PT87376B

PT87376B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra o peptideo de procolagenio aminoterminal (tipo iii) e processo de determinacao imunologica selectiva de peptideo de procolagenio (tipo iii) em liquidos corporais utilizando aqueles anticorpos monoclonais

Info

Publication number: PT87376B
Application number: PT87376A
Authority: PT
Inventors: Dietrich Brocks; Jurgen Punter; Rupert Timpl; Helmut Strecker
Original assignee: Hoechst Ag; Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1987-05-02
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1992-08-31
Also published as: IE881290L; DK169583B1; FI882019A; FI882019A0; EP0289930B1; FI96433B; DK232888D0; JPH07110879B2; IE63371B1; NO881905D0; DE3881275D1; NO881905L; EP0289930A2; NO173104C; FI96433C; ATE89862T1; ES2056850T3; EP0289930A3; DK232888A; NO173104B

Description

cindido após secreção extracelular da molécula de procolagênio (tipo III). Por meio de um método de determinação radioimunológi co, como o descrito na publicação de Patente Europeia N9. 4940, ê possível determinar a concentração do peptídeo de procolagênio em líquidos corporais. O conhecimento da concentração no soro deste peptídeo possibilita o diagnóstico acerca da actividade de doenças fibróticas, como por exemplo de doenças do fígado /Rohde,

H. et al. Eur. J. Clin. Invest. _9, 451 - 459 (1979).7.

A determinação do peptídeo de proco lagénio (tipo III) no soro e em outros líquidos corporais não ê, no entanto, possível de forma exacta e selectiva com os métodos até agora descritos, uma vez que os anticorpos policlonais que são utilizados nestes métodos reagem com diferentes antigenes existentes no soro, que em parte correspondem a produtos de decomposição do peptídeo de procolagênio (tipo III), com afinidades diferentes e reduzidas /Niemela, O. et al. Clin. Chim. Acta 124, 39 - 44 (1982).7. Este facto conduz a que as curvas de dilui ção do soro e de outros líquidos corporais usadas para curvas pa drão, que são traçadas a partir de peptídeo de procolagênio (tipo III) puro, não são paralelas e portanto que o conteúdo em antigene de cada amostra desconhecida devera ser determinado em vã rias diluições a fim de avaliar a concentração de antigene na in tersecção de 50% das curvas de diluição.

Por meio do processo do pedido de Patente Europeia 0089 008 ê possível resolver este problema técnico utilizando anticorpos que têm afinidades comparáveis para o peptídeo de procolagênio (tipo III) e para os respectivos produtos de decomposição Col. 1. Com este processo determinam-se em conjunto o peptídeo de procolagênio (tipo III) intacto e degrada do, o que no entanto leva a incertezas no diagnostico, uma vez que o colectivo normal e o colectivo dos pacientes se sobrepõem em grande parte.

Surpreendentemente encontrou-se ago ra um novo anticorpo monoclonal que não reage com os produtos de decomposição do peptídeo de procolagênio (tipo III) existentes nos líquidos corporais. Com este anticorpo monoclonal torna-se possível uma determinação imunolõgica do peptídeo do procolagê-

nio (tipo III) aminoterminal na qual os respectivos produtos de decomposição não interferem e que se caracteriza por curvas de diluição do soro que se apresentam completamente paralelas às curvas de diluição de outros líquidos corporais e às curvas padrão .

Por conseguinte a presente invenção refere-se a:

Um anticorpo monoclonal com o tipo de reacção contra o proco lagênio intacto (tipo III) e o pN-colagénio (procolagénio a que falta o propeptídeo C-terminal, pico 4a), o peptídeo de procolagénio (tipo III) aminoterminal intacto (pico 5a) bem como o Col 1 e os produtos de decomposição do peptídeo de procolagénio (tipo III) aminoterminal com peso molecular igua

2.

3.

4.

5.

ao de Col 1 (pico 6a).

Uma linha de células de hibridoma formada por fusão de células de uma linha de mieloma com linfõcitos de um animal previamente imunizado com peptídeo de procolagénio (tipo III) e que produz o anticorpo caracterizado em 1.

Um processo para a preparação do anticorpo caracterizado em 1 Um processo para a determinação quantitativa por via imunolõ gica de peptídeo de procolagénio (tipo III) com o anticorpo caracterizado em 1.

Uma composição de diagnóstico para determinação da quantidade de peptídeo de procolagénio (tipo III) em líquidos corporais constituída por uma quantidade activa do anticorpo monoclonal caracterizado em 1 em mistura com um suporte aceitável em diagnóstico.

A presente invenção é seguidamente descrita em pormenor, em especial nas suas formas preferidas de concretização. Para além disso a invenção ê definida nas reivindicações .

Para a preparação do anticorpo mono clonal podem imunizar-se animais, de preferência mamíferos, como por exemplo ratos, ratazanas, coelhos ou cobaias, com peptídeo de procolagénio (tipo III), o qual pode ser isolado de acordo com o processo da Patente Europeia 4940, na presença de adjuvantes.

Ê especialmente preferida a utilização de ratos, especialmente da

estirpe SJL. Por meio de repetição de injecções secundárias, por exemplo após períodos de 4 a 8 semanas, torna-se mais forte a resposta imunitária. Verifica-se o decurso da imunização por determinação da concentração de anticorpos por ensaio de ligação radioimunolõgica /r. Timpl e L. Risteli, Immunochemistry of the extracellular matrix, H. Furthmayr Ed., Vol. 1, 199 (1982)_7. Alguns dias antes da fusão dos linfôcitos com uma linha de células de mieloma tratam-se os animais com peptídeo de procolagénio (ti po III) sem adjuvante. Colhem-se linfôcitos dos animais e fundem -se com uma linha de células de mieloma que pode provir igualmen te de uma das espécies animais acima referidas, de preferência, no entanto, de rato, especialmente com a linha de células P3X63AG.653. De preferência fundem-se linfôcitos com linhas de células de mieloma da mesma espécie. A fusão e a multiplicação dos clones celulares são levadas a efeito de modo conhecido do especialista, com determinação no sobrenadante da cultura celular por meio de ensaios de ligação imunolõgicos da concentração dos anticorpos específicos. A partir dos clones celulares provenientes da fusão seleccionam-se clones apropriados para a utilização em processos imunolõgicos. Considera-se especialmente preferido o trabalho com uma linha de células preparada por fusão de linfôcitos de ratos da estirpe SJL contra o peptídeo de proco lagênio (tipo III) com a linha de células de mieloma de rato P3X63AG8.653. Esta linha de células encontra-se depositada na Eu ropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, Reino Unido, sob o número 87042308.

Os anticorpos monoclonais da presen te invenção pertencem ao grupo das imunoglobulinas, de preferência ãs classes das proteínas IgG, IgA e IgM. Ê especialmente van tajoso o uso dos anticorpos da classe IgG, especialmente da sub-classe IgG2b. O anticorpo da presente invenção apresenta a propriedade surpreendente de ter uma afinidade para o antigene supe rior ã afinidade dos anticorpos policlonais. Normalmente verifica-se o contrário. As propriedades dos anticorpos monoclonais fo . ram comparadas com as do anticorpo monoclonal PIIIP 296 obtido a partir da linha de células ECACC 87042308 quando se separam os

antigenes existentes no soro por meio de cromatografia de filtra ção em gel segundo o peso molecular e se utilizam as fracções da cromatografia em análises radioimunológicas. Deste modo verifica -se que a fracção de antigenes que interfere na análise com anti corpos policlonais e que tem o peso molecular do produto de decomposição Col 1 não interfere com o anticorpo monoclonal da pre sente invenção. Na figura 3 ê representado o perfil de eluição da cromatografia de filtração em gel de soro humano, tal como apresenta o anticorpo monoclonal, em comparação com o perfil de eluição apresentado pelos anticorpos policlonais. 0 pico 4/4a corresponde ao procolagênio tipo III intacto ou pN-colagênio tipo III /ítohde H. et al. Eur. J. Biochem. 135, 197 (1983/7. 0 pico 5/5a corresponde ao peptídeo de procolagênio tipo III aminoterminal intacto (P III P), enquanto que o pico 6/6a corresponde a Col 1 bem como a produtos de decomposição do peptídeo de proco lagênio tipo III aminoterminal com o mesmo peso molecular que o Col 1 /Rohde H. et al. Eur. J. Biochem. 135, 197 (1983/7· A concentração das substâncias nas fracções correspondentes pode ser determinada por meio de uma curva padrão de peptídeo de procolagênio tipo III.

Para a preparação dos anticorpos da presènte invenção ê importante ter disponível uma fonte apropria da para a obtenção do antigene. Como já mencionado, isola-se pe£ tldeo de procolagênio (tipo III) de alto grau de pureza de origem humana ou animal de preferência de acordo com o processo da Patente Europeia 4940, segundo o qual se decompõem com colagenase tecidos ou líquidos corporais patológicos, se separa a partir da mistura reaccional o peptídeo de procolagênio e se purifica por combinação de métodos cromatogrãficos e/ou de imunoadsorção.

O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser usado em diferentes processos imunológicos, in cluindo todas as formas de análises radioimunológicas, por exemplo análise de saturação sequencial ou análise de equilíbrio, eventualmente após marcação com cloramina T ou com reagente de Bolton-Hunter /Felber, Meth. Biochem. Anal. 22, 1 (1974); Shell^f et al., Clin. Chem. 19, 146 (1975/7 bem como noutras análises de ligação competitiva e não competitiva, tais como análise por fluo

rescência, analise enzimática, analise por quimioluminescência ou outras análises imunolõgicas, incluindo a análise imunorradio métrica (IRMA). 0 anticorpo monoclonal pode, por conseguinte, ser utilizado em processos imunolõgicos para isolamento e caracterização bem como para determinação quantitativa do peptídeo de procolagénio (tipo III) em tecidos e em líquidos corporais. Os processos são levados a'efeito de acordo com métodos conhecidos em si dos especialistas provocando a reacção de uma amostra líquida que contém peptídeo de procolagénio (tipo III) com o anticorpo monoclonal da presente invenção, esteja este em solução ou sobre um suporte solido, e determinando a quantidade do peptídeo de procolagénio (tipo III) através do complexo antigene-anticorpo formado. Neste processo não tem qualquer importância o facto de o peptídeo de procolagénio (tipo III) estar ainda ligado à ex tremidade aminoterminal do procolagénio (tipo III) ou não. Os produtos de decomposição do peptídeo de procolagénio (tipo III), especialmente o Col I, que incomodavam em geral a determinação imunolõgica, não interferem com o anticorpo da presente invenção.

Nos exemplos que se seguem elucida-se mais em pormenor a presente invenção. Os dados em percentagem referem-se a peso, sempre que nada em contrário seja indicado.

EXEMPLO 1

Preparação do Peptídeo de Procolagé nio (tipo III) (Ρ III P) :

Preparou-se o peptídeo de procolagé nio (tipo III) por meio da acção da colagenase sobre o procolagé nio (tipo III) a 379 C. Nesta operação o peptídeo não foi exposto ã acção de qualquer agente de desnaturação. Para a preparação de quantidades superiores do peptídeo utilizou-se um processo mo dificado. Todas as fases do processo até à acção da colagenase são efectuadas numa câmara fria. As diferentes soluçóes de NaCl utilizadas contêm, para promover a solubilidade, tris.HCl 0,05 M a pH 7,4, EDTA 0,01 M, azida de sódio (200 mg/ml) e os inibidores de protease fluoreto de fenilmetilsulfonilo (3 pg/ml) e p-clo

romercuribenzoato (3 jag/ml) .

Homogeneizou-se pele fetal de vitela (3 kg) em 10 1 de NaCl 1 M e extraiu-se durante 2 dias. Preci pitou-se o colagénio extraído por adição ã solução de extracção de NaCl solido até uma concentração final de 2,5 M. Apôs agitar de um dia para o outro, separou-se o precipitado por centrifugação (1800 x g, 20 minutos), lavou-se duas vezes com NaCl 2,5 M e dissolveu-se novamente por agitação de um dia para o outro com 10 1 de NaCl 0,5 M. Eliminaram-se por centrifugação pequenas quan tidades de materiais insolúveis. A mistura de colagénio (tipo III) e procolagênio (tipo III) obtida deste modo foi precipitada com NaCl 1,6 Μ. O precipitado foi então suspenso em 2 1 de tris. HC1 0,05 M (pH 8,0) e após adição de CaCl₂ 0,02 M foi aquecido a 50? C durante 20 minutos e finalmente foi incubado durante 3 horas a 379 C juntamente com 1500 U de colagenase bacteriana (CLSPA Worthington, USA) por grama de precipitado húmido. Depois da actuação da colagenase, separou-se o precipitado formado por centrifugação e dialisou-se a solução contra tris.HCl 0,005 M a pH 8,0 e ureia 6,8 M e fez-se passar através de uma coluna de DEAE-celulose (5,0 x 30 cm) que tinha sido equilibrada com o mesmo tampão.

A proteína ligada na coluna foi reti rada com soluções de NaCl com concentrações crescentes de 0 a 0,3 Μ. A quantidade total eluida de 2 1. A solução proveniente da co luna foi comprovada no que se refere ã absorção a 236 nm e ã actividade antigênica por meio de anticorpos específicos para com o segmento aminoterminal do procolagênio (tipo III). Normalmente o último pico eluído da coluna contêm o peptídeo de procolagênio (tipo III). O peptídeo foi libertado dos sais presentes por diãlise contra água destilada e foi liofilizado. Purificou-se ainda por passagem numa coluna de agarose A 1,5 M (2x120 cm) equilibrada com CaCl₂ 1 M e tris.HCl 0,05 M a pH 7,5.

EXEMPLO 2

Produção de Hibridomas.

Imunizaram-se por via intramuscular

ratos da estirpe SJL com 5 pg de peptídeo de procolagénio(tipo III), obtido de acordo com o Exemplo 1, na presença de adjuvante de Freund completo. Apõs 4 semanas e após 3 meses reforçou-se a reacção imune por uma nova injecçao intramuscular de 5 jig de pep tídeo de procolagénio (tipo III) na presença de adjuvante de Freund incompleto. Três dias antes da fusão reforçou-se a respos ta imune por injecção intraperitoneal de mais 50 pg de peptídeo de procolagénio (tipo III).

Para a fusão sacrificaram-se os ani mais e isolaram-se as células do baço. As células de baço foram fundidas com células da linha de células de mieloma P3X63AG8.653 na presença de polietilenoglicol. 0 híbrido células de baço x P3X63AG8.653 foi seleccionado por cultura da mistura de fusão em meio de hipoxantina-aminopterina-timidina num período de duas se manas. A fim de conseguir uma linha de células estável, os clones celulares obtidos foram subclonados várias vezes. As colónias de células resultantes foram ensaiados quanto à produção de anticorpos por meio de um ensaio de ligação radioimunológico. A linha de células obtida, a partir da qual se obtém o anticorpo monoclonal P III P 296, encontra-se depositada na ECACC sob o nu mero 87042308.

EXEMPLO 3

Ensaio de Ligação Radioimunológico

Incubaram-se dum dia para o outro

300 jjI do sobrenadante da cultura das células ou outra amostra, como por exemplo o líquido ascítico apõs crescimento das células na cavidade abdominal de ratos, com 100 F¹ de uma solução de pep tídeo de procolagénio (tipo III) com 1-125 (1 ng de proteína/100 F¹ preparado como descrito na EP 4940, Exemplo 1). Os complexos antigene-anticorpo formados foram precipitados por adição de soro de IgG anti-rato de cabra ou de outras espécies. Após centrifugação e decantação do sobrenadante, a quantidade de radioactividade precipitada foi determinada num espectrómetro de cintilação tf .

EXEMPLO 4

Ensaio Radioimunolõgico

Incubaram-se de um diapara o outro a 49 C 0,2 ml da amostra a analisar ou do padrão de peptídeo de procolagênio (tipo III) com uma quantidade limitante de P III P 296 (em 0,1 ml de tampão) em relação à quantidade do antigene marcado e 0,1 ml de peptídeo de procolagênio (tipo III) marcado com 1-125 (contendo 1 ng de proteína). Em seguida incubou-se durante 1 h com uma quantidade previamente ensaiada de soro de IgG anti-rato de cabra na presença de 10% de polietilenoglicol (PEG 6000) . Os complexos antigene-anticorpo formados foram separados por centrifugação (1500 x g) e aquantidade de radioactividade foi determinada num espectrómetro de cintilação y apõs decantação.

Por comparação com uma curva padrão, para cuja construção se utilizaram padrões com diferentes quanti dades de peptídeo de procolagênio (tipo III), ê possível determi nar a concentração do peptídeo de procolagênio (tipo III) na solução desconhecida. A Figura 1 mostra a curva padrão (1) e curvas de diluição de soro. (2) com P III P 296 (a) em comparação com o processo de acordo com EP 4940 com anticorpos policlonais (b).

EXEMPLO 5

Marcação Radioactiva do P III P 296 Depositaram-se 0,2 ml de uma solução com 0,2 mg do P III P 296 monoclonal em tampão de fosfato 0,05 M a pH 7,4 num tubo de ensaio de poliestireno (12 x 55 mm) 125 e trataram-se com 100 MBq de solução de Na I, tamponizada com 10 pl de tampão de fosfato 0,5 M a pH 7,4. Apôs adição de 50 pl de uma solução aquosa de 20 pg de cloramina T, misturou-se duran te 1 min. Em seguida fez-se terminar a reacção de iodação por adr. ção de 50 pl de uma solução aquosa de 20 pg de dissulfito de sódio.

125

O Na I que nao reagiu foi em se125 guida separado do P III P 296 marcado com I por cromatografia numa resina permutadora de iões. As fracções cromatogrãficas que continham o anticorpo marcado com I foram diluídas com uma so

Q

lução de 20 g de Tween 20 e 14,6 g de Na₂ EDTA num litro de tampão de tris.HCl 0,05 Ma pH 8,0 de tal modo gue a concentração final do anticorpo marcado era de 200 pg/l.

EXEMPLO 6

Revestimento dos tubos de ensaio com o anticorpo

A fim de revestir com o anticorpo tubos de ensaio de poliestireno (12 x 75 mm) depositaram-se em cada tubo 300 pl de uma solução de 4 mg de Ρ III P 296 monoclonal por litro de tampão de fosfato de sódio 0,01 M a pH 6,4 e in cubou-se de um dia para o outro, â temperatura ambiente. Em segui da retirou-se a solução de anticorpo por aspiração. Após esta operação, deitaram-se em cada tubo 500 pl de uma solução a 1% de albumina de soro de bovino em tampão de tris-citrato 0,05 M a pH

7,5 e incubou-se de um dia para o outro ã temperatura ambiente. Finalmente retirou-se a solução por aspiração. Os tubos contendo o anticorpo revestindo a superfície foram secos sobre gel de sílica.

EXEMPLO 7

Ensaio imunorradiomêtrico

Incubou-se 0,1 ml da amostra a analisar ou 0,1 ml do padrão de procolagénio (tipo III) em cada tubo de ensaio de poliestireno gue tinha sido previamente revestido ã superfície com 1,2 pg do Ρ III P 296 monoclonal, com adição de 0,1 ml de solução salina tamponizada por fosfato (phosphate buffered saline, PBS) a temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida lavaram-se os tubos de ensaio duas vezes com 1 ml de PBS em cada lavagem e decantou-se. Após esta operação, adicionaram-se a cada tubo 200 pl de anticorpo Ρ III P monoclonal marcado

125 * ⁹ com I (conteúdo de 40 ng do anticorpo) e incubou-se durante haas ã temperatura ambiente. Determinou-se no aparelho de medição de cintilação a radioactividade do complexo anticorpo-antige ne- I-anticorpo ligado à parede dos tubos de ensaio após duas

lavagens com 1 ml PBS em cada lavagem e decantação final.

A concentração de peptídeo de lagênio (tipo III) na solução da amostra desconhecida pode calculada por comparação com uma curva padrão estabelecida padrões contendo diferentes quantidades de peptídeo de procolagê nio (tipo III). A Figura 2 mostra a curva padrão da analise radioimunomêtrica. (B/T significa: anticorpo ligado/total).

proco ser com

EXEMPLO 9

Determinação da distribuição de peso molecular do antigene que reage no soro humano com P III P 296

Submeteu-se 1 ml de soro a uma cromatografia em coluna de filtração em gel através dum alildextrano reticulado com Ν,Ν'-metilenobisacrilamida /coluna de Sephacryl S 300 (1,6 x 130 cm)./ equilibrado em solução salina tamponi zada com fosfato (Phosphate buffered saline, PBS) com 0,04% de um detergente não iõnico, por exemplo com um monolaurato de sorbitol polietoxilado (Tween 20), separando-se em fracções com 3,3 ml. Submeteram-se alíquotas das fracções de 0,2 ml ao ensaio radioimunolõgico de acordo com o exemplo 4. A Figura 3 mostra o per fil de eluição do antigene determinado por meio de P III P 296 em comparação com o perfil do antigene determinado mediante o uso dos anticorpos policlonais:

Pico 4/4a corresponde ao pN-colagénio e ao procolagênio (tipo III) aminoterminal intacto

Pico 5/5a corresponde ao peptídeo de procolagênio (tipo III) = = (P III P)

Pico 6/6a corresponde a Col 1 bem como a produtos de decomposição do peptídeo de procolagênio (tipo III) aminoterminal com peso molecular idêntico a Col 1.

A concentração das substâncias nas fracções correspondentes pode ser determinada por meio de uma curva padrão de peptídeo de procolagênio (tipo III).

Claims

an ticorpo monoclonal contra o peptídeo de procolagenio aminoterminal a)

Processo para, a preparação de um

b)

c)

d) (tipo III) caracterizado por se imunizarem animais com peptídeo de procolagenio aminoterminal (tipo III) se fundirem os linfõcitos resultantes com células de mieloma, se seleccionarem od híbridos com respeito à ocorrência de um anticorpo (contra o peptídeo de procolagenio aminoterminal (tipo III), e clonarem-se estes híbridos e se isolarem a partir dos clonais que apresentam a tra o procolagenio (tipo nio PN (pico 4a), contra

III) aminoterminal intacto (pico 5a)' bem como Col 1 e produtos de decomposição do peptídeo de procolagenio aminoterminal com o mesmo peso molecular de referidos clones os anticorpos mono reacção apresentada na Figura 3 con III) intacto e contra o procolagéo peptídeo de procolagenio (tipo

CO1 (tipo III)

1 (pico 6a).
2Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se utilizar a linha de células de hibri. doma ECACC 87042308 para a realização da fase d).

Processo para a determinação imunolõgica quantitativa de peptídeo de procolagenio (tipo III) com anticorpos caracterizado por

a) se fazer reagir uma amostra líquida contendo peptídeo de pro colagênio (tipo III) aminoterminal ou procolagénio (tipo III? com anticorpos monoclonais obteníveis de acordo com a reivin dicação 1 e

b) se determinar a quantidade do peptídeo de procolagénio (tipo III) aminoterminal ou de procolagénio através do complexo an tigene-anticorpo formado.