JPH0746105B2

JPH0746105B2 - インタ−フエロン−γの免疫化学的測定法および測定用試薬

Info

Publication number: JPH0746105B2
Application number: JP61024639A
Authority: JP
Inventors: 孝一近藤; 伸宏鈴木
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-02-05
Filing date: 1986-02-05
Publication date: 1995-05-17
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: JPS62180270A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はインターフェロン−γの測定法および測定用試
薬に関する。

従来の技術ヒトのインターフェロン（IFN）には、抗原的に異なる
α，β，γ型の少くとも３種のタイプが存在することが
知られている［ネイチャー，286,110（1980）］。イン
ターフェロン−γ（IFN−γ）については、マイト−ジ
エンや抗原刺激によって、主としてＴリンパ球から産生
されることが判っており、別名免疫インターフェロン
（Ｉ−IFN）とも呼ばれている［ザインターフェロン
システム，スプリンガー社，ニューヨーク,11頁−26
頁,1979年］。IFN−γは生体内で、種々の免疫反応にと
もなって産生されることが予想され、免疫調節に重要な
役割を果たしていると考えれている。また、IFN−γの
性質としては、インターフェロン−α（IFN−α）やイ
ンターフェロン−β（IFN−β）と抗原性が異なること
や、誘起剤の種類が異なることの他に、酸や熱に対する
安定性が悪いことなども判っている［ザインターフェ
ロンシステム，スプリンガー社，ニューヨーク,11頁
−26頁，（1979年）］。

一般的にIFNは、生体の産生する抗ウイルス作用をもつ
ものとして定義されているが、この他に多くの生物活性
をもつことが証明されており、特に抗腫瘍効果を有する
点で注目されている［ブラット，55,711−721（198
0）；同誌，55,875−884（1980）］。

腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細胞の増殖を直
接抑制する方法と、宿主の免疫反応を介して、間接的に
腫瘍を抑制する方法が考えられ、後者の場合、例えばナ
チュラルキラー細胞（NK）や、マクロファージの活性
化、或いはキラーＴ細胞の活性化などが考えられる。実
際、IFNには直接作用の他に、この様な種々の免疫増強
活性があることが証明されている［バイオケミカエト
バイオフイジカアクタ，516,231−247（1978）］。
IFN−γはインビトロでのこれら抗腫瘍につながる各種
の活性、およびインビボ於ける抗腫瘍活性が、IFN−α
やIFN−βに比べはるかに高いことから、その重要性が
強く指摘されている［セルラ−イムノロジー，49,390−
394（1980）］。

上記状況のもとで、IFN−γの医薬品としての開発が行
われており、特に遺伝子工学に基づくIFN−γ精製蛋白
質の大量製造法［特開昭59−186995号公報］も確立さ
れ、実用化も間近に来ている。

これに伴い、IFN−γの精製過程，最終製品の純度決定
や品質管理、動物投与時の生体内挙動を調べるため、IF
N−γの抗ウイルス活性に基づく方法［蛋白質核酸酵
素，別冊No.25,“インターフェロン研究の進歩",P355−
363,共立出版，東京（1981）］やIFN−γ関連抗体を用
いる免疫化学的方法［ザ・エンボ・ジャーナル，２,152
7−1530（1983）；特開昭59−186995号公報；特開昭60
−107569号公報など］などが発表されまた用いられてい
る。

発明が解決しようとする問題点上述のとおり、数種のIFN−γの検出・測定法が知られ
ているが、これらの方法は測定感度が限られておりIFN
−γの医薬品としての使用において必須である、品質管
理上あるいは生体内挙動観察上必要なその極微量測定に
適用するには不充分である。

また測定感度のみならず正確にIFN−γ活性物質のみを
認識して行なう方法が要求される。

本発明は、測定用試料を、第１図で示されるポリペプ
チド（Ｉ）と結合し、ペプチド＜Glu−Asp−Pro−Tyr−
Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−
Phe−Asn−Ala−Gly（II）およびペプチドLys−Arg−Ly
s−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Ar
g−Ala−Ser−Gln（III）のいずれとも結合しないモノ
クローナル抗体およびポリクローナル抗インターフェ
ロン−γ抗体のいずれか一方を含有する固定相と他方を
含有する標識体とをサンドイッチ法に付すことを特徴と
するインターフェロン−γの免疫化学的測定法ならびにポリペプチド（Ｉ）と結合し、ペプチド（II）および
ペプチド（III）のいずれとも結合しないモノクローナ
ル抗体およびポリクローナル抗インターフェロン−γ
抗体のいずれか一方を含有する固定相と他方を含有する
標識体とを組合せてなるインターフェロン−γの免疫化
学的測定用試薬を提供するものである。

以下本願明細書において特に注記した場合を除きIFN−
γとは、天然のIFN−γ（nIFN−γ）および遺伝子組み
換え技術で製造されたIFN−γ（rIFN−γ）双方を包含
する。

nIFN−γとは、天然から得られるIFN−γ（例えば、ヒ
ト末梢血リンパ球をインデューサーで誘導したもの）や
そのＮ末端部分またはＣ末端部分を欠くフラグメント
［ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー，
259,6790−6797（1984）］の中、抗ウイルス活性を有す
るものを意味し、通常糖鎖を有する。

rIFN−γには、第１図に示される146個のアミノ酸から
なるポリペプチド（Ｉ）ならびにポリペプチド（Ｉ）の
９番目のアミノ酸がGlnのものおよび140番目のアミノ酸
がGlnのものが包含される。またポリペプチド（Ｉ）の
Ｎ末端アミノ酸から131番目までのアミノ酸残基を含み1
32番目以降のいずれかの部分で切断された15Kスピーシ
ーズやその他のフラグメントも包含する。さらにポリペ
プチド（Ｉ）のＮ末端アミノ酸から４番目までのいずれ
かのアミノ酸残基またはペプチドを欠除したポリペプチ
ドならびにこれらのＣ末端部分を欠く対応するフラグメ
ントをも包含する。

上記モノクローナル抗体は、例えば第１図における22番
目から130番目までのアミノ酸配列を含有するポリペプ
チド（IV）で免疫した動物のリンパ球と、同種または異
種の動物のリンパ球様細胞株とを細胞融合し、上記モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローン化
して製造し、該ハイブリドーマを培養することにより製
造することができる。

動物の免疫に用いる第１図における22番目から130番目
までのアミノ酸配列を含有するポリペプチド（IV）に関
し、前記ポリペプチド（Ｉ）が好ましく、とりわけ大腸
菌を用いて製造された精製rIFN−γ蛋白質（EPC公開第0
110044号公報）が有利に使用できる。

免疫する動物は、羊，山羊，兎，モルモット，ラット，
マウス等の哺乳動物，とりわけそれらの実験動物やニワ
トリ，七面鳥，ウズラ等の鳥類が使われるが、モノクロ
ーナル抗体を得るためには、ラット，マウスが好まし
い。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下，
腹腔内，静脈内，筋肉内，皮内等のいずれのルートから
でも可能であるが、主として皮下，腹腔内，静脈内に
（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。また、接種間
隔，接種量等も可変度は高く、種々の方法が可能である
が、例えば２週間隔で２〜８回接種し、最終免疫後、１
〜５日、好ましくは２〜４日後の脾細胞を用いる方法が
よく用いられる。接種量は１回にポリペプチド量とし
て、マウス当り0.1μｇ以上、好ましくは10μｇ〜300μ
ｇ用いることが望ましい。

またIFN−γのアミノ酸配列の一部を有するペプチド、
例えば前記したペプチド（II）を用いて、上記ポリペプ
チド（Ｉ）と二重免疫によっても製造することができ
る。すなわち、例えばまずポリペプチド（Ｉ）を接種
し、その後ペプチド（II）の蛋白質複合体を接種し、さ
らにポリペプチド（Ｉ）およびペプチド（II）の蛋白質
複合体を合わせて接種する。なおこの免疫方法において
は、接種の順序および免疫原の構成は自由に変更でき、
各接種時の免疫原の総量は上記の範囲で行う。

リンパ球源として脾臓細胞を用いる場合において、脾臓
を摘出する場合はその前に、部分採血を行い、血中の抗
体価の上昇を確認した上で、融合実験を行うことが望ま
しい。

上記リンパ球とリンパ球様細胞株との細胞融合は、例え
ば免疫したマウスのリンパ球（とりわけ脾臓細胞由来の
もの）をヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ欠損（HGPRT^-）やチミジンキナーゼ欠
損（TK^-）の様なマーカーを持った適切な同種または異
種動物（好ましくは同種）のミエローマ等の、リンパ球
様細胞株との間で融合させる。融合には、センダイウイ
ルス，ポリエチレングリコール（PEG）等の融合剤が用
いられる。もちろんジメチルスルホキシド（DMSO）その
他の融合促進剤を加えることも可能である。PEGの重合
度は、ふつう1000〜6000,時間は0.5〜30分，濃度は10％
〜80％等が用いられるが、好ましい条件の一例として、
PEG6000を35〜55％で４〜10分処理することにより、効
率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン培地［HAT培地；ネ
イチャー，256,495−497（1975）］等を用いて、選択的
に増殖させることが出来る。

マウスの血清や増殖して来た細胞の培養上清は、目的と
する抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行
うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に
行うことが出来る。即ち、放射線免疫測定法（RIA法）
または酵素免疫測定法（EIA法）等の方法で調べること
が出来るが、これらの方法についても種々の変法が可能
である。好ましい測定法の一例として、EIAを用いる方
法について述べる。固相にrIFN−γを常法に従って固定
（例えば96穴のマイクロタイタ−プレートを固相として
用いるとマルチスキャン等を用いた迅速な測定が可能と
なり有利である）させておき、これに測定したい培養上
清や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（以下４〜
40℃を示す）で反応させる。この後、反応物をよく洗っ
た後、酵素で標識した抗マウス抗体（山羊，兎などのポ
リクローナル抗体に例えばホースラディッシュペルオキ
シダーゼ等の酵素を結合したものを市販品として入手出
来る）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応物を
よく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定温で反応
させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光強度等で
測定することができる。

選択培地で増殖を示し、かつIFN−γへの結合能や免疫
に用いたポリペプチド（IV）に対する抗体活性のみられ
たウエルの細胞は、限界希釈法等によりクローニングを
行うことが望ましい。クローン化された細胞の上清につ
いて同様にスクリーニングを行い抗体価の高いウエルの
細胞を増やすことにより、免疫したポリペプチド（IV）
と反応性を示すと考えられるモノクローナル抗体産生ハ
イブリド−マクローンが得られる。

これらポリペプチド（IV）と反応性を示すハイブリドー
マやそのクローンの産生するモノクローナル抗体がIFN
−γのどの部分を認識するかということを調べること
は、単にモノクローナル抗体を特定化するという意味だ
けでなく、IFN−γの検出や精製におけるモノクローナ
ル抗体の使い方を明確にし、また認識部位の異なる複数
のモノクローナル抗体の組み合わせによる応用展開を広
くする上で重要である。

この目的のためには、例えばペプチド（II），ペプチド
（III）および第１図における５番目から146番目までの
アミノ酸からなるポリペプチド（Ｖ）［特開昭61−5096
号公報］を用いることにより、上記により得られるモノ
クローナル抗体が、rIFN−γのＮ末端部分を認識してい
るか、Ｃ末端部分を認識しているか、或いはＮ末端,C末
端以外の部分を認識しているかを容易に知ることができ
る。即ち、ポリペプチド（IV）に反応性のあるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング
法について前に述べたが、この方法の中で、固相にポリ
ペプチド（IV）を固定する代りに、ペプチド（II）また
はペプチド（III）を用いる方法により有利にこの目的
を達成することができる。

さらにこれらクローンの産生する抗体がnIFN−γ（例え
ばヒト末梢血リンパ球からレクチンとホルボールエステ
ル等で誘導したもの）およびrIFN−γ（例えばポリペプ
チド（Ｉ），ポリペプチド（Ｖ）など）を吸収する能力
について生物活性を用いて調べることができる。その方
法として有利に用いられる一例を次に述べるが、もちろ
ん種々の変法も可能である。例えばウサギ抗マウスイム
ノグロブリン抗体をセルロースビーズ等の担体に常法に
従いカプリングさせておき、これに測定したいハイブリ
ドーマ上清またはマウスの血清を加え、一定時間、定温
で反応させる。この後反応物をよく洗い一定量のIFN−
γを加える。IFN−γとして、例えばnIFN−γやrIFN−
γを加えた後、一定時間，定温で反応させ、反応上清中
に含まれるIFN−γの活性を測定する。この様にして目
的とする抗体のIFN−γ活性の吸収能を測定することが
できる。

次に、これらクローンの産生する抗体が、rIFN−γ（例
えばポリペプチド（Ｉ），ポリペプチド（Ｖ）など）や
nIFN−γのもつ抗ウイルス作用（以後AVAと略す）を中
和する能力があるか否かを調べることもできる。中和活
性のある抗体の取得は、該抗体が直接生物活性に関連し
た部位を認識していることになるのでIFN−γを含むサ
ンプルから、IFN−γを精製したり、EIA法やRIA法を用
いて定量したりする上に於て、極めて重要である。抗体
の中和活性は例えば次の様にして測ることができる。即
ち、一定量のIFN−γに対して大過剰量の抗体を加え、
一定時間、一定温度で反応させた後、反応物をAVAにて
測定することができる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。例え
ば、液体培地たとえばPMI−1640に0.1〜40％の牛血清を
加えた培地等で２〜10日間、好ましくは３〜５日間培養
することにより、培養液から該モノクローナル抗体を得
ることができるが、この他にマウス等の適切な哺乳動物
の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取するこ
れにより、細胞培養上清よりも遥かに高力価の抗体を、
多量に効率よく取得することができる。このためには、
例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もって接種
したBALB/C等のマウスに１×10⁴〜１×10⁷個、好ましく
は５×10⁵〜２×10⁶個のハイブリドーマを腹腔内等に接
種し、７〜20日後、好ましくは10〜14日後に腹水液等を
採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分
画,DEAE−セルロースカラムクロマト等により容易にモ
ノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離す
ることができる。

上記で得られるモノクローナル抗体は、下記の性状を有
する。

（１） nIFN−γおよびポリペプチド（Ｉ）と結合す
る。

（２）第１図における第１番目から第131番目までの
アミノ酸からなるポリペプチド（15Kスピーシーズ）と
結合する。

（３）ペプチド（II）およびペプチド（III）のいず
れとも結合しない。

（４） IFN−αおよびIFN−βとは結合しない。

（５） nIFN−γおよびポリペプチド（Ｉ）の抗ウイル
ス活性を中和する。

（６）ポリペプチド（Ｖ）を認識しその抗ウイルス活
性を中和する。

（７）オクタロニー法による検定によりIgG1のサブク
ラスの抗体に属する。

（８） SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、標準免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖の分子量に完
全に一致する２本のバンドのみを示す。

本発明においては、上記モノクローナル抗体に包含され
るモノクローナル抗体WNγ３−29.33がとりわけ有利に
使用できる。

上記本発明に用いられるポリクローナル抗インターフェ
ロン−γ抗体は、rIFN−γもしくはnIFN−γなどIFN−
γに対するポリクローナル抗体で、例えばrIFN−γもし
くはnIFN−γを人以外の温血動物に接種して抗体を形成
せしめ、これを採取することにより得られるポリクロー
ナル抗体が挙げられる。人以外の温血動物としては、た
とえば哺乳動物（例、ウサギ，ヒツジ，ラット，マウ
ス，モルモット，ウシ，ウマ，ブタ），鳥類（例、ニワ
トリ，ハト，アヒル，ガチョウ，ウズラ）などが挙げら
れ、とりわけウサギが有利に用いられる。

抗原として用いるIFN−γとして、rIFN−γ、なかでも
前記ポリペプチド（Ｉ）が好ましく、とりわけ大腸菌を
用いて製造された精製rIFN−γが好ましい。IFN−γを
人以外の温血動物に接種する方法として動物に接種する
抗原量は抗体産生するに有効な量でよく、たとえばウサ
ギに１回約0.1mgないし約2mgをほぼ等容量の生理食塩水
およびフロインドの完全アジュバンド（たとえば容量で
前者１に対し後者0.5〜２の割合）で乳化して、背部お
よび（または）後肢掌皮下に約２ないし約４週間おきに
約３ないし６回接種すると良好な抗体を産生させ得る場
合が好ましい。このようにして、温血動物中に形成され
た抗体を採取する方法としては、たとえばウサギでは、
通常最終接種後約７日から12日の間に耳静脈から採血
し、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清
は所望により、公知の方法に従って塩析し、通常rIFN−
γを保持させた担体を用いるアフィニティ・クロマトグ
ラフィーで吸着した画分を回収することによりポリクロ
ーナル抗体として得ることができる。

本発明においては上記モノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体の２種の抗体はイムノグロブリンでもよ
く、またはそのフラクション｛例、Ｆ（ab′）₂,Fab′
もしくはFab｝であってもよい。

本発明の上記モノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体のいずれか一方を含有する固定相は担体に保持さ
れた該抗体である。担体としては、たとえば、ゲル粒子
（例、アガロースゲル［例、セファロース4B,セファロ
ース6B（ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン社）製］デキストランゲル［例、セファデックスＧ−
75,セファデックスＧ−100,セファデックスＧ−200（フ
ァルマシア・ファインケミカル社製）］，ポリアクリル
アミドゲル［例、バイオゲルＰ−30,バイオゲルＰ−60,
バイオゲルＰ−100（バイオラッド・ラボラトリーズ社
（米国））］，セルロース粒子［例、アビセル（旭化成
製），イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチ
ルセルロース，カルボキシメチルセルロース）］，物理
的吸着剤［例、ガラス（例、ガラス球，ガラスロッド，
アミノアルキルガラス球，アミノアルキルガラスロッ
ド），シリコン片，スチレン系樹脂（例、ポリスチレン
球，ポリスチレン粒子）］，イオン交換樹脂｛例，弱酸
性陽イオン交換樹脂［例、アンバ−ライトIRC−50（ロ
ーム・ハース社（米国）製），ゼオカーブ226（パーム
チット社（西ドイツ）製）］，弱塩基性陰イオン交換樹
脂［例、アンバ−ライトIR−4B,ダウエックス３（ダウ
ケミカル社（米国）製）］｝などが挙げられる。

とりわけ本発明において、ポリスチレン球，ポリスチレ
ン粒子などスチレン系樹脂，ガラス，シリコン片，ポリ
アクリルアミドゲルなどが有利に用いられる。

抗体を担体上に保持するには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば“代謝",第８巻（1971年），第696頁
に記載されているブロムシアン法，グルタールアルデヒ
ド法などが挙げられる。また、より簡単な方法として物
理的に担体表面に吸着させてもよい。

本発明の、上記モノクローナル抗体もしくはポリクロー
ナル抗体の他方を含有する標識体は、抗体と標識剤の結
合物として用いる。標識剤としては、放射性同位元素，
酵素，蛍光物質，発光物質などが挙げられる。

放射性同位元素としてはたとえば¹²⁵I,¹³¹I,³H,¹⁴Cなど
が、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、その例としてはたとえば（１）カルボヒドラー
ゼ［例、グリコシダーゼ（例、β−ガラクトシダーゼ、
β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−フル
クトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダ
ーゼ、α−マンノシダーゼ）、アミラーゼ（例、α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルコア
ミラーゼ、タカアミラーゼＡ）、セルラーゼ、リゾチー
ム］、（２）アミダーゼ（例、ウレアーゼ、アスパラギ
ナーゼ）、（３）エステラーゼ［例、コリンエステラー
ゼ（例、アセチルコリンエステラーゼ）、ホスファター
ゼ（例、アルカリホスファターゼ）、スルファターゼ、
リパーゼ］、（４）ヌクレアーゼ（例、デオキシリボヌ
クレアーゼ、リボヌクレアーゼ）、（５）鉄・ポルフィ
リン酵素（例、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトク
ロームオキシダーゼ）、（６）銅酵素（例、チロシナー
ゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ）、（７）脱水素酵素
（例、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、乳
酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素）などが、蛍光
物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンスイ
ソチオシアネートなどが、発光物質としてはルミノー
ル，ルミノール誘導体，ルシフェリン，ルシゲニンなど
がそれぞれ挙げられる。上記標識剤のうち、酵素とりわ
けペルオキシダーゼが有利に用いることができる。

本発明においては、モノクローナル抗体を含有する固定
相およびポリクローナル抗体を含有する標識体を用いる
ことが好ましい。またポリクローナル抗体は抗体フラク
ション（とりわけFab′が好ましい）として用いること
が好ましい。

標識体の製造法をより具体的に説明するため、以下上記
の場合について説明するが、ポリクローナル抗体を含有
する固定相およびモノクローナル抗体を含有する標識体
を用いる場合も、公知手段に基づき同様に製造すること
ができる。

ポリクローナル抗体と標識剤とを結合させるには公知の
常套手段であるクロラミンＴ法［ネイチャー，194,495
（1962）］，過ヨウ素酸法［ジャーナル・オブ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー，22,1084
（1974）］，マレイミド法［ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー，79,233（1976）］などが用いられる。標
識剤としてペルオキシダーゼを用いる場合、とりわけ特
開昭58−149700号公報記載の一般式［式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。］で表わされる
結合剤が有利に用いられる。

次にサンドイッチ法について、その測定原理を説明す
る。未知量の抗原を含む被検液に担体上に保持された過
剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応），次に標識剤
で標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させる
（第２反応）。担体上に保持された標識剤もしくは担体
上に保持されなかった標識剤の活性を測定する。第１反
応，第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして
行なってもよい。

本発明のサンドイッチ法によるrIFN−γもしくはnIFN−
γの高感度は免疫化学的測定方法は、未知量のrIFN−γ
もしくはnIFN−γを含有する被検試料に固定相を加えて
反応させる（第１反応）。固定相を洗浄したのち、標識
体の一定量を加えて反応させる（第２反応）。次に通
常、固相をよく洗浄し、固相上に結合している標識剤の
活性を測定する。標識剤が放射性同位元素である場合、
ウエルカウンターもしくは液体シンチレーションカウン
ターで測定する。標識剤が酵素である場合、基質を加え
て放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性を測定す
る。標識剤が蛍光物質，蛍光物質であっても、それぞれ
公知の方法に従って測定する。上述のアッセイ方法にお
いて、第１反応と第２反応の間における洗浄を省略して
もよいし、さらに簡略化するために被検液，抗体結合固
相および標識剤で標識した抗体を同時に加えて反応させ
てもよい。

上記本発明のインターフェロン−γの免疫化学的測定用
試薬は、例えば下記測定試薬キットとすることができ
る。

（１）担体上に保持された該モノクローナル抗体（２）標識化された該ポリクローナル抗体（３）０〜10ngの標準rIFN−γもしくはnIFN−γ （４）上記（１）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に用い
るとができる緩衝液であればいずれでもよいが、その一
例としてはpH6〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝
液が挙げられる。）（５）インキュベーション後、担体の洗浄に用いる緩衝
液（該担体の洗浄に用いることができる緩衝液であれば
いずれでもよいが、その一例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。）（６）標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測定に
必要な試薬。その一例として、酵素にペルオキシダーゼ
を用いた場合、ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試
薬，比色法を利用する場合、ｏ−フェニレンジアミンと
過酸化水素、酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好ましく
はクエン酸緩衝液）および反応停止液が挙げられる。

上記キットはたとえば下記の方法により使用することが
できる。

標準rIFN−γ,nIFN−γもしくは被検液約10ないし200μ
に試薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）と
接触させて約０ないし40℃で約１ないし48時間反応させ
る。担体を水洗後、試薬（２）の約10ないし300μを
加えたのち、約０ないし40℃で反応させる。約１ないし
48時間反応後、試薬（５）で洗浄し担体上に結合してい
る標識剤の活性を測定する。標識剤が放射性同位元素で
ある場合、ウエルカウンターもしくは液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、
基質液約10〜1000μを加えて約20〜40℃で約0.2〜24
時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反応液中の
吸光度もしくは蛍光強度を測定する。

本発明のIFN−γの測定法は、用いるモノクローナル抗
体の性状が明確化されており、また標識体の感度が高
い。従ってIFN−γの活性部位を正確に認識し、分解物
等を明確に区別して極めて高感度な信頼性の高いIFN−
γの測定ができる。

作用および実施例以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことはいうまでもない。

参考例に開示するマウスＢハイブリドーマWNγ３−
29.33は、財団法人発酵研究所（Institute for Ferment
ation, Osaka）にIFO−50001として寄託されている。

参考例１（ｉ）免疫原の製造免疫原として用いた、ポリペプチド（Ｉ）（rIFN−γ）
はEPC公開第0110044号公報記載の方法により、ポリペプ
チド（II）と牛サイログロブリンの結合物（IFN−γNP
−TG）は特願昭58−215168号明細書記載の方法により製
造した。

（ii）免疫ポリペプチド（Ｉ）をタンパク量として50μg,フロイン
ドコンプリートアジュバントとよく混合し、７〜８週令
のBALB/C雌マウスの皮下に接種した（初回接種）。初回
接種の２週後、同量のポリペプチド（Ｉ）をフロインド
インコンプリートアジュバント（FIA）とよく混合し、
皮下に接種した（二次接種）。三次・四次接種は２週間
隔で二次接種と同じ方法で行なった。五次，六次，七次
接種は、ポリペプチド（Ｉ）をタンパク量として40μｇ
およびIFN−γNP−TGをタンパク量として40μg,FIAとよ
く混合し、皮下に２週間隔で接種した。七次接種の２週
後、ポリペプチド（Ｉ）25μg,IFN−γNP−TG40μｇに
0.5mlの生理食塩水を加え、静脈内に最終免疫を行なっ
た。

（iii） ELISA法を用いた抗体アッセイ法上記（ii）の方法で免疫したマウスの血清あるいは参考
例１（iv）および（ｖ）で得られたハイブリドーマ培養
上清中の抗体活性はエンザイムリンクドイムノソー
ベントアッセイ（ELISA）法を用いて検索した。即
ち、ポリペプチド（Ｉ）に15μg/mlになるよう0.1M重炭
酸ナトリウムを含有したリン酸緩衝液（pH8.0）を加
え、96ウエルマイクロプレートの各ウエルに100μず
つ分注し、４℃で24時間反応させた。反応後、ウエルの
余剰の結合部位をふさぐため２％牛血清アルブミン（BS
A）含有リン酸緩衝液を100μずつ分注し、４℃24時間
処理し、ELISAに使用するプレートを作成した。

以上のように調製したプレートに血清あるいはハイブリ
ドーマ培養上清100μを加え、24℃で３時間反応させ
た。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、ホースラデイシ
ュベルオキシダーゼ（HRP）でラベルしたヤギ抗マウス
イムノグロブリン抗体を各ウエルに100μ加え、室温
で３時間反応後させた。反応終了後、各ウエルをリン酸
緩衝液でよく洗浄し、10mlの0.1Mクエン酸緩衝液に22mg
のオルソフェニレンジアミン,10μのH₂O₂を加えた酵
素基質溶液100μを各ウエルに加えて、酵素反応を室
温で15分行ない、４規定硫酸で反応を停止させた。反応
停止後、タイターテックマルチスキャン（フロー社製）
を用いて波長492nmで発色色素量を措定し、抗体の活性
を判定した。

（iv）細胞融合およびハイブリドーマ上清の抗体の測
定参考例１（ii）の最終免疫の３日後マウスの脾臓を摘出
し、ステンレスメッシュで圧迫，ろ過し、イーグルズ・
ミニマム・エッセンシャルメディウム（MEM）に浮遊さ
せ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞とし
て、BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3−×63,Ag8.U1
（P3U1）を用いた［カレントトピックスインマイ
クロバイオロジーアンドイムノロジー，81,1−７
（1978）］。細胞融合は、原法［ネイチャー，256,495
−497（1975）］に準じて行なった。即ち、リンパ球含
有脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ血清を含有しないMEM
で３度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5:1になるよ
うに混合して、800回転で15分間遠心分離を行なって細
胞を沈殿させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽く
ほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）6000（コ
ッホライト社製）を0.3ml加え、37℃温水槽中で７分間
静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分2mlの割合
でMEMを添加し、合計12mlのMEMを加えた後600回転15分
間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を10％牛胎
児血清を含有するRPMI1640メディウム（RPMI1640−10FC
S）にP3U1が1ml当り２×10⁵個になるよう浮遊し、24穴
マルチディシュ（リンブロ社製）に１ウエル1mlずつ144
ウエルに播種した。播種後、細胞を37℃で５％炭酸ガス
フラン器中培養した。24時間後、HAT（ヒポキサンチン
１×10^-4M,アミノプテリン４×10^-7M,チミジン1.6×10
^-5M）を含んだRPMI1640−10FCS培地（HAT培地）を１ウ
エル当り1mlずつ添加することにより、HAT選択培養を開
始した。HAT選択培養は、培養開始3,5,7日後に旧液を1m
l捨てたあと、1mlのHAT培地を添加することにより継続
した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後10〜14日で
播種した全ウエルに認められ、培養液が黄変したとき
（約１×10⁶個/ml）、上清を採取し、ポリペプチド
（Ｉ）をコートしたマイクロプレートを用いたELISA法
（参考例１（iii）記載）で、抗体の有無を検討した。
抗体活性は、144ウエル中３ウエルに認められた。

次に、これら３ウエルの抗体が、IFN−γを認識するか
どうか抗ウイルス活性の吸収により検索した。すなわ
ち、ウサギ抗マウスIgG抗体を結合させた３％セルロー
ス溶液500μに培養上清を500μを加え、４℃で24時
間反応させた。反応後セルロースを生理食塩水でよく洗
浄し、2200U/mlのIFN−γを加え、４℃で24時間反応さ
せ、上清中のIFN活性を測定した。IFN−γサンプルとし
て、参考例１（ｉ）記載のポリペプチド（Ｉ）を用い
た。

IFN活性の測定は、マイクロプレートを用いた細胞変性
効果（CPE）リーディング法で測定した［アプライド
マイクロバイオロジー，16,1706−1707（1968）］。す
なわち、96穴マイクロプレート（ヌンク社製）全てのウ
エルに50μのMEMを入れ、最初のウエルにIFNサンプル
を50μ加えて、連続的に２倍希釈を行なった、このよ
うにした各ウエルに、WISH細胞を20％FCS含有MEMに1ml
当り４×10⁵個になるよう調製した細胞浮遊液50μを
加え、24時間,37℃，炭酸ガスフラン器で培養した。培
養後、水泡性口内炎ウイルス（ニュージャーシー株）を
2000TCID₅₀（ティッシュ−カルチュァインフェクティン
グドーズ50）になるようMEMで調整し，その50μを各
々のウエルに加え、37℃，炭酸ガスフラン器内で培養し
た。約35時間後、IFNサンプルを加えていないウエル細
胞が100％CPEを起こした時点で、各ウエルのCPEを顕微
鏡で観察し、50％のCPEを起こしているウエルのIFN−サ
ンプルの希釈数の逆数をもってIFNの力価とした。

その結果、３ウエル（WNγ３−16,29,45）からの抗体が
rIFN−γ（ポリペプチド（Ｉ））の抗ウイルス活性を吸
収することが分り、そのうちの１つ（WNγ３−29）は、
強い吸収能を示した（第１表）。

（ｖ）クローニング上記（iv）で得られたポリペプチド（Ｉ）に強い結合性
を示す抗体を産生するハイブリドーマWNγ３−29を、限
界希釈法によりクローニングを行なった。すなわち、ハ
イブリドーマが２個/mlになるようRPMI−20FCSに浮遊さ
せ、96穴マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウエル当
り、0.1mlずつ分注した。分注する際、フイーダー細胞
としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウエル当り５×10⁵個
になるように加えた。このようにして、約２週間後に細
胞の増殖が認められるようになった細胞の培養上清を採
取して、抗体の有無を参考例１（iii）記載のELISA法で
調べた。その結果、得られた48クローン中38クローンに
抗体活性を認めた。

以後の実験ではこれらクローンの中の代表的なクローン
としてマウスＢハイブリドーマWNγ３−29.33を選
んで実験に用いた。

（vi）抗体の認識部位の検討上記（ｖ）で得られたポリペプチド（Ｉ）に強い結合性
を示すモノクローナル抗体が、IFN−γのどの部位を認
識するかを検討した。すなわち、ハイブリドーマWNγ３
−29.33の培養上清50μとペプチド（II）（IFN−γN
P）またはペプチド（III）（IFN−γCP）をそれぞれ20
μg/mlに調製したもの50μとを混合し、37℃で１時間
反応させた後、この混合液中の抗体価を、参考例１（ii
i）記載のELISA法で検討した。なお対照はペプチド（I
I）またはペプチド（III）溶液のかわりにHAT培地を用
いた。この実験で、抗体がIFN−γＮ末部を認識するも
のならばIFN−γNPにより、IFN−γＣ末部を認識するも
のならば、IFN−γCPにより抗体の活性基がマスクさ
れ、マイクロプレート上のrIFN−γに結合しない筈であ
る。結果は第２表に示したように、WNγ３−29.33モノ
クローナル抗体のマイクロプレート上のrIFN−γへの結
果は、IFN−γNPまたはIFN−γCPによって阻害されなか
った。

従ってこの抗体は、第１図における４番目から21番目お
よび131番目から146番目以外のアミノ酸部分を認識する
ことが分かった。なお、対照として用いたIFN−γＮ末
部を認識するWNγ２−76.53モノクローナル抗体（特開
昭60−107569号公報参照）,C末部を認識するγ２−11.1
モノクローナル抗体（EPC公開第0103898号公報参照）の
マイクロプレート上のポリペプチド（Ｉ）への結合は、
それぞれペプチド（II）およびペプチド（III）によっ
て阻害された。

参考例２モノクローナル抗体の製造（ｉ）抗体産生ハイブリドーマの腹水化および腹水か
らの抗体精製クローニングによって得られたマウスＢハイブリドーマ
WNγ３−29.33細胞１×10⁶個を、あらかじめ0.5mlのミ
ネラルオイルを腹腔内に投与しておいたBALB/Cマウス腹
腔内に接種することにより腹水化を行なった。ハイブリ
ドーマを腹腔に投与して10日後、腹水を採取した。得ら
れた腹水9.7mlから、ステーリンら［ジャーナル・オブ
・バイオロジカルケミストリー，256,9750−9754（198
1）］の方法に準じてモノクローナル抗体を精製した。
まず腹水からフイブリン様物質を除去するため10,000rp
m15分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（PBS:8.1mM
Na₂HPO₄,1.5mM KH₂PO₄,2.7mM KCl,137mM NaCl,pH7.2）
で280nmの紫外部吸収（A₂₈₀）が12〜14の値を示す濃度
に希釈した。希釈後サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶
液を47％の濃度になるように加え、４℃で撹拌しながら
60分間塩析を行ない、その後遠心（10,000rpm,15分間）
を行なって沈殿物を得た。沈殿物を50mM NaCl含有20mM
トリス緩衝溶液（pH7.9）に溶解し、同溶液２に対し
て透析を行なった。２時間後、２の新しい透析液に換
え、さらに15時間透析を行なった。透析後、沈殿を除去
するため10000rpm,15分間遠心を行ない、上清をA₂₈₀の
値が20〜30の濃度になるように調整した。このサンプル
を充分量の50mM−NaCl含有トリス緩衝溶液で平衡化した
17mlのDEAEセルロースカラム（ワットマンDE₅₂）にか
け、50mM NaCl含有トリス緩衝溶液でよく洗った後、50m
M−500mM NaClを含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液を用い
て1.5ml/分の流出速度で分画を行なって素通り分画を濃
縮し、モノクローナル抗体WNγ３−29.33を得た。抗体
の純度の確認にはラエムリらの方法［ネイチャー，227,
680−685（1970）］に準じてSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を用いた。すなわち、硫安塩析し、DEAEセ
ルロースカラムで素通りした分画を、２−メルカプトエ
タノールで還元し、アクリルアミド濃度10％のゲルを用
いて180ボルトで2.5時間泳動を行なった。その結果、分
子量52K前後にＨ鎖,28K前後にＬ鎖の２つのバンドが認
められた。

（ii）モノクローナル抗体のIFN−γに対する結合能
および中和能 WNγ３−29.33モノクローナル抗体のIFN−γに対する結
合能，および中和能を、γ２−11.1−モノクローナル抗
体,WNγ２−76.53モノクローナル抗体と比較検討した。
結合能：ウサギ抗マウスIgG抗体を結合させた３％セル
ロース溶液500μにそれぞれ精製したモノクロール抗
体を500μ（約25μｇの抗体含有）加え、４℃で24時
間反応させた。反応後セルロースを生理食塩水でよく洗
浄し、550U/mlのrIFN−γを加え、４℃で24時間反応さ
せ、上清中のIFN活性を参考例１（iv）記載のCPEリーテ
ィング法で測定した。IFN−γサンプルとして、ポリペ
プチド（Ｉ）およびヒト末梢血リンパ球をコンカナバリ
ンA40μg/mlと12−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール
−13−アセテート15ng/mlで刺激して72時間後採取した
上清（nIFN−γ）を用いた。また対照として500μのI
FN−α（ナマルバ細胞をセンダイウイルス10HAユニット
で刺激して48時間後の培養上清で550U/mlのIFN−αを含
む）,500μのIFN−β（リー・バイオモレキュラー・
リサーチラボラトリーズ社から購入したもの550U/mlのI
FN−βを含む）を用いた。その結果、WNγ３−29.33モ
ノクローナル抗体は、これまでに得られていたモノクロ
ーナル抗体よりIFN−γに対して強い結合能を示すこ
と、およびIFN−α,IFN−βには全く結合性を示さない
こと等が分かった（第３表）。中和能：上記の２種のIF
N−γ（nIFN−γ，ポリペプチド（Ｉ））,IFN−αおよ
びIFN−β（力価は何れも上記と同じ）それぞれ500μ
に、精製した抗体500μ（約25μｇの抗体含有）を加
え、４℃で24時間反応させた。反応後反応液中のIFN活
性をCPEリーティグ法で測定した。その結果、WNγ−３
−29.33モノクローナル抗体は、nIFN−γ，ポリペプチ
ド（Ｉ）の抗ウイルス活性をほぼ完全に中和し、WNγ２
−76.53抗体より強い中和能を示したが、IFN−α，βに
対しては中和活性を持たないことが分かった（第４
表）。

（iii）モノクローナル抗体のポリペプチド（Ｖ）に
対する中和能ポリペプチド（Ｖ）に対してWNγ３−29.33モノクロー
ナル抗体が反応するかどうかを参考例２（ii）記載の中
和法で検討した。すなわち、1370U/mlの抗ウイルス活性
を示すポリペプチド（Ｖ）含有上清500μと等量の精
製した抗体（約25μｇの抗体含有）を加え24℃で24時間
反応させ、残存するIFN活性をCPEリーティング法で測定
した。その結果、WNγ３−29.33モノクローナル抗体
は、ポリペプチド（Ｖ）の抗ウイルス活性をほぼ完全に
中和することが分かった（第５表）。本実験の結果およ
び，参考例２（ii）の結果から、該モノクローナル抗体
は、第１図における22番目から130番目までのアミノ酸
配列の何れかのエピトープを認識するものであることが
判明した。

（iv）モノクローナル抗体のサブクラスハイブリドーマWNγ３−29.33培養上清中のモノクロー
ナル抗体とウサギ抗マウスIgG1,G2a,G2b,G3抗体（マイ
ルス社）との寒天内沈降反応（イムノロジカルメソッド
ゲルディフュージョンテクニックブラックウエル
オックスフォード 1964年）により抗体のサブクラスを
検討した。結果は、モノクローナル抗体とウサギ抗マウ
スIgG1抗体との間に著明な１つのバンドが認められ、他
の抗マウスIgG抗体との間には、バンド形成はみられな
かった（第６表）。従って当モノクローナル抗体は、Ig
G1サブクラスに属するものであることが判明した。

実施例１標識剤としてペルオキシダーゼを用いる酵素
免疫測定法（１） WNγ３−29.33結合固相の作成 96ウエルのマイクロテスト用プレート（ヌンク−イムノ
プレートI:ヌンク社（デンマーク）製）の各ウエルに参
考例２で得たWNγ３−29.33溶液（30μg/ml,0.1M炭酸緩
衝液pH9.6）150μを注入し、４℃で一晩放置した。PB
S（0.15M NaClを含むpH7.4の0.01Mリン酸緩衝液）300μ
で洗浄後、１％BSAおよび0.005％チメロサールを含む
0.02Mリン酸緩衝液（pH7.0）300μを注入し、４℃で
保存した。

（２）ポリクローナル抗体の製造 EPC公開第0110044号公報記載の方法で得られた精製rIFN
−γ蛋白質2mgを生理食塩水1mlに溶解し、これにフロイ
ンドの完全アジュバント［免疫の生化学，橘ら著，共立
出版株式会社（1967年）］1.5mlを加えてよく混合して
乳剤を作り、1mlをウサギの両大腿部筋肉内および背部
皮下数箇所に注射した。以上の操作を４週毎に４回行な
い最終免疫後１週間で採血して抗血清を得た。硫酸アン
モニウム法で塩析してグロブリン画分を調製したのち、
rIFN−γ結合セファロース4Bカラムを用いるアフィニテ
ィ・クロマトグラフィーに供した。カラムに保持された
抗体画分を0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（pH2.3）で溶出
することにより、rIFN−γに強い親和性を有するポリク
ローナル抗体を得た。

（３）ポリクローナル抗体Fab′フラグメントの製造前項で得られたポリクローナル抗体5mgに0.1mgのペプシ
ンを加え30℃で一夜反応後、セファデックスＧ−150カ
ラム（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られた抗体
Ｆ（ab′）_２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元
し、セファデックスＧ−25のカラムによるゲルクロマト
グラフィーで精製してポリクローナル・ウサギ抗rIFN−
γ抗体（Fab′フラグメント）を得た。

（４）ポリクローナル抗原rIFN−γ抗体（Fab′）−H
RP複合体の製造（ａ）マレイミド基の導入 6mgの西洋わさびペルオキシダーゼ［ベーリンガーマン
ハイム社（西ドイツ）製］を1mlの0.1Mリン酸緩衝液（p
H7.0）に溶解し、50μのN,N−ジメチルホルムアミド
にとかした結合試薬MMC（一般式［Ｉ］において、ｎ＝
1,R＝シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを加えて30
℃で60分間撹拌しながら反応させた。生成した沈殿を遠
心分離して除去し、上清をセファデックスＧ−25のカラ
ム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液で溶出させ
た。タンパクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用い
て濃縮した。このようにして調製したマレイミド化ペル
オキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導
入されたマレイミド基の数は1.0〜1.2個であった（ペル
オキシダーゼの分子量を40,000,▲Ｅ^280nm _1%▼22.75と
して計算）。

（ｂ）マレイミド化ペルオキシダーゼと抗rIFN−γ抗
体（Fab′フラグメント）との複合体の製造上記（ａ）で調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ1.
5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlに溶解し、先に
（３）項で得たポリクローナル抗rIFN−γ抗体（Fab′
フラグメント）1.8mgをとかした5mMエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.1
5mlを加えて４℃で20時間反応させた。反応後、ウルト
ロゲルAcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用いる
ゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.5）で溶出させた。溶出液の280nmの吸光度ならびに酵
素活性を測定しペルオキシダーゼとウサギ抗rIFN−γ抗
体（Fab′フラグメント）との複合体の溶出画分を得
た。

（５）操作法（１）項で作成したプレートをPBSで洗浄後、各ウエル
に緩衝液Ｂ（10％仔牛血清，および0.005％チメロサー
ルを含む0.02Mリン酸緩衝液（pH6.5）50μおよび緩衝
液Ｂで希釈した標準rIFN−γ 100μを加え、室温で
一晩放置した。PBSで洗浄後、緩衝液Ｂで酵素濃度とし
て500ng/mlに希釈した第（４）項に作製した酵素標識剤
150μ加え、室温で４時間反応させた。各ウエルをPBS
で洗浄後，基質液として0.2％Ｏ−フェニレンジアミン
および0.02％過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH
5.5）100μを加え、室温で20分間反応させた。2M硫酸
100μを加えて酵素反応を停止させたのち、各ウエル
の492nmの吸光度をタイターテック・マルチスキャン
（フロー社米国）で測定した。

第２図に得られたrIFN−γの標準曲線を示した。

実施例２ IFN−γの免疫化学的測定キットおよびrIFN
−γの測定下記のIFN−γ免疫化学的測定キットを用い、下記の操
作法に従って、rIFN−γ投与患者血清中rIFN−γ濃度を
測定した。

（１）実施例１−（１）で得られたモノクローナル抗
体感作プレート。

（２）実施例１−（４）で得られたペルオキシダーゼ
標識ポリクローナル抗体複合体。

（３）０〜10ngの標準rIFN−γ。

（４）上記（２），（３）の試薬および被検液の希釈
に用いる緩衝液E:10％仔牛血清,0.4M NaCl,0.005％チメ
ロサールを含むpH6.5の0.05Mリン酸緩衝液。

（５）Ｏ−フェニレンジアミン。

（６）上記（５）の溶解に用いる緩衝液D:002％過酸
化水素,0.005％チメロサールを含むpH5.5の0.1Mクエン
酸緩衝液。

（７）停止液:2M 硫酸。

測定緩衝液Ｅに溶解させたrIFN−γ標準溶液あるいは緩衝液
Ｅで５倍以上に希釈された被検血清試料100μを、緩
衝液Ａ｛pH7.0の0.01Mリン酸緩衝液（NaCl:0.14M）｝で
洗浄された（１）の各ウエルに注入し、室温で一晩反応
させた。各ウエルを緩衝液Ａで洗浄後、緩衝液Ｅで希釈
された試薬（２）150μを加えて、室温で４時間反応
させた。各ウエルを緩衝液Ａで洗浄後、試薬（６）で溶
解した0.2％の試薬（５）150μを加えて室温で30分反
応させた。各ウエルに2M H₂SO₄ 100μを添加して反応
を停止させ、492nmの吸光度をマイクロプレート用自動
比色計［タイターテック・マルチスキャン・フロー社
（米国）製］を用いて測定した。

結果を第７表に示す。

発明の効果本発明のIFN−γの測定法は、正確にIFN−γを認識し、
極めて高感度であり、とりわけ患者血中のIFN−γの測
定等に有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は146個のアミノ酸からなるIFN−γのアミノ酸配
列を示す。第２図は本発明で得られたrIFN−γの標準曲線を示す。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−7300（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ, 79（２），（1985），Ｐ．293−306 Ｂｌｏｃｈｅｍ．Ｂｌｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，128（１）, （1985），Ｐ．171−178 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，134（３）, （1985），Ｐ．1609−1618 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３（４）, （1985），Ｐ．321−332 Ｒｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，81（16），（1984），Ｐ. 5219−5222 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ, 77（２），（1985），Ｐ．275−282

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定用試料を、第１図で示されるポリペ
プチドと結合し、ペプチド＜Glu−Asp−Pro−Tyr−Val
−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe
−Asn−Ala−GlyおよびペプチドLys−Arg−Lys−Arg−S
er−Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−S
er−Glnのいずれとも結合しないモノクローナル抗体お
よびポリクローナル抗インターフェロン−γ抗体のい
ずれか一方を含有する固定相と他方を含有する標識体と
を用いるサンドイッチ法に付すことを特徴とするインタ
ーフェロン−γの免疫化学的測定法。
【請求項２】第１図で示されるポリペプチドと結合
し、ペプチド＜Glu−Asp−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu−A
la−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−G
lyおよびLys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Ph
e−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Glnのいずれとも結
合しないモノクローナル抗体およびポリクローナル抗
インターフェロン−γ抗体のいずれか一方を含有する固
定相と他方を含有する標識体とを組合せてなるインター
フェロン−γの免疫化学的測定用試薬。