DK169583B1 - Monoklont antistof, fremgangsmåde til dets fremstilling, hybridomcellelinie, der producerer antistoffet, fremgangsmåde til kvantitativ immunologisk bestemmelse af prokollagen-peptid (type III) med antistoffet, samt diagnostisk præparat indeholdende det monoklonale antistof - Google Patents

Description

DK 169583 B1

Opfindelsen angår et monoklont antistof, en fremgangsmåde til dets fremstilling, en hybridomcellelinie, der producerer antistoffet, en fremgangsmåde til kvantitativ immunologisk bestemmelse af prokollagen-peptid (type III) 5 med antistoffet, som et diagnostisk præparat, der indeholder det monoklonale antistof.

Prokollagenpeptid (type III) er det aminoterminale propeptid for kollagen (type III), som efter secernering af prokollagen (type III)-molekylet fraspaltes ekstracellulært.

10 Med en radioimmunologisk bestemmelsesmetode, således som den er beskrevet i EP-patentskrift nr. 4940, kan koncentrationen af dette prokollagenpeptid i legemsvæsker bestemmes. Kendskab til serumkoncentrationen af peptidet tillader udsagn om aktiviteten af fibrotiske sygdomme, f.eks. i leveren (H.

15 Rohde et al., Eur. J. Clin. Invest. 9, 451-459 (1979)).

Den nøjagtige, selektive bestemmelse af prokollagenpeptid (type III) i serum og andre legemsvæsker er imidlertid ikke mulig med de tidligere beskrevne metoder, da de poly-klonale antistoffer, som anvendes ved disse metoder, reagerer 20 med forskellige, i serum forekommende antigener, der til dels er nedbrydningsprodukter af prokollagenpeptid (type III), med forskellig, lav affinitet (O. Niemelå et al., Clin. Chim. Acta 124. 39-44 (1982)). Dette fører til, at serumsfortyndingskurverne og fortyndingskurverne for andre 25 legemsvæsker ikke er parallelle med den standardkurve, som er opstillet med rent prokollagenpeptid (type III), og at antigenindholdet af hver ukendt prøve derfor må bestemmes i flere fortyndinger for at måle antigenkoncentrationen over fortyndingskurvens 50%'s indfangning.

30 Ved hjælp af fremgangsmåden ifølge EP-patentansøgning nr. 0.089.008 er det muligt at løse dette tekniske problem, idet der anvendes antistoffer, som har sammenlignelig aktivitet for prokollagenpeptid (type III) og dets nedbrydningsprodukt Col 1. Med denne fremgangsmåde bestemmes intakt 35 og sønderdelt prokollagenpeptid (type III) sammen, hvilket dog fører til unøjagtighed i det diagnostiske udsagn, da DK 169583 B1 2 normalkollektiv og patientkollektiv kan overlappe hinanden stærkt.

Overraskende har man nu fundet frem til et monoklonalt antistof, som ikke reagerer med de i legemsvæsker forekom-5 mende nedbrydningsprodukter af prokollagenpeptid (type III).

Med dette monoklonale antistof er en immunologisk bestemmelse af det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) blevet mulig, ved hvilken bestemmelse peptidets nedbrydningsprodukter ikke medbestemmes, og som udmærker sig ved, at serum-10 fortyndingskurver, fortyndingskurver for andre legemsvæsker og standardkurven viser komplet parallelitet.

Opfindelsen angår: 1. Et monoklonalt antistof, som har specifik virkning mod en epitop på intakt prokollagen (type III), pN-kollagen 15 og intakt aminoterminalt prokollagenpeptid (type III), men udviser en svag reaktion mod Col 1 og nedbrydningsprodukter af det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvægt som Col l.

20 2. En hybridomcellelinie, som producerer et antistof ifølge opfindelsen, og som er dannet ved fusion af af celler fra en myelomacellelinie og lymfocytter fra et i forvejen med prokollagenpeptid (type III) immuniseret dyr.

25 3. En fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof imod aminoterminalt prokollagenpeptid (III), ved hvilken a) dyr immuniseres med aminoterminalt prokollagenpeptid (type III), 30 b) lymfocytter udvindes og fusioneres med myelomaceller, c) hybrider udvælges og klones med henblik på, at der foreligger et antistof med de ovenfor angivne egenskaber, og d) antistoffet udvindes fra de nævnte kloner.

35 DK 169583 B1 3 4. En fremgangsmåde til kvantitativ immunologisk bestemmelse af prokollagenpeptid (type III) med antistoffer, ved hvilken a) en flydende prøve, som indeholder aminoterminalt 5 prokollagenpeptid (type III) eller prokollagen (type III), bringes til omsætning med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, og b) · mængden af det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) eller prokollagenet bestemmes via det dannede antigen- 10 -antistof-kompleks.

5. Et diagnostisk præparat til kvantitativ immunologisk bestemmelse af prokollagenpeptid (type III) med antistoffer, hvilket præparat består af en virksom mængde af det mono- 15 klonale antistof ifølge opfindelsen i blanding med et diagnostisk acceptabelt bærestof.

I det følgende belyses opfindelsen detaljeret, især de foretrukne udførelsesformer, under henvisning til tegnin-20 gen, hvor fig. 1 viser standardkurverne (1) og serumfortyndingskurverne (2) med henholdsvis PIIIP 296 (a) og poly-klonale antistoffer (b), fig. 2 viser standardkurven til en radioimmunometrisk 25 analyse, og fig. 3 viser reaktionsmønsteret for det monoklonale antistof PIIIP 296 og for polyklonale antistoffer.

Til fremstilling af det monoklonale antistof kan dyr, fortrinsvis pattedyr, f.eks. mus, rotter, kaniner og 30 marsvin, i nærværelse af adjuvans immuniseres med prokollagenpeptid (type III), som er isoleret ved fremgangsmåden ifølge EP-patentskrift nr. 4940. Fortrinsvis anvendes der mus, især dem af SJL-stammen. Med gentagne sekundærinjek-tioner, f.eks. med mellemrum på 4-8 uger, forstærkes immun-35 reaktionen. Et godt resultat af immuniseringen kontrolleres ved bestemmelse af koncentrationen af antistoffer ved den DK 169583 B1 4 radioimmunologiske bindingsprøve (R. Timpl og L. Risteli, Immunochemistry of the extracullular matrix, H. Furthmayr, udgiver, bind 1, 199 (1982)). Nogle dage før fusionen af lymfocytterne med en myelomacellelinie behandles dyrene 5 med prokollagenpeptid (type III) uden adjuvans. Dyrenes lymfocytter udvindes og fusioneres med en myelomacellelinie, som ligeledes kan stamme fra én af de ovenfor nævnte dyrearter, dog fortrinsvis fra mus, især med cellelinien P3X63AG8.-653. Lymfocytter fusioneres med fordel med myelomacellelinier 10 fra samme dyreart. Fusionen og den videre dyrkning af celleklonerne gennemføres på en for fagmanden kendt måde, idet koncentrationen af specifikke antistoffer bestemmes i den ovenstående væske i cellekulturen ved hjælp af en immunologisk bindingsprøve. Fra de ved fusionen opstående cellekloner 15 udvælges egnede kloner til anvendelsen ved immunologiske fremgangsmåder. Særligt foretrukket arbejdes der med en cellelinie, som fremstilles ved fusion af lymfocytter fra mus af SJL-stammen imod prokollagenpeptid (type III) med musemyelomacellelinien P3X63AG8.653. Denne cellelinie er 20 deponeret ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP40JG, GB, under nummeret 87042308.

De her omhandlede, monoklonale antistoffer hører hjemme i immunoglobulingruppen, fortrinsvis i klasserne 25 IgG-, IgA- og IgM-proteiner. Antistoffer af IgG-klassen, især af underklassen IgG2b, kan anvendes med særlig fordel.

Det her omhandlede antistof er især overraskende, fordi dets affinitet til antigenet er højere end affiniteten af polyklonale antistoffer. Sædvanligvis når man til det mod-30 satte resultat. Egenskaberne af det monoklonale antistof bliver gjort tydelige ved hjælp af det fra cellelinien ECACC 87042308 udvundne, monoklonale antistof PIIIP 296, når de i serum tilstedeværende antigener opdeles efter deres molekylvægt via gelfiltreringschromatografi, og fraktionerne fra 35 chromatografien anvendes ved radioimmunoafprøvning. Derved viser det sig, at den antigenfraktion, som medbestemmes ved DK 169583 B1 5 analyse med polyklonale antistoffer, og som har molekylvægten af nedbrydningsproduktet Col 1, ikke medbestemmes af det monoklonale antistof ifølge opfindelsen. I fig. 3 på tegningen er vist elueringsprofilen af gelfiltreringschromatografi 5 af humant serum, således som det monoklonale antistof viser den, i sammenligning med elueringsprofilen, som polyklonale antistoffer viser den. Spids 4/4a svarer til intakt prokolla-gen (type III) hhv. pN-kollagen (type III) (H. Rohde et al., Eur. J. Biochem. 135. 197 (1983)). Spids 5/5a svarer 10 til intakt, aminoterminalt prokollagenpeptid (type III) (P III P), medens spids 6/6a svarer til Col 1 samt til nedbrydningsprodukter af det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvægt som Col 1 (H. Rohde et al., Eur.

J. Biochem 135. 197 (1983)). Koncentrationen af stoffer i 15 de tilsvarende fraktioner kan bestemmes ved hjælp af en standardkurve for prokollagenpeptid (type III).

Til fremstillingen af de her omhandlede antistoffer er det vigtigt, at der står en egnet kilde til udvinding af antigenet til rådighed. Som ovenfor nævnt isoleres humant 20 eller animalsk, højrenset prokollagenpeptid (type III) med fordel ved fremgangsmåden ifølge EP-patentskrift nr. 4940, idet væv eller pathologiske legemsvæsker nedbrydes med kollagenase, og prokollagenpeptidet skilles fra reaktionsopløsningen og renses ved kombination af chromatografiske metoder 25 og/eller immunoadsorption.

De her omhandlede, monoklonale antistoffer kan anvendes ved forskellige, immunologiske metoder, herunder alle former for radioimmunoafprøvninger, f.eks. sekventiel mætningsanalyse eller ligevægtsanalyse, eventuelt efter mærkning 30 med chloramin T eller Bolton-Hunter-reagens (Felber, Meth. Biochem. Anal. 22, 1 (1974); Shelley et al., Clin. Chem.

19. 146 (1975)), samt ved andre konkurrerende og ikke-konkur-rerende bindingsafprøvninger, såsom fluorescens-, enzym-, chemiluminescens- eller andre immunoafprøvninger, herunder 35 immunoradiometrisk afprøvning (IRMA). Det monoklonale antistof kan derfor anvendes ved immunologiske metoder til iso- DK 169583 B1 6 lering og karakterisering samt til kvantitativ bestemmelse af prokollagenpeptid (type III) i væv og legemsvæsker. Der gås frem efter for fagmanden kendte metoder, idet en flydende prøve, som indeholder prokollagenpeptid (type III), bringes 5 til reaktion med det her omhandlede monoklonale antistof, enten i opløsning eller på en fast bærer, og mængden af prokollagenpeptid (type III) bestemmes via det dannede anti-gen-antistof-kompleks. Det spiller her ingen rolle, om prokollagenpeptid (type III) stadigvæk er knyttet sammen med 10 aminoendedelen af prokollagen (type III) eller ikke. De hidtil ved den immunologiske bestemmelse forstyrrende nedbrydningsprodukter af prokollagenpeptid (type III), især Col 1, medbestemmes ikke af det her omhandlede antistof.

I de efterfølgende eksempler illustreres opfindelsen 15 yderligere. Procentangivelser er efter vægt, medmindre andet er angivet.

Eksempel 1.

Fremstilling af prokollagenpeptid ftvpe ΙΙΙΪ (P III P>.

20 Prokollagenpeptid (type III) fremstilles ved indvirk ning af kollagenase på prokollagen (type III) ved 37°C. Herved udsættes peptidet ikke for nogen denatureringsmidler.

Til fremstilling af større mængder af peptidet anvendes en modificeret metode. Alle fremgangsmådeskridt indtil indvirk-25 ningen af kollagenasen gennemføres i kølerum. De forskellige NaCl-opløsningen, som anvendes til opløseliggørelse, indeholder 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,01 M EDTA, natriumazid (200 mg/ml) og proteaseinhibitorerne phenylmethylsulfonyl-fluorid (3 Mg/ml) og p-chlormercuribenzoat (3 Mg/ml).

30 3 kg kalvefosterhud homogeniseres i 10 1 1 M NaCl og ekstraheres 2 døgn. Opløst kollagen fælles fra ekstraktionsopløsningen ved tilsætning af fast NaCl til en slutkoncentra-tion på 2,5 M. Efter omrøring natten over samles udfældningen ved centrifugering (1800 x g, 20 minutter), vaskes to gange 35 med 2,5 M NaCl og opløses igen, idet den omrøres natten over i 10 liter 0,5 M NaCl. Små mængder uopløseligt materiale DK 169583 B1 7 fjernes ved centrifugering. Den således opnåede blanding af kollagen (type III) og prokollagen (type III) fældes med 1,6 M NaCl. Derefter suspenderes bundfaldet i 2 liter 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) og opvarmes efter tilsætning af 0,02 M 5 CaCl2 i 20 minutter ved 50°C og inkuberes derefter i 3 timer ved 37° C sammen med 1500 enheder bakteriel kollagenase (CLSPA, Worthington, USA) pr. gram fugtigt bundfald. Efter indvirkning af kollagenasen skilles det dannnede bundfald fra ved centrifugering, og opløsningen dialyseres imod 0,005 10 M Tris-HCl, pH 8, 6,8 M urinstof og fyldes på en DEAE-cellu-losesøjle (5,0 x 30 cm), som er ækvilibreret med samme puffer.

De på søjlen bundne proteiner udvaskes med en NaCl--opløsninger, hvis koncentration stiger fra 0 til 0,3 M.

15 Den samlede elueringsmængder andrager 2 liter. Den fra søjlen udstrømmende opløsning afprøves for adsorption ved 236 nm og dens antigenaktivitet ved anvendelse af antistoffer, som er specifikke for det aminoterminale segment af prokollagen (type III). Normalt indeholder den sidste spids, som elueres 20 for søjlen, prokollagenpeptid (type III). Peptidet afsaltes ved dialyse imod destilleret vand og lyofiliseres. Den videre rensning sker på en søjle (2 x 120 cm) med agarose A 1,5 M, som er ækvilibreret med 1 M CaCl2, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5.

25 Eksempel 2.

Hvbridomaproduktion.

Mus af SJL-stammen immuniseres intramuskulært med 5 Aig prokollagenpeptid (type III), som er fremstillet ifølge eksempel 1, nærværelse af Freund's komplette adjuvans. Efter 30 4 uger og efter 3 måneder forstærkes immunreaktionen ved hjælp af en yderligere intramuskulær injektion af 5 /ig prokollagenpeptid (type III) i nærværelse af Freund's ukomplette adjuvans. 3 dage før fusionen forstærkes immunreaktionen ved intraperitoneal injektion af yderligere 50 μg prokol-35 lagenpeptid (type III).

Til fusion dræbes dyrene, og miltcellerne isoleres.

DK 169583 B1 8 I nærværelse af polyethylenglycol fusioneres miltcellerne med myelomacellelinien P3X63AG8.653. Ved dyrkning af fusionsblandingen i hypoxanthin-aminopterin-thymidin-medium i et tidsrum på 2 uger selektioneres for miltcelle x P3X63AG8.653-5 -hybrider. Til opnåelse af en stabil cellelinie underklones de fremkomne cellekloner flere gange. De opståede cellekolonier afprøves for antistofproduktion ved radioimmunologisk bindingsprøve. Den opståede cellelinie ud fra hvilken man udvinder det monoklonale antistof P III P 296, er deponeret 10 hos ECACC under nummeret 87042308.

Eksempel 3.

Radioimmunobindinasafprøvning.

300 /iliter ovenstående cellekulturvæske eller en 15 anden prøve, f.eks. ascites efter dyrkning af celler i bughulen på mus, inkuberes natten over med 100 μΙίΐβΓ af en opløsning af 125 I prokollagenpeptid (type III) (1 ng pro-tein/100 eliter, fremstillet som beskrevet i EP 4940, eksempel 1). De dannede antigen-antistof-komplekser udfældes ved 20 tilsætning af anti-muse-IgG-serum fra får eller en anden dyreart. Efter centrifugering og afdekantering af den ovenstående væske bestemmes mængden af udfældet radioaktivitet på 'r-scintillationsspektrometer.

25 Eksempel 4.

Radioiimmunoafprovnina.

0,2 ml af den prøve, som skal analyseres, eller af prokollagenpeptid (type III)-standard inkuberes natten over ved 48 C med en med hensyn til mængden af mærket antigen 30 begrænsende mængde af P III P 296 (i 0,1 ml puffer) og 0,1 ml 125 I-mærket prokollagenpeptid (type III) (indeholder 1 ng protein). Derefter inkuberes i 1 time med en i forvejen afprøvet mængde anti-muse-IgG-serum fra får i nærværelse af 10% polyethylenglycol (PEG 6000). De udfældede antigen-anti-35 stof-komplekser fracentrifugeres (1500 x g) , og efter frade-kantering bestemmes radioaktiviteten i Tr-scentillationsspek- DK 169583 Bl 9 trometer.

Ved sammenligning med en standardkurve, til hvis opstilling der anvendes standard med forskellige mængder prokollagenpeptid (type III), kan koncentrationen af prokol-5 lagenpeptid (type III) i den ukendte opløsning bestemmes. Figur 1 på tegningen viser standardkurven (1) og serumfortyndingskurver (2) med P III P 296 (a) sammenlignet med fremgangsmåden i EP-patentskrift nr. 4940 med polyklonale antistoffer (b).

10

Eksempel 5.

Radioaktiv mærkning af P III P 296.

0,2 ml af en opløsning med 0,2 mg af det monoklonale P III P 296 i 0,05 M phosphatpuffer, pH 7,4, fyldes i et 15 polystyrenreagensglas (12 x 55 mm) og blandes med 100 MBq Na125I-opløsning, pufret med 10 eliter 0,5 M phosphatpuffer, pH 7,4. Efter tilsætning af 50 ^liter af en vandig opløsning af 20 μg chloramin T blandes i 1 minut. Derefter afsluttes ioderingsreaktionen ved tilsætning af 50 μΐiter af en vandig 20 opløsning af 20 μg natriumdisulfit.

Det ikke-omsatte Na125I skilles derefter fra det 125i_mærkede P III P 296 ved chromatografi på en anionbytter.

De chromatografiske fraktioner, som indeholder de oprensede 125I-mærkede antistoffer, fortyndes med en opløsning af 20 25 g "Tween ® 20" og 14,6 g Na2EDTA i en liter 0,05 M Tris- -HCl-puffer, pH 8,0, således at koncentrationen af det mærkede antistof andrager 200 μg/liter.

Eksempel 6.

30 Antistofbelæoning af forsøasreaaensqlas♦

Til fiksering af antistofferne på polystyrenreagensglas (12 x 75 mm) fyldes i hvert enkelt glas 300 pliter af en opløsning af 4 mg monoklonalt P III P 296 pr. liter 0,01 M natriumphosphatpuffer, pH 6,4, og der inkuberes natten 35 over ved stuetemperatur. Derefter frasuges antistofopløsningen. Dernæst fyldes i hvert enkelt glas 500 μΙ^βΓ af en DK 169583 B1 10 1%'s opløsning af okseserumalbumin i 0,05 M Tris-citrat--puffer, pH 7,5, og der inkuberes natten over ved stuetemperatur. Dernæst frasuges opløsningen. De antistofbelagte reagensglas tørres over silicagel.

5

Eksempel 7.

Immunradiometrisk afprøvning.

0,1 ml af den prøve, som skal analyseres, eller 0,1 ml prokollagen (type III)-standard inkuberes ved stuetempe-10 ratur i 2 timer i polystyrenreagensglas, som i forvejen er belagt med 1,2 Mg af monoklonalt P III P 296, under tilsætning af 0,1 ml phosphatpufret kogsaltopløsning (PBS). Derefter vaskes reagensglassene 2 gange med hver gang 1 ml PBS og dekanteres. Derpå fyldes i reagensglassene 200 Mliter 15 125I-mærket, monoklonalt P III P-antistof (indeholder 40 ng antistof), og der inkuberes timer ved stuetemperatur. Radioaktiviteten af de til reagensglasvæggen bundne antistof--antigen-125l-antistof-komplekser bestemmes i et scintil-lationsmåleapparat efter 2 gange vask med hver gang 1 ml 20 PBS og efterfølgende dekantering.

Ved sammenligning med en standardkurve, til hvis opstilling der er anvendt standarder med forskellige mængder af prokollagenpeptid (type III), kan koncentrationen af prokollagenpeptid (type III) i den ukendte prøveopløsning 25 beregnes. Figur 2 på tegningen viser standardkurven til den radioimmunometriske afprøvning. B/T betyder: antistof bun-det/totalt.

Eksempel 8.

30 Bestemmelse af molekvlvæatfordelinqen for de med P III P 296 reagerende antigener i humant serum.

1 ml serum opdeles ved gelfiltreringschromatografi over et allyldextran tværbundet med N, N' -methylenbisacrylamid ("Sephacryl ® S 300"-søjle (1,6 x 130 cm)), ækvilibreret i 35 phosphatpufret saltopløsning (PBS) med 0,04% af et ikke-ionisk detergent, f.eks. et polyethoxyleret sorbitolmonolau- DK 169583 B1 11 rat ("Tween ® 20"), i fraktioner med 3,3 ml. 0,2 ml af hver af fraktionerne anvendes ved radioimmunoafprøvningen ifølge eksempel 4. Figur 3 på tegningen viser elueringsprofilen af det ved hjælp af P III P 296 bestemte antigen i sammenligning 5 med profilen af det ved hjælp af de polyklonale antistoffer bestemte antigen:

Spids 4/4a svarer til pN-kollagen og intakt, aminoterminalt prokollagen (type III), spids 5/5a svarer til aminoterminalt prokollagenpeptid (type 10 III)= (P III P), spids 6/6a svarer til Col 1 samt nedbrydningsprodukter af det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) med samme molekylvægt som Col l.

Koncentrationen af stofferne i de tilsvarende frak-15 tioner kan bestemmes ved hjælp af en standardkurve for prokollagenpeptid (type III).

Claims (11)

1. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det har specifik virkning mod en epitop på intakt prokol-lagen (type III), pN-kollagen og intakt aminoterminalt pro- 5 kollagenpeptid (type III), men udviser en svag reaktion mod Col 1 og nedbrydningsprodukter af det aminoterminale prokol-lagenpeptid (type III) med samme molekylvægt som Col 1.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav l, kendetegnet ved, at det har specifik virkning imod en epitop 10 på det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) og pN-kol-lagen, hvilken epitop ikke er til stede på Col 1.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 2, k e n-detegnet ved, at det er tilordnet klassen IgG.

4. Monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst 15 af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det er dannet ved hjælp af et hybridoma, som er opstået ved fusion af celler fra en myelomalinie og af lymfocytter fra et i forvejen med prokollagenpeptid (type III) immuniseret dyr.

5. Monoklonalt antistof P III P 296 fra hybridomacel-20 lelinien ECACC 87042308.

6. Hybridomacellelinie, som producerer et antistof ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at den er dannet ved fusion af af celler fra en myelomacellelinie og lymfocytter fra et i forvejen med prokollagenpeptid (type III) 25 immuniseret dyr.

7. Hybridomacellelinie ECACC 87042308.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof imod aminoterminalt prokollagenpeptid (type III), kendetegnet ved, at 30 a) dyr immuniseres med aminoterminalt prokollagenpeptid (type III), b) lymfocytter udvindes og fusioneres med myelomaceller, c) hybrider udvælges og klones med henblik på, at der foreligger et antistof med de i et hvilket som helst af 35 kravene 1-5 angivne egenskaber, og d) antistoffet udvindes fra de nævnte kloner. DK 169583 B1 13

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at der til gennemførelse af trin d) anvendes hybridomacellelinien ECACC 87042308.

10. Fremgangsmåde til kvantitativ immunologisk bestem-5 melse af prokollagenpeptid (type III) med antistoffer, kendetegnet ved, at a) en flydende prøve, som indeholder aminoterminalt prokollagenpeptid (type III) eller prokollagen (type III), bringes til omsætning med et monoklonalt antistof ifølge et 10 hvilket som helst af kravene 1-5, og b) mængden af det aminoterminale prokollagenpeptid (type III) eller prokollagenet bestemmes via det dannede antigen--antistof-kompleks.

11. Diagnostisk præparat til brug ved fremgangsmåden 15 ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det består af en virksom mængde af det monoklonale antistof ifølge et eller flere af kravene 1-5 i blanding med et diagnostisk acceptabelt bærestof.