útján nyert antitesteket alkalmazunk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a mintának az antitestekkel való inkubálása előtt ugyanabban a mintában a kreatinkináz-összaktivitást is meghatározzuk.
- 4. Szer az MB-kreatinkináz izoenzim-hibrid aktivitásának testfolyadék-mintákban MM-kreatinkináz (izom-kreatinkináz) jelenlétében az 1. igénypont szerint történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy oly antitesteket tartalmaz, amelyek az MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének enzimaktivitását teljesen gátolják, anélkül, hogy ugyanakkor az adott esetben jelenlevő MB-kreatinkináz B-alegységének enzim-aktivitását inaktiválnák, és amely antitestek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljes gátlást tudnak kifejteni, és olyan enzimszubsztrát-puffer keveréket tartalmaz, amely egy segédreakciót követő fotometriás mérés útján lehetővé teszi a kreatinkináz aktivitásának meghatározását.
- 5. A 4. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az kecskékből nyert antitesteket tartalmaz.
- 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azkal jellemezve, hogy az olyan antitesteket tartalmaz, amelyek a mintában 2500 egység/liter koncentrációig képesek teljesen gátolni az MM- és MB-kreatinkináz M-alegységének aktivitását.
- 7. A 4—6. igénypontok bármelyike szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az enzim szubsztrát-puífer keverékben az enzimszubsztrát-rész kreatin-foszfátból, redukált glutationból, adenozin-difoszfátból (ADP), nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátból (NADP), adenozin-monofoszfátból (AMP), hexokinázból, glükóz-6-foszfát-dehidrogenázból, glükózból és magnézium-acetátból áll.
- 8. A 7. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az enzimszubsztrát-puffer keverékben a puffer vízben oldott trietanolamin-acetát, és pH-értéke 7 körül Van.
- 9. A 4—6. igénypontok bármelyike szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az enzimszubsztrát176133 20-puffer keverékben az enzimszubsztrát-rész kreatin-foszfátból, adenozin-difoszfátból (ADP), nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátból (NADP), adenozin-monofoszfátból (AMP), hexokinázból, glükóz-6-foszfát5 -dehidrogenázból, glükózból, magnézium-acetátból, N-acetil-ciszteinből, etiléndiamin-tetraacetátból (EDTA) és adenozin(5')-pentafoszfo-(5')adenozinból áll.
- 10. A 9. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az enzimszubsztrát-puffer keverékben10 a puffer vízben oldott imidazol-acetát, és pH-értéke 6,7 körül van.
- 11. A 7. vagy 8. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az enzimszubsztrát-puffer keverék komponensei közül a kreatin-foszfát 35 mM, az15 ADP 1 mM, a NADP 0,6 mM, az AMP 10 mM, a hexokináz 1200 egység/1, a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 1200 egység/1, a glükóz 20 mM, a magnézium-acetát 10 mM, a redukált glutation 9 mM és a 7 pH-értékü trietanolamin-acetát puffer 100 mM töménységben van 20 jelen a vizsgálati elegyben.
- 12. A 9. vagy 10. igénypont szerinti szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az enzimszubsztrát-puffer keverék komponensei közül a kreatin-foszfát 20 mM, az ADP 2 mM, a NADP 2 mM, az AMP 10 mM, a hexo-25 kináz 2500egység/I vagy ennél nagyobb, a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz 1500 egység/1 vagy ennél nagyobb, a glükóz 20 mM, a magnézium-acetát 10 mM, az N-acetil-cisztein 20 mM, az EDTA 2 mM, az adenozin(5')-pentafoszfo-(5')adenozin 10 mM és a 6,7 pH30 értékű imidazol-acetát puffer 100 mM töménységben van jelen a vizsgálati elegyben.
- 13. Az 5—12. igénypontok bármelyike szerinti, kreatinkináz teljes aktivitásának és MB-kreatinkináz aktivi-35 tásának egy mintában történő, párhuzamos meghatározására alkalmas szer kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az olyan antitesteket tartalmaz, amelyek az MM-kreatinkináz- és MB-kreatinkináz-izoenzimek M-alegységének enzimaktivitását teljesen gátolják, anélkül, hogy 40 ugyanakkor az adott esetben jelenlevő MB-kreatinkináz B-alegységének enzimaktivitását inaktiválnák, és amely antitestek kreatinkináz-szubsztrátumok jelenlétében is teljes gátlást tudnak kifejteni, és olyan enzimszubsztrát-puffer keveréket is tartalmaz, amely egy segédreakciót követő fotometriás mérés útján lehetővé teszi a kreatinkináz aktivitásának meghatározását.A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2548963A DE2548963C3 (de) | 1975-11-03 | 1975-11-03 | Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU176133B true HU176133B (en) | 1980-12-28 |
Family
ID=5960613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU76ME2027A HU176133B (en) | 1975-11-03 | 1976-11-03 | Process and reagent for determining mb-creatinase-activity in body-liquid-samples |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4067775A (hu) |
| JP (1) | JPS5257887A (hu) |
| AT (1) | AT359205B (hu) |
| BE (1) | BE847905A (hu) |
| BR (1) | BR7607257A (hu) |
| CH (1) | CH628144A5 (hu) |
| CS (1) | CS200196B2 (hu) |
| DD (1) | DD127243A5 (hu) |
| DE (1) | DE2548963C3 (hu) |
| DK (1) | DK151920C (hu) |
| ES (1) | ES452916A1 (hu) |
| FI (1) | FI60720C (hu) |
| FR (1) | FR2330010A1 (hu) |
| GB (1) | GB1512328A (hu) |
| HU (1) | HU176133B (hu) |
| IE (1) | IE44183B1 (hu) |
| IL (1) | IL50803A (hu) |
| IT (1) | IT1109402B (hu) |
| LU (1) | LU76112A1 (hu) |
| NL (1) | NL190171C (hu) |
| NO (1) | NO148457C (hu) |
| SE (1) | SE439380B (hu) |
| ZA (1) | ZA766526B (hu) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2548962C2 (de) * | 1975-11-03 | 1985-11-21 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Antikörper gegen die Untereinheit M von Creatinkinase-Isoenzymen |
| US4237219A (en) * | 1977-10-27 | 1980-12-02 | Washington University | Radioimmunoassay assay and reagents for MB isoenzyme of CK |
| DE2828658C3 (de) * | 1978-06-29 | 1981-10-22 | Lkb-Produkter Ab, Stockholm | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
| US4260678A (en) * | 1979-02-23 | 1981-04-07 | Corning Glass Works | Determining creatine kinase isoenzmes via immobilized antibody-isoenzyme complexes |
| DE2908053C2 (de) * | 1979-03-02 | 1982-08-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase MB |
| US4353982A (en) * | 1980-04-10 | 1982-10-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
| EP0040964A1 (en) * | 1980-05-23 | 1981-12-02 | Michael Howard Burnam | Protein enzyme derivative |
| US5009996A (en) * | 1980-06-30 | 1991-04-23 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Two site cross-reaction immunometric sandwich assay method |
| US5009997A (en) * | 1980-06-30 | 1991-04-23 | Shah Vipin D | Two site cross-reaction immunometric sandwich assay method |
| US4360413A (en) * | 1980-12-29 | 1982-11-23 | Beckman Instruments, Inc. | Creatine kinase isoenzyme electrophoretic technique and improved creatine kinase isoenzyme reagent for use therein |
| US4387160A (en) * | 1981-02-17 | 1983-06-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
| ES511156A0 (es) * | 1981-04-13 | 1983-08-01 | Hoechst Co American | Un metodo de determinar la presencia de un antigeno en un medio liquido sospechoso de contenerlo. |
| JPS58183098A (ja) * | 1982-04-20 | 1983-10-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アイソザイム分別定量法 |
| JPS60125565A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | エノラ−ゼサブユニット量の分別定量法 |
| US4624916A (en) * | 1984-04-06 | 1986-11-25 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Process and composition for the rapid quantitation of small levels of creative kinase-MB isoenzyme |
| US4703002A (en) * | 1985-05-01 | 1987-10-27 | Eastman Kodak Company | Method for preparing coating compositions containing an immunologically reactive species and elements containing same |
| US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
| US4983513A (en) * | 1986-03-28 | 1991-01-08 | Beckman Instruments, Inc. | Sulfhydryl compounds for suppressing the inhibitory effects of NAD degradation products on LD-L activity |
| JPS63131065A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-03 | Yatoron:Kk | 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 |
| US4950592A (en) * | 1987-05-12 | 1990-08-21 | Eastman Kodak Company | Blend of monoclonal antibodies |
| JPH01503565A (ja) * | 1987-05-12 | 1989-11-30 | クールター・エレクトロニクス・インコーポレーテッド | 中和／免疫阻害アッセイ方法および試験キット |
| US5382515A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Creative kinase-MB immunoassay for myocardial infarction and reagents |
| US4900662A (en) * | 1987-07-21 | 1990-02-13 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | CK-MM myocardial infarction immunoassay |
| US5382522A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Immunoassay for creatine kinase-MB and creatine kinase-BB isoforms and reagents |
| US5804394A (en) * | 1988-04-06 | 1998-09-08 | Unitika Ltd. | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
| JPH02181654A (ja) * | 1989-01-06 | 1990-07-16 | Green Cross Corp:The | 抗酵素抗体価の測定方法 |
| US5086001A (en) * | 1989-12-01 | 1992-02-04 | Baxter International, Inc. | Automated test method for evaluating the physical compatibility of intravenous drugs in solutions |
| US5512447A (en) * | 1990-09-07 | 1996-04-30 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis and treatment of diabetes |
| DK0547164T3 (da) * | 1990-09-07 | 2004-10-25 | Univ California | Fremgangsmåder til diagnosticering og behandling af diabetes |
| JPH09304393A (ja) * | 1996-05-15 | 1997-11-28 | Ind Technol Res Inst | 急性心筋梗塞診断キット |
| US5998158A (en) * | 1997-05-14 | 1999-12-07 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Glucose free, stable dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme |
| JP3750955B2 (ja) * | 1997-04-18 | 2006-03-01 | 富士写真フイルム株式会社 | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
| EP0989190B1 (en) * | 1998-09-22 | 2002-11-27 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme |
| DE69809741T2 (de) * | 1998-09-22 | 2003-04-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | Trockenes analytisches Element zur quantitativen Analyse von Creatinkinase oder seinem MB-Isoenzym |
| EP1072889B1 (en) * | 1999-01-19 | 2008-08-13 | Sysmex Corporation | Method for assaying creatine kinase isozyme activity and assay reagent |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (de) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode |
| DE2258822A1 (de) * | 1972-12-01 | 1974-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern |
| US3994783A (en) * | 1975-09-26 | 1976-11-30 | Calbiochem | Differential assay of creatine phosphokinase isoenzymes |
-
1975
- 1975-11-03 DE DE2548963A patent/DE2548963C3/de not_active Expired
-
1976
- 1976-10-28 FR FR7632591A patent/FR2330010A1/fr active Granted
- 1976-10-29 BR BR7607257A patent/BR7607257A/pt unknown
- 1976-11-01 IL IL50803A patent/IL50803A/xx unknown
- 1976-11-01 IE IE2428/76A patent/IE44183B1/en not_active IP Right Cessation
- 1976-11-01 US US05/737,587 patent/US4067775A/en not_active Expired - Lifetime
- 1976-11-01 DD DD195542A patent/DD127243A5/xx unknown
- 1976-11-01 ZA ZA766526A patent/ZA766526B/xx unknown
- 1976-11-02 NO NO763722A patent/NO148457C/no unknown
- 1976-11-02 FI FI763127A patent/FI60720C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 CS CS767066A patent/CS200196B2/cs unknown
- 1976-11-02 SE SE7612175A patent/SE439380B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 JP JP51133145A patent/JPS5257887A/ja active Granted
- 1976-11-02 CH CH1380576A patent/CH628144A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 DK DK496476A patent/DK151920C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 AT AT809576A patent/AT359205B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 ES ES452916A patent/ES452916A1/es not_active Expired
- 1976-11-02 IT IT52004/78A patent/IT1109402B/it active
- 1976-11-03 LU LU76112A patent/LU76112A1/xx unknown
- 1976-11-03 GB GB45805/76A patent/GB1512328A/en not_active Expired
- 1976-11-03 HU HU76ME2027A patent/HU176133B/hu not_active IP Right Cessation
- 1976-11-03 BE BE172009A patent/BE847905A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-11-03 NL NLAANVRAGE7612182,A patent/NL190171C/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU176133B (en) | Process and reagent for determining mb-creatinase-activity in body-liquid-samples | |
| US4366242A (en) | Method and agent for the immunological determination of enzymes | |
| JPH0614045B2 (ja) | 末端デオキシヌクレオチジル転移酵素の測定法 | |
| US4387160A (en) | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme | |
| EP0070033B1 (en) | Quantitative determination of adenosine | |
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| JPS58111754A (ja) | クレアチニンの免疫学的測定法及びそのための試薬 | |
| Homburger et al. | Creatine kinase radioimmunoassay and isoenzyme electrophoresis compared in the diagnosis of acute myocardial infarction. | |
| US4330620A (en) | Method and reagent for the determination of creatine kinase MB | |
| US4237219A (en) | Radioimmunoassay assay and reagents for MB isoenzyme of CK | |
| US6586194B1 (en) | Method for assaying creatine kinase isozyme activity and assay reagent | |
| CA1062609A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-mb | |
| JP2846463B2 (ja) | 抗ストレプトキナーゼ抗体の検出方法 | |
| EP0085402B1 (en) | Method of determination of human urine kallikrein and kit for the same | |
| CS207669B2 (cs) | Prostředek ke stanovení účinnosti hybridního isoenzymu kreatinkinázy-MB | |
| Fishman et al. | Quantitation of potency of antisera to placental alkaline phosphatase by an automated immunoenzyme technique | |
| JP2001228157A (ja) | 化粧品及びその他製剤中からウシ胎盤由来成分を検出する方法 | |
| JPS59111062A (ja) | β型エノラ−ゼの測定法 | |
| JPH0933527A (ja) | 低分子化合物の高感度測定法 | |
| JPH05260997A (ja) | 測定用試薬とその測定方法 | |
| JP2000270893A (ja) | γ−グルタミルトランスペプチターゼ活性の測定用試薬並びにその測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |