JPS585661A - 前立腺酸ホスフアタ−ゼアイソザイムの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酸ホスファターゼ線条くのアイソザイムを含む不均一な
一群の酵素でＴｏ夛、各アイソザイムは一種の組織に特
異性を有する。この組織特異性の結果として、血清中の
組織特異性アイソザイムの定食は、その組織の異常の同
定に役立つ。前立腺癌に伴って血清中の前立腺酸ホスフ
ェ−）　（ｐｒｏａｍｔｔｃａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅｓ　）　（Ｐ　Ａ　Ｐ　）アイソデイム議度の上昇
をみることについて紘多くの報告がある（　Ｒ，Ｍ、　
Ｔｏｖｎａｅｎｄ　：　Ａｎｎ、　Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ
、　８ｃｉ、　７　（５）Ｃ２５４−２６１、Ｍａｙ−
Ｊｕｎｅ、　１９７７　）。

しかしながら、血清中のＰＡＰアイソデイム鎖度の定量
は、前立腺以外の臓器組織からの他の酸ホスファターゼ
の存在の丸めに複雑である。実際。

甲状腺以外の酸ホスファターゼが通常、血清中にかなシ
の濃度存在する（　Ｌｌ、　Ｃ，ら：　：ｆ＊　Ｌａｂ
−Ｃ１１ｎ、Ｍ＠１．８２：４４６−４６０（１９７３
））。

し九がって、各種起源の酸ホスファターゼの中から、Ｐ
ＡＰアイソデイムにだけ％異的な定量方法が要求される
。

血清中ＰＡＰ量の測定はこれまでＰＡＰＫ％異的な基質
、ＰＡＰの化学的阻害という方向に向けられてきた。し
かしながら、特異的基質や阻害剤といっても大部分、Ｐ
ＡＰ以外のアイソザイムとも反応するので、このような
アプローチ拡必ずしも満足できるものではなかった。し
たがって、これまでの方法でａ、　Ｃ４まった陽性また
紘陰性の試験結果を与え、不適当な治療を招く可能性が
高かつ九。

ＰＡＰの免疫学的定量方法もいくつか報告されている。

Ｃｈｏａ、　Ｂ、Ｋａら（Ｐｒｏｃ、　Ｂｏａ、　Ｅｘ
ｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、１６２：３９６−４００（１９７９））は酵素
活性ならびに硫酸アンモニウム沈殿抗原−抗体複合体中
のλ２８工標識ＰＡＰの放射活性を測定する定量システ
ムを報告している。この方法によｊ９．ＰＡＰは硫酸ア
ンモニウム沈殿抗原−抗体禎合体の測定によシ定量され
る。しかしながら、この方法では、硫酸アンモニウム沈
殿の非特異的性質によシ、酸ホスファターゼからの高い
パックグラウンドがある。

ヒトアルカリホスファターぜの各臓器Ｉ！＃異性アイソ
デイムの定量において、他のアイソザイムからの妨害の
問題を解決する試みに、二重抗体免疫酵素定量法が報告
されている（　Ｓｕｓａｍａｎら：Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、　２４５　：　１６０　（１９
６８）　ｓ　（１！ｈｏｅら：　Ｃ１ｌ！１．　Ｃｈｅ
ｍ、２６　：　１８５４−１８５９（１９８０））。い
ずれの場合も、所望のアイソザイムに特異的な抗体を試
験サンプルと反応させ、次の工程で抗体−アイソデイム
複合体を第二の可溶性抗体（抗μｍグロブリン）と反応
させる。遠心分離したのち、沈殿について残ったアイソ
デイム活性を測定する。

Ｓｕｓｓｍａｎ、　Ｃｈｏｅの方法の順に正確になるが
この場合拡第二の可溶性抗体を抗体−アイソデイム複合
体と、定量すべきアイソザイムが完全に沈殿するように
反応させる必要がある。この反応は、温度、−、イオン
強度、時間、タンパク濃度等のような因子に依存する。

これらの因子を定量操作においてコントロールすること
は困難であり、８ｕｓｓｍａｎ　’ｐ　Ｃｈｏｅの方法
には、特異的なアイソザイムの正確な定量という点では
限界がある。

本発明は生物学的液体サンプル中のＰＡＰアイソデイム
量を免疫化学的に測定する方法に関する。

血清ＰＡＰアイソデイム濃度の上昇は前立腺癌の存在を
示すものである。

本発明の免疫化学的方法では、二重抗体免疫酵素定量法
を採用する。抗体のひとつは抗体とアミロースの反応生
成物として不溶′化し九抗体である。

本発明の方法によれば試験サンプルを、サンプルのアイ
ソディふと選択的に免疫学的に結合する第一の抗体、お
よび第一の抗体と選択的に免疫学的に結合する第二の不
溶化抗体とインキエペートする。免疫学的反応によって
不溶性の免疫複合体が生成し、これは容易に単離できる
。免疫複合体を単離し、それに含まれるアイソデイム活
性を測定する。

免疫グロブリン（ＩｇＧ　）　、酵素などのタンパクが
固体支持体アミロースに結合し、免疫吸着体として使用
できるＩｇ（）−アミロースのような不溶化タンパクを
生成することが明らかにされた。たとえばＩｇＧのよう
なタンパクをアンローとの反応で不溶化すると他の固体
支持体で不溶化したタンパクよシも利点のあることも明
らかにされ九。とくにＩｇＧ−アミロースの生成は簡単
な反応で行われるので有利である。アミロースｄ　Ｉｇ
Ｇの結合のために大きな表面積を提供し、またＩＪｇ（
）−アミロースの反応生成物は低速の遠心分離で容易に
分離できるが、免疫学的定量のための反応が完結するに
十分な時間、懸濁状態に維持される。

本発明の方法は、きわめて特異的、迅速、高度に！Ｅ確
、再現性を有するという点で従来方法よシはるかに優れ
ていて、非前立腺アイソデイムを含む血清からＰＡＰア
インデイムをＩＦ＃＾的に単離し、単一されたＰ人Ｐア
イソデイム量を特異的に定量できる。

本発明の方法は、とくに、生成した反応混合物の免疫複
合体が速やかに沈殿し、アイソデイム活性の一定に利用
できる点が有利である。さらに、免疫複合体を生じる反
応混合物は、温度、・−、イオン強度、時間、タンパク
濃度等の因子に無関係である。これらの因子がないので
、本発明ではそれが原因となる誤差がなく、Ｆｉ、るか
に正確にアイソザイムの特異量を定量できる。

本発明の方法では試験サンプルとして任意の生物学的液
体、たとえばヒトおよび動物の全血、血Ｗ１％血清、リ
ンパ液、胆汁、尿、を髄液、痰、汗ならびに糞が使用で
きる。ま次、ヒトおよび動物の組織、九とえば骨格筋、
心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄、皮膚等からの液体プレバ
レージョンを用いることも可能である。生物学的液体が
好ましい。

本発明の試験テンプルとしてとくに好ましい生物学的液
体はヒト血清である。

本発明は詳しくは他の非前立腺アイソデイムまたは他の
タンパク性物質を含むこともある生物学的液体中のＰＡ
Ｐアイソデイム量を定量する方法に関する０本発明の方
法は問題の特異的ＰＡＰアイソデイムを単離し、ついで
単離ＰＡＰアインデイムの酵素活性を測定するものであ
る。

ＰＡＰアインデイムの単離は２種の異なる抗体を用いる
ことによル達成される。すなわち生物学的液体と第一の
抗体および第二の抗体を反応混合物中で反応させ、つい
で反応混合物からＰＡＰアインデ・イムな含む免疫複合
体を分離する。

本発明における第一の抗体は、反応混合物中に溶解し、
ＰＡＰアイソデイムの酵素活性を阻害することなくＰＡ
Ｐアイソ？イムに選択的に結合する任意の抗体である。

第一の抗体は、動物に抗原として精製ＰＡＰアイソデイ
ムを注射し、動物から採血して抗体を含む血清を得るこ
とによシ、常法で製造できる。ＰＡＰアイソデイムの精
製および精製ＰＡＰアイソデイムを抗原として動物に注
射し、第一抗体を含む抗ＰＡＰ血清を得るには公知の任
意の常法を利用できる。抗ＰＡＰ血清紘精製する必要は
なく、本発明の方法にそのまま使用できる。精製ＰＡＰ
アインデイムを用いて得た抗ＰＡＰ血清は、前立腺組織
以外の組織からの酸ホスファターゼとは反応せず、ＰＡ
Ｐアインデイムと免疫学的に結合してもその酵素活性は
阻害されない、抗ＰＡＰ血清に含まれる第一の抗体は試
験サンプルのＰＡＰアイソデイムのみと免疫学的に特異
的に結合し、しかも同時１ｃＰＡＰアイノデイムの酵素
活性には影響しないということである。

第一の抗体を生じさせるために抗原として用いたＰＡＰ
アイソデイムは、適当な生物学的液体たとえば前立腺液
、血清または生物学的に新鮮な適当な甲状腺組織から得
ることができる。このアイソザイムの好ましい原料拡動
物の前立腺液または組織であシ、とくにヒ）ＩＩＩ立腺
液腺液は組織が好ましい。

第一の抗体を生じさせるためのＰＡＰアイソデイムの高
純度への精製は、非特異的抗体の生成を抑えるためにと
くに重要である。ＰＡＰアイソデイム紘このような目的
で本技術分野において認められた任意慣用の精製方法で
精製できる。好ましい精製方法としては、常用技術、九
とえば親和性クロマトグラフィーや電気泳動がある。

第一の抗体を生じさせるために用いるＰＡＰアイソデイ
ムの純度ならびに生成した抗体の特異性は本技術分野で
最近用いられている方法、たとえば免疫拡散や電気泳動
によって測定できる。ＰＡＰアイソデイムの純度を測定
するのに好ましい方法はアクリルアミドグル電気泳動で
ある。

第一の抗体は本技術分野で用いられている任意の動物に
産生させることができる。とくにを椎動匍、たとえばブ
タ、ウシ、イヌ、ロバ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ラット等
である。ロバ、ヒツジおよびヤギが好ましい。とくに好
ましい動物はヤギである。

本発明の好ましい態様によれば、第一の抗体唸第−の動
物種としてヤギに、ヒト前立腺組織から得た精製ＰＡＰ
アイソデイムによシ、慣用の免疫技術で免疫処置して産
生させ、第一の抗体、ヤイ抗−ＰＡＰを得る。

試験サンプル中に用いられる第一の抗体の量は、サンプ
ル中のＰＡＰアイソデイムに結合するのに十分な量であ
る。第一の抗体は、ＰＡＰアインデイムに結合するのに
必要な量よシ過剰にサンプル中に加えると最善の結果が
得られる。各サンプルに必要な抗体量の算出は本技術分
野でよく知られた方法にしたがって実施できる。

第一の抗体を添加したのち、試験サンプルに不溶化した
第二の抗体を加える。第一の抗体添加後第二の抗体を加
えるまでの時間にはとくに制限線ないが、第一の抗体添
加後少なくとも１５分おいて不溶化した第二の抗体を加
えるのが好ましい。

本発明によれば、第二の抗体をアミロースにアンド結合
させて不溶化した第二の抗体を用いる。

不溶化された第二の抗体中の第二の抗体は、第一の抗体
に結合したアイソザイムの酵素活性を阻害することなく
第一の抗体に選択的に結合する任意の抗体が使用できる
。不溶化された第二の抗体中の第二の抗体量、第一の抗
体の生産に用いた動物種以外の任意の動物に、本技術分
野でよく知られた任意の方法を轡いて産生させる。すな
わち、第二の抗体は、特異的な第一の抗体を産生させた
動物以外の動物を、第一の抗体の調製に用いた宿主動物
の血液から得たｒ−グロブリンで免疫処置して製造され
る。第二の抗体は第一の抗体に対して免疫反応性を有し
、複合体を形成する。

不溶化された第二の抗体を生成するのに用いられるアミ
ロースはＤ−グルー−スのホモポリマーである。アミロ
ース中のＤ−ゲルコピ２ノース単位はほぼ（１−４）α
−グリコシド結合をとっている。アミロースの分子量は
アミロースの原料によって異なるが、平均分子量は約１
００．０００から約１，１０肌０００である。

本発明の方法においては、任意の起源の任意の公知の分
子量のアミロースが使用でき、抗体とアミロースの反応
生成物を与える。抗体とアミロースの反応生成物を製造
する前に、所望によシ、アミロースを任意の慣用方法で
精製してもよい、しかしながら、純度には制限はない、
純度５０％から１００％のアミ四−スな用いるのが好ま
しい。

第二の抗体を九社他のタンパクをアミン結合を軽てアミ
ロースに結合させ、不溶化させた第二の抗体を生成させ
る方法は、ポリサッカライドをタンパクに結合させる任
意の方法によることができる。

本発明の好ましい態様では、第二の抗体または他のタン
パクを活性化アミロースに、慣用のシッフの塩基反応を
用いて結合させる（　Ｇｕｔｈｒｌｅ、　Ｒ。

Ｄ、　：　Ａｄｖ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈ
ｅｍ、　１６　：　１０１　＋１９６１）。

好ましい方法によれば、複数個のＤ−グルコざラノース
単位を含むアミロースを、α−１，４−結合グルコース
単位を酸化してアミロース−ジアルデヒドを与る酸化剤
、たとえば過ヨウ素酸ナトリウム（Ｎ１１ＩＯ４）で活
性化する。生成したアミロース−ジアルデヒドを次に、
添化した第二の抗体またはタンパクの一級アミノ基と反
応させて、シックの塩基またはアルジミンを生成させる
。このシッフの塩基を還元剤と反応させると、タンパク
とアミロースの間に一級アミノ結合が生成する。この反
応に用いられる慣用の還元剤の中では、一般的に、水素
化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）のような還元剤の使
用が好ましい、第二の抗体−アミロース生成物の製造操
作は、以下の反応式で示すことができる。反応式中のｎ
　ＦｉＤ−ゲルコピ２ノース単位が複数個存在すること
を示している。

アミロース／タンパク結合の反応式 不溶化された抗体の形成には、前述の方法で抗体をアミ
ロースと反応させて、抗体をアミン結合を介してアミロ
ースに結合させる。不溶化された抗体の製造に際しての
アミリースと抗体の量には制限はない、しかしながら、
一般には、抗体１重量部に対してアミロース約１〜約２
００重量部である。使用する抗体１重量部に対してアミ
ロース約８〜約２０１量部が好ましい。

本発明によれは、第二の抗体添加ＩＫ免疫複合体が生成
すれば、その免疫複合体は本技術分野で公知の任意の方
法によって、サンプル溶液または混合物から分離でき、
生じた沈殿のＰＡＰＷ＃素活性を測定すればよい。本発
明においては、酵素活性を測定するの紘沈殿についてで
ある。

サンプル溶液から沈殿を分離するのに利用でする慣用方
法中、通常の一過およびクロマトグラフィーが好ましい
。サンプル溶液から沈殿を分離するのにとくに好ましい
方法紘遠心分離し、ついで上澄液を傾瀉する方法で、沈
殿について測定を行えにサンゾル中ｃｔｐＡｐｔｔ定量
できる。

試験サンプルから単離され１ｐＡｐアイソデイムの活性
の測定は本技術分野でよく知られた慣用方法によって行
われる。この種の方法としては、たとえば＠Ｍｅｔｈｏ
ｄｅｎ　ｄｅｒ、　ａｎｚｙｍａｔｉａｃｈｅｎ　Ａｎ
ａｌｙｓｅ″。

Ｂ＠ｒｇｍｓｙｅｒ、　Ｈ，Ｕ、編、第６版（１９７４
）、第１巻、１４５頁以下に記載の比色法、ならびに螢
光法がある。

本発明はまた。生物学的液体中のＰＡＰアイソデイムの
存在を定量的に測定す、る診断用試験キットシステムに
関する。試験キットの構成は、（ａ）ＰＡＰアイソデイ
ムと選択的に免疫学的に結合できる抗体を含有する第一
の容器、（ｂ）第一の容器中に含有される抗体と選択的
に免疫学的に結合で−きる第二の抗体をアミロースに結
合させて形成した不溶性抗体を含有する第二の容器、お
よびＣ）ＰＡＰアイソデイムの酵素活性を定量できる基
質試薬である。

診断試験キットシステムの全成分を本発明の方法にし九
がって用いると、非前立腺アインデイムを含む生物学的
液体サンプル中のＰＡＰアイソデイムの酵素活性が、本
技術分野の熟練者によル答易に定量できる。試験キット
は、生物学的液体サンプル中のＰＡＰアイソデイム量の
定量を必要とする診療所、病院、検査室、開業医に適し
ている。

次に本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する
が、これは本発明の範囲および精神を限定するものでは
ない。

Ａ）凍結ヒト前立腺組織１００ｇを０．０５Ｍエチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と０．０１重量％の’Ｉ’
ｖｒｅｅｎ　８Ｑを含むホモジネート溶液中に４℃で加
える。凍結した組織をホモジネート溶液中で約０↓５時
間解凍する。解凍後、塊がなくなるまでゾレンダー中で
ホモジナイズする。ホモジナイズは水浴中の混合物を２
０秒以下で処理して行う。

得られ九ホモジネートを一夜４℃で攪拌する。この混合
物を４℃、１６，５００Ｘ＃で１時間遠心分離する。得
られた上澄液約２４０−を３回、０．９％Ｎａツ含有の
０．００５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液−６，３で（各
ｄ４．ＯＪ）透析する。透析液ははじめの容量約２４０
゛−から約２６０−に増加する。

得られ友透析物を１０００ｉｄの凍結乾燥フラスコにと
り、ドライアイス−アセトンで急速に凍結して凍結乾燥
の準備をし、−夜で凍結乾燥する。

得られた凍結乾燥物質を０．９％Ｎａツ含有０．００５
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，３）　２０ＷＬｔ
−ｅ再生し、これを以下ＯＢ）に使用する。

Ｂ）ＬＫＢカラムに上述の緩衝液中であらかじめ膨潤さ
せたＣｏｎ−Ａ　８ｅｐｈａｒｏａｅ　４　Ｂ　？’ル
を充填し、ついで液を流さないでカラム中にｒルを沈積
させる。得られた充填カラムを上述の緩衝液的４００−
で洗浄する。

上記入）の再生液を上に調製したＬＫＢカラム上に置く
。カラムに置いたのち、約３時間カラム上に放置し、つ
いで上述の緩衝液８００１１１７を４０．０−７時の速
さで通過させる。次に０．００５　Ｍ　！ｊン酸す）　
ＩＪウムと０．９％ＮａＣＪの緩衝液−６，３中で別個
にｗ４製し、活性炭を通してＦ遇した０、０〜０．３Ｍ
マンノース勾配５００−をＬＫＢカラムに通じ、流速４
Ｑ、Ｑｄ／時で１０．０１１ｊずつの分画を集める（計
５０個の分画な集める）。次に１．０　Ｍマンノース５
００１Ｌｌｔｒ、ｘＢ力２ムに通し、同様にして計５０
個の分画を集める。得られた分画すべてについて、タン
パクおよびＰＡＰ活性を試験した。比活性≧２０００シ
グマ単位／ＷｇタンパクのＰＡＰ活性を含む分画をプー
ルし、０．００５Ｍリン酸ナトリウムと０．９％ＮａＣ
Ｊの緩衝液−６，６に対して透析し、　Ａｍ１ｃｏｎｐ
過装置を用いて濃縮すると、以下のりに使用する濃縮透
析液４．０１１７が得られる。

Ｃ）　　Ｂｆｉｃｈｌａｒの製造システムを用いて７．
５％アクリルアミドｒルを調製する。Ｂｔｌｃｈｌｅｒ
システム用に以下の緩衝液も調製する。システムの上部
緩衝液として０．０１４　Ｍ酢酸中０．０３５　Ｍβ−
７９二ンおよび下部緩衝液および溶出緩衝液として０．
０５６　Ｍ酢酸中Ｏｊ１４Ｍβ−７９＝ｙで＠る。

Ｂ）における濃縮透析液４．０１１７に４０％ｆｆ１ｌ
ｉ１．０１およびメチルグリーン染料３滴を加えて混合
する。この温合物をＢｕｃｈｌｅｒシステムの７．５％
アクリルアミドｒル上に置を、電気泳動を開始する（１
０００ポルト、２００ミリアンペア、約１゛６時間）。

混合物を下部／溶出緩衝液で溶出し、１Ｑ、Ｑｉｕの分
画を集める。得られた分画のＰＡＰおよびタンパク活性
を試−する。ＰＡＰ活性を含む分画をプールし％　０．
０１　Ｍクエン酸緩衝液−６、ＯＫ対し一夜透析し、２
回交換を行うと、ＩＰＩ１２の免疫処置に使用できる高
純度のＰＡＰが得られる。高度に精製されたＰＡＰは一
２０’Ｏで保存できる。

１２ 精製ＰＡＰＫよるヤギの免疫処置での第一の抗体の産生 ヤヤを免疫処置するための免疫原の生成には、９％１１
において得られた０、０１　Ｍクエン酸緩衝液−６，０
中の高純度精製ＰＡＰを同容の完全フロインドアジェパ
ン）　（Ｍ−ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉａ　ｂａｃｉｌ１
１死菌含有鉱油懸濁液）と混合して０．５ダＰＡＰ／１
１１の混合物を得る。得られた混合物をホモジナイズし
、免疫原となる水／油エマルジョンを調製する。ヤヤに
連続３週間連続して、２部位の補助領域に免疫原２１１
１１１各部位ごとに１−１皮下注射する。不完全フロイ
ンドアジュバントの第二次注射は、−次の注射から２週
問おいて行い、さらに数カ月間。

不完全フロイントアジ−パントの第二次注射を１力月ご
とに続ける。免疫処置後１〜２週ごとにヤギを採血し、
抗血清を得る。

皇ｉ ロバ抗ヤイＩｇ（）血清のグロブリン分画の調製アミロ
ースと結合させるのに用いるロバ抗ヤイ、　ＩｇＧ血清
のグロブリン分画は、以下の成分および操作によって調
製する。

項目　　　　　　　成　　　　　　　分　　　　　　　
　量ａ）　市販ロバ抗ヤｆＩｇＧ血清　　　　　　　　
　　　５Ｑ［］Ｍｌｃ）　　ｏ、ｏ　Ｉ　Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ７，４約１４Ｊ操作： ロバ抗ヤイＩｇＧ血清５００ｄを適当な容器に４℃でと
プ、電磁攪拌板上に置く。中等度に攪拌しながら、この
容器に飽和硫酸アンモニウム（ｂ）３００−を徐々に加
え、容器の内容物を３７．５％飽和にする。容器を４℃
で１時間攪拌したのち、沈殿した抗体を、４℃、１２０
０）ｌで３０分間遠心分離し、ペレットとして集める。

ペレットを約３５０１のリン酸塩緩衝液（ｃ）に溶解し
、容量を同じ緩衝液ではじめの容量５００−にする。次
に飽和硫酸アンモニウム（ｂ）２５０１１７を穏やかに
攪拌しながら、４℃で加え、得られた混合−を６３％飽
和にする。

この混合物を４℃で１時間攪拌する。混合物から沈殿し
た抗体を、４℃、１２００Ｘ、！ｉ＋で３０分間遠心分
離するとペレット状となる。このペレットを約２０ロー
のリン酸塩緩衝液に溶解し、透析袋に移し、リン酸塩緩
衝液に対し４℃で透析する。

緩衝液を３回かえ（各回４Ｊ）、各回最低４時間透析す
る。得られた透析液を炭酸塩−１炭酸塩緩衝液け）で１
回４看に透析する。この最終透析液のタンパク濃度はＬ
ｏｗｒｙ法によって定量し、１２呼／−、最終容量８０
０１１１に希釈し、以下の例４で活性化アミロースと容
易に結合するロバ抗ヤイＩｇＧ血清のグロブリン７ラク
シヨンを得る。

豊土 例３の操作で製造したロバ抗ヤイエｇａ血清のグロブリ
ン分画をアミロースに結合させるために、まず、アミロ
ースを以下の工１１１〜１６によって活性化する。

１、アミロース２０ｇを脱イオン水苔５ＱＱｌｌＪを含
む４個の１Ｊ遠沈管にそれぞれとる。添加中および添加
後、電磁攪拌器で攪拌する。脱イオン水を加えて遠沈管
に容量いっばいにする。

２、各遠沈管を室温で１時間攪拌し、アミロースを膨潤
させる。

３、各遠沈管を２５００）ｌで５分間遠心分離して膨潤
アミロースを遠心分離する。

４、各遠沈管の上澄液を傾瀉し、台管のペレットを工程
５に移す。

５、台管に脱イオン水１Ｊを加えて、ペレットを再懸濁
する。

６、工程６．４および５をさらに２回くシ返して、計４
回洗浄する。

入　水にペレットを再懸濁し、−夜室温で水中にペレッ
トを放置し、翌日遠心分離し、傾瀉し、残った最終ペレ
ットを工１１９に移す。

８、メタ過ヨウ素酸ナトリウム２５．６８　Ｆを脱イオ
ン水７００１１７に溶解し、容量を８００−とする。

９、工１ｉ７からの最終ペレットを各管中、工程８で製
造したメタ過ヨウ素酸（０，１５Ｍ）２００−に再懸濁
する。

１０、工程９で再懸濁し九ペレットを室温で２時間、穏
やかに攪拌する。

１１、エチレングリコール（液体＞　４９．６６１を脱
イオン水３００−と混合する。脱イオン水で容量４００
−とする。エチレングリコール添加前に遠心分離しない
。

１２．１程１０で２時間攪拌したのちに、工程１１で調
製した２Ｍエチレングリコールｉｏｏｙを４個の６管に
加え、管の内容物を室温で穏やかに６０分間攪拌する。

。 １６、工程２の遠沈管を５分間、２５００ＸＮで遠心分
離する。６管を傾瀉し、ペレットを分離する。

１４、工ｌ！１３のペレットを別個に、炭酸塩−重炭酸
塩緩衝液（例６の（１）ＩＪに再懸濁し、１５〜６０分
攪拌する。

１５、工程１５および１４をさらに２回〈シ返す。

１６、上澄液を傾瀉し、例３の方法によって製造したロ
バ抗ヤイＩｇＧ血清のグロブリン分画と結合できる活性
化アミロースを含むペレットが得られる。

例５ ０バ抗ヤイＩｇ（）血清のグロブリン分画と活性化アミ
ロースの結合 ロバ抗ヤイＩｇＧ血清のグロブリン分画（例３の方法で
調製）の活性化アミロース（例４の方法で調製）への結
合は、以下の成分および操作によって行われる。

活性化７　ｉ　ｏ−２膨ｆ１４デル４０〇−１（例４） ロバ抗ヤギエｇＧ８００１１１１゜ ２　（例６） リン酸塩緩衝化食塩水　　　　　約２７゜６　　（ＰＢ
Ｓ）ｐＨ７，４ ４水素化ホウ素ナトリウム　　　　　　０．８９５　　
ウシ血清アルブミン　　　　　　　　４．８９６　　ナ
トリウムアジド　　　　　　　　　１．６ｇ操作 １、活性化アミロースの各ペレット（乾燥重量２０ｇ１
例４の方法で調製し、１００−に膨潤）を含む４個の各
遠沈管にロバ抗ヤギｒｇＧ　（例３で調製）１２■／ｌ
ｌｊ％２００１１１１ｊを加え、アミロースとＩｇＧを
結合させる。

２、結合紘攪拌下に５６〜４８時間、室温で行う。

６、管を５分間２５００）ｌで遠心分離する。

４．６管の上澄液のタンパクを２８０の０．Ｄ。

でチェックする。

５、リン酸塩緩衝食塩水８００１１ＪＫ水素化ホウ素ナ
トリウム０．８ｇを加える。

６、アンロース−タンパクを含む工程３の４個の遠沈管
のそれぞれに、水素化ホウ素ナトリウム溶液２００１１
ｊを加える。得られた懸濁液を室温で１時間穏やかに攪
拌する。

７、工程６の懸濁液を攪拌後、得られた６管の還元アミ
ロース−タンパクデルを工程３と同様にして遠心分離し
、上澄液は捨てる。

８．６管のデルをリン酸塩緩衝食塩水で１Ｊとし、再懸
濁し−ｆｉ−グルを室温で１０〜２０分攪拌する。

９６　　攪拌後、））ａルを工程３のようにして遠心分
離する。上澄液を捨て、工程３および９を２回〈ル返す
。

１０、ｉｂれた各管中の４個のアミロース−タンパクペ
レットをそれぞれＰＢ８２００−に再懸濁し、２ぷにな
るまで洗液と交換し、アミ四−スータンパク懸濁液を得
る。

１１、ウシ血清アルブミン４．８ｇおよびナトリウムア
ジド１．６ｇをＰＢ８１ＱＱ−に攪拌下に加える。この
溶液をアミロース−タンパク懸濁液に加える。

１２、アミロース−タンパク懸濁液にＰＢＳを加えて５
％水性懸濁液、最終容量１６００−とする。

例６ 生物学的液体サンプル中のＰＡＰ活性は以下の操作によ
シ定量する。

Ａ）試験血清サンプルまたは対照２００４をピペットで
試験管にとる。水ゾ２ンクとして蒸留水２００４を他の
試験管に加える。例２の方法で得られ九ヤイ抗−ＰＡＰ
血清２０４を６管に加える。得られた混合物を混合した
のち、室温で１５分間インキエベートする。よく攪拌し
たアミｎ−スータンパク懸濁液（例５の方法で調製）２
００超を６管に加える。試験管を混合し、室温で１５分
間インキエベートさせる。０．９％食塩水（蒸留水１０
００−に対し塩化ナトリウム９．０Ｌ）３．ｏＮｌを６
管に加え、管を混合する。６管を１５００）ｌで１０分
間遠心分離し、上澄液を傾瀉して除去すると、以下のＢ
）に用いる同相ペレット含有試験管が得られる。

Ｂ）ＰＡＰ発色基質溶液を、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎチ
モールフタレイン七ノリン酸エステルナトノリン酸エス
テルナトリウム１バイアルｊを加えて調製する。フラス
コを靜かにまわして、基質を完全に溶解させる。この基
質溶液は２〜８℃で６０日間、１８〜２６℃で２日間保
存できる。この基質溶液の温度を室温まで上昇させる。

Ａ）の同相ペレットを含む試験管を３７℃の水浴に浸し
、５分間放置平衡化させる。次にＰＡＰ比色基質溶液０
．５ｄを固相ぺＶットを含む各試験管に加える。次に各
試験管を混合し、第一の試験管（サンプル管）Ｋ基質を
添加したのち、６７℃で６０分間インキエベートする。

３０分の終わフに、アルカリ性Ｗｏｒｔｈｉｎｇ−ｔｏ
ｎ溶液を台管に加え、混合し、１５００１’で１０分関
連心分離する。得られた台管の上澄液の吸光度をスペク
トロメーターにより　５９０　ｎｍで測定する。

Ｃ）　　Ｂ）において使用し＋ｐＡｐ発色基質溶液は以
下のようにして製造する。

サンプルまたは対照中のＰＡＰ濃度を知るには慣用のＷ
ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎチモールフタレイン希釈液を調製
して標準曲線を作る。血清サンプルまたは対照の吸光度
から水ブランクの吸光度を差引き、補正した吸光度によ
って標準曲線からＰＡＰの濃度を読む。

代理人　　浅　村　　　皓 手続補正書（自制 昭和５７年８月１ｂ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１０７５１９　　号−２、発明の名
称 前立腺酸ホスファターゼアイソデイムの定量方法３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和　　年　　月　　日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物学的液体サンプル中の前立腺酸ホスファター
   ゼアインデイムを定量するにめたシｓ　”）サンプルを
   （１）本アイノデイムの酵素活性を阻害することなくサ
   ンプルの本アインデイムを選択的に免疫学的に結合する
   可溶性の第一の抗体および（ｉｔ）本アイソデイムの酵
   素活性を阻害することなく第一の抗体と選択的に免疫学
   的に結合する第二の抗体をアミロースに結合させて形成
   させた不溶化抗体とインキユベートして、アイソデイム
   ー第一の抗体−第二の抗体および第一の抗体−第二の抗
   体を含有する免疫複合体の混合物を沈殿として得ｓ　ｂ
   ）免疫複合体を含む沈殿を単一しｓ　ｃ）沈殿中のアイ
   ソデイム活性を測定することを特徴とする定量、方法 （２）生物学的液体サンプルは血清である特許請求の範
   囲第１項記載の定量方法 （３）纂−の抗体はヤイ抗前立腺酸ホスファターゼであ
   シ第二の抗体はロバ抗ヤギＩｇＧである特許請求の範囲
   第１項および第２項のいずれか一つに記載の定量方法 （４）アイソデイム活性は分光測光法によって測定する
   特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか一つに
   記載の定量方法 （５）分光側光法は比色試薬を用いて行う特許請求の範
   囲第４項記載の定量方法 （６）比色試薬はチモールフタレイン−リン酸エステル
   またはその塩基付加塩である特許請求の範囲第５項記載
   の定量方法 （７）　　生物学的液体サンプル中の前立腺酸ホスファ
   ターゼアイソデイムを定量するための診断試験用キット
   システムにおいて、ａ）本アイソデイムと選択的に免疫
   学的に結合できる抗体を含有する第一の容器、ｂ）第一
   の容器中に含有される抗体と選択的に免疫学的に結合で
   きる第二の抗体をアミロースに結合させて形成させた不
   溶化抗体を含有する第二の容器、およびＣ）本アイソデ
   イムの酵素活性を定量できる試薬からなるキットシステ
   ム（８）　　ア（ン結合を介してアミロースに結合させ
   九タンパクからなる組成物 （９）　　タンパクは免疫グロブリンである特許請求の
   範囲第８項記載の組成物