JP2001228157A - 化粧品及びその他製剤中からウシ胎盤由来成分を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ウシ胎盤に特徴的に存在するタンパク質
としてウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼを見出
し、それを大量に精製する方法を確立し、それを免疫原
とする抗体の標識化抗体を用いたエンザイムイムノアッ
セイによりウシ胎盤由来成分を検出する測定方法。 【効果】 本測定方法は、特に化粧品製剤中よりウシ胎
盤抽出液成分を高感度に検出することを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウシ胎盤由来成分
を測定する新規技術に関するものであり、更に詳細に
は、ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼを指標とし
てウシ胎盤抽出液成分その他のウシ胎盤由来成分を測定
する点を特徴とするものである。本発明は、例えば、従
来適切な方法がなかった化粧品及びその他製剤中のウシ
胎盤由来成分を簡便且つ正確に検出、測定するのに有効
に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ等の胎盤から
得られる水抽出エキスはプラセンタエキスとして古くか
ら医薬品及び化粧品分野で用いられてきた原料の一つで
ある。特にウシ胎盤から得られたウシ胎盤抽出液は、広
く化粧品分野において美白剤の有効成分として用いられ
ている。

【０００３】ウシ胎盤抽出液の有効成分としては、３０
種以上の遊離アミノ酸、ビタミン類、微量元素類等が知
られている。その他にも多くのペプチド及びタンパク質
が含まれている。また、その作用は、メラニン色素生成
に大きく関与しているチロシナーゼ酵素に対する阻害作
用、種々の細胞の代謝活性を促進させる作用等について
良く知られており、さらに抗炎症、抗アレルギー作用、
活性酸素除去作用も有すると言われている。しかし、配
合成分の種類の多さからどの成分がどのような作用を示
すのか十分に確認されていない。そのため、ウシ胎盤抽
出液成分の製品製剤中からの検出・確認方法は未だに確
立されていない。

【０００４】近年、医薬品・食品、化粧品分野における
製品への全成分表示の義務化等の流れと同時に、配合成
分の検出・確認方法の確立についての必要性が高まって
いる。

【０００５】本発明者らは、従来より化粧品等の製剤中
からのウシ胎盤抽出液成分の検出方法の確立について鋭
意研究を行い、平成１０年の日本薬学会第１１８年会に
おいて「ウシ胎盤抽出液（プラセンタエキス）の遊離ア
ミノ酸分析と化粧品製剤中からの検出法の検討（演題番
号ＹＰ１５−１３９）」の報告を行った。報告内容は、
ウシ胎盤抽出液の遊離アミノ酸の精密分析とそれを配合
した化粧品製剤の遊離アミノ酸の精密分析を行い、その
両者の結果を統計処理することにより化粧品製剤中の遊
離アミノ酸がウシ胎盤抽出液由来のものであるか判定す
るものである。実験結果では、１．０％のウシ胎盤抽出
液が配合されていれば十分に検出が可能であった。しか
し、いくつかの問題についてはこの方法では解決できな
かった。まず、ウシ胎盤抽出液以外の遊離アミノ酸が配
合されている化粧品製剤にはこの方法が適用できないこ
とと検出されている遊離アミノ酸がウシ胎盤由来のもの
であることが証明できない問題がある。また、化粧品製
剤では、ウシ胎盤抽出液の配合濃度が１．０％以下の場
合も多いため、そのような製剤にも適用できない問題が
ある。

【０００６】このように、ウシ胎盤抽出液（例えばプラ
センタエキス）等のウシ胎盤由来成分を測定するための
正確にして簡便な方法は現在までのところ開発されてお
らず、したがって、例えばプラセンタエキス配合化粧品
中のプラセンタエキスの含有量を正確且つ簡便に測定す
ることはできないというのが現状である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、上記した各種の問題点を解決して、ウ
シ胎盤由来成分を高感度で測定、検出するための新規な
方法を開発する目的でなされたものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために種々の検討を行った結果、ウシ胎盤由
来成分が各種の成分を多数含有している点に改めて着目
し、複雑な構成からなるウシ胎盤由来成分を一括して直
接検出するのではなく、その中からウシ胎盤特異的なひ
とつの構成成分を見出すことができれば、これを測定す
ることによってウシ胎盤由来成分を検出、測定できると
の観点にはじめてたった。

【０００９】そこで本発明者らは、種々の検討を行った
結果、ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ酵素（な
お、アルカリフォスファターゼを以下においてＡＬＰと
いうこともある）がウシ胎盤特異的な酵素であることを
はじめて発見しただけでなく、それを抗原として作製し
た抗体を用いることによってウシ胎盤由来ＡＬＰのみを
選択的に検出できることを確認し、そして更に、ウシ胎
盤由来ＡＬＰのみを測定すればウシ胎盤由来成分を検
出、測定できることを確認した。

【００１０】つまり本発明者らは、ウシ胎盤由来ＡＬＰ
というひとつの酵素を測定することによってウシ胎盤由
来成分全体が検出、測定できること、換言すれば、ウシ
胎盤由来ＡＬＰの測定がウシ胎盤由来成分測定のための
必要にして充分な条件であることをはじめて見出し、こ
れらの有用新知見に基づいて、更に研究の結果、本発明
の完成に至ったものである。

【００１１】すなわち、本発明者らは、ウシ胎盤由来成
分（なお、以下において、その代表例としてウシ胎盤抽
出液について本発明を詳述する。）中にのみ含有される
成分について種々の検討を行った結果、従来からウシ胎
盤由来成分として公知であるウシ胎盤由来アルカリフォ
スファターゼがヒト胎盤及びウシ腸由来のアルカリフォ
スファターゼと異なる酵素であることを見出した。この
ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼをウシ胎盤より
大量に精製し、これを抗原とした抗体を作製し、その交
差反応性について検討を行った結果、本抗体はウシ胎盤
由来アルカリフォスファターゼ特異的であることが判明
した。本発明はウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ
特異的抗体を用いて、製剤中から高感度にウシ胎盤由来
成分を検出する方法に関するものである。以下に本発明
を詳細に説明する。

【００１２】本発明において、検出する成分は非常に重
要な課題である。本来であれば、ウシ胎盤抽出液は、さ
まざまな有用な作用を有するものであるので、その作用
毎に有用成分を特定し、その検出方法について確立する
ことが最も望ましい。しかし、ウシ胎盤抽出液には生体
に有用であることが公知な遊離アミノ酸やビタミン類等
の微量成分が多く含まれており、また未知のペプチド・
タンパク質も含まれていることが予想されている。特に
遊離アミノ酸はその配合比率によっても生物的活性作用
が異なることも知られている。そのため現在まで知られ
ているウシ胎盤抽出液の作用は、これらの微量有効成分
の種類とその配合比率等が関与すると考えられるため、
有効成分の特定は非常に困難であり、現在まで特定され
ている成分はない状況である。

【００１３】そのため発明者らは、検出する成分として
ウシ胎盤に特徴的に存在するものの検討を行い、ウシ胎
盤抽出液中のアルカリフォスファターゼがウシ胎盤に特
異的なタンパク質であることを見出した。アルカリフォ
スファターゼは、フォスフォモノエステラーゼの一つで
あり、酵素活性の最適ｐＨをアルカリ性にもち、ほとん
どすべてのリン酸モノエステル結合をほぼ同じ速度で加
水分解し、無機リン酸を生じる特異性の比較的広い亜鉛
酵素である。その存在は高等動物から細菌に及び、膜画
分にリポタンパク質と結合し、高等動物では臓器特異的
なアイソザイムが存在していることは知られていたが、
特にウシ胎盤に存在しているものについては詳細な報告
はされていない。

【００１４】発明者らは、ヒト胎盤抽出液中に存在する
ヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼ、免疫及び酵素
反応試薬としてよく用いられているウシ腸由来アルカリ
フォスファターゼ及び今回のウシ胎盤由来アルカリフォ
スファターゼの種々の比較試験を行い、それらが化学的
に異なるタンパク質であるか検討した。その結果、それ
ぞれアルカリフォスファターゼ活性の最適ｐＨが全く異
なることが判明し、それぞれ異なるタンパク質であるこ
とが明らかとなった。

【００１５】この酵素の最適ｐＨを測定し比較する実験
は、通常では検体数が多い場合、正確な酵素活性測定が
困難である。そのため、今回の実験では酵素活性測定に
臨床診断としてヒトの血液中の酵素活性を自動的に多検
体測定する分析装置を用い、さらに微妙なｐＨ緩衝作用
をもち高感度な測定が可能な反応溶液を用いた。その結
果、ヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼの最適ｐＨ
はｐＨ１０．３〜１０．５、ウシ腸由来アルカリフォス
ファターゼの最適ｐＨはｐＨ９．５〜９．７、ウシ胎盤
由来アルカリフォスファターゼの最適ｐＨは、ｐＨ９．
９〜１０．１であることが判明した。これらのことか
ら、ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼは他のアル
カリフォスファターゼと異なるものと認められ、これに
対する特異的な抗体を用いることによりウシ胎盤抽出液
成分が検出可能であるとの認識を得た。

【００１６】しかしながら、抗体を作製するためには精
製された抗原が大量に必要であり、工業化のためには数
ｍｇ以上という非常に大量のしかも精製された抗原が必
要である。ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼは、
市販品（シグマ社）から粗精製品が市販されていたが、
１９９９年（平成１１年）に製造中止となり、市販品は
入手不可能である。これには他由来のアルカリフォスフ
ァターゼは含まれていないものの、粗精製品のため投与
抗原には適していない。また、ウシ胎盤から精製する方
法も公知の報告がなく確立されていない。本発明は、そ
の精製及び大量生産の方法についてその技術をはじめて
確立しただけでなく、抗体を作製する方法についてもそ
の技術を確立した。そして更に、該抗原の測定技術も確
立しただけでなく、実際の化粧品中における該抗原の測
定可能性を確認し、しかもその測定値が化粧品に実際に
含まれているウシ胎盤抽出液の含有量となることも併せ
確認してなされたものであって、本発明は、きわめて特
徴的であり、まさに画期的なものである。

【００１７】先ず、抗原として使用するウシ胎盤由来Ａ
ＬＰの大量精製については、その原料としてニチレイ・
水溶性プラセンタエキス（株式会社ニチレイ：商品名）
を用い、種々の精製方法を組み合わせることにより精製
可能であることが明らかとなった。この精製方法とは、
限外ろ過法、有機溶剤等を用いた塩析法、イオン交換樹
脂を用いたカラムクロマトグラフィー及びゲルろ過法な
どであるが、その他の方法を組み合わせても精製するこ
とはできる。

【００１８】この精製品の純度により、これを抗原とし
て用いた場合の得られた抗体の特異性が異なる可能性が
あるが、本発明においてはウシ胎盤由来アルカリフォス
ファターゼと反応することが確認できれば、発明の目的
を達成することができる。

【００１９】このウシ胎盤由来ＡＬＰ精製品を抗原とし
て用いることによって、本発明のウシ胎盤由来成分を検
出する抗体を得ることができる。抗体を作製する方法は
常法によればよく、例えばウシ胎盤由来ＡＬＰを抗原と
し、必要あればキャリア蛋白質を結合し、Ｆｒｅｕｎｄ
完全アジュバント等の各種アジュバントと混合して、動
物に免疫し、抗血清を得ることにより抗体を得ることが
できる。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ等を利用することができる。

【００２０】本発明においては、上記したポリクローナ
ル抗体のほか、モノクローナル抗体を使用することがで
きる。モノクローナル抗体は、常法にしたがえばよく、
例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの
作製は、（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５（１９７
５））に準じて実施することができる。すなわち、免疫
動物から摘出した膵臓細胞、リンパ節細胞又はＢリンパ
球から選ばれる抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ポ
リエチレングリコールの存在下で融合する。ＨＡＴ培地
（１×１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍ アミノ
ブテリン、１．６×１０^-3Ｍ チミジン含有）等により
ハイブリドーマを選択的に増殖させ、培養上清中への上
記トランスフェクタントと特異的に結合する抗体の分泌
が認められた細胞を限界希釈法によりクローニングす
る。

【００２１】こうして作製されたハイブリドーマは、そ
の培養上清や骨髄腫細胞の由来する動物に移植して得ら
れる腹水よりモノクローナル抗体を生産することができ
る。免疫動物の抗血清やハイブリドーマの培養上清、腹
水より抗体を精製する方法としては、硫安塩析、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等、既知の精製方法により行うことができる。

【００２２】本発明のウシ胎盤抽出液成分を検出する抗
体としては、ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼに
特異性があるものであれば、モノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のどちらの抗体でも使用できる。その
特異性を確認する方法としては、公知のさまざまな方法
を応用することによって実施できる。例えば、ウシ胎
盤、ヒト胎盤及びウシ腸由来アルカリフォスファターゼ
との交差反応性をマイクロプレートを用いたエンザイム
イムノアッセイなどの免疫測定により確認することがで
きる。

【００２３】これらの抗体は、例えばプロテインＡを用
いたアフィニティーカラムにより精製する。さらに精製
する場合には免疫抗原を用いたアフィニティークロマト
グラフィーにより行うことができる。しかし、その精製
純度は、抗原であるウシ胎盤由来アルカリフォスファタ
ーゼを検出することが可能であれば、十分である。もち
ろん精製したものを使用すれば、定性分析はもとより定
量分析も可能であって、ウシ胎盤由来成分を定性的及び
定量的に検出、測定することができる。

【００２４】以上のようにして得られた抗ウシ胎盤由来
アルカリフォスファターゼ抗体は、医薬部外品・化粧品
及びその他の製剤中から、ウシ胎盤由来成分としてのア
ルカリフォスファターゼを高感度に検出する用途に用い
ることができる。したがって本発明は、抗ウシ胎盤由来
ＡＬＰ抗体を含有することを特徴とするウシ胎盤由来成
分測定用キットを提供するものであり、必要あれば、更
に、標識化した抗ウシ胎盤由来ＡＬＰ抗体、ウシ胎盤由
来ＡＬＰ、緩衝液、発色試薬等とともに、本キットを組
むこともできる。

【００２５】本発明に係るウシ胎盤由来成分の検出、測
定方法は、ウシ胎盤由来ＡＬＰを指標とする点を特徴と
するものであり、ウシ胎盤由来ＡＬＰを検出、測定する
ことにより、ウシ胎盤由来成分の検出、測定を行うもの
である。ウシ胎盤由来ＡＬＰの測定は、免疫測定法その
他適宜の方法で行うことができる。免疫測定法として
は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット
法、免疫沈降法、免疫組織染色法など公知の方法が挙げ
られる。好適な方法としては、サンドイッチ法、第二抗
体法、競合法、沈澱法等が非限定的に例示される。

【００２６】上記した各方法において、トレーサーとし
ては、酵素（ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、Ｇ−６−Ｐ デヒドロゲナーゼ等）、アイソトープ
（¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ等）、蛍光物質（フルオレセイン、ＦＩ
ＴＣ、ローダミン等）、発光物質（フェリチン、ルシフ
ェリン、ルミノール等）、その他常用される標識剤がす
べて自由に使用できる。抗原や抗体へのトレーサー物質
の標識技術は既に広く普及しており、多くの成書や報告
がある。

【００２７】抗体又は抗原を固定する固相としては、従
来用いられているポリスチレンビーズ、プレート、ラテ
ックス粒子、磁性微粒子などが使用可能であり、材質や
形状には何等制限はない。固定する方法も、物理吸着、
共有結合、ビオチン−アビジン結合、抗原抗体反応を利
用することなど既知の方法をすべて利用することが可能
である。これらの方法は、広く一般的に利用され、多く
の成書や報告がある。

【００２８】本発明に係るウシ胎盤由来成分の検出法の
態様のひとつは、標識化抗ウシ胎盤由来アルカリフォス
ファターゼ抗体を検出試薬として、該標識化抗ウシ胎盤
由来アルカリフォスファターゼ抗体と特異的な親和性を
有するウシ胎盤抽出液成分であるアルカリフォスファタ
ーゼを検出することを要点としている。従って、本発明
の検出法は、例えば、次のようになる。濃度を調整した
抗ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ抗体を９６穴
マイクロプレートに添加し、抗体をプレート上に固相化
する。そのプレートをアルブミン等のタンパク質でブロ
ッキングする。プレートを洗浄した後、検量線作成用に
既知濃度のウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ希釈
液と未知試料を加え反応させる。プレートを洗浄した
後、ビオチンで標識した抗ウシ胎盤由来アルカリフォス
ファターゼ抗体を加え反応させ、さらにペルオキシダー
ゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、３，３′，５，
５′−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含む発色試
薬を加え、酸で反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定
する。その吸光度から作成した検量線によって未知試料
に含まれるウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ濃度
を決定する。

【００２９】本発明によれば、５ｎｇ／ｍｌ程度の非常
に低濃度のウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼが、
定量可能となる。本発明の測定方法で測定した結果、ウ
シ胎盤由来アルカリフォスファターゼを含むウシ胎盤抽
出液中には、１０μｇ／ｍｌ以上のウシ胎盤由来アルカ
リフォスファターゼが含まれていることから、０．１％
のウシ胎盤抽出液を含む製剤からウシ胎盤由来アルカリ
フォスファターゼを検出することが可能である。

【００３０】以上、ウシ胎盤由来成分としてウシ胎盤抽
出液成分について説明してきた。プラセンタエキスはそ
の代表例であって、通常、妊娠３カ月前後の健康なウシ
の新鮮胎盤から低温下に水及び／又はエタノール等の有
機溶媒で抽出された組織抽出物であって、一部市販され
ている。また、本発明において、ウシ胎盤由来成分に
は、上記したウシ胎盤抽出液のほかその処理物（濃縮
物、ペースト化物、乾燥物、乳化物、希釈物から選ばれ
る少なくともひとつ）が包含され、また、胎盤の乾燥粉
末、炭化物、水解物等も包含される。

【００３１】したがって、本発明は、これらのウシ胎盤
由来成分を含有する化粧品、医薬用部外品、飲食品、そ
の他各種製剤から、ウシ胎盤由来ＡＬＰアッセイを行う
ことにより、ウシ胎盤由来成分を格別の妨害作用を受け
ることなく、正確且つ簡便に検出及び／又は測定するこ
とができる。

【００３２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、これらにより本発明を制限するものではな
い。

【００３３】

【実施例１：アルカリフォスファターゼの最適ｐＨ】酵
素の最適ｐＨを測定するためには、迅速な多検体酵素活
性測定が必要である。そこで今回の分析は、臨床診断と
してヒトの血液中の酵素活性を自動的に多検体測定する
分析装置を用いた。

【００３４】（１）分析装置 自動分析装置 日立７１５０ サンプル、緩衝液及び発色液を装置にセットし、プログ
ラムを実行させることにより酵素活性値を算出する装置
である。

【００３５】（２）測定方法 ２−エチルアミノエタノールに塩酸を加え作製したｐＨ
９〜１１の間の１０点のｐＨの緩衝液０．３２ｍｌとサ
ンプル０．００４ｍｌを混合し、３７℃で加温した。こ
れにニトロフェニルリン酸を含む発色液０．０８ｍｌを
加え反応を開始させた。４分間の反応後、４０５ｎｍと
５０５ｎｍにおける吸光度差を測定し、アルカリフォス
ファターゼの活性値を算出した。反応時のｐＨを確認す
るために各ｐＨの緩衝液と発色液を反応条件の比率で混
合し、３７℃に加温した後のｐＨを測定した。１サンプ
ル、１点のｐＨにつき３回測定し、その平均値を求め、
最高の活性値を示したｐＨの活性を１００％として、同
一サンプルの他のｐＨにおける比活性値（％）を算出し
た。

【００３６】（３）試薬組成 緩衝液（１０００ｍｌ中）：２−エチルアミノエタ
ノール（１１１ｇ）、塩化マグネシウム（０．１０３
ｇ）、塩酸（ｐＨ調製に必要な量）、精製水（適量） 発色液（１０００ｍｌ中）：ほう酸（３．１１
ｇ）、水酸化ナトリウム（０．４２２ｇ）、塩化マグネ
シウム（０．１５０ｇ）、ｐ−ニトロフェニルリン酸２
ナトリウム（２９．０ｇ）、精製水（適量） （４）サンプル シグマ社製ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ
（ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐｌａｃｅｎｔａ）：ＢＰ
と略す カタログ番号 Ｐ−３７６５（１９９９年時点生産中
止） シグマ社製ウシ腸由来アルカリフォスファターゼ
（ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ（Ｃａｌｆ） Ｉｎｔｅｓｔ
ｉｎｅ）：ＢＩと略す カタログ番号 Ｐ−３８７７ シグマ社製ヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼ
（ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ）：ＨＰと
略す カタログ番号 Ｐ−１３９１ ニチレイ・水溶性プラセンタエキス（商品名）：Ｐ
Ｅと略す

【００３７】（５）実験結果 得られた結果を下記表１に示す。表１に示したように、
ウシ胎盤由来，ウシ腸由来、及びヒト胎盤由来のＡＬＰ
の最適ｐＨとｐＨの違いによる比活性の変化が異なるこ
とから、これらの酵素は化学的に異なるタンパク質分子
であるアイソザイムであることが判明した。なお、表１
の結果を図１に示した。

【００３８】

【００３９】

【実施例２：ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼの
精製】ウシ胎盤抽出液であるニチレイ・水溶性プラセン
タエキス（商品名）２００Ｋｇを、分画分子量３万の膜
を用いた限外ろ過により、約１０Ｋｇまで濃縮した。こ
れに同量のアセトンを加え攪拌した後、遠心分離処理
（５０００ｒｐｍ、３０分）を行い、沈殿を回収した。
この沈殿を完全に乾燥させた後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１ｍＭ ＭｇＣｌ₂溶液にて溶
解させ、遠心分離処理（１００００ｒｐｍ、３０分）を
行い、上清のみを回収した。この上清をバイオラッド社
製のアフィゲルブルー（１００−２００メッシュ）カラ
ムで処理した。このアフィゲルブルーカラムには、ウシ
アルブミン等のタンパク質は吸着するが、ウシ胎盤由来
アルカリフォスファターゼは吸着しなかった。そこで未
吸着のアルブミンが生じないように、添加上清量とカラ
ムサイズを考慮ながら、複数回に分けて上清を処理し
た。一度上清を処理してアフィゲルブルーカラムは、３
Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄することにより再生可
能であった。

【００４０】このアフィゲルブルーカラム処理サンプル
を、陰イオン交換樹脂であるファルマシア社製のＤＥＡ
Ｅ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＦカラムにより分画した。
予め開始緩衝液である２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）＋１ｍＭ ＭｇＣｌ₂で平衡化したＤＥＡＥ
−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＦカラムにアフィゲルブルー
カラム処理サンプルを添加し、開始緩衝液でＤＥＡＥ−
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦカラムを洗浄した。ＤＥＡＥ−
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＦカラムからアルカリフォスフ
ァターゼを含むタンパク質分画を、０．１Ｍ ＮａＣｌ
を含む開始緩衝液で溶出させた。溶出液は、フラクショ
ンコレクターにより分画し、２８０ｎｍの吸光度とアル
カリフォスファターゼ活性値から必要な分画を選別し
た。得られたアルカリフォスファターゼ分画は、分画分
子量１０Ｋの限外ろ過膜で濃縮した。ファルマシア社製
のＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ−３００ＨＲを用いて、その
濃縮液のゲルろ過を行った。このゲルろ過分画物の２８
０ｎｍの吸光度とアルカリフォスファターゼ活性値から
必要な分画を選別した。

【００４１】得られたアルカリフォスファターゼ分画の
純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。クマシー染色
によりタンパク質のバンドを確認した。複数のバンドが
認められた場合、再度、ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ
ＦＦカラム処理とＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ−３００Ｈ
Ｒにより精製した。純度の高いウシ胎盤由来アルカリフ
ォスファターゼは、分子量マーカーとして用いられる分
子量９７４００のフォスフォリラーゼＢとほぼ同じ分子
量であった（図２参照）。抗体を作製するための免疫源
として十分な純度のウシ胎盤由来アルカリフォスファタ
ーゼが得られた。

【００４２】

【実施例３：抗ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ
抗血清の作製】ウサギ免疫により抗血清の作製を行っ
た。ウサギは体重２．０Ｋｇの雌を用いた。１回の投与
免疫源としては、実施例２で作製したウシ胎盤由来アル
カリフォスファターゼ精製品０．５ｍｇをフロイント・
コンプリートアジュバントと等量混合し、完全にＷａｔ
ｅｒ ｉｎ ｏｉｌ状にしたものを用いた。投与は１把
につき４回行い、その血清が免疫源と反応することをオ
クタロニー法により確認した後、全採血を行い、それを
抗血清とした。

【００４３】

【実施例４：抗血清の精製】抗血清２０ｍｌに硫酸ナト
リウム（無水）３．６ｇを添加し、硫安分画処理を行っ
た。得られた沈殿は、１．５Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎａ
ＯＨ，３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）で溶解し、溶解液
を遠心分離処理し、上清をフィルターろ過した。これを
ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファ
ルマシア社製）カラムを用いて抗体の精製を行った。得
られた抗体画分はＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄ
Ｓａｌｉｎｅ（以下ＰＢＳ（−）と記す）に緩衝液交
換を行い、抗体濃度は２８０ｎｍの吸光度から濃度（ｍ
ｇ／ｍｌ）＝１．４×（吸光度）として算出した。

【００４４】

【実施例５：抗血清抗体の特異性確認試験１】精製処理
を行った抗血清（以下は精製抗体とする）の特異性を確
認するために、ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ
との反応性について実験を行った。実験は以下の手順に
従って実施した。

【００４５】 精製抗体をＰＢＳで２０μｇ／ｍｌに
調製し、プレート（免疫測定用）に０．１ｍｌ／穴で分
注し、抗体を固相化させた。 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．９％ ＮａＣｌ
溶液でプレート洗浄を行った。 ０．５％エッグアルブミン／ＰＢＳをプレートに
０．３ｍｌ／穴で分注し、ブロッキングを行った。 ブロッキング液を除去した。 サンプルとして免疫源として使用したウシ胎盤由来
アルカリフォスファターゼの希釈列を作製し、０．１ｍ
ｌ／穴で分注し、固相化抗体と室温で２時間反応させ
た。 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．９％ ＮａＣｌ
溶液でプレート洗浄を行った。 ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを含む発色
液を０．１ｍｌ／穴で分注し、発色させた後、反応を酸
により停止させた。 プレートリーダーで４０５ｎｍ（リファレンス：５
９５ｎｍ）の吸光度を測定した。以上の実験から固相化
した精製抗体とウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ
は、濃度依存的に反応することが確認された。またこの
精製抗体は、ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼの
酵素活性を強く阻害しないことも判明した。下記表２に
測定値を示す。

【００４６】

【００４７】

【実施例６：標識精製抗体の作製】マイクロプレートを
用いたエンザイムイムノアッセイなどの免疫測定を行う
ためにビオチンで標識した精製抗体の作製を行った。作
製は以下の手順に従って実施した。

【００４８】 精製抗体約２．６ｍｇを０．１Ｍ Ｎ
ａＣＯ₃／０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）で緩衝液
交換し、最終的に０．５ｍｌにした。 Ｂｉｏｔｉｎ −Ｏｓｕ（同仁化学研究所製、化学
名Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｄ−ｂｉｏｔｉｎ）
３．４ｍｇをジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）０．
１ｍｌに溶解して、１００ｍＭビオチン溶液を調製し
た。 スターラーで攪拌しながら精製抗体０．５ｍｌにビ
オチン溶液をすばやく加えた。 スターラーでよく混和攪拌しながら、２５℃で４時
間反応させた。 ０．２２μｍフィルターろ過後、ＰＢＳ（−）に緩
衝液交換し、最終的に抗体濃度として１ｍｇ／ｍｌにな
るように調製した。

【００４９】

【実施例７：精製抗体の特異性確認試験２】抗血清から
得られた精製抗体の特異性を確認するために、ウシ腸由
来アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）とヒト胎盤
由来アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）との交差
反応性についてサンドイッチ法による免疫測定により検
討した。実験は以下の手順に従って実施した。

【００５０】a. 精製抗体をＰＢＳで２０μｇ／ｍｌに
調製し、プレート（免疫測定用）に０．１ｍｌ／穴で分
注し、抗体を固相化させた。 b. ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．９％ ＮａＣｌ
溶液でプレート洗浄を行った。 c. ０．５％エッグアルブミン／ＰＢＳをプレートに
０．３ｍｌ／穴で分注し、ブロッキングを行った。 d. ブロッキング液を除去した。 e. サンプルとしてウシ胎盤由来アルカリフォスファタ
ーゼ（ＢＰ）、ウシ腸由来アルカリフォスファターゼ
（ＢＩ）及びヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼ
（ＨＰ）の希釈列を作製し、０．１ｍｌ／穴で分注し、
固相化抗体と室温で２時間反応させた。 f. ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．９％ ＮａＣｌ
溶液でプレート洗浄を行った。 g. ビオチン標識精製抗体を０．５％エッグアルブミン
／ＰＢＳ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製し、０．１ｍｌ／
穴で分注し、室温で１時間反応させた。 h. ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．９％ ＮａＣｌ
溶液でプレート洗浄を行った。 i. 市販ぺルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニ
チレイ製）を０．５％エッグアルブミン／ＰＢＳ溶液で
１０倍に調製し、０．１ｍｌ／穴で分注し、室温で３０
分反応させた。 j. ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．９％ ＮａＣｌ
溶液でプレート洗浄を行った。 k. ３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン（Ｔ
ＭＢ）を含む発色液（ＤＡＫＯ社製）を０．１ｍｌ／穴
で分注し、室温で１０分前後反応させた。 l. 反応停止液として３Ｍリン酸を０．０５ｍｌ／穴で
分注し、プレートミキサーにより攪拌し、反応を停止さ
せる。 m. プレートリーダーにより４５０ｎｍ（リファレン
ス：６５５ｎｍ）の差吸光度を測定した。

【００５１】得られた結果を表３に示した。その結果か
ら明らかなように、以上の実験より、本精製抗体はヒト
胎盤由来ＡＬＰ（ＨＰ）と全く交差反応をしないことが
確認され、また、その測定結果から、ウシ胎盤由来ＡＬ
Ｐ（ＢＰ）に対する抗体はウシ腸由来ＡＬＰ（ＢＩ）と
ヒト胎盤由来ＡＬＰ（ＨＰ）とは充分に反応しないこと
から、これらのＡＬＰは免疫学的にも異なることが確認
された。なお、活性値（ＫＡＵ）はサンプルのＡＬＰ活
性値を示し、測定値は４５０ｎｍ（リファレンス：６５
５ｎｍ）の吸光度を示した。

【００５２】

【００５３】

【実施例８：ウシ胎盤抽出液成分の検出感度に関する検
討】実施例７で用いたサンドイッチ法による免疫測定系
のウシ胎盤抽出液成分検出濃度について検討を行った。
実験は、標準品として精製されたウシ胎盤由来アルカリ
フォスファターゼの希釈列（５〜２００ｎｇ／ｍｌ）を
作製し、測定した。さらにニチレイ・水溶性プラセンタ
エキス（ロット番号Ｐ９０９）の０．１％水溶液を希釈
剤（０．５％エッグアルブミン／ＰＢＳ）で４倍希釈
し、測定した。測定方法は実施例７とサンプルが異なる
だけで他の工程は同一である。

【００５４】標準品は６重測定を行い、それらの平均値
と標準偏差を下記表４に示した（図３参照）。この結果
から、本発明による測定系によって、ウシ胎盤由来アル
カリフォスファターゼは５ｎｇ／ｍｌまで十分に測定可
能であることが判明した。また０．１％濃度のニチレイ
・水溶性プラセンタエキス（ロットＰ９０９）の５重測
定の結果から、プラセンタエキス中のウシ胎盤由来アル
カリフォスファターゼ濃度も再現性良く測定することが
可能であった。これらのことからプラセンタエキスを
０．１％配合した化粧品製剤を２０倍希釈しても、本測
定系ではプラセンタエキス成分であるウシ胎盤由来アル
カリフォスファターゼを十分に検出可能であることが判
明した。

【００５５】

【００５６】

【実施例９：化粧品製剤中からのプラセンタエキス成分
の検出】化粧品製剤中からのプラセンタエキス成分の検
出について検討を行った。化粧品製剤で最も検出が困難
であると考えられる製剤は、ミルクあるいはクリーム等
の乳化された製剤である。この乳化製剤には、界面活性
剤が使用されており、これはタンパク質と親和性を有す
るため免疫測定においては妨害物質として作用する可能
性が高い。そのため我々は、プラセンタエキスを０．１
％配合した化粧品製剤（製剤、）を試作し、その製
剤中からのプラセンタエキス成分の検出を試みた。化粧
品製剤の組成表を以下の表５に示す。

【００５７】

【００５８】測定は、化粧品製剤サンプルを希釈剤
（０．５％エッグアルブミン／ＰＢＳ）により４倍希釈
し、そのままサンプルとして使用した。測定方法は実施
例７と同じ方法で行い、標準品（５〜２００ｎｇ／ｍ
ｌ）と４倍希釈した０．１％濃度ニチレイ・水溶性プラ
センタエキスを同時に測定し、その標準曲線から化粧品
製剤中のウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ濃度を
求めた。

【００５９】測定結果を以下の表６に示す。なお、＊実
濃度及び＊＊実測含有率（％）は、それぞれ、次のこと
を表わす。 ＊実濃度（ｎｇ／ｍｌ）：測定値×４（希釈倍率） ＊＊実測含有率（％）：（製剤中の濃度／０．１％プラ
センタエキス中の濃度）×１００

【００６０】

【００６１】以上の測定結果から、本測定方法によって
化粧品製剤中からプラセンタエキス成分であるウシ胎盤
由来アルカリフォスファターゼが十分に検出できること
が判明した。実測含有率が１００％より低値であること
は種々の検討が必要であるが、製剤中の他の妨害成分の
可能性より、タンパク質濃度が非常に希薄な製剤である
ため、タンパク質であるアルカリフォスファターゼの容
器への吸着作用等が考えられる。しかし、製剤中に存在
することの確認試験としては十分であると考えられた。

【００６２】

【発明の効果】本発明のウシ胎盤由来成分を検出する方
法は、化粧品製剤等よりウシ胎盤に特徴的に存在するウ
シ胎盤由来アルカリフォスファターゼを検出することに
より、従来化粧品製剤から検出できなかったウシ胎盤由
来成分の検出・確認試験を可能にするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１の結果を示す図である。

【図２】本発明の実施例２の結果を示す電気泳動パター
ンの図面代用写真である。

【図３】本発明の実施例８の結果を示す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼ
   を指標として検出すること、を特徴とする試料中のウシ
   胎盤由来成分を検出する方法。
2. 【請求項２】 抗ウシ胎盤由来アルカリフォスファター
   ゼ抗体を使用してウシ胎盤由来アルカリフォスファター
   ゼを検出すること、を特徴とする請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 抗ウシ胎盤由来アルカリフォスファター
   ゼ抗体が、ウシ腸由来アルカリフォスファターゼ及びヒ
   ト胎盤由来アルカリフォスファターゼとは化学的に相違
   するウシ胎盤由来アルカリフォスファターゼを精製し、
   これを抗原として作製された抗体であること、を特徴と
   する請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 抗ウシ胎盤由来アルカリフォスファター
   ゼ抗体を標識化した標識化抗ウシ胎盤由来アルカリフォ
   スファターゼ抗体を検出試薬としてウシ胎盤由来アルカ
   リフォスファターゼを検出すること、を特徴とする請求
   項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 試料が化粧品、医薬部外品、医薬品、飲
   食品、その他の製剤から選ばれる少なくともひとつであ
   ること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記
   載の方法。
6. 【請求項６】 ウシ胎盤由来成分がウシ胎盤抽出液又は
   その処理物（濃縮物、ペースト化物、乾燥物、乳化物、
   希釈物の少なくともひとつ）であること、を特徴とする
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 抗ウシ胎盤由来アルカリフォスファター
   ゼ抗体を含有すること、を特徴とするウシ胎盤由来成分
   検出用キット。