NO173104B - Monoklonalt antistoff til selektiv immunologisk bestemmelse av intakt prokollagenpeptid (type iii) og prokollagen (type iii), en hybridoma cellelinje som produserer dette antistoff samt et preparat inneholdende antistoffet - Google Patents
Monoklonalt antistoff til selektiv immunologisk bestemmelse av intakt prokollagenpeptid (type iii) og prokollagen (type iii), en hybridoma cellelinje som produserer dette antistoff samt et preparat inneholdende antistoffet Download PDFInfo
- Publication number
- NO173104B NO173104B NO881905A NO881905A NO173104B NO 173104 B NO173104 B NO 173104B NO 881905 A NO881905 A NO 881905A NO 881905 A NO881905 A NO 881905A NO 173104 B NO173104 B NO 173104B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- type iii
- procollagen
- antibody
- cell line
- procollagen peptide
- Prior art date
Links
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 8
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102100030152 Complement C1r subcomponent-like protein Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100326463 Homo sapiens C1RL gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-NQAPHZHOSA-N Sorbitol Polymers OCC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-NQAPHZHOSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Pressure Welding/Diffusion-Bonding (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår et monoklonalt antistoff av klassen IgG til bruk ved selektiv immunologisk bestemmelse av intakt pro-kollagen-peptid (type III) og pro-kollagen (type III) i kroppsvæsker.
Oppfinnelsen angår også en hybridoma cellelinje som produserer et slikt antistoff.
Oppfinnelsen angår til slutt et diagnostisk preparat til fastleggelse av prokollagen peptid (type III)-mengden i kroppsvæsker.
Prokollagenpeptid (type III) er det aminoterminale propeptid av kollagen (type III), som efter spalting av prokollagen (type III )-molekylet avspaltes ekstracellulært. Med en radioimmunologisk bestemmelsesmetode, slik den er omtalt i EP-PS nr. 4940, kan konsentrasjonen av dette prokollagenpeptid bestemmes i kroppsvæsker. Kjennskapet til peptidets serumkonsentrasjon muliggjør uttalelser over aktiviteten av fibrotiske sykdommer, for eksempel av leveren [Rohde, H. et al. "Eur. J. Clin. Invest", 9, 451-459 (1979)].
Den nøyaktige, selektive bestemmelse av prokollagenpeptid (type III) i serum og andre kroppsvæsker er imidlertid ikke mulig med de hittil omtalte metoder, da de polyklonale antistoffer som anvendes i disse metoder, reagerer med forskjellige, i serum forekommende antigener, som delvis er avbygningsprodukter av prokollagenpeptidet (type III) med forskjellig lavere affinitet [Niemelå, 0. et al. "Clin. Chim. Acta" 124, 39-44 (1982)]. Dette fører til at serumfor-tynningskurvene og fortynningskurvene av andre kroppsvæsker ikke er parallelle til justeringskurver som dannes med rent prokollagenpeptid (type III), og derfor må bestemmes av enhver ukjent prøve av antigeninnholdet i flere fortynninger for å fastslå antigenkonsentrasjonen over den 50#-ige snitt av fortynningskurven.
Ved hjelp av fremgangsmåten i EP-PS 0 089 008 er det mulig å løse dette tekniske problem, idet det anvendes antistoffer som for intakt prokollagenpeptid (type III) og dets av-bygningsprodukt Col 1 har sammenlignbar affinitet. Med denne fremgangsmåte bestemmes intakt og degradert prokollagenpeptid (type III) sammen, hvilket imidlertid fører til unøyaktighet i den diagnostiske uttalelse, da normalkollektiv og pasient-kollektiv kan overlappe sterkt.
Overraskende ble det nå funnet et monoklonalt antistoff som ikke reagerer med de i kroppsvæsker forekommende avbygningsprodukter av prokollagenpeptidet (type III). Med dette monoklonale antistoff er det muliggjort en immunologisk bestemmelse av det aminoterminale prokollagenpeptid (type III), hvor dets avbygningsprodukter ikke medomfattes, og som utmerker seg ved at serumfortynningskurver, fortynningskurvene av andre kroppsvæsker og justeringskurven viser komplett parallellitet.
I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse et monoklonalt antistoff av klassen IgG, og dette antistoff karakteriseres ved evnen til å reagere spesifikt med intakt prokollagen (type III), pN-kollagen, inntakt aminoterminalt prokollagenpeptid (type III), dog ikke bindende til Col 1 og nedbrytningsproduktene av det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvekt som Col 1.
I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det monoklonale antistoff PHI 296 produsert av den hybridome cellelinje ECÅCC 87042308.
Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også en hybridoma cellelinje, nemlig den hybridome cellelinje ECACC 87042308, som produserer det ' ovenfor nevnte antistoff, og denne cellelinje karakteriseres ved at cellelinjen er hybridomen ECACC 87042308 og ved at den er dannet ved fusjon av celler fra en myelom cellelinje og av lymfocytter av et på forhånd med prokollagenpeptid (type III) immunisert dyr.
Til slutt angår oppfinnelsen et diagnostisk preparat til fastleggelse av prokollagenpeptid (type III)-mengden i kroppsvæsker, og dette preparat karakteriseres ved at det inneholder det monoklonale antistoff som beskrevet ovenfor sammen med en diagnostisk godtagbar bærer.
Oppfinnelsen forklares detaljert nedenfor, spesielt de foretrukne utførelsesformer.
Til fremstilling av det monoklonale antistoff kan dyr, fortrinnsvis gnagere, som for eksempel mus, rotter, kaniner, marsvin, immuniseres med prokollagenpeptid (type III), som ble isolert efter fremgangsmåten i EP-PS 4940 i nærvær av adjuvans. Fortrinnsvis anvendes mus, spesielt slike av SJL stammen. Med gjentatte sekundærinjeksjoner, for eksempel i avstander på 4 til 8 uker, forsterkes immunresponsen. Resul-tatet av immuniseringen kontrolleres ved bestemmelse av konsentrasjonen av antistoffer i den radioimmunologiske bindingsprøve (R. Timpl og L. Risteli, "Immunochemistry of the extracellular matrix", H. Furthmayr, Ed., vol. 1, 199
(1982)). Noe før fusjonen av lymfocyttene med en myelom cellelinje behandles dyrene med prokollagenpeptid (type III) uten adjuvans. Lymfocytter av dyrene fremstilles og fusjoneres med en myelom cellelinje, som likeledes kan stamme fra en av de ovennevnte dyrearter, fortrinnsvis imidlertid fra mus, spesielt med cellelinjen P3X63AG8.653. Det fusjoneres fordelaktig lymfocytter med myelom cellelinjer av samme arter. Fusjonen og den videre dyrking av celleklonene gjennomføres på en for fagfolk kjent måte, idet konsentrasjonen av det spesifikke antistoff bestemmes i supernatanten av cellekulturen ved hjelp av immunologisk bindingsprøve. Av de ved fusjonen oppnådde cellekloner utvelges egnede kloner for anvendelse i immunologiske fremgangsmåter. Fortrinnsvis arbeides det med en cellelinje som fremstilles ved fusjon av lymfocytter av mus av SJL-stammen mot prokollagenpeptid (type III) med mus-myeolom cellelinjen P3X63ÅG8.653. Denne cellelinje er deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP40JG, U.K. under nummer 87042308.
De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen hører til gruppen av immunoglobuliner, fortrinnsvis til klassen av IgG-, IgA- og IgM-proteiner. Antistoffer av IgG klassen, spesielt av underklassen IgG2B, er spesielt anvendbare. Antistoffet ifølge oppfinnelsen er spesielt overraskende fordi dets affinitet til antigener er høyere enn affiniteten av polyklonale antistoffer. Vanligvis er det motsatte tilfelle. Tydeliggjort blir egenskapene av det monoklonale antistoff ved hjelp av det fra cellelinje ECACC 87042308 fremstilte monoklonale antistoff PIIIP 296, når de i serum tilstedeværende antigener over gelfiltreringskromatografi spaltes efter deres molekylvekt og fraksjonene av kromato-grafien anvendes i radioimmunoanalyse. Derved viser det seg at antigenfraksjonen som medomfåttes ved analyse med polyklonale antistoffer og har molekylvekten av avbygnings-produktet Col 1 ikke omfattes av det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen. På fig. 3 vises elueringsprofilen av gelfiltreringskromatografi av humant serum, slikt det viser det monoklonale antistoff sammenlignet med elueringsprofilen som det har polyklonale antistoffer. Topp 4/4a tilsvarer intakt prokollagen (type III) henholdsvis pN-kollagen (type III) [Rohde H. et al. "Eur. J. Biochem." 135, 197 (1983)]. Topp 5/5a tilsvarer intakt aminoterminalt prokollagenpeptid (type III) (P III P), mens topp 6/6a tilsvarer Col 1 samt avbygningsprodukter av det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvekt som Col 1 [Rohde H. et al. "Eur. J. Biochem." 135, 197 (1983)]. Konsentrasjonen av stoffene i de tilsvarende fraksjoner kan bestemmes ved hjelp av et prokollagenpeptid (type III) justeringskurve.
For fremstillingen av antistoffene ifølge oppfinnelsen er det viktig at en egnet kilde til fremstilling av antigenet står til disposisjon. Som allerede nevnt, isoleres humant eller animalsk, høyrenset prokollagenpeptid (type III) fordelaktig ved fremgangsmåten ifølge EP-PS 4940, idet vev eller patologiske kroppsvæsker avbygges med kollagenase og prokollagenpeptidet separeres fra reaksjonsoppløsningen og renses ved kombinasjon av kromatografiske metoder og/eller immunadsorpsj on.
Det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i forskjellige immunologiske fremgangsmåter, innbefattende alle former av radioimmunoanalyse, for eksempel sekvensielle metningsanalyser eller likevektsanalyser, eventuelt efter markering med kloramin T eller Bolton-Hunter-reagens [Felber, "Meth. Biochem. Anal." 22, 1 (1974), Shelley et al., "Clin. Chem." 19, 146 (1975 )] samt i andre kompetitive og ikke-kompetitive bindingsanalyser, som fluorescens-, enzym-, kjemiluminescens- eller andre imunoanalyser, innbefattende immunoradiometrisk analyse (IRMA). Det monoklonale antistoff kan derfor anvendes i immunologiske fremgangsmåter til isolering og karakterisering samt til kvantitativ bestemmelse av prokollagenpeptid (type III) i vev og kroppsvæsker. Man går fram efter de for fagfolk i og for seg kjente metoder, idet en flytende prøve som inneholder prokollagenpeptid (type III) bringes til reaksjon med det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen enten det er i oppløsning eller på en fast bærer, og mengden av prokollagenpeptid (type III) bestemmes over det dannede antigen-antistoff-kompleks. Derved spiller det ingen rolle om prokollagenpeptid (type III) dessuten er forbundet eller ikke med aminoterminusen av prokollagen (type III). De hittil ved den immunologiske bestemmelse forstyrrende avbygningsprodukter av prokollagenpeptidet (type III), spesielt Col 1, omfattes ikke av antistoffet ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen forklares nærmere i de følgende eksempler, hvor prosentangivelser refererer seg til vekt, dersom intet annet er angitt.
Eksempel 1
Fremstilling av prokollagenpeptid (type III) (P III P): Prokollagenpeptid (type III) fremstilles ved innvirkning av kollagenase på prokollagen (type III) ved 37°C. Herved utsettes peptidet ikke for noen denatureringsmidler. Til fremstilling av større mengder av peptidet anvendes en modifisert fremgangsmåte. Alle fremgangsmåtetrinn inntil innvirkning av kollagenasen gjennomføres i kulderom. De forskjellige NaCl-oppløsninger som anvendes til oppløselig-gjøring inneholder 0,05 M tris-HCl, pH 7,4 0,01 M EDTA, natriumazid (200 mg/ml) og protease-inhibitoren fenylmetyl-sulfonylfluorid (3 jjg/ml) og p-klormercuribenzoat (3 jjg/nk).
Føtal kalvehud (3 kg) homogeniseres i 10 1 1 M NaCl og ekstraheres to dager. Oppløst kollagen felles fra ekstraher-ingsoppløsningen ved tilsetning av fast NaCl inntil en sluttkonsentrasjon på 2,5 M. Efter omrøring natten over samles precipitatet ved sentrifugering (1800 x g, 20 minutter), vaskes to ganger med 2,5 M NaCl og oppløses igjen, idet det omrøres natten over i 10 1 0,5 M NaCl. Mindre mengder uoppløselig material fjernes ved sentrifugering. Den således dannede blanding av kollagen (type III) og prokollagen (type III) felles med 1,6 M NaCl. Precipitatet suspenderes derefter i 2 1 0,5 M tris-HCl (pH 8,0) og oppvarmes efter tilsetning av 0,02 M CaCl2 20 minutter ved 50°C og inkuberes derefter i 3 timer ved 37°C sammen med 1500 U bakteriell kollagenase (CLSPA, Worthington, USA) pr. gram fuktig precipitat. Efter innvirkning av kollagenasen separeres det dannede precipitat ved sentrifugering og oppløsningen dialyseres mot 0,005 M tris-HCl, pH 8, 6,8 M urinstoff og has over en DEAE-cellulosesøyle (5,0 x 30 cm), som ble ekvilibrert med samme kultur.
De på søylen bundne proteiner vaskes ut med NaCl-oppløs-ninger, hvis konsentrasjon øker fra 0 til 0,3 M. Den samlede elueringsmengde utgjør 2 1. Den fra søylen utrennende oppløsning undersøkes med hensyn til adsorpsjonen ved 236 nm og dens antigenaktivitet ved anvendelse av antistoffer som er spesifikke for det aminoterminale segment av prokollagen (type III). Normalt inneholder den siste topp som elueres fra søylen, prokollagenpeptid (type III). Peptidet avsaltes og lyofiliseres ved dialyse mot destillert vann. Den videre rensing foregår på en søyle med agarose A 1,5 M (2 x 120 cm), som er ekvilibrert med 1 M CaCl£, 0,05 M tris-HCl, pH 7,5.
Eksempel 2
Hybridoma produksjon.
Mus av SJL-stammen immuniseres intramuskullært med 5 pg prokollagenpeptid (type III), som ble dannet ifølge eksempel 1, i nærvær av komplett Freunds' Adjuvans. Efter 4 uker og efter 3 måneder forsterkes immunreaksjonen ved en ytterligere intramuskulær injeksjon av 5 pg prokollagenpeptid (type III) i nærvær av ukomplett Freunds' Adjuvans. Tre dager før fusjonen forsterkes immunresponsen ved intraperitoneal injeksjon av ytterligere 50 jjg prokollagenpeptid (type III).
Til fusjonen avlives dyrene og miltcellen isoleres. I nærvær av polyetylenglykol fusjoneres miltcellene med Myelom cellelinjen P3X63AG8.653. Ved kultivering av fusjonsbland-ingen i Hypoxantin-aminopterin-tymidin-mediet over et tidsrom på 2 uker seleksjoneres på miltceller x P3X63AG8.653-hybrider. For oppnåelse av en stabil cellelinje subklones de dannede cellekloner flere ganger. De dannede cellekolonier undersøkes i radioimmunologisk bindingsprøve på antistoffpro-duksjon. Den dannede cellelinje, hvorfra man utvinner det monoklonale antistoff P III P 296, er deponert ved ECACC under nummer 87042308.
Eksempel 3
Radioimmun-bindingsprøve
300 jjI cellekulturoverstående eller annen prøve, for eksempel ascites, efter dyrking av celler i bukhulen av mus, inkuberes med 100 fil av et I-markert prokollagenpeptid (type III) oppløsning, (1 ng protein/100 jjI fremstilt som omtalt i EP-PS 4940, eksempel 1) natten over. De dannede antigen-antistoff-komplekser utfelles ved tilsetning av anti mus IgG serum fra sau eller en annen art. Efter sentrifugering og dekantering av det overstående bestemmes mengden av den precipiterte radioaktivitet i "y-scintillasjonsspektrometer.
Eksempel 4
Radioimmun-prøve.
0,2 ml av prøven som skal analyseres eller prokollagenpeptid (type III)-standarden inkuberes natten ved 4°C med en i forhold til mengden av det markerte antigen begrensende mengde av PIIIP 296 (i 0,1 ml buffer) og 0,1 ml 125 J-markert prokollagenpeptid (type III) (inneholder 1 ng protein). Derefter inkuberes det med en på forhånd utprøvet mengde anti mus IgG serum fra sau i nærvær av 10$ polyetylenglykol (PEG 6000) i 1 time. De felte antigen-anti stoff-komplekser frasentrifugeres (1500 x g) og efter dekantering bestemmes i radioaktiviteten 'y-scintillasjonsspektrometeret.
Ved sammenligning med én justeringskurve, til hvis oppstill-ing det ble anvendt standarder med forskjellige mengder prokollagenpeptid (type III), kan derefter konsentrasjonen av prokollagenpeptid (type III) bestemmes i den ukjente oppløsning. Figur 1 viser justeringskurven (1) og serumfor-tynningskurven (2) med PIIIP 296 (a) sammenlignet med fremgangsmåten ifølge EP 4940 med polyklonale antistoffer (b).
Eksempel 5
Radioaktiv markering av P III P 296.
0,2 ml av en oppløsning med 0,2 mg av det monoklonale P III P 296 i 0,05 M fosfatbuffer pH 7,4 has i et lite polystyrenrør (12 x 55 mm) og hiandes med 100 MBq Na125 J-oppløsning, avbufret med 10 pl 0,5 M fosf atbuf f er pH 7,4. Efter tilsetning av 50 ml av en vandig oppløsning av 20 pg kloramin T blandes 1 minutt. Derefter avsluttes joderingsreaksjonen ved tilsetning av 50 pl av en vandig oppløsning av 20 pg natriumdisulfitt.
Det ikke-omsatte Na^25j separeres derefter fra det 125j_ markerte P III P 296 ved kromatografi på en anionutveksler. De kromatografiske fraksjoner, som inneholdet det opprensede <l25>J-markerte antistoff, fortynnes med en oppløsning av 20 g Tween 20 og 14,6 g Na2EDTA i 1 liter 0,05 M tris-HCl-buffer pH 8, således at konsentrasjonen av det markerte antistoff utgjorde 200 pg/1.
Eksempel 6
Antistoffbelegging av små prøverør.
Til fiksering av antistoffet på små polystyrenprøverør (12 x 75 mm) has i hvert rør 300 pl av en oppløsning av 4 mg monoklonalt P III P pr. liter 0,01 M natriumf osf atbuf f er pH 6,4 og inkuberes natten over ved romtemperatur. Derefter frasuges antistoffoppløsningen. Derefter has i hvert rør 500 pl av en 1^-ig oppløsning av storfeserumalbumin i 0,05 M tris-citratbuffer pH 7,5 og inkuberes natten over ved romtemperatur. Derefter frasuges oppløsningen. De antistoff-belagte smårør tørkes over silikagel.
Eksempel 7
Immunradiometrisk prøve.
0,1 ml av prøven som skal analyseres eller 0,1 ml av prokollagen (type III)-standard inkuberes i små polystyren-prøverør som på forhånd ble belagt med 1,2 pg av det monoklonale P III P 296, under tilsetning av 0,1 ml fosfat-
buffer koksaltoppløsnig (phosphate buffered saline, PBS) ved romtemperatur i 2 timer. Derefter vaskes prøverørene to ganger med hver gang 1 ml PBS og dekanteres. Derefter has 200 pl 125-J-markert monoklonalt P III P-antistoff (inneholder 40 ng antistoff) i rørene og de inkuberes så i timer ved romtemperatur. Radioaktiviteten av de til prøverørveggen bundne antistoff-antigen-<12>^J-antistoffkomplekser bestemmes efter to gangers vasking med hver gang 1 ml PBS og efter-følgende dekantering i scintillasjonsmåleapparat.
Ved sammenligning med en justeringskurve til hvis innstilling det anvendes standarder med forskjellige mengder prokollagenpeptid (type III), kan man så bestemme konsentrasjonen av prokollagenpeptid (type III) i den ukjente prøveoppløsning. Figur 2 viser justeringskurven av den radioimmunometriske analysen (B/T betyr: antistoff bundet/samlet).
Eksempel 8
Bestemmelse av molekylvektsfordeling av de med PIIIP 296 reagerende antigener i humant serum. 1 ml serum oppdeles pr. gelfiltreringskromatografi over en allyldekstran som er fornettet med N-N'-metylenbisacrylamid ["Sephacryl" S 300 søyle (1,6 x 130 cm)], ekvilibrert i "Phosphate buffered Saline" (PBS) med 0,04$ av en ikke-ionisk detergent, eksempelvis et polyetoksylert sorbit-monolaurat (Tween 20), i fraksjoner med 3,3 ml. Hver 0,2 ml av fraksjonene anvendes i radioimmunanalysen ifølge eksempel 4. Figur 3 viser elueringsprofilen av det ved hjelp av PIIIP 296 bestemte antigen sammenlignet til profilen ved hjelp av polyklonalt antistoff bestemt reagens: Topp 4/4a tilsvarer pN kollagen og intakt aminoterminalt
prokollagen (type III)
Topp 5/5a tilsvarer aminoterminalt prokollagenpeptid
(type III)=(P III P)
Topp 6/6a tilsvarer Col 1 samt avbygningsprodukter av det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvekt som Col 1.
Konsentrasjonen av stoffene i de tilsvarende fraksjoner kan bestemmes ved hjelp av et prokollagenpeptid (type III) justeringskurve.
Claims (4)
1.
Monoklonalt antistoff av klassen IgG, karakterisert ved evnen til å reagere spesifikt med intakt prokollagen (type III), pN-kollagen, inntakt aminoterminalt prokollagenpeptid (type III), dog ikke bindende til Col 1 og nedbrytningsproduktene av det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvekt som Col 1.
2.
Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er antistoffet PIIIP 296 produsert av den hybridome cellelinjen ECACC 87042308.
3.
Hybridoma cellelinje som produserer et antistoff ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at cellelinjen er hybridomen ECACC 87042308 og ved at den er dannet ved fusjon av celler fra en myelom cellelinje og av lymfocytter av et på forhånd med prokollagenpeptid (type III) immunisert dyr.
4.
Diagnostisk preparat til fastleggelse av prokollagenpeptid (type III)-mengden i kroppsvæsker, karakterisert ved at det inneholder det monoklonale antistoff ifølge kravene 1 og 2 sammen med en diagnostisk godtagbar bærer.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3714633 | 1987-05-02 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO881905D0 NO881905D0 (no) | 1988-04-29 |
| NO881905L NO881905L (no) | 1988-11-03 |
| NO173104B true NO173104B (no) | 1993-07-19 |
| NO173104C NO173104C (no) | 1993-10-27 |
Family
ID=6326685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO881905A NO173104C (no) | 1987-05-02 | 1988-04-29 | Monoklonalt antistoff til selektiv immunologisk bestemmelse av intakt prokollagenpeptid (type iii) og prokollagen (type iii), en hybridoma cellelinje som produserer dette antistoff samt et preparat inneholdende antistoffet |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0289930B1 (no) |
| JP (1) | JPH07110879B2 (no) |
| AT (1) | ATE89862T1 (no) |
| DE (1) | DE3881275D1 (no) |
| DK (1) | DK169583B1 (no) |
| ES (1) | ES2056850T3 (no) |
| FI (1) | FI96433C (no) |
| IE (1) | IE63371B1 (no) |
| NO (1) | NO173104C (no) |
| PT (1) | PT87376B (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5679583A (en) * | 1987-05-02 | 1997-10-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids |
| GB2208865B (en) * | 1987-08-19 | 1991-12-11 | Farmos Group Ltd | Purified propeptide of procollagen type iii, antibody to the propeptide and assay method using the antibody. |
| US6010862A (en) * | 1987-11-06 | 2000-01-04 | Washington Research Foundation | Methods of detecting collagen type III degradation in vivo |
| DE69915059T2 (de) * | 1998-05-28 | 2004-08-26 | Bayer Healthcare Ag | Monoklonaler antikörper und assay zur bestimmung von n-terminalem prokollagen-propeptid typ iii (piiinp) |
| US6916903B2 (en) | 1998-06-19 | 2005-07-12 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
| US6602980B1 (en) | 1998-06-19 | 2003-08-05 | Washington Research Foundation | Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3209149A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-10-06 | Hoechst Ag | Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum |
-
1988
- 1988-04-27 AT AT88106748T patent/ATE89862T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-27 DE DE8888106748T patent/DE3881275D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 EP EP88106748A patent/EP0289930B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-27 ES ES88106748T patent/ES2056850T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 DK DK232888A patent/DK169583B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-04-28 JP JP63104475A patent/JPH07110879B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 PT PT87376A patent/PT87376B/pt active IP Right Grant
- 1988-04-29 NO NO881905A patent/NO173104C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 FI FI882019A patent/FI96433C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 IE IE129088A patent/IE63371B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE881290L (en) | 1988-11-02 |
| DK169583B1 (da) | 1994-12-12 |
| FI882019A (fi) | 1988-11-03 |
| FI882019A0 (fi) | 1988-04-29 |
| EP0289930B1 (de) | 1993-05-26 |
| FI96433B (fi) | 1996-03-15 |
| DK232888D0 (da) | 1988-04-28 |
| JPH07110879B2 (ja) | 1995-11-29 |
| IE63371B1 (en) | 1995-04-19 |
| NO881905D0 (no) | 1988-04-29 |
| DE3881275D1 (de) | 1993-07-01 |
| NO881905L (no) | 1988-11-03 |
| EP0289930A2 (de) | 1988-11-09 |
| NO173104C (no) | 1993-10-27 |
| FI96433C (fi) | 1996-06-25 |
| ATE89862T1 (de) | 1993-06-15 |
| ES2056850T3 (es) | 1994-10-16 |
| PT87376B (pt) | 1992-08-31 |
| EP0289930A3 (de) | 1991-06-12 |
| DK232888A (da) | 1988-11-03 |
| JPS63296695A (ja) | 1988-12-02 |
| PT87376A (pt) | 1989-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sharp et al. | Characterization of the 1, 4-dihydropyridine receptor using subunit-specific polyclonal antibodies: Evidence for a 32,000-Da subunit | |
| Curtiss et al. | A novel method for generating region-specific monoclonal antibodies to modified proteins. Application to the identification of human glucosylated low density lipoproteins. | |
| EP0699306B1 (en) | Assay for cardiac troponin i | |
| US4312853A (en) | Radioimmunological determination of procollagen (type III) and procollagen peptide (type III) | |
| DK169571B1 (da) | Monoklont antistof, fremgangsmåde til dets fremstilling, hybridomcellelinie, der producerer antistoffet, fremgangsmåder til kvantitativ immunologisk bestemmelse af prokollagen-peptid (type III) med antistoffet, samt diagnostisk præparat indeholdende det monoklonale antistof | |
| Hargrave et al. | Rhodopsin's amino terminus is a principal antigenic site | |
| JP2959837B2 (ja) | 癌関連ハプトグロビン | |
| DK168872B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer til immunologisk bestemmelse af aminoterminalt prokollagen peptid (type III) og/eller prokollagen (type III), antistoffer fremstillet ved fremgangsmåden, anvendelsen af antistofferne til immunologisk bestemmelse af aminoterminalt prokollagen peptid (type III) og/eller prokollagen (type III) og udgangsprodukt til brug ved fremgangsmåden | |
| EP0605410B1 (en) | Immunodiagnostic assay for rheumatoid arthritis | |
| EP0585960A2 (en) | Diagnostic method for autoimmune diseases | |
| DK169583B1 (da) | Monoklont antistof, fremgangsmåde til dets fremstilling, hybridomcellelinie, der producerer antistoffet, fremgangsmåde til kvantitativ immunologisk bestemmelse af prokollagen-peptid (type III) med antistoffet, samt diagnostisk præparat indeholdende det monoklonale antistof | |
| US5679583A (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
| JP3018110B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| CA2155793C (en) | Monoclonal antibiodies for selective immunological determination of high molecular weight, intact laminin forms in body fluids | |
| CA2174559C (en) | Antibody to aminoterminal propeptide of type 1 procollagen, and assay method using it | |
| Banga et al. | Analysis of antigenic determinants of retinal S-antigen with monoclonal antibodies. | |
| Erhard et al. | Production and purification of mouse IgG subclass specific chicken egg yolk antibodies using a new indirect affinity chromatography method with protein G | |
| EP0417298A1 (en) | Detection of human tissue factor activator | |
| CA2115171C (en) | Monoclonal antibodies to human pulmonary surfactant apoprotein d and use thereof | |
| Moore et al. | A radioimmunoassay method for quantification of α-tropomyosin in heart homogenates | |
| Mikami et al. | Studies on immunological assay of vitamin‐K dependent factors. III. A DOUBLE MONOCLONAL IMMUNORADIOMETRIC ASSAY FOR FACTOR IX ANTIGEN | |
| Sipe | Detection of antibodies to the amyloid fibril protein AA by means of the solid-phase radioimmunoassay for AA | |
| JPH05192180A (ja) | 抗腎抗体、それを含有する腎疾患診断薬、腎疾患診断キットおよび腎疾患由来抗原の測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN OCTOBER 2003 |