FI96433C - Monoklonaalisia vasta-aineita intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiivistä, immunologista määritystä varten kehonnesteistä - Google Patents

Description

, 96433

Monoklonaalisia vasta-aineita intaktin prokollageenipep-tidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiivistä, immunologista määritystä varten kehonnesteistä 5 Prokollageenipeptidi (tyyppi III) on kollageenin (tyyppi III) aminoterminaalinen propeptidi, joka prokolla-geeni (tyyppi III) -molekyylin erittymisen jälkeen lohkaistaan solun ulkopuolella pois. Tämän prokollageenipep-tidin konsentraatio ruumiinnesteissä voidaan määrittää 10 sellaisen radioimmunologisen määritysmenetelmän avulla kuin on kuvattu EP-julkaisussa nro 4940. Peptidinkonsent-raation seerumissa tuntemisen perusteella on mahdollista antaa lausuntoja fibroottisten sairauksien, kuten esimerkiksi maksassa esiintyvien fibroottisten sairauksien, ak-15 tiivisuudesta [Rohde, H. et ai., Eur. J. Clin. Invest. 9, 451 - 459 (1979)].

Prokollageenipeptidin (tyyppi III) täsmällinen, selektiivinen määrittäminen seerumista ja muista ruumiinnesteistä ei tähän mennessä kuvatuilla menetelmillä kuiten-20 kaan ole mahdollista, koska polyklonaaliset vasta-aineet, joita näissä menetelmissä käytetään, reagoivat erilaisten seerumissa esiintyvien antigeenien kanssa, jotka osaksi edustavat prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, erilaisella, pienemmällä affiniteetilla [Niemelä, 25 0. et ai., Clin. Chim. Acta 124, 39 - 44 (1982)]. Tästä on seurauksena, että seerumin laimennuskäyrät ja muiden ruumiinnesteiden laimennuskäyrät eivät ole yhdensuuntaisia standardikäyrän kanssa, joka on laadittu puhtaan prokollageenipeptidin (tyyppi III) avulla, ja sen vuoksi täytyy 30 jokaisesta tuntemattomasta näytteestä määrittää antigeeni-pitoisuus useista laimennoksista, jotta antigeenikonsent-raatio saataisiin selville laimennuskäyrän 50 %:n leikkauksen avulla.

EP-hakemuksen 0 089 008 menetelmän avulla on mah-35 dollista ratkaista tämä tekninen ongelma käyttämällä vas- 2 96433 ta-aineita, joilla on samankaltainen affiniteetti ehyttä prokollageenipeptidiä (tyyppi III) ja sen hajoamistuotetta Col 1 kohtaan. Tässä menetelmässä määritetään ehyt ja pilkkoutunut prokollageenipeptidi (tyyppi III) yhdessä, 5 mikä kuitenkin johtaa diagnostisen lausunnon epätarkkuuteen, koska normaaliryhmä ja potilasryhmä voivat mennä suuressa määrin päällekkäin.

Yllättäen on nyt löydetty monoklonaalinen vasta-aine, joka ei reagoi ruumiinnesteissä esiintyvien prokolla-10 geenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteiden kanssa. Tämä monoklonaalinen vasta-aine tekee mahdolliseksi aminoter-minaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) immunologisen määrityksen, jossa sen hajoamistuotteet eivät tule otetuksi mukaan ja joka on siinä suhteessa erityisen hyvä, 15 että seerumin laimennuskäyrät, muiden ruumiinnesteiden laimennuskäyrät ja standardikäyrä ovat täydellisesti yhdensuuntaisia .

Keksinnön kohteena on siten: 1. Monoklonaalinen vasta-aine, joka pystyy sitoutu-20 maan spesifisesti intaktiin prokollageeniin (tyyppi III), pN-kollageeniin ja intaktiin aminoterminaaliseen prokolla-geenipeptidiin (tyyppi III), mutta ei Col l:een eikä sellaisiin aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi

III) hajoamistuotteisiin, joilla on sama molekyylipaino 25 kuin Col 1:113, sillä on hybridoomasolulinjalla ECACC

87 042 308 tuotetun monoklonaalisen vasta-aineen ominaisuudet ja sitä voidaan valmistaa viljelemällä hybridoomaa, joka on syntynyt myeloomalinjan solujen ja etukäteen pro-kollageenipeptidillä tyyppi III immunisoidun eläimen lym-30 fosyyttien fuusion tuloksena, ja ottamalla talteen muodostuneet vasta-aineet.

2. Hybridoomasolulinja, joka muodostetaan fuusioimalla myloomalinjan soluja ja lymfosyyttejä, jotka ovat peräisin etukäteen prokollageenipeptidillä (tyyppi III) 35 immunisoidulta eläimeltä, ja joka tuottaa kohdassa 1. luonnehdittua vasta-ainetta.

Il 96433 3. Menetelmä kohdassa 1. luonnehditun vasta-aineen valmistamiseksi.

4. Menetelmä prokollageenipeptidin (tyyppi III) määrittämiseksi kvantitatiivisesti immunologisesti kohdas- 5 sa 1. luonnehditun vasta-aineen avulla.

5. Diagnostinen valmiste prokollageenipeptidi (tyyppi III) -määrän toteamiseksi ruumiinnesteistä, joka valmiste käsittää tehoavan määrän kohdassa 1. luonnehdittua monoklonaalista vasta-ainetta seoksessa diagnostisesti 10 hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa.

Seuraavassa selostetaan yksityiskohtaisesti keksintöä, erityisesti sen parhaina pidettyjä suoritusmuotoja. Lisäksi keksintö määritellään patenttivaatimuksissa.

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi 15 voidaan eläimiä, mieluimmin jyrsijöitä, kuten esim. hiiriä, rottia, kaniineja, marsuja, immunisoida adjuvantin läsnä ollessa prokollageenipeptidillä (tyyppi III) , joka on eristetty EP-julkaisun 4 940 menetelmän mukaan. Erityisen mielellään käytetään hiiriä, varsinkin SJL-kantaa ole-20 via. Toistettujen, esimerkiksi 4-8 viikon päästä annettujen lisäruiskeiden avulla vahvistetaan immuunivastausta. Immunisoinnin vaikutusta kontrolloidaan määrittämällä vasta-aineiden konsentraatio radioimmunologisen sitoutumis analyysin avulla [R. Timpl ja L. Risteli, Immunochemistry * 25 of the extracellular matrix, H. Furthmayr toim., osa 1, 199 (1982)]. Muutamia päiviä ennen lymfosyyttien fuusiota myeloomasolulinjan kanssa käsitellään eläimiä prokollageenipeptidillä (tyyppi III) ilman adjuvanttia. Eläinten lymfosyyttejä otetaan talteen ja fuusioidaan myeloomasolulin-30 jän kanssa, joka voi samoin olla peräisin joltakin yllä . mainitulta eläinlajilta, mieluimmin kuitenkin hiireltä, erityisen mielellään fuusioidaan solulinjan P3X63AG8.653 kanssa. On edullista fuusioida lymfosyyttejä saman lajin myeloomasolulinjojen kanssa. Fuusio ja solukloonien edel-35 leenkasvatus suoritetaan alan asiantuntijalle tunnetulla « 4 96433 tavalla, jolloin määritetään soluviljelmän kasvuliuoksesta spesifisten vasta-aineiden konsentraatiota immunologisen sitoutumisanalyysin avulla. Fuusiossa syntyneistä solu-klooneista valitaan sopivia klooneja käytettäviksi immuno-5 logisissa menetelmissä. Erityisen mielellään käytetään työskentelyssä solulinjaa, joka aikaansaadaan fuusioimalla SJL-kannan hiiriltä peräisin olevia, prokollageenipeptidin tyyppi III vastaisia lymfosyyttejä hiiren myeloomasolulin-jan P3X63AG8.653 kanssa. Tämä solulinja on tallennettu 10 talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP40JG, Iso-Britannia, numerolla 87 042 308.

Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet 15 kuuluvat immunoglobuliinien ryhmään, ensisijaisesti IgG-ja IgA- ja IgM-proteiinien luokkaan. Erityisen edullista on käyttää IgG-luokan, etenkin IgG2b-alaluokan vasta-aineita. Keksinnön mukainen vasta-aine on yllättävä etenkin sen vuoksi, että sen affiniteetti antigeeniin on suurempi 20 kuin polyklonaalisten vasta-aineiden affiniteetti. Yleensä todetaan olevan päinvastoin. Monoklonaalisten vasta-aineiden, joita edustaa solulinjalta ECACC 87 042 308 saatu monoklonaalinen vasta-aine PIIIP 296, ominaisuudet selvenevät, kun seerumissa esiintyvät antigeenit erotellaan ‘ 25 geelisuodatuskromatografiän avulla molekyylipainon perus teella ja kromatografiästä saadut fraktiot käytetään ra-dioimmunoanalyysiin. Tällöin osoittautuu, että antigeeni-fraktio, joka tulee polyklonaalisten vasta-aineiden avulla suoritetussa analyysissä mukaan luetuksi ja jolla on ha-30 joamistuotteen Col 1 molekyylipaino, ei keksinnön mukaista . vasta-ainetta käytettäessä tulee otetuksi mukaan. Kuviossa 3 on esitetty monoklonaalisen vasta-aineen avulla saatu ihmisen seerumin geelisuodatuskromatografiän eluutiopro-fiili verrattuna eluutioprofiiliin, jollainen saadaan 35 esille polyklonaalisten vasta-aineide avulla. Huippu 4/4a k 3

II

5 96433 vastaa ehyttä prokollageenia tyyppi III tai pN-kollageenia tyyppi III [Rohde H. et ai., Eur. J. Biochem. 135, 197 (1983)]. Huippu 5/5a vastaa ehyttä aminoterminaalista pro-kollageenipeptidiä tyyppi III (P III P) , kun taas huippu 5 6/6a vastaa Col l:tä samoin kuin aminoterminaalisen pro- kollageenipeptidin tyyppi III hajoamistuotteita, joilla on sama molekyylipaino kuin Col l:llä [Rohde H. et ai., Eur.

J. Biochem. 135, 197 (1983)]. Aineiden konsentraatio vastaavissa fraktioissa voidaan määrittää prokollageenipep-10 tidin tyyppi III standardikäyrän avulla.

Keksinnön mukaisten vasta-aineiden valmistamista varten on tärkeää, että käytössä on sopiva lähde antigeenin saamiseksi. Kuten jo on mainittu, eristetään ihmisen tai eläimen erittäin hyvin puhdistettu prokollageenipepti-15 di (tyyppi III) edullisesti EP-patentin 4940 menetelmän mukaan, hajoittamalla kudokset tai patologiset ruumiinnesteet kollagenaasin avulla ja erottamalla prokollageenipep-tidi reaktioliuoksesta ja puhdistamalla käyttäen kromatografisten menetelmien ja/tai immuuniadsorption yhdistel-20 mää.

Keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää erilaisissa immunologisissa menetelmissä, mukaan luettuna kaikki radioimmunoanalyysin muodot, esim. peräkkäinen kyllästysanalyysi tai tasapainoanalyysi, mah-25 dollisesti kloramiini T:llä tai Bolton-Hunter-reagenssilla merkitsemisen jälkeen [Felber, Meth. Biochem. Anal. 22, 1 (1974); Shelley et ai., Clin. Chem. 19, 146 (1975)] sekä muissa kilpailuun perustuvissa ja ei-kilpailuun perustuvissa sitoutumisanalyyseissä, kuten fluoresenssi-, entsyy-30 mi-, kemiluminesenssi- tai muissa immunoanalyyseissä, mu kaan luettuna immunoradiometrinen analyysi (IRMA). Monoklonaalista vasta-ainetta voidaan siten käyttää immunologisissa menetelmissä prokollageenipeptidin (tyyppi III) eristämiseksi ja karakterisoimiseksi sekä kvantitatiivi-35 seksi määrittämiseksi kudoksista ja ruumiinnesteistä. Toi- 6 96433 mitään käyttäen menetelmiä, jotka ovat alan asiantuntijalle sinänsä tunnettuja, antamalla nestemäisen näytteen, joka sisältää prokollageenipeptidiä (tyyppi III) , reagoida keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, 5 joka voi olla liuoksessa tai kiinteän kantajan pinnalla, ja määrittämällä prokollageenipeptidin (tyyppi III) määrä muodostuneen antigeeni-vasta-ainekompleksin perusteella. Tällöin ei ole merkitystä sillä, onko prokollageenipeptidi (tyyppi III) vielä sidottuna prokollageenin (tyyppi III) 10 aminopäähän vaiko ei. Tähän saakka immunologisessa määrityksessä häirinneitä prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, erityisesti Col l:tä, ei keksinnön mukainen vasta-aine ota mukaan.

Seuraavissa esimerkeissä selvennetään keksintöä li-15 sää. Prosenttimäärät ovat painoprosentteja, ellei toisin ole ilmoitettu.

Esimerkki 1

Prokollageenipeptidin (tyyppi III) (P III P) valmistamisen 20 Prokollageenipeptidiä (tyyppi III) tuotetaan anta

malla kollagenaasin vaikuttaa prokollageeniin (tyyppi III) 37 °C:ssa. Tällöin peptidiä ei saateta alttiiksi millekään denaturointiaineille. Suurempien määrien peptidiä valmistamiseksi käytetään muunnettua menetelmää. Kaikki menetel-25 män vaiheet kollagenaasin vaikuttamiseen asti suoritetaan kylmähuoneessa. Erilaiset NaCl-liuokset, joita käytetään liukoiseksi tekemiseen, sisältävät 0,05 M Tris-HCl:a, pH

7,4, 0,01 M EDTA:a, natriumatsidia (200 mg/ml) ja prote-aasi-inhibiittoreita fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (3 3 0 /ig/ml) ja p-kloorielohopeabentsoaatti (3 Mg/ml) .

Sikiökautisen vasikan nahkaa (3 kg) homogenisoidaan 10 litrassa 1 M NaCl:a ja uutetaan kahden päivän ajan. Liuennut kollageeni seostetaan uuttoliuoksesta lisäämällä kiinteää NaClra loppukonsentraatioksi 2,5 M. Sen jälkeen 35 kun on sekoitettu yli yön, kootaan saostuma sentrifugoi- it 7 96A33 maila (1 800 x g, 20 minuuttia), pestään kaksi kertaa 2,5 M NaCl:lla ja liuotetaan jälleen sekoittamalla sitä yön ajan 10 litrassa 0,5 M NaClra. Pienet määrät liukenemattomia materiaaleja poistetaan sentrifugoimalla. Näin saatu 5 kollageenin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) seos seostetaan 1,6 M NaClrlla. Saostuma suspendoidaan sitten 2 litraan 0,05 M Tris-HCl:a (pH 8,0), ja sen jälkeen kun on lisätty 0,02 M CaCl2:a, kuumennetaan 20 minuutin ajan 50 °C:ssa ja sen jälkeen inkuboidaan 3 tunnin 10 ajan 37 °C:ssa yhdessä 1 500 U:n kanssa bakteerikolla-genaasia (CLSPA, Worthington, USA) grammaa kohden kosteaa saostumaa. Kollagenaasin vaikuttamisen jälkeen erotetaan muodostunut saostuma sentrifugoimalla ja liuosta dialysoi-daan 0,005 M Tris-HCl:a, pH 8, 6,8 M virtsa-ainetta vas-15 taan ja se lisätään DEAE-selluloosapylvääseen (5,0 x 3 0 cm), joka on tasapainotettu samalla puskuriliuoksella.

Pylvääseen sitoutuneet proteiinit huuhdotaan pois NaCl-liuoksilla, joiden konsentraatio suurenee Orsta 0,3 5 M:seen. Kokonaiseluutiotilavuus on 2 1. Pylväästä pois 20 virtaavasta liuoksesta tutkitaan absorptio 236 nm: n aallonpituudella ja antigeeniaktiivisuus käyttämällä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä prokollageenin (tyyppi III) aminoterminaaliselle osalle. Normaalisti sisältää viimeinen pylväästä eluoituva huippu prokollageenipeptidin 25 (tyyppi III). Peptidistä poistetaan suolat dialysoimalla tislattua vettä vastaan, ja se lyofilisoidaan. Lisäpuhdis-tus tapahtuu agaroosi A 1,5 M (2 x 120 cm) -pylväässä, joka on tasapainotettu liuoksella, jossa on 1 M CaCl2, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5.

30 Esimerkki 2

Hybridooman tuottaminen SJL-kantaa olevat hiiret immunisoidaan antamalla lihaksen sisään 5 μq prokollageenipeptidiä (tyyppi III) , joka on saatu esimerkin 1 mukaisesti, täydellisen Freundin 35 adjuvantin läsnäollessa. Neljän viikon kuluttua ja kolmen 96433

O

kuukauden kuluttua vahvistetaan immuunireaktiota antamalla lihakseen lisäruiskeena 5 μg prokollageenipeptidiä (tyyppi III) epätäydellisen Freundin adjuvantin läsnäollessa. Kolme päivää ennen fuusiota vahvistetaan immuunivasetta anta-5 maila ruiskeena vatsaontelon sisään vielä 50 μg prokollageenipeptidiä (tyyppi III).

Fuusiota varten eläimet tapetaan ja eristetään pernasolut. Pernasolut fuusioidaan polyetyleeniglykolin läsnä ollessa myeloomasolulinjan P3X63AG8.653 kanssa. Kasvatta-10 maila fuusioseosta hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini- elastusaineessa kahden viikon ajan selektoidaan pernasolu x P3X63AG8.653—hybridejä. Stabiilin solulinjan aikaansaamiseksi jatkokloonataan saadut solukloonit useita kertoja. Aikaansaadut solukloonit tutkitaan radioimmunologisen si-15 toutumisanalyysin avulla vasta-aineen tuottamisen suhteen.

Aikaansaatu solulinja, josta saadaan monoklonaalista vasta-ainetta P III P 296, on tallennettu kokoelmaan ECACC-numerolla 87 042 308.

Esimerkki 3 20 Radioimmunositoutumisanalyysi 300 μΐ solujen kasvuliuosta tai muuta näytettä, kuten esim. vesivatsanestettä sen jälkeen kun soluja on kasvatettu hiirten vatsaontelossa, inkuboidaan yön ajan 100 μ1:η kanssa I-125-prokollageenipeptidi (tyyppi III)-liuos-25 10 ta (1 ng proteiinia/100 μΐ, valmistettu kuten on kuvat tu EP-4940:ssä, esimerkissä 1). Muodostuneet antigeenivas-ta-ainekompleksit saostetaan lisäämällä lampaasta tai jostakin muusta lajista peräisin olevaa anti-hiiren IgG -seerumia. Sentrifugoinnin ja sakan yläpuolella olevan nesteen 30 dekantoinnin jälkeen määritetään saostuneen radioaktiivisuuden määrä #-tuikespektrometrin avulla.

Esimerkki 4 Radioimmunoanalyysi 0,2 ml analysoitavaa näytettä tai prokolla-35 geenipeptidi (tyyppi III) -standardia inkuboidaan yön ajan

II

9 96433 4 °C:ssa merkityn antigeenin määrä huomioon ottaen rajoittavan määrän kanssa PIIIP 296:ta (0,1 ml:ssa puskuriliuosta) ja 0,1 ml:n kanssa 1-125:llä merkittyä prokollageeni-peptidiä (tyyppi III) (sisältää 1 ng proteiinia). Sen jäl-5 keen inkuboidaan yksi tunti etukäteen tutkitun määrän kanssa anti-hiiren IgG -seerumia, joka on peräisin lampaasta, 10 % polyetyleeniglykolin (PEG 6000) läsnä ollessa. Saostuneet antigeeni-vasta-ainekompleksit sentrifugoi-daan alas (1500 x g) ja dekantoinnin jälkeen määritetään 10 radioaktiivisuus #-tuikespektrometrin avulla.

Vertaamalla standardikäyrään, jonka laatimiseen käytetään eri määriä prokollageenipeptidiä (tyyppi III) sisältäviä standardeja, voidaan sitten määrittää prokol-lageenipeptidin (tyyppi III) konsentraatio tuntemattomasta 15 liuoksesta. Kuviossa l on esitetty standardikäyrä (1) ja seerumin laimennuskäyriä (2), joiden tapauksessa on käytetty PIIIP 296:ta (a) verrattuna EP 4940:n mukaiseen menetelmään, jossa on käytetty polyklonaalisia vasta-aineita (b).

20 Esimerkki 5 P III P 296:n merkitseminen radioaktiivisuudella 0,2 ml liuosta, jossa on 0,2 mg monoklonaalista P III P 296:ta 0,05 M fosfaattipuskuriliuoksessa, pH 7,4, pannaan polystyreenikoeputkeen (12 x 55 mm) ja joukkoon 25 lisätään 100 MBq Nal25I-liuosta, joka on puskuroitu 10 μ1:1ΐΆ 0,5 M fosfaattipuskuriliuosta, pH 7,4. Sen jälkeen kun on lisätty 50 μΐ vesiliuosta, jossa on 20 μg kloramiini T:tä, sekoitetaan yhden minuutin ajan. Tämän jälkeen päätetään jodausreaktio lisäämällä 50 μΐ vesiliuosta, jos-30 sa on 20 /ig natriumdisulfiittia.

Reagoimaton Na125I erotetaan sen jälkeen 125I:lla merkitystä P III P 296:sta amioninvaihtokromatografiän avulla. Kromatografiän fraktiot, jotka sisältävät puhdistettua, 125I:lla merkittyä vasta-ainetta, laimennetaan liuok-35 sella, jossa on 20 g Tween 20:tä ja 14,6 g Na2EDTA:ta lit- 10 96433 rassa 0,05 M Tris-HCl-puskuriliuosta, pH 8,0, siten että merkityn vasta-aineen konsentraatioksi tulee 200 jLtg/l.

Esimerkki 6

Vasta-ainekerroksen kiinnittäminen koeputkiin 5 Vasta-aineiden kiinnittämiseksi polystyreenikoeput- kiin (12 x 75 mm) pannaan jokaiseen putkeen 300 /xl liuosta, jossa on 4 mg monoklonaalista P III P 296:ta litrassa 0,01 M natriumfosfaattipuskuriliuosta, pH 6,4, ja inkuboi-daan yön ajan ympäristön lämpötilassa. Sitten imetään vas-10 ta-aineliuos pois. Sen jälkeen lisätään jokaiseen putkeen 500 μΐ liuosta, jossa on 1 % naudan seerumin albumiinia 0,05 M Tris-sitraattipuskuriliuoksessa, pH 7,5, ja inku-boidaan yön ajan ympäristön lämpötilassa. Tämän jälkeen imetään liuos pois. Vasta-ainekerroksen omaavat putket 15 kuivataan silikageelin avulla.

Esimerkki 7

Immunoradiometrinen analyysi 0,1 ml analysoitavaa näytettä tai 0,1 ml prokolla-geeni (tyyppi III) -standardia inkuboidaan ympäristön läm-20 pötilassa 2 tunnin ajan polystyreenikoeputkissa, joihin on etukäteen kiinnitetty kerrokseksi 1,2 μg monoklonaalista p III P 296:ta ja joihin on lisätty 0,1 ml fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta (PBS). Sen jälkeen pestään koeputket kaksi kertaa kulloinkin 1 ml:11a PBS:a ja dekan-25 toidaan. Sitten lisätään koeputkiin 20 μΐ 1-125:llä merkittyä monoklonaalista P III P -vasta-ainetta (sisältää 40 ng vasta-ainetta) ja inkuboidaan tunteja ympäristön lämpötilassa. Koeputken seinämään sitoutuneiden vasta-aine-an-tigeeni-l25I-vasta-ainekompleksien radioaktiivisuus määrite-30 tään tuikelaskurissa sen jälkeen kun on pesty kaksi kertaa kulloinkin 1 ml:11a PBS:a ja tämä jälkeen dekantoitu.

Vertaamalla standardikäyrään, jonka laatimisessa käytetään eri määriä prokollageenipeptidiä (tyyppi III) sisältäviä standardeja, voidaan sitten laskea prokollagee-35 nipeptidin (tyyppi III) konsentraatio tuntemattomassa näy- • n 964ό3 teliuoksessa. Kuvio 2 esittää radioimmunometrisen analyysin standardikäyrää. (B/T tarkoittaa: sitoutunutta vasta-ainetta kokonaismäärä).

Esimerkki 9 5 Ihmisen seerumissa olevien P III P 296:n kanssa reagoivien antigeenien molekyylipainojakauman määrittäminen 1 ml seerumia erotellaan geelisuodatuskromatogra-fian avulla käyttäen allyylidekstraania, joka on ristikyt-10 ketty N-Ν'-metyleembisakryyliamidilla ( Speharcyl S 300 - pylväs, 1,6 x 130 cm), tasapainotettuna fosfaatilla puskuroidulla keittosuolaliuoksella (PBS), joka sisältää 0,04 % ei-ionista peusainetta, esimerkiksi polyetoksiloitua sor-biittimonolauraattia (Tween 20), 3,3 ml:n fraktioiksi.

15 Kustakin fraktiosta käytetään 0,2 ml esimerkin 4 mukaiseen radioimmunoanalyysiin. Kuviossa 3 on esitetty P III P 296:n avulla määritetyn antigeenin eluutioprofiili verrattuna polyklonaalisten vasta-aineiden avulla määritetyn antigeenin profiiliin: 20 huippu 4/4a vastaa pN-kollageenia ja ehyttä amino- terminaalista prokollageenia (tyyppi III) huippu 5/5a vastaa aminoterminaalista prokollagee-nipeptidiä (tyyppi III) = (P III P) .. huippu 6/6a vastaa Col l:tä samoin kuin aminoter- 25 minaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama molekyylipaino kuin Col l:llä.

Aineiden konsentraatio vastaavissa fraktioissa voidaan määrittää prokollageenipeptidi (tyyppi III) -standar-dikäyrän avulla.

Claims (7)

12 96«3

1. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se pystyy sitoutumaan spesifisesti intaktiin 5 prokollageeniin (tyyppi III), pN-kollageeniin ja intaktiin aminoterminaaliseen prokollageenipeptidiin (tyyppi III), mutta ei Col l:een eikä sellaisiin aminoterminaalisen pro-kollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteisiin, joilla on sama molekyylipaino kuin Col l:llä, että sillä on 10 hybridoomasolulinjalla ECACC 87 042 308 tuotetun monoklo-naalisen vasta-aineen ominaisuudet ja että sitä voidaan valmistaa viljelemällä hybridoomaa, joka on syntynyt mye-loomalinjan solujen ja etukäteen prokollageenipeptidillä (tyyppi III) immunisoidun eläimen lymfosyyttien fuusion 15 tuloksena, ja ottamalla talteen muodostuneet vasta-aineet.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se kuuluu IgG-luokkaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen 20 vasta-aine, tunnettu siitä, että se on hybridoo- masolulinjan ECACC 87 042 308 tuottama monoklonaalinen vasta-aine P III P 296.

4. Hybridoomasolulinja ECACC 87 042 308.

5. Menetelmä aminoterminaalisen prokollageenipep-25 tidin (tyyppi III) vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) viljellään hybridoomasolulinjaa ECACC 87 042 308 ja b) otetaan talteen muodostuneet vasta-aineet.

6. Menetelmä vasta-aineiden avulla suoritettavaa prokollageenipeptidin (tyyppi III) kvantitatiivista immunologista määritystä varten, tunnettu siitä, että a) nestemäinen näyte, joka sisältää aminoterminaa-lista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) tai prokollagee-35 nia (tyyppi III), saatetaan reagoimaan jonkin patenttivaa- 96433 timuksista 1-3 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja b) aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) tai prokollageenin määrä määritetään muodostuneen an-5 tigeeni-vasta-ainekompleksin perusteella.

7. Diagnostinen valmiste prokollageenipeptidi (tyyppi III) -määrän toteamiseksi ruumiinnesteistä, tunnettu siitä, että se sisältää tehokkaan määrän jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista monoklonaalista vas-10 ta-ainetta seoksessa diagnostisesti hyväksyttävän kantaja- aineen kanssa. « 14 96433