JPH0595794A - ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法 - Google Patents
ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法Info
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- JPH0595794A JPH0595794A JP3324972A JP32497291A JPH0595794A JP H0595794 A JPH0595794 A JP H0595794A JP 3324972 A JP3324972 A JP 3324972A JP 32497291 A JP32497291 A JP 32497291A JP H0595794 A JPH0595794 A JP H0595794A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、ヒトマクロファージコロニー刺激因
子（ヒトＭ−ＣＳＦ）に対する抗体、その製造法及び該
抗体の利用によるヒトＭ−ＣＳＦの免疫学的精製及び測
定法の確立を目的とする。 【構成】本発明によれば、ヒトＭ−ＣＳＦに特異的に反
応することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル
抗体及び該抗体を固相化した第１抗体と検体とを反応さ
せ、次いで反応物に他のヒトＭ−ＣＳＦ抗体を反応さ
せ、得られる反応複合体と酵素標識抗体とを反応させる
３ステップサンドスイッチ法により検体中のヒトＭ−Ｃ
ＳＦを測定するＭ−ＣＳＦの免疫測定法が提供される。
子（ヒトＭ−ＣＳＦ）に対する抗体、その製造法及び該
抗体の利用によるヒトＭ−ＣＳＦの免疫学的精製及び測
定法の確立を目的とする。 【構成】本発明によれば、ヒトＭ−ＣＳＦに特異的に反
応することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル
抗体及び該抗体を固相化した第１抗体と検体とを反応さ
せ、次いで反応物に他のヒトＭ−ＣＳＦ抗体を反応さ
せ、得られる反応複合体と酵素標識抗体とを反応させる
３ステップサンドスイッチ法により検体中のヒトＭ−Ｃ
ＳＦを測定するＭ−ＣＳＦの免疫測定法が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトマクロファージコ
ロニー刺激因子（ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ
ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏ
ｒ、以下ヒトＭ−ＣＳＦという）に対する抗体、殊にモ
ノクローナル抗体、その製造法及び該抗体の利用、特に
ヒトＭ−ＣＳＦの免疫学的精製及び測定への利用に関す
る。
ロニー刺激因子（ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ
ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏ
ｒ、以下ヒトＭ−ＣＳＦという）に対する抗体、殊にモ
ノクローナル抗体、その製造法及び該抗体の利用、特に
ヒトＭ−ＣＳＦの免疫学的精製及び測定への利用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】一般に、造血細胞の増殖、分化には特定
の増殖及び分化因子が必要とされており、最終的に成熟
した各種の血球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファー
ジ、好酸球、血小板、リンパ球等になるまでの間には、
数多くの分化、増殖因子が関与している〔三浦恭定著、
血液幹細胞、中外医学社、１９８３年〕。之等の中で顆
粒球系前駆細胞及びマクロファージ系前駆細胞の増殖、
分化を刺激するものとしてコロニー刺激因子（ｃｏｌｏ
ｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｔｏｒ，ＣＳＦ）
が知られており［Ｍｅｔａｃａｌｆ，Ｄ．，Ｔｈｅ Ｈ
ｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８４）］、かかるＣＳＦには、
末梢血の顆粒球に対する増血作用が著しい顆粒球−ＣＳ
Ｆ（Ｇ−ＣＳＦ）、骨髄中で単球−マクロファージの産
生を刺激するマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）及
び骨髄中から顆粒球や単球の前駆細胞であるＣＦＵ−Ｇ
Ｍ（コロニー形成ユニット−顆粒球・マクロファージ
（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ−ｇｒａｎ
ｕｌｏｃｙｔｅ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）から顆粒球や
マクロファージからなるコロニーを形成させる顆粒球・
マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られてい
る。また更に多能性幹細胞に作用するＣＳＦとしてマル
チ−ＣＳＦ（Ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ：ＩＬ−３）も知られ
ている。
の増殖及び分化因子が必要とされており、最終的に成熟
した各種の血球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファー
ジ、好酸球、血小板、リンパ球等になるまでの間には、
数多くの分化、増殖因子が関与している〔三浦恭定著、
血液幹細胞、中外医学社、１９８３年〕。之等の中で顆
粒球系前駆細胞及びマクロファージ系前駆細胞の増殖、
分化を刺激するものとしてコロニー刺激因子（ｃｏｌｏ
ｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｔｏｒ，ＣＳＦ）
が知られており［Ｍｅｔａｃａｌｆ，Ｄ．，Ｔｈｅ Ｈ
ｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕ
ｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８４）］、かかるＣＳＦには、
末梢血の顆粒球に対する増血作用が著しい顆粒球−ＣＳ
Ｆ（Ｇ−ＣＳＦ）、骨髄中で単球−マクロファージの産
生を刺激するマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）及
び骨髄中から顆粒球や単球の前駆細胞であるＣＦＵ−Ｇ
Ｍ（コロニー形成ユニット−顆粒球・マクロファージ
（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ−ｇｒａｎ
ｕｌｏｃｙｔｅ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）から顆粒球や
マクロファージからなるコロニーを形成させる顆粒球・
マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られてい
る。また更に多能性幹細胞に作用するＣＳＦとしてマル
チ−ＣＳＦ（Ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ：ＩＬ−３）も知られ
ている。
【０００３】之等のＣＳＦについては、いずれも遺伝子
組換え技術により、ヒトの各種ＣＳＦ遺伝子がクローニ
ングされており、大量に収得することが可能となってい
る［Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２８，８１０（１９８５）：Ｎａｇａｔａ，
Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，４１５
（１９８６）：Ｓｏｕｚａ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３２，６１（１９８６）：Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．， １５２，１
４０１（１９８８）：Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，１５０４（１９８
７）］。
組換え技術により、ヒトの各種ＣＳＦ遺伝子がクローニ
ングされており、大量に収得することが可能となってい
る［Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２８，８１０（１９８５）：Ｎａｇａｔａ，
Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，４１５
（１９８６）：Ｓｏｕｚａ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３２，６１（１９８６）：Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．， １５２，１
４０１（１９８８）：Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，１５０４（１９８
７）］。
【０００４】上記ＣＳＦの中でＭ−ＣＳＦは、現在骨髄
における単球の産生促進作用、成熟単球の機能の亢進
（単球のＧＭ−ＣＳＦやＧ−ＣＳＦ産生の亢進、単球の
抗体依存性殺腫瘍活性の増強、単球の抗体非依存性殺腫
瘍活性の増強）、骨髄移植後の白血球回復促進及び生着
生存率の上昇、血中コレステロール低下作用等の各種の
生物活性作用が知られている［特表昭６３−５０２２７
１号公報、特表平１−５０２５９３号公報、特開平３−
２１２５号公報、Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｊ．
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４８，３２３−
３２８（１９９０）］。
における単球の産生促進作用、成熟単球の機能の亢進
（単球のＧＭ−ＣＳＦやＧ−ＣＳＦ産生の亢進、単球の
抗体依存性殺腫瘍活性の増強、単球の抗体非依存性殺腫
瘍活性の増強）、骨髄移植後の白血球回復促進及び生着
生存率の上昇、血中コレステロール低下作用等の各種の
生物活性作用が知られている［特表昭６３−５０２２７
１号公報、特表平１−５０２５９３号公報、特開平３−
２１２５号公報、Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ，Ｋ．，Ｊ．Ｊ．
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４８，３２３−
３２８（１９９０）］。
【０００５】上記Ｍ−ＣＳＦは、その生物活性から癌化
学療法及び放射線療法時の共通した欠点である白血球の
減少を軽減させるものと考えられ、この点から種々臨床
試験が行なわれ、癌化学療法後の白血球減少からの回復
を有意に促進しているという結果も報告されている［Ｍ
ｏｔｏｙｏｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｉｎｏ
ｂｉｏｌ．，１７２，２０５（１９８６）］。
学療法及び放射線療法時の共通した欠点である白血球の
減少を軽減させるものと考えられ、この点から種々臨床
試験が行なわれ、癌化学療法後の白血球減少からの回復
を有意に促進しているという結果も報告されている［Ｍ
ｏｔｏｙｏｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｉｎｏ
ｂｉｏｌ．，１７２，２０５（１９８６）］。
【０００６】該Ｍ−ＣＳＦは上記の観点から種々の臨床
用途に対して医薬品としての臨床研究が行なわれている
が、医薬用に大量に精製品を取得するためには精製の各
工程にて簡便にヒトＭ−ＣＳＦを検出及び定量する技術
の確立が必須となる。また、各種の免疫欠損病や異常免
疫応答の研究並びに之等の臨床上の診断のために、ヒト
Ｍ−ＣＳＦの体内レベルと病態との関係が近年注目され
るに至り、生体内のヒトＭ−ＣＳＦ量を高感度、高精度
で定量できる方法の確立が斯界で望まれている現状にあ
る。
用途に対して医薬品としての臨床研究が行なわれている
が、医薬用に大量に精製品を取得するためには精製の各
工程にて簡便にヒトＭ−ＣＳＦを検出及び定量する技術
の確立が必須となる。また、各種の免疫欠損病や異常免
疫応答の研究並びに之等の臨床上の診断のために、ヒト
Ｍ−ＣＳＦの体内レベルと病態との関係が近年注目され
るに至り、生体内のヒトＭ−ＣＳＦ量を高感度、高精度
で定量できる方法の確立が斯界で望まれている現状にあ
る。
【０００７】しかして、従来のＭ−ＣＳＦの検出、定量
法としては、マウス或はヒト健常人骨髄細胞を用いたコ
ロニー形成法［Ｍｅｔａｃａｌｆ，Ｄ．，ＴｈｅＨｅｍ
ａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ（１９８４）］や慢性骨髄性白血病末梢血
リンパ球を用いた放射性同位元素標識チミジンの取り込
み法［Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏ
ｏｄ，６３，９０４−９１１（１９８４）］、好中球生
存維持アッセイ法［Ｃ．Ｇ．Ｂｅｇｌｅｙ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ， ６８，１６２−１６６（１９８
６）］等の生物学的検出・定量方法が知られている。し
かしながら、之等の生物学的検出・定量方法は、一般に
アッセイ用試料の入手、測定値の再現性、定量性、感
度、迅速性等の点で種々の問題がある。しかも之等従来
の方法では、前記各種のＣＳＦが同一活性を示すため
に、之等を区別しては測定できないという重大な欠点が
ある。
法としては、マウス或はヒト健常人骨髄細胞を用いたコ
ロニー形成法［Ｍｅｔａｃａｌｆ，Ｄ．，ＴｈｅＨｅｍ
ａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ（１９８４）］や慢性骨髄性白血病末梢血
リンパ球を用いた放射性同位元素標識チミジンの取り込
み法［Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏ
ｏｄ，６３，９０４−９１１（１９８４）］、好中球生
存維持アッセイ法［Ｃ．Ｇ．Ｂｅｇｌｅｙ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ， ６８，１６２−１６６（１９８
６）］等の生物学的検出・定量方法が知られている。し
かしながら、之等の生物学的検出・定量方法は、一般に
アッセイ用試料の入手、測定値の再現性、定量性、感
度、迅速性等の点で種々の問題がある。しかも之等従来
の方法では、前記各種のＣＳＦが同一活性を示すため
に、之等を区別しては測定できないという重大な欠点が
ある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
ＣＳＦの検出・定量法にみられる欠点を悉く解消して、
ＣＳＦの中で特にヒトＭ−ＣＳＦを特異的に測定できる
新しい免疫学的手法及び該手法に利用できる新規な抗ヒ
トＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を提供することを目的
とする。
ＣＳＦの検出・定量法にみられる欠点を悉く解消して、
ＣＳＦの中で特にヒトＭ−ＣＳＦを特異的に測定できる
新しい免疫学的手法及び該手法に利用できる新規な抗ヒ
トＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を提供することを目的
とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
より鋭意研究を重ねた結果、新たにヒトＭ−ＣＳＦに特
異的に反応するヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体の確
率に成功すると共に、その利用によって、従来の生物学
的検出・定量法より優れた実用的なヒトＭ−ＣＳＦの定
量法の確立にも成功し、ここに本発明を完成するに至っ
た。
より鋭意研究を重ねた結果、新たにヒトＭ−ＣＳＦに特
異的に反応するヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体の確
率に成功すると共に、その利用によって、従来の生物学
的検出・定量法より優れた実用的なヒトＭ−ＣＳＦの定
量法の確立にも成功し、ここに本発明を完成するに至っ
た。
【００１０】即ち、本発明は、ヒトＭ−ＣＳＦに特異的
に反応することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦモノクロー
ナル抗体、特にヒトＭ−ＣＳＦの蛋白部位をエピトープ
として認識する上記モノクローナル抗体、還元剤存在下
でヒトＭ−ＣＳＦに反応性を有しない上記モノクローナ
ル抗体、ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の少なくとも１
位Ｖａｌから１５１位Ｔｈｒまでのアミノ酸配列を認識
部位にもつ上記モノクローナル抗体、組換えチャイニー
ズハムスター卵巣細胞由来のヒトＭ−ＣＳＦを免疫抗原
として免疫された哺乳動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫
細胞との融合により得られるハイブリドーマの産生する
上記モノクローナル抗体、組換え大腸菌由来のヒトＭ−
ＣＳＦを免疫抗原として免疫された哺乳動物の脾細胞と
哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により得られるハイブリ
ドーマの産生する上記モノクローナル抗体、免疫抗原が
プラスミドｐｔｒｐＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０１で形
質転換された組換え大腸菌由来のヒトＭ−ＣＳＦである
上記モノクローナル抗体、ハイブリドーマがＫＯＣＯ５
７１（微工研菌寄第１２５２２号）、ＫＯＣＯ５７２
（微工研菌寄第１２５２３号）、ＫＯＣＯ５７３（微工
研菌寄第１２５２４号）、ＫＯＣＯ５７４（微工研菌寄
第１２５２５号）及びＭＭＣ−１（微工研菌寄第１２５
３７号）から選ばれるものである上記モノクローナル抗
体に係わる。
に反応することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦモノクロー
ナル抗体、特にヒトＭ−ＣＳＦの蛋白部位をエピトープ
として認識する上記モノクローナル抗体、還元剤存在下
でヒトＭ−ＣＳＦに反応性を有しない上記モノクローナ
ル抗体、ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の少なくとも１
位Ｖａｌから１５１位Ｔｈｒまでのアミノ酸配列を認識
部位にもつ上記モノクローナル抗体、組換えチャイニー
ズハムスター卵巣細胞由来のヒトＭ−ＣＳＦを免疫抗原
として免疫された哺乳動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫
細胞との融合により得られるハイブリドーマの産生する
上記モノクローナル抗体、組換え大腸菌由来のヒトＭ−
ＣＳＦを免疫抗原として免疫された哺乳動物の脾細胞と
哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により得られるハイブリ
ドーマの産生する上記モノクローナル抗体、免疫抗原が
プラスミドｐｔｒｐＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０１で形
質転換された組換え大腸菌由来のヒトＭ−ＣＳＦである
上記モノクローナル抗体、ハイブリドーマがＫＯＣＯ５
７１（微工研菌寄第１２５２２号）、ＫＯＣＯ５７２
（微工研菌寄第１２５２３号）、ＫＯＣＯ５７３（微工
研菌寄第１２５２４号）、ＫＯＣＯ５７４（微工研菌寄
第１２５２５号）及びＭＭＣ−１（微工研菌寄第１２５
３７号）から選ばれるものである上記モノクローナル抗
体に係わる。
【００１１】更に本発明によれば、上記本発明のヒトＭ
−ＣＳＦモノクローナル抗体を固相化した第１抗体と検
体とを反応させ、次いで反応物に他のヒトＭ−ＣＳＦ抗
体を反応させ、得られる反応複合体と酵素標識抗体とを
反応させる３ステップサンドスイッチ法により検体中の
ヒトＭ−ＣＳＦを測定することを特徴とするヒトＭ−Ｃ
ＳＦの免疫測定法も提供される。
−ＣＳＦモノクローナル抗体を固相化した第１抗体と検
体とを反応させ、次いで反応物に他のヒトＭ−ＣＳＦ抗
体を反応させ、得られる反応複合体と酵素標識抗体とを
反応させる３ステップサンドスイッチ法により検体中の
ヒトＭ−ＣＳＦを測定することを特徴とするヒトＭ−Ｃ
ＳＦの免疫測定法も提供される。
【００１２】本発明の免疫検定法によれば、ヒトＭ−Ｃ
ＳＦのみを他のＣＳＦと区別して高感度、高精度で検出
・定量することができる。
ＳＦのみを他のＣＳＦと区別して高感度、高精度で検出
・定量することができる。
【００１３】また、本発明のモノクローナル抗体は、上
記の通りヒトＭ−ＣＳＦに特異的であるため、その利用
によれば例えばアフィニティクロマトグラフィー等の手
法によって、ヒトＭ−ＣＳＦの特異的精製をも行なうこ
とができる。
記の通りヒトＭ−ＣＳＦに特異的であるため、その利用
によれば例えばアフィニティクロマトグラフィー等の手
法によって、ヒトＭ−ＣＳＦの特異的精製をも行なうこ
とができる。
【００１４】尚、以下の本明細書におけるアミノ酸、ペ
プチド、核酸、制限酵素、その他に関する略号による表
示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法ま
たは規定或は当該分野における慣用記号に従うものとす
る。またアミノ酸等に関して光学異性体があり得る場
合、特に明記しなければＬ−体を示すものとする。
プチド、核酸、制限酵素、その他に関する略号による表
示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法ま
たは規定或は当該分野における慣用記号に従うものとす
る。またアミノ酸等に関して光学異性体があり得る場
合、特に明記しなければＬ−体を示すものとする。
【００１５】以下、本発明抗体の製造方法及びかくして
得られる抗体の利用による酵素免疫法につき順次詳述す
る。
得られる抗体の利用による酵素免疫法につき順次詳述す
る。
【００１６】本発明抗体は、ヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同
効物（誘導体）を免疫抗原として利用して製造すること
ができる。ここで上記ヒトＭ−ＣＳＦの同効物として
は、ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも一部が
同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば
ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の一部につき置換、欠
失、付加等の改変を行なって得られるヒトＭ−ＣＳＦ誘
導体が包含される。かかるヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同効
物としては、既に各種のものが知られており、之等は例
えばヒトＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を用いて遺伝子
工学的手法により、該遺伝子が宿主細胞中で発現される
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換株を培養することにより製造
することができる。
効物（誘導体）を免疫抗原として利用して製造すること
ができる。ここで上記ヒトＭ−ＣＳＦの同効物として
は、ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも一部が
同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば
ヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の一部につき置換、欠
失、付加等の改変を行なって得られるヒトＭ−ＣＳＦ誘
導体が包含される。かかるヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同効
物としては、既に各種のものが知られており、之等は例
えばヒトＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を用いて遺伝子
工学的手法により、該遺伝子が宿主細胞中で発現される
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換株を培養することにより製造
することができる。
【００１７】上記ヒトＭ−ＣＳＦの遺伝子としては、代
表的にはＭ−ＣＳＦ産生能を有する各種のヒト細胞、よ
り具体的にはＡＧＲ−ＯＮ［特開昭５９−１６９４８９
号公報記載の特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト
培養株化細胞、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）に「ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．ＣＲＬ−
８１９９」として受託］より分離されたｍＲＮＡから、
オカヤマ−バーグ法〔Ｈ．Ｏｋａｙａｍａａｎｄ Ｐ．
Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０ （１９８３）〕や
グブラーホフマン法〔Ｖ．Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｂ．
Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ， ２５，２６３−２６
９（１９８３）〕等に従い調製されるものを例示できる
［特開平１−１０４１７６号公報等参照］。また上記遺
伝子は例えばホスファイト トリエステル法〔Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１，１０５（１９８４）〕等の常法に従い核酸
の化学合成等により製造することもできる。之等の方法
において一部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削
除、付加乃至結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単
離、精製乃至複製、選別等の各種操作乃至手段は、いず
れも常法に従い得る。例えば上記ＤＮＡの単離精製は、
アガロースゲル電気泳動法等に従うことができ、核酸配
列のコドンの一部の改変は、サイト−スペシフィック
ミュータジェネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｌｉｃ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．，８１，５６６２−５６６６（１９８
４）〕等に従うことができる。上記において所望アミノ
酸に対応する遺伝暗号の選択は、特に限定されず、利用
する宿主細胞のコドン使用頻度等を考慮して常法に従い
決定できる。また上記方法に従い得られる遺伝子のＤＮ
Ａ配列の決定及び確認は、マキサム−ギルバート（Ｍａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学修飾法〔Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍ．，６５，４９９−５６０（１９８０）〕やＭ
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，
Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６（１９８２）〕等によ
り行ない得る。
表的にはＭ−ＣＳＦ産生能を有する各種のヒト細胞、よ
り具体的にはＡＧＲ−ＯＮ［特開昭５９−１６９４８９
号公報記載の特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト
培養株化細胞、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）に「ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．ＣＲＬ−
８１９９」として受託］より分離されたｍＲＮＡから、
オカヤマ−バーグ法〔Ｈ．Ｏｋａｙａｍａａｎｄ Ｐ．
Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０ （１９８３）〕や
グブラーホフマン法〔Ｖ．Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｂ．
Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ， ２５，２６３−２６
９（１９８３）〕等に従い調製されるものを例示できる
［特開平１−１０４１７６号公報等参照］。また上記遺
伝子は例えばホスファイト トリエステル法〔Ｎａｔｕ
ｒｅ，３１，１０５（１９８４）〕等の常法に従い核酸
の化学合成等により製造することもできる。之等の方法
において一部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削
除、付加乃至結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単
離、精製乃至複製、選別等の各種操作乃至手段は、いず
れも常法に従い得る。例えば上記ＤＮＡの単離精製は、
アガロースゲル電気泳動法等に従うことができ、核酸配
列のコドンの一部の改変は、サイト−スペシフィック
ミュータジェネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｌｉｃ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．，８１，５６６２−５６６６（１９８
４）〕等に従うことができる。上記において所望アミノ
酸に対応する遺伝暗号の選択は、特に限定されず、利用
する宿主細胞のコドン使用頻度等を考慮して常法に従い
決定できる。また上記方法に従い得られる遺伝子のＤＮ
Ａ配列の決定及び確認は、マキサム−ギルバート（Ｍａ
ｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）の化学修飾法〔Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍ．，６５，４９９−５６０（１９８０）〕やＭ
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，
Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６（１９８２）〕等によ
り行ない得る。
【００１８】かくして得られるヒトＭ−ＣＳＦ遺伝子の
利用による遺伝子組換え技術に従うヒトＭ−ＣＳＦ乃至
その同効物の製造は、一般的遺伝子組換え技術〔Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）等参照〕に従い、
ヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同効物をコードする遺伝子を含
むベクターを作成し、該ベクターで宿主細胞を形質転換
し、得られる形質転換体を培養し、発現・物を精製する
ことにより実施できる。本発明者らは先に、上記遺伝子
組換え技術に従うヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同効物の各種
の発現系、即ちＣＯＳ細胞発現系、大腸菌発現系、ＣＨ
Ｏ細胞発現系等の確立に成功している［特開平１−１０
４１７６号公報参照］。
利用による遺伝子組換え技術に従うヒトＭ−ＣＳＦ乃至
その同効物の製造は、一般的遺伝子組換え技術〔Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）等参照〕に従い、
ヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同効物をコードする遺伝子を含
むベクターを作成し、該ベクターで宿主細胞を形質転換
し、得られる形質転換体を培養し、発現・物を精製する
ことにより実施できる。本発明者らは先に、上記遺伝子
組換え技術に従うヒトＭ−ＣＳＦ乃至その同効物の各種
の発現系、即ちＣＯＳ細胞発現系、大腸菌発現系、ＣＨ
Ｏ細胞発現系等の確立に成功している［特開平１−１０
４１７６号公報参照］。
【００１９】かくして得られる組換えヒトＭ−ＣＳＦ乃
至その同効物（以下、単に「ｒｈＭ−ＣＳＦ」という）
は、これをそのまま又はハプテンとして用いて、本発明
モノクローナル抗体の製造のための所望の免疫抗原を作
成でき、この免疫抗原の利用による本発明抗体の製造
は、基本的には公知の方法に従うことができる［Ｈａｎ
ｆｌａｎｄ，Ｐ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄ
ｓ，１５，１０５（１９７５）：Ｈａｎｆｌａｎｄ
Ｐ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１０，２０
１（１９７６）：Ｋｏｓｃｉｅｌａｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７，２１４（１９７８）］。
至その同効物（以下、単に「ｒｈＭ−ＣＳＦ」という）
は、これをそのまま又はハプテンとして用いて、本発明
モノクローナル抗体の製造のための所望の免疫抗原を作
成でき、この免疫抗原の利用による本発明抗体の製造
は、基本的には公知の方法に従うことができる［Ｈａｎ
ｆｌａｎｄ，Ｐ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄ
ｓ，１５，１０５（１９７５）：Ｈａｎｆｌａｎｄ
Ｐ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１０，２０
１（１９７６）：Ｋｏｓｃｉｅｌａｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７，２１４（１９７８）］。
【００２０】該方法としては、より具体的には、例えば
上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細
胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（ハイブ
リドーマ、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を作成し、これよりヒ
トＭ−ＣＳＦを認識する所望抗体（モノクローナル抗
体）を産生するクローンを選択し、該クローンの培養に
よる方法を採用できる。
上記免疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細
胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（ハイブ
リドーマ、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を作成し、これよりヒ
トＭ−ＣＳＦを認識する所望抗体（モノクローナル抗
体）を産生するクローンを選択し、該クローンの培養に
よる方法を採用できる。
【００２１】上記方法において、免疫抗原で免疫される
哺乳動物としては、特に制限はなく各種のものをいずれ
も使用できるが、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞と
の適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般にはマ
ウス、ラツト等が有利に用いられる。免疫は一般的方法
により、例えばｒｈＭ−ＣＳＦ又はこれを結合試薬によ
り適当な担体に結合させて得られる免疫抗原を、哺乳動
物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。例えばマウスの場合、より具体
的には、免疫抗原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）や生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、所望により
通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜１４日
毎に数回投与し、総投与量が約１００〜５００μｇ／マ
ウス程度になるようにするのが好ましい。上記アジュバ
ントとしては、例えば百日咳ワクチン、完全フロインド
アジュバント、アラム等を用いることができる。免疫細
胞としては、上記免疫抗原の最終投与の約３日後に免疫
された動物より摘出した脾細胞を使用するのが好まし
い。
哺乳動物としては、特に制限はなく各種のものをいずれ
も使用できるが、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞と
の適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般にはマ
ウス、ラツト等が有利に用いられる。免疫は一般的方法
により、例えばｒｈＭ−ＣＳＦ又はこれを結合試薬によ
り適当な担体に結合させて得られる免疫抗原を、哺乳動
物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。例えばマウスの場合、より具体
的には、免疫抗原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）や生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、所望により
通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜１４日
毎に数回投与し、総投与量が約１００〜５００μｇ／マ
ウス程度になるようにするのが好ましい。上記アジュバ
ントとしては、例えば百日咳ワクチン、完全フロインド
アジュバント、アラム等を用いることができる。免疫細
胞としては、上記免疫抗原の最終投与の約３日後に免疫
された動物より摘出した脾細胞を使用するのが好まし
い。
【００２２】上記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の
種々のもの、例えばＸ６３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）
〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７
５）〕、ｐ３Ｕ１（ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１）〔Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７
（１９７８）〕、ＮＳ−１（ｐ３／ＮＳ−１−Ａｇ４−
１）〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５
１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８，４
０５−４１５（１９７６）〕、ＳＰ２／０（Ｓｐ２／０
−Ａｇ１４）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０
（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、×６３．６．
５．３．〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８−
１５５０（１９７９）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７８）〕等や、ラ
ットにおけるＲ２１０（２１０．ｒｃｙ３．Ａｇ１．２
３．（Ｙ３））〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３
３（１９７９）〕等の骨髄腫細胞等を使用できる。
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の
種々のもの、例えばＸ６３（ｐ３／×６３−Ａｇ８）
〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７
５）〕、ｐ３Ｕ１（ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１）〔Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７
（１９７８）〕、ＮＳ−１（ｐ３／ＮＳ−１−Ａｇ４−
１）〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５
１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８，４
０５−４１５（１９７６）〕、ＳＰ２／０（Ｓｐ２／０
−Ａｇ１４）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０
（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、×６３．６．
５．３．〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８−
１５５０（１９７９）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７８）〕等や、ラ
ットにおけるＲ２１０（２１０．ｒｃｙ３．Ａｇ１．２
３．（Ｙ３））〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３
３（１９７９）〕等の骨髄腫細胞等を使用できる。
【００２３】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反
応は、公知の方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）らの方法〔Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，（７３），３（１９８１）〕等に準じて行な
うことができる。より具体的には、上記融合反応は、通
常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常
の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高めるた
めにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添
加することもできる。また、電気処理（電気融合）によ
る方法等を適宜採用することもできる。免疫細胞と形質
細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と変りはなく、例
えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程
度用いるのが普通である。融合反応時の培地としては上
記形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各種のもの、
例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他の
この種細胞培養に一般に利用されるものを使用でき、通
常之等培地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を抜い
ておくのが好ましい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫
細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１００
０〜６０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０ｗ
／ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれ
る。以後、適当な培地を逐次添加して遠心分離し、上清
を除去する操作を繰返すことにより所望のハイブリドー
マが形成される。
応は、公知の方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）らの方法〔Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，（７３），３（１９８１）〕等に準じて行な
うことができる。より具体的には、上記融合反応は、通
常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常
の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高めるた
めにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添
加することもできる。また、電気処理（電気融合）によ
る方法等を適宜採用することもできる。免疫細胞と形質
細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と変りはなく、例
えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程
度用いるのが普通である。融合反応時の培地としては上
記形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各種のもの、
例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他の
この種細胞培養に一般に利用されるものを使用でき、通
常之等培地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を抜い
ておくのが好ましい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫
細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１００
０〜６０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０ｗ
／ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれ
る。以後、適当な培地を逐次添加して遠心分離し、上清
を除去する操作を繰返すことにより所望のハイブリドー
マが形成される。
【００２４】得られる所望のハイブリドーマの分離は、
通常の選別用培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養す
ることにより行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目
的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が
死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよ
い。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希
釈法により目的とする抗体の検索及び単一クローン化に
供することができる。
通常の選別用培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養す
ることにより行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目
的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が
死滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよ
い。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希
釈法により目的とする抗体の検索及び単一クローン化に
供することができる。
【００２５】目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳ
Ａ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）〕、プラーク
法、スポット法、凝集反応法、オクタロニー（Ｏｕｃｈ
ｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法
〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭和５７年
３月５日〕に従い実施することができ、この検索には前
記免疫抗原が利用できる。かくして得られるヒトＭ−Ｃ
ＳＦを認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、通常の培地で継代培養することがで
き、また液体窒素中で長期間保存することができる。
Ａ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０）〕、プラーク
法、スポット法、凝集反応法、オクタロニー（Ｏｕｃｈ
ｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法
〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭和５７年
３月５日〕に従い実施することができ、この検索には前
記免疫抗原が利用できる。かくして得られるヒトＭ−Ｃ
ＳＦを認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、通常の培地で継代培養することがで
き、また液体窒素中で長期間保存することができる。
【００２６】上記ハイブリドーマからの本発明モノクロ
ーナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従って
培養してその培養上清として得る方法やハイブリドーマ
をこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、そ
の腹水として得る方法等が採用される。前者の方法は、
高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗
体の大量生産に適している。また上記のごとくして得ら
れる抗体は、更に塩析、硫酸アンモニウム分画、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロ
マトグラフイー等の通常の手段により精製できる。
ーナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従って
培養してその培養上清として得る方法やハイブリドーマ
をこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、そ
の腹水として得る方法等が採用される。前者の方法は、
高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗
体の大量生産に適している。また上記のごとくして得ら
れる抗体は、更に塩析、硫酸アンモニウム分画、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロ
マトグラフイー等の通常の手段により精製できる。
【００２７】得られる本発明モノクローナル抗体は、上
記粗精抗体液、即ち抗体産生ハイブリドーマ培養上清乃
至マウス腹水の形態のままで、或は之等のクロマトグラ
フィー等による精製品の形態で利用して、例えば免疫沈
降法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段
により、ヒトＭ−ＣＳＦを簡便且つ特異的に精製するこ
とができる。
記粗精抗体液、即ち抗体産生ハイブリドーマ培養上清乃
至マウス腹水の形態のままで、或は之等のクロマトグラ
フィー等による精製品の形態で利用して、例えば免疫沈
降法、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段
により、ヒトＭ−ＣＳＦを簡便且つ特異的に精製するこ
とができる。
【００２８】また、本発明モノクローナル抗体の利用に
よれば、検体中のヒトＭ−ＣＳＦを免疫反応により、特
異的に測定することができる。該方法としては、通常の
競合法、サンドイッチ法によるラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ）、免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、凝集法等の通
常の免疫学的手法をいずれも採用でき、之等の方法の操
作、手順等は常法と異なるところはない。
よれば、検体中のヒトＭ−ＣＳＦを免疫反応により、特
異的に測定することができる。該方法としては、通常の
競合法、サンドイッチ法によるラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ）、免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、凝集法等の通
常の免疫学的手法をいずれも採用でき、之等の方法の操
作、手順等は常法と異なるところはない。
【００２９】本発明は、上記本発明モノクローナル抗体
を用いた３ステップサンドイッチ法をも提供するもので
ある。この方法は、例えば代表的には以下のごとくして
実施される。即ち、９６ウェルプレート等の適当な担体
に固相化させた本発明抗体を第１抗体として用い、これ
とヒトＭ−ＣＳＦ標準溶液及び測定物質（臨床血液サン
プル等のヒトＭ−ＣＳＦを含有する検体）等とを、室温
にて一夜静置反応させ［第１ステップ］、次いで、第２
抗体としての抗ヒトＭ−ＣＳＦ家兎抗血清（家兎抗ヒト
Ｍ−ＣＳＦポリクローナル抗体）を上記プレートに加
え、室温にて２時間程度反応させることにより、該第２
抗体と第１ステップでの反応物（本発明モノクローナル
抗体と測定物質との反応物）とを反応させ［第２ステッ
プ］、更に酵素標識抗家兎ＩｇＧ抗体等の標識抗体の一
定量を、上記第２ステップでの反応物（本発明抗体と測
定物質と二次抗体との反応複合体）と室温にて２時間程
度反応させ［第３ステップ］、次いで上記第３ステップ
で得られた反応複合体と標識抗体との結合体から非結合
標識抗体を分離除去した後、発色溶液を加えて発色反応
させ、２Ｎ硫酸にて発色反応を停止させ、得られる発色
反応液の吸光度を測定することにより実施される。かく
して検体中のヒトＭ−ＣＳＦを定量することができる。
を用いた３ステップサンドイッチ法をも提供するもので
ある。この方法は、例えば代表的には以下のごとくして
実施される。即ち、９６ウェルプレート等の適当な担体
に固相化させた本発明抗体を第１抗体として用い、これ
とヒトＭ−ＣＳＦ標準溶液及び測定物質（臨床血液サン
プル等のヒトＭ−ＣＳＦを含有する検体）等とを、室温
にて一夜静置反応させ［第１ステップ］、次いで、第２
抗体としての抗ヒトＭ−ＣＳＦ家兎抗血清（家兎抗ヒト
Ｍ−ＣＳＦポリクローナル抗体）を上記プレートに加
え、室温にて２時間程度反応させることにより、該第２
抗体と第１ステップでの反応物（本発明モノクローナル
抗体と測定物質との反応物）とを反応させ［第２ステッ
プ］、更に酵素標識抗家兎ＩｇＧ抗体等の標識抗体の一
定量を、上記第２ステップでの反応物（本発明抗体と測
定物質と二次抗体との反応複合体）と室温にて２時間程
度反応させ［第３ステップ］、次いで上記第３ステップ
で得られた反応複合体と標識抗体との結合体から非結合
標識抗体を分離除去した後、発色溶液を加えて発色反応
させ、２Ｎ硫酸にて発色反応を停止させ、得られる発色
反応液の吸光度を測定することにより実施される。かく
して検体中のヒトＭ−ＣＳＦを定量することができる。
【００３０】上記において第２抗体としては、第１抗体
として用いた本発明モノクローナル抗体とは別の本発明
モノクローナル抗体を用いることもできる。また、第１
抗体として家兎抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を
用い、第２抗体として本発明モノクローナル抗体を用い
ることもできる。更に３ステップサンドイッチ法におい
ては、第１抗体として家兎抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクロー
ナル抗体を用い、第２抗体として羊抗ヒトＭ−ＣＳＦポ
リクローナル抗体を用いる（第１抗体が家兎ポリクロー
ナル抗体で第２抗体が羊ポリクローナル抗体である）こ
ともでき、その逆、即ち第１抗体として羊ポリクローナ
ル抗体を用い、第２抗体として家兎ポリクローナル抗体
を用いることも可能である。
として用いた本発明モノクローナル抗体とは別の本発明
モノクローナル抗体を用いることもできる。また、第１
抗体として家兎抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を
用い、第２抗体として本発明モノクローナル抗体を用い
ることもできる。更に３ステップサンドイッチ法におい
ては、第１抗体として家兎抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクロー
ナル抗体を用い、第２抗体として羊抗ヒトＭ−ＣＳＦポ
リクローナル抗体を用いる（第１抗体が家兎ポリクロー
ナル抗体で第２抗体が羊ポリクローナル抗体である）こ
ともでき、その逆、即ち第１抗体として羊ポリクローナ
ル抗体を用い、第２抗体として家兎ポリクローナル抗体
を用いることも可能である。
【００３１】上記ヒトＭ−ＣＳＦの測定法において、第
１抗体、即ち抗ヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（或
は家兎又は羊抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体）の
不溶化は、常法に従い抗体を不溶性担体に物理的又は化
学的に結合させることにより実施できる。上記不溶化の
ための不溶性担体としては、例えばポリスチレン、セフ
ァデックス、イオン交換樹脂、プラスチックチューブ、
アミノ共重合体等を使用でき、不溶化は共有結合法とし
てのジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬に
よる担体結合法、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学
反応、或はイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン
結合法、ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用
いる物理的吸着法等によって行なうことができる。尚、
上記第２抗体としてのポリクローナル抗体は、ヒトＭ−
ＣＳＦを認識する限り特に限定はなく、例えば本発明抗
体もしくはその製法において開示した免疫抗原を哺乳動
物に投与して生体内に産生される抗血清を使用すること
ができる。
１抗体、即ち抗ヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（或
は家兎又は羊抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体）の
不溶化は、常法に従い抗体を不溶性担体に物理的又は化
学的に結合させることにより実施できる。上記不溶化の
ための不溶性担体としては、例えばポリスチレン、セフ
ァデックス、イオン交換樹脂、プラスチックチューブ、
アミノ共重合体等を使用でき、不溶化は共有結合法とし
てのジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬に
よる担体結合法、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学
反応、或はイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン
結合法、ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用
いる物理的吸着法等によって行なうことができる。尚、
上記第２抗体としてのポリクローナル抗体は、ヒトＭ−
ＣＳＦを認識する限り特に限定はなく、例えば本発明抗
体もしくはその製法において開示した免疫抗原を哺乳動
物に投与して生体内に産生される抗血清を使用すること
ができる。
【００３２】上記第３ステップで用いられる標識抗体と
しては、公知のものでよく、既に市販のマウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、馬、牛等の動
物に免疫して得られる抗血清をパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）、アルカリホスファターゼ等で酵素標識した抗イム
ノグロブリン抗体、例えばパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識ヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体やパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体等を使用することがで
きる。
しては、公知のものでよく、既に市販のマウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、馬、牛等の動
物に免疫して得られる抗血清をパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）、アルカリホスファターゼ等で酵素標識した抗イム
ノグロブリン抗体、例えばパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識ヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体やパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体等を使用することがで
きる。
【００３３】上記測定法において、検体として用いられ
るサンプルとしては、例えば血清もしくは血漿形態の血
液、細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃
液、尿、膵臓液、骨髄液、唾液等の各種体液のいずれで
もよいが、血液、特に血清又は血漿が好ましい。
るサンプルとしては、例えば血清もしくは血漿形態の血
液、細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃
液、尿、膵臓液、骨髄液、唾液等の各種体液のいずれで
もよいが、血液、特に血清又は血漿が好ましい。
【００３４】上記において測定系に利用される溶媒とし
ては、反応に悪影響を与えない通常の各種のものをいず
れも利用でき、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液等のｐＨが約５．０〜
９．０程度の緩衝液の利用が好ましい。尚、本発明にお
いては、上記溶媒に、約０．１〜３０ｗ／ｖ％程度の血
清（測定対象のヒトＭ−ＣＳＦが含まれていないもの）
及び／又は約０．１〜２Ｍ程度のＮａＣｌを含ませるの
が、上記測定法の目的により合致していて好ましい。
ては、反応に悪影響を与えない通常の各種のものをいず
れも利用でき、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液等のｐＨが約５．０〜
９．０程度の緩衝液の利用が好ましい。尚、本発明にお
いては、上記溶媒に、約０．１〜３０ｗ／ｖ％程度の血
清（測定対象のヒトＭ−ＣＳＦが含まれていないもの）
及び／又は約０．１〜２Ｍ程度のＮａＣｌを含ませるの
が、上記測定法の目的により合致していて好ましい。
【００３５】測定の際の免疫反応条件は、特に制限はな
く、通常のこの種測定法と同様のものとすることができ
る。一般には約４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃程
度の温度条件下に、約１〜８０時間程度を要して免疫反
応を行なえばよい。
く、通常のこの種測定法と同様のものとすることができ
る。一般には約４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃程
度の温度条件下に、約１〜８０時間程度を要して免疫反
応を行なえばよい。
【００３６】本発明抗体を用いたヒトＭ−ＣＳＦの上記
測定法では、上記免疫反応終了後の固相−液相（前記第
３ステップでの反応複合体と標識抗体との結合体−非結
合標識抗体）の分離を、例えば遠心分離、濾別、デカン
テーション、洗浄等の通常の方法により行なうことがで
きる。
測定法では、上記免疫反応終了後の固相−液相（前記第
３ステップでの反応複合体と標識抗体との結合体−非結
合標識抗体）の分離を、例えば遠心分離、濾別、デカン
テーション、洗浄等の通常の方法により行なうことがで
きる。
【００３７】またかくして分離された各物質の酵素標識
活性の測定は、使用した酵素の種類に応じて、公知の各
種方法に従い実施することができる。その際用いられる
発色溶液としては、通常のもの、例えば酵素としてパー
オキシダーゼを用いる場合には、ｏ−フェニレンジアミ
ン（ＯＰＤ）等を用いることができ、発色反応の停止も
常法に従い例えば反応液に１〜４Ｎの硫酸等の適当な酵
素活性阻害剤を添加することにより実施できる。
活性の測定は、使用した酵素の種類に応じて、公知の各
種方法に従い実施することができる。その際用いられる
発色溶液としては、通常のもの、例えば酵素としてパー
オキシダーゼを用いる場合には、ｏ−フェニレンジアミ
ン（ＯＰＤ）等を用いることができ、発色反応の停止も
常法に従い例えば反応液に１〜４Ｎの硫酸等の適当な酵
素活性阻害剤を添加することにより実施できる。
【００３８】かくして、本測定方法によれば、臨床血液
サンプル等の微量のヒトＭ−ＣＳＦを含有する試料を検
体として、該検体中のヒトＭ−ＣＳＦを高精度、高感度
をもって、しかも簡便な操作で定量することができる。
サンプル等の微量のヒトＭ−ＣＳＦを含有する試料を検
体として、該検体中のヒトＭ−ＣＳＦを高精度、高感度
をもって、しかも簡便な操作で定量することができる。
【００３９】上記ヒトＭ−ＣＳＦの測定法の実施に特に
便利な方法は、試薬として前記第１抗体、第２抗体及び
標識抗体を含有する測定キットを利用する方法である。
該キット中のヒトＭ−ＣＳＦ試薬中には、例えばグリセ
ロールや牛血清蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添
加存在させることができる。この抗体試薬は好ましくは
凍結乾燥したものであるのがよく、該キットには水溶性
もしくは水と混和し得る溶媒を含有させることもでき
る。更に抗体試薬には再構成された試薬系を一定のｐＨ
に保つための緩衝液や試料が悪化するのを防止するため
の保存剤及び／又は安定剤を配合することができる。緩
衝液はキット試薬の必須成分ではないが本測定法を実施
する際にｐＨを約５．０〜９．０とするものを用いるの
が好ましい。また再構成剤は、好ましくは水を含んだも
のであるが、該水の一部又は全部を水と混和し得る溶媒
で置き換えることもできる。この水と混和し得る溶媒と
しては、よく知られている例えばグリセリン、アルコー
ル類、グリコールエーテル類等を例示することができ
る。
便利な方法は、試薬として前記第１抗体、第２抗体及び
標識抗体を含有する測定キットを利用する方法である。
該キット中のヒトＭ−ＣＳＦ試薬中には、例えばグリセ
ロールや牛血清蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添
加存在させることができる。この抗体試薬は好ましくは
凍結乾燥したものであるのがよく、該キットには水溶性
もしくは水と混和し得る溶媒を含有させることもでき
る。更に抗体試薬には再構成された試薬系を一定のｐＨ
に保つための緩衝液や試料が悪化するのを防止するため
の保存剤及び／又は安定剤を配合することができる。緩
衝液はキット試薬の必須成分ではないが本測定法を実施
する際にｐＨを約５．０〜９．０とするものを用いるの
が好ましい。また再構成剤は、好ましくは水を含んだも
のであるが、該水の一部又は全部を水と混和し得る溶媒
で置き換えることもできる。この水と混和し得る溶媒と
しては、よく知られている例えばグリセリン、アルコー
ル類、グリコールエーテル類等を例示することができ
る。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトＭ−ＣＳＦに特異
的な抗体、特にモノクローナル抗体が提供される。該モ
ノクローナル抗体の利用によれば、測定感度が極めて高
く、特異性に優れ、従って例えばヒトの臨床サンプル等
の極めて低濃度のヒトＭ−ＣＳＦを含有する検体中の該
ヒトＭ−ＣＳＦをも正確に測定可能な免疫検定法による
測定手法が提供される。
的な抗体、特にモノクローナル抗体が提供される。該モ
ノクローナル抗体の利用によれば、測定感度が極めて高
く、特異性に優れ、従って例えばヒトの臨床サンプル等
の極めて低濃度のヒトＭ−ＣＳＦを含有する検体中の該
ヒトＭ−ＣＳＦをも正確に測定可能な免疫検定法による
測定手法が提供される。
【００４１】
【実施例】以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を更
に詳述するが、本発明は之等各例に限定されるものでは
ない。尚、参考例１は本発明で免疫抗原として使用する
ＣＨＯ細胞で発現されるヒトＭ−ＣＳＦ（誘導体）の製
造例、参考例２は大腸菌で発現されるヒトＭ−ＣＳＦ
（誘導体）の製造例である。之等各参考例は、ＰＣＴ国
際公開第ＷＯ９１−０６５６７号公報に記載の方法に従
うものであり、各例では製造されるヒトＭ−ＣＳＦを次
のように定義する。即ち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を宿主
としてヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の１位Ｖａｌから
１５１位Ｔｈｒまでのアミノ酸を含む発現ベクターにて
産生されたＭ−ＣＳＦ分子を“Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦ”と呼ぶ。尚、このカギ括弧内番号はＣ
ＨＯ細胞で産生されるＭ−ＣＳＦはそのＮ末端域が１位
Ｖａｌの上流に更に２アミノ酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）
を蒸された構造を採ることによるものである。また参考
考例１で得られるＣＨＯ細胞を宿主として、３２個のア
ミノ酸配列よりなるシグナルペプチド及び５２２個のア
ミノ酸配列よりなる成熟ヒトＭ−ＣＳＦ蛋白質をコード
する発現ベクターにより産生されるヒトＭ−ＣＳＦを
“ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ”と呼ぶ。
に詳述するが、本発明は之等各例に限定されるものでは
ない。尚、参考例１は本発明で免疫抗原として使用する
ＣＨＯ細胞で発現されるヒトＭ−ＣＳＦ（誘導体）の製
造例、参考例２は大腸菌で発現されるヒトＭ−ＣＳＦ
（誘導体）の製造例である。之等各参考例は、ＰＣＴ国
際公開第ＷＯ９１−０６５６７号公報に記載の方法に従
うものであり、各例では製造されるヒトＭ−ＣＳＦを次
のように定義する。即ち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を宿主
としてヒトＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の１位Ｖａｌから
１５１位Ｔｈｒまでのアミノ酸を含む発現ベクターにて
産生されたＭ−ＣＳＦ分子を“Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦ”と呼ぶ。尚、このカギ括弧内番号はＣ
ＨＯ細胞で産生されるＭ−ＣＳＦはそのＮ末端域が１位
Ｖａｌの上流に更に２アミノ酸残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）
を蒸された構造を採ることによるものである。また参考
考例１で得られるＣＨＯ細胞を宿主として、３２個のア
ミノ酸配列よりなるシグナルペプチド及び５２２個のア
ミノ酸配列よりなる成熟ヒトＭ−ＣＳＦ蛋白質をコード
する発現ベクターにより産生されるヒトＭ−ＣＳＦを
“ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ”と呼ぶ。
【００４２】更に、各例で得られる試料のＣＳＦ活性
は、以下の方法により測定されるものとする。
は、以下の方法により測定されるものとする。
【００４３】
【ＣＳＦの活性測定法】牛胎児血清（ＦＣＳ）２０ｍ
ｌ、α−培地３０ｍｌ及び２倍濃度α−培地２０ｍｌを
混和して得られる溶液を３７℃にて保温し、その２３．
３ｍｌを予め５０℃に保温した１％寒天（ディフコ社
製）溶液１０ｍｌと混合して３７℃に保温する。
ｌ、α−培地３０ｍｌ及び２倍濃度α−培地２０ｍｌを
混和して得られる溶液を３７℃にて保温し、その２３．
３ｍｌを予め５０℃に保温した１％寒天（ディフコ社
製）溶液１０ｍｌと混合して３７℃に保温する。
【００４４】一方Ｂａｌｂ／Ｃ系マウス大腿骨より採取
した骨髄細胞（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、
α−培地にて細胞濃度が１０７個／ｍｌとなるように調
製し、その１ｍｌを上記３７℃に保温してある寒天培地
に加えてよく混和した後、３７℃に保温し、次いでその
０．５ｍｌを、予め５０μｌの供試試料を入れたウェル
（ティッシュカルチャークラスター１２、コスター社
製）に加えて手早く混和して室温に放置する。各ウェル
の寒天が固化するのを待って炭酸ガスインキュベーター
に移し、更に３７℃で７日間培養する。
した骨髄細胞（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、
α−培地にて細胞濃度が１０７個／ｍｌとなるように調
製し、その１ｍｌを上記３７℃に保温してある寒天培地
に加えてよく混和した後、３７℃に保温し、次いでその
０．５ｍｌを、予め５０μｌの供試試料を入れたウェル
（ティッシュカルチャークラスター１２、コスター社
製）に加えて手早く混和して室温に放置する。各ウェル
の寒天が固化するのを待って炭酸ガスインキュベーター
に移し、更に３７℃で７日間培養する。
【００４５】かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を
用いて計測し、ＣＳＦ活性の指標とする。またＣＳＦ活
性の単位（Ｕ／ｍｌ）は、上記コロニー数より、次式
（ａ）に従って算出した値を用いた。
用いて計測し、ＣＳＦ活性の指標とする。またＣＳＦ活
性の単位（Ｕ／ｍｌ）は、上記コロニー数より、次式
（ａ）に従って算出した値を用いた。
【００４６】ＣＳＦ活性単位（Ｕ／ｍｌ）＝（コロニー
数）×（希釈倍率）÷１．５（ａ） 尚、上記で生じるコロニーは形態学的及び酵素化学的観
察の結果、殆んどすべてがマクロファージコロニーであ
った。
数）×（希釈倍率）÷１．５（ａ） 尚、上記で生じるコロニーは形態学的及び酵素化学的観
察の結果、殆んどすべてがマクロファージコロニーであ
った。
【００４７】
【参考例１】ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの製
造 ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１−０６５６７号公報に記載の
参考例１に従って、ＣＨＯ細胞を培養して得られた培養
上清液の濃縮液９３０ｍｌを硫安分画して２５〜６５％
の硫安沈殿画分を得た後、蒸留水に溶解して（１１８０
ｍｌ）、以下の精製工程により目的の均質なＣＨＯ［−
３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを得た。尚、以下の工程にお
いて目的蛋白はウエスタンブロッティング法に従い検出
した。該ウエスタンブロッティングは、バイオ・ラッド
社のトランスブロットセルを用いて行ない、トランスフ
ァーされたニトロセルロース膜を１％スキムミルク含有
ＰＢＳ−にてブロッキング後、Ｍ−ＣＳＦに対するウサ
ギ抗血清と反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギ抗体（バイオ・ラッド社製）を反応させた。Ｍ−
ＣＳＦのバンドの検出は、得られたニトロセルロース膜
と発色基質である４−クロロ−１−ナフトール液とを反
応させることにより行なった。上記で得られた培養上清
のＣＳＦ活性は２×１０４単位／ｍｌであった。
造 ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１−０６５６７号公報に記載の
参考例１に従って、ＣＨＯ細胞を培養して得られた培養
上清液の濃縮液９３０ｍｌを硫安分画して２５〜６５％
の硫安沈殿画分を得た後、蒸留水に溶解して（１１８０
ｍｌ）、以下の精製工程により目的の均質なＣＨＯ［−
３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを得た。尚、以下の工程にお
いて目的蛋白はウエスタンブロッティング法に従い検出
した。該ウエスタンブロッティングは、バイオ・ラッド
社のトランスブロットセルを用いて行ない、トランスフ
ァーされたニトロセルロース膜を１％スキムミルク含有
ＰＢＳ−にてブロッキング後、Ｍ−ＣＳＦに対するウサ
ギ抗血清と反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギ抗体（バイオ・ラッド社製）を反応させた。Ｍ−
ＣＳＦのバンドの検出は、得られたニトロセルロース膜
と発色基質である４−クロロ−１−ナフトール液とを反
応させることにより行なった。上記で得られた培養上清
のＣＳＦ活性は２×１０４単位／ｍｌであった。
【００４８】（１）ＣｏｎＡ−セファロ−ス−クロマト
グラフィー 約５００ｍｌのＣｏｎＡ−セファロースゲルを充填した
カラム（５×２５ｃｍ）を０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡
化した後、上記溶解液をアプライし、同緩衝液にて充分
に洗浄後、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを含む
同緩衝液にて溶出を行なった。全溶出液をＹＭ−１０膜
を用いた限外濾過により濃縮後、２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液を交換した後（４０
ｍｌ）、以下の条件で５回に分けて陰イオン交換高速液
体クロマトグラフィーに供した。
グラフィー 約５００ｍｌのＣｏｎＡ−セファロースゲルを充填した
カラム（５×２５ｃｍ）を０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡
化した後、上記溶解液をアプライし、同緩衝液にて充分
に洗浄後、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを含む
同緩衝液にて溶出を行なった。全溶出液をＹＭ−１０膜
を用いた限外濾過により濃縮後、２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液を交換した後（４０
ｍｌ）、以下の条件で５回に分けて陰イオン交換高速液
体クロマトグラフィーに供した。
【００４９】（２）陰イオン交換高速液体クロマトグラ
フィー カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩ
Ｄ×１５ｃｍ、トーソー社製） 溶出液Ａ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 溶出液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：３．０ｍｌ／分 フラクション容積：６ｍｌ／チューブ／２分 上記溶出の結果、目的のＭ−ＣＳＦはフラクションＮ
ｏ．２６〜４３に溶出され、主たるＭ−ＣＳＦ画分であ
るフラクションＮｏ．３０〜３９をプールして、限外濾
過濃縮（ＹＭ−１０膜使用）した後（１５ｍｌ）、４回
に分けて以下の精製を行なった。
フィー カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩ
Ｄ×１５ｃｍ、トーソー社製） 溶出液Ａ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 溶出液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：３．０ｍｌ／分 フラクション容積：６ｍｌ／チューブ／２分 上記溶出の結果、目的のＭ−ＣＳＦはフラクションＮ
ｏ．２６〜４３に溶出され、主たるＭ−ＣＳＦ画分であ
るフラクションＮｏ．３０〜３９をプールして、限外濾
過濃縮（ＹＭ−１０膜使用）した後（１５ｍｌ）、４回
に分けて以下の精製を行なった。
【００５０】（３）ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷＲＰ逆
相高速液体クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷＲＰ（７．５ｍｍ
ＩＤ×７５ｍｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ 溶離液Ｂ：ｎ−プロパノール：１％ＴＦＡ（９：１） 流速：３ｍｌ／分 フラクション容積：１．５ｍｌ／チューブ／０．５分 上記溶出フラクション中のＭ−ＣＳＦ画分をプールし
た後、限外濾過（ＹＭ−１０膜使用）にて濃縮し、更に
セントリコン３０（アミコン社製）にて濃縮し（１ｍ
ｌ）、３回に分けてゲル濾過高速液体クロマトグラフィ
ーを行なった。
相高速液体クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷＲＰ（７．５ｍｍ
ＩＤ×７５ｍｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ 溶離液Ｂ：ｎ−プロパノール：１％ＴＦＡ（９：１） 流速：３ｍｌ／分 フラクション容積：１．５ｍｌ／チューブ／０．５分 上記溶出フラクション中のＭ−ＣＳＦ画分をプールし
た後、限外濾過（ＹＭ−１０膜使用）にて濃縮し、更に
セントリコン３０（アミコン社製）にて濃縮し（１ｍ
ｌ）、３回に分けてゲル濾過高速液体クロマトグラフィ
ーを行なった。
【００５１】（４）ゲル濾過高速液体クロマトグラフィ
ー カラム：スーパーローズ１２ＨＲ１０／３０（１０ｍｍ
ＩＤ×３０ｃｍ、ファルマシアＬＫＢ社製） 溶出液：０．３ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：０．８ｍｌ／分 フラクション容積：０．８ｍｌ／チューブ／１分 上記クロマトグラフィーの結果、Ｍ−ＣＳＦはフラクシ
ョンＮｏ．１５〜１７にかけて溶出され、その中のフラ
クションＮｏ．１６をプールして実験に供した（５．６
ｍｇ、比活性：３．８×１０７単位／ｍｇ蛋白）。
ー カラム：スーパーローズ１２ＨＲ１０／３０（１０ｍｍ
ＩＤ×３０ｃｍ、ファルマシアＬＫＢ社製） 溶出液：０．３ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：０．８ｍｌ／分 フラクション容積：０．８ｍｌ／チューブ／１分 上記クロマトグラフィーの結果、Ｍ−ＣＳＦはフラクシ
ョンＮｏ．１５〜１７にかけて溶出され、その中のフラ
クションＮｏ．１６をプールして実験に供した（５．６
ｍｇ、比活性：３．８×１０７単位／ｍｇ蛋白）。
【００５２】（５）ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７，６８０（１９７０）］に従い、上記（４）
で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを、レ
ムリのサンプルバッファー［２−メルカプトエタノール
を含むもの（２−ＭＥ＋）及び含まないもの（２−ＭＥ
−）の両者］の夫々と混合後、９５℃で１０分間加熱処
理し、ミニスラブゲル（ゲル濃度１５％）を用いてＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行なった。分子量マーカーとしてはプレ
ステインドマーカー（バイオ・ラッド社製）を用い、染
色はシルバーステイン（和光純薬社製）にて行なった。
ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７，６８０（１９７０）］に従い、上記（４）
で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを、レ
ムリのサンプルバッファー［２−メルカプトエタノール
を含むもの（２−ＭＥ＋）及び含まないもの（２−ＭＥ
−）の両者］の夫々と混合後、９５℃で１０分間加熱処
理し、ミニスラブゲル（ゲル濃度１５％）を用いてＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行なった。分子量マーカーとしてはプレ
ステインドマーカー（バイオ・ラッド社製）を用い、染
色はシルバーステイン（和光純薬社製）にて行なった。
【００５３】その結果、非還元条件下（２−ＭＥ−状
態）での分子量は約８５０００を主成分として、６２０
００〜１１５０００にかけて、また還元条件（２−ＭＥ
＋状態）では４３０００を主成分として３９０００〜４
６０００にかけて、夫々スメアーしたバンドとして検出
された。
態）での分子量は約８５０００を主成分として、６２０
００〜１１５０００にかけて、また還元条件（２−ＭＥ
＋状態）では４３０００を主成分として３９０００〜４
６０００にかけて、夫々スメアーしたバンドとして検出
された。
【００５４】（６）ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
ＦのＮ末端域アミノ酸配列 上記（４）で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−Ｃ
ＳＦのＮ末端域アミノ酸配列を、気相シークエンサー
（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定し
た。
ＦのＮ末端域アミノ酸配列 上記（４）で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−Ｃ
ＳＦのＮ末端域アミノ酸配列を、気相シークエンサー
（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定し
た。
【００５５】その結果、Ｎ端１０個のアミノ酸配列とし
て次の配列が確認された。尚、サイクル７におけるアミ
ノ酸（Ｘ′）は同定し得ず、遣伝子構造からＣｙｓであ
ると推定した。Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｘ´−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−
て次の配列が確認された。尚、サイクル７におけるアミ
ノ酸（Ｘ′）は同定し得ず、遣伝子構造からＣｙｓであ
ると推定した。Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｘ´−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−
【００５６】
【参考例２】 （１）プラスミドｐ ｔｒｐ ＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ
１０１の作製 プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−１８５［Ｍ−ＣＳＦ
遺伝子（λｃＭ１１ｃＤＮＡ、約２．５ｋｂ）を保有す
るプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１から作製した（特開
平１−１０４１７６号公報参照）］を、制限酵素Ｓｃａ
Ｉ及びＢａｍＨＩで消化してＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ Ｄ
ＮＡ断片（約４５０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法
により単離、精製した。次いで、得られたＤＮＡ断片の
ＳｃａＩ切断端にＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１−０６５６
７号公報参考例２に記載の合成リンカー（Ａ）をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結させ、ＳｃａＩ切断端側に制限
酵素ＸｂａＩの切断端を有するＸｂａＩ−ＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を得た。
１０１の作製 プラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１−１８５［Ｍ−ＣＳＦ
遺伝子（λｃＭ１１ｃＤＮＡ、約２．５ｋｂ）を保有す
るプラスミドｐｃＤＭ−ＣＳＦ１１から作製した（特開
平１−１０４１７６号公報参照）］を、制限酵素Ｓｃａ
Ｉ及びＢａｍＨＩで消化してＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ Ｄ
ＮＡ断片（約４５０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法
により単離、精製した。次いで、得られたＤＮＡ断片の
ＳｃａＩ切断端にＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１−０６５６
７号公報参考例２に記載の合成リンカー（Ａ）をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結させ、ＳｃａＩ切断端側に制限
酵素ＸｂａＩの切断端を有するＸｂａＩ−ＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片（約４８０ｂｐ）を得た。
【００５７】得られたＤＮＡ断片を、ヒトＩＬ−２発現
プラスミドｐ ｔｒｐ ＩＬ−２Ｄ８Δ（特開昭６３−
１２９５８号公報参照）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ切断部
位に挿入して、所望のプラスミドｐ ｔｒｐ ＩＬ−２
Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０１を得た。
プラスミドｐ ｔｒｐ ＩＬ−２Ｄ８Δ（特開昭６３−
１２９５８号公報参照）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ切断部
位に挿入して、所望のプラスミドｐ ｔｒｐ ＩＬ−２
Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０１を得た。
【００５８】該プラスミドをエシェリヒア・コリＨＢ１
０１株にトランスフォームさせた形質転換体は、「Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐｔｒｐ
ＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０１」なる名称で、１９８
８年１２月２６日に工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第２２２６号（Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］
ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６）として寄託された。
０１株にトランスフォームさせた形質転換体は、「Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐｔｒｐ
ＩＬ−２Ｘ−Ｍ−ＣＳＦ１０１」なる名称で、１９８
８年１２月２６日に工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第２２２６号（Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］
ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２６）として寄託された。
【００５９】（２）Ｅ．Ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−Ｃ
ＳＦの分離、精製 １）大腸菌からのＭ−ＣＳＦ画分の調製 上記（１）で得たプラスミドｐｔｒｐ ＩＬ−２Ｘ−Ｍ
−ＣＳＦ１０１を保持する大腸菌ＳＧ２１０５８株７．
５ｇ（湿重量）に、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１．０ｍｌを加えて充分に撹拌した。次に、リ
ゾチーム４ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ、続けてＥＤＴＡを最終
濃度が１０ｍＭとなるように加え、４℃で１５分間撹拌
処理し、超音波処理（２０ＫＨｚ、１０分間、２００
Ｗ）を行ない、更に１００００×ｇ／分で２０分間遠心
分離を行ない沈渣を得た。これを更に洗浄用緩衝液［２
％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ
７．０）にて洗浄後、同条件で再度遠心分離を行ない、
この操作を２回繰返して、Ｍ−ＣＳＦ画分（沈渣）を得
た。
ＳＦの分離、精製 １）大腸菌からのＭ−ＣＳＦ画分の調製 上記（１）で得たプラスミドｐｔｒｐ ＩＬ−２Ｘ−Ｍ
−ＣＳＦ１０１を保持する大腸菌ＳＧ２１０５８株７．
５ｇ（湿重量）に、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１．０ｍｌを加えて充分に撹拌した。次に、リ
ゾチーム４ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ、続けてＥＤＴＡを最終
濃度が１０ｍＭとなるように加え、４℃で１５分間撹拌
処理し、超音波処理（２０ＫＨｚ、１０分間、２００
Ｗ）を行ない、更に１００００×ｇ／分で２０分間遠心
分離を行ない沈渣を得た。これを更に洗浄用緩衝液［２
％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ
７．０）にて洗浄後、同条件で再度遠心分離を行ない、
この操作を２回繰返して、Ｍ−ＣＳＦ画分（沈渣）を得
た。
【００６０】２）Ｍ−ＣＳＦ画分からＭ−ＣＳＦの再構
成 上記１）の操作により得られたＭ−ＣＳＦ画分に、７Ｍ
塩酸グアニジン及び２５ｍＭ２−メルカプトエタノール
を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）２０ｍｌを加
え、室温で４時間以上撹拌して溶解させた。この溶解液
を、予め０．５ｍＭ還元型グルタチオン、０，１ｍＭ酸
化型グルタチオン及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０００ｍｌの入ったビーカー
（スターラーにて撹拌）中に徐々に滴下し、その後、４
℃にて２日間以上放置した。次に溶液を１００００×ｇ
／分で３０分間遠心分離して、沈澱を除去して上清を得
た。かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳ
Ｆが存在している。
成 上記１）の操作により得られたＭ−ＣＳＦ画分に、７Ｍ
塩酸グアニジン及び２５ｍＭ２−メルカプトエタノール
を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）２０ｍｌを加
え、室温で４時間以上撹拌して溶解させた。この溶解液
を、予め０．５ｍＭ還元型グルタチオン、０，１ｍＭ酸
化型グルタチオン及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０００ｍｌの入ったビーカー
（スターラーにて撹拌）中に徐々に滴下し、その後、４
℃にて２日間以上放置した。次に溶液を１００００×ｇ
／分で３０分間遠心分離して、沈澱を除去して上清を得
た。かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳ
Ｆが存在している。
【００６１】３）Ｍ−ＣＳＦの精製 上記２）で得た遠心上清の精製を以下の通り行なった。 ３−１）イオン交換クロマトグラフィーによる濃縮 予５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化し
ておいたＱＡＥ−ゼータ・プレップ１００（ファルマシ
アＬＢＫ社製）に上記２）で得た再構成液をかけ、次に
上記緩衝液で充分に洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む
上記緩衝液にてＭ−ＣＳＦ画分の溶出を行なった。
ておいたＱＡＥ−ゼータ・プレップ１００（ファルマシ
アＬＢＫ社製）に上記２）で得た再構成液をかけ、次に
上記緩衝液で充分に洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む
上記緩衝液にてＭ−ＣＳＦ画分の溶出を行なった。
【００６２】３−２）疎水性高速液体クロマトグラフィ
ー 上記で得られた画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和溶
液となるように加え、１００００×ｇ／分で２０分間遠
心分離し、沈殿を除去して上清を得た。この上清を０．
４５μｍミリポアーフィルター通した後、下記条件で疎
水性高速液体クロマトグラフィーを行なった。 カラム：ＴＳＫゲルフェニル５ＰＷ（１５０ｍｍ×２
１．５ｍｍＩＤ、トーソー社製） 溶出液Ａ：３０％飽和硫安含有４０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４） 溶出液ｂ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 流速：３．０ｍｌ／分 フラクション容積：３．０ｍｌ／チューブ／分 上記の結果、Ｍ−ＣＳＦ活性は硫安濃度６〜３％の画
分に溶出された。該活性画分を分取し、限外濾過器にて
４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して溶媒
交換を行なった。
ー 上記で得られた画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和溶
液となるように加え、１００００×ｇ／分で２０分間遠
心分離し、沈殿を除去して上清を得た。この上清を０．
４５μｍミリポアーフィルター通した後、下記条件で疎
水性高速液体クロマトグラフィーを行なった。 カラム：ＴＳＫゲルフェニル５ＰＷ（１５０ｍｍ×２
１．５ｍｍＩＤ、トーソー社製） 溶出液Ａ：３０％飽和硫安含有４０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４） 溶出液ｂ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 流速：３．０ｍｌ／分 フラクション容積：３．０ｍｌ／チューブ／分 上記の結果、Ｍ−ＣＳＦ活性は硫安濃度６〜３％の画
分に溶出された。該活性画分を分取し、限外濾過器にて
４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して溶媒
交換を行なった。
【００６３】３−３）陰イオン交換高速液体クロマトグ
ラフィー 上記３−２）で得た画分を、以下の条件で陰イオン交換
高速液体クロマトグラフィーにかけた。 カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩ
Ｄ×１５０ｍｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 溶離液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：３．０ｍｌ／分 上記陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーの結果
（溶出パターン）より、フラクションＮｏ．３５及び３
６（０．２８〜０．２９Ｍ ＮａＣｌ濃度）に認められ
るピークがＭ−ＣＳＦに相当し、該ピークを集めて大腸
菌から精製Ｍ−ＣＳＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ
−ＣＳＦ）を得た。
ラフィー 上記３−２）で得た画分を、以下の条件で陰イオン交換
高速液体クロマトグラフィーにかけた。 カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩ
Ｄ×１５０ｍｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 溶離液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：３．０ｍｌ／分 上記陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーの結果
（溶出パターン）より、フラクションＮｏ．３５及び３
６（０．２８〜０．２９Ｍ ＮａＣｌ濃度）に認められ
るピークがＭ−ＣＳＦに相当し、該ピークを集めて大腸
菌から精製Ｍ−ＣＳＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ
−ＣＳＦ）を得た。
【００６４】（４）Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−Ｃ
ＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ，ＵＫ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７，６８０（１９７０）］に従い、上記（３）
で得られたＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦの上
清をサンプルとして、レムリのサンプルバッファー［２
−メルカプトエタノールを含むもの（２−ＭＥ＋）及び
含まないもの（２−ＭＥ−）の両者］の夫々と混合後、
９５℃で１０分間加熱処理し、ミニスラブゲル（ゲル濃
度１５％）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
ＳＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ，ＵＫ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７７，６８０（１９７０）］に従い、上記（３）
で得られたＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦの上
清をサンプルとして、レムリのサンプルバッファー［２
−メルカプトエタノールを含むもの（２−ＭＥ＋）及び
含まないもの（２−ＭＥ−）の両者］の夫々と混合後、
９５℃で１０分間加熱処理し、ミニスラブゲル（ゲル濃
度１５％）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
【００６５】その結果、非還元条件下（２−ＭＥ−状
態）での分子量は約３２０００を主成分としており、ま
た還元条件（２−ＭＥ＋状態）では約１７０００を主成
分としていることが検出された。上記（３）で得られた
Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ精製標品の比活
性は４×１０７単位／ｍｇであった。
態）での分子量は約３２０００を主成分としており、ま
た還元条件（２−ＭＥ＋状態）では約１７０００を主成
分としていることが検出された。上記（３）で得られた
Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ精製標品の比活
性は４×１０７単位／ｍｇであった。
【００６６】
【実施例１】本発明モノクローナル抗体の製造 ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを抗原とする
モノクローナル抗体の製造 参考例１で製造したＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
Ｆを免疫抗原として用いて、その２０μｇを等量のフロ
インド完全アジュバント液と混合乳化させ、これを４０
μｇ／マウスずつ、雄性Ｂａｌｂ／ｃ系マウス（８週
齢）に腹腔内投与して免疫した。その後同様に３回、２
週間おきに同免疫抗原液の同量を同経路で追加投与して
免疫した。２〜３週間後に最終免疫として２０μｇの抗
原液を静脈内投与して免疫した。以下の操作は全て無菌
的に行ない、試験は３７℃に保って行なった。上記最終
免疫の２〜３日後に、マウスから脾臓を摘出し、摘出脾
臓より脾細胞を取出し、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０
培地（日水製薬社製）の中で擂り潰した。次に遠心分離
（１５００ｒｐｍ、５分間）して細胞ペレットをかきと
り、該ペレットに細胞中に存在する赤血球を０．８３％
塩化アンモニウム緩衝液で１〜２分間処理して融解除去
した。上記で得られた細胞を感作リンパ球細胞として集
め、これを３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。
モノクローナル抗体の製造 参考例１で製造したＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
Ｆを免疫抗原として用いて、その２０μｇを等量のフロ
インド完全アジュバント液と混合乳化させ、これを４０
μｇ／マウスずつ、雄性Ｂａｌｂ／ｃ系マウス（８週
齢）に腹腔内投与して免疫した。その後同様に３回、２
週間おきに同免疫抗原液の同量を同経路で追加投与して
免疫した。２〜３週間後に最終免疫として２０μｇの抗
原液を静脈内投与して免疫した。以下の操作は全て無菌
的に行ない、試験は３７℃に保って行なった。上記最終
免疫の２〜３日後に、マウスから脾臓を摘出し、摘出脾
臓より脾細胞を取出し、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０
培地（日水製薬社製）の中で擂り潰した。次に遠心分離
（１５００ｒｐｍ、５分間）して細胞ペレットをかきと
り、該ペレットに細胞中に存在する赤血球を０．８３％
塩化アンモニウム緩衝液で１〜２分間処理して融解除去
した。上記で得られた細胞を感作リンパ球細胞として集
め、これを３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。
【００６７】次に、マウス骨髄腫細胞［Ｐ３Ｕ１、Ｃｕ
ｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，７３，３（１９８１）］を、１５％ＦＣＳ（牛
胎児血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に８−ア
ザグアニン１００μＭを加えた培地中で継代培養し、こ
れをミエローマ細胞として用いて、上記リンパ球細胞と
同様にして洗浄した。
ｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，７３，３（１９８１）］を、１５％ＦＣＳ（牛
胎児血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に８−ア
ザグアニン１００μＭを加えた培地中で継代培養し、こ
れをミエローマ細胞として用いて、上記リンパ球細胞と
同様にして洗浄した。
【００６８】上記脾細胞とミエローマ細胞とを、細胞数
比が１０：１になるように５０ｍｌのチューブ内で混和
し、得られた細胞混合物を５００×ｇで５分間遠心分離
後、上清をパスツールピペットで完全に除去し、ペレッ
トをよくほぐした。之等の操作は３７℃に保温した水槽
内で行なった。次に、４５％ポリエチレングリコール−
４０００（ベーリング・マンハイム・山之内社製、以下
「ＰＥＧ」という）２ｍｌを、ゆっくりと３０秒間かき
混ぜながら滴下した後、３０秒間放置し、次いでＦＣＳ
を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地５ｍｌをゆっくりと
２分間位をかけて加えて１分間放置し、更に同液５ｍｌ
を加えて３分間放置した後、遠心分離（１５００ｒｐ
ｍ、５分間）し、上清をパスツールピペットで除去し、
得られたペレットを５０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に細胞懸濁液１×１０５個／ｍｌとな
るように懸濁させた。
比が１０：１になるように５０ｍｌのチューブ内で混和
し、得られた細胞混合物を５００×ｇで５分間遠心分離
後、上清をパスツールピペットで完全に除去し、ペレッ
トをよくほぐした。之等の操作は３７℃に保温した水槽
内で行なった。次に、４５％ポリエチレングリコール−
４０００（ベーリング・マンハイム・山之内社製、以下
「ＰＥＧ」という）２ｍｌを、ゆっくりと３０秒間かき
混ぜながら滴下した後、３０秒間放置し、次いでＦＣＳ
を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地５ｍｌをゆっくりと
２分間位をかけて加えて１分間放置し、更に同液５ｍｌ
を加えて３分間放置した後、遠心分離（１５００ｒｐ
ｍ、５分間）し、上清をパスツールピペットで除去し、
得られたペレットを５０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に細胞懸濁液１×１０５個／ｍｌとな
るように懸濁させた。
【００６９】次に、上記懸濁液を２４穴のプレート（コ
ースター社製）４枚に１ｍｌ／ウェルずつ分注し、３７
℃、５％ＣＯ２、１００％湿度のインキュベーター内で
培養した。２４時間後、１ｍｌ／ウェルずつ１０％ＦＣ
Ｓ添加ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ、アミノプテリン
４×１０−７Ｍ及びチミジン１．６×１０−５Ｍを含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地（以下これを「ＨＡＴ培地」と
いう）を各ウェルに添加した。以後、上清を２日目、３
日目に培地の半分ずつ吸引し、同量の新しいＨＡＴ培地
を加えて液替えを行なった。その後、液替えは２〜３日
おきに行なった。６日目に同様に上清を吸引し１×１０
−４Ｍヒポキサンチン及びチミジン１．６×１０−５Ｍ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下これを「ＨＴ培
地」という）に替えた。以後、ＲＰＭＩ−１６４０培地
で増殖維持した。融合後、７〜１０日間でコロニーが肉
眼で観察されるようになり、細胞が２４穴プレートの底
面積の１／４を占めた時より、上清を参考例１で得たＣ
ＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを抗原とする酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で試験してスクリーニング
し、陽性となったウェルのハイブリドーマを直ちに限界
希釈法［Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７
３，３（１９８１）］によりクローニングした。
ースター社製）４枚に１ｍｌ／ウェルずつ分注し、３７
℃、５％ＣＯ２、１００％湿度のインキュベーター内で
培養した。２４時間後、１ｍｌ／ウェルずつ１０％ＦＣ
Ｓ添加ヒポキサンチン１×１０−４Ｍ、アミノプテリン
４×１０−７Ｍ及びチミジン１．６×１０−５Ｍを含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地（以下これを「ＨＡＴ培地」と
いう）を各ウェルに添加した。以後、上清を２日目、３
日目に培地の半分ずつ吸引し、同量の新しいＨＡＴ培地
を加えて液替えを行なった。その後、液替えは２〜３日
おきに行なった。６日目に同様に上清を吸引し１×１０
−４Ｍヒポキサンチン及びチミジン１．６×１０−５Ｍ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下これを「ＨＴ培
地」という）に替えた。以後、ＲＰＭＩ−１６４０培地
で増殖維持した。融合後、７〜１０日間でコロニーが肉
眼で観察されるようになり、細胞が２４穴プレートの底
面積の１／４を占めた時より、上清を参考例１で得たＣ
ＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを抗原とする酵素免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で試験してスクリーニング
し、陽性となったウェルのハイブリドーマを直ちに限界
希釈法［Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７
３，３（１９８１）］によりクローニングした。
【００７０】即ち、ＥＬＩＳＡ用９６穴ウェルマイクロ
プレート（ヌンク社製）に、免疫感作に用いた免疫抗原
ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦをＰＢＳ（シグマ
社製、製造ＮＯ．Ｐ−４４１７）中に１０μｇ／ｍｌに
なるように希釈した抗原溶液を上記イムノプレートに１
００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で２時間静置してコ
ーティングを行なった。次に、抗原溶液を除去した後、
０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＰＢＳをそれ
ぞれ４００μｌ／ウェルずつ加え、室温で１時間静置し
た後、０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳを除去し、上清を１０
０μｌ／ウエルずつ加えた。室温で一晩インキュベート
した後、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０及び
ＰＢＳでウェルを３回洗浄した。次に、１００μｌ／ウ
エルのＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗ウ
サギＩｇＧ抗体（バイオ・ラッド社製）を加え、室温に
て２時間インキュベートした後、０．０５％ツイーン−
２０及びＰＢＳで５回洗浄した。最後に、１００μｌ／
ウェルのオルトフエニレンジアミン（ＯＰＤ）基質液
［４ｍｇＯＰＤ（シグマ社製、製造Ｎｏ．Ｐ−８２８
７）、４μ１３０％過酸化水素水及び１０ｍｌクエン酸
緩衝液（ＰＨ５．０）＝ＯＰＤ緩衝液（シグマ社製、製
造Ｎｏ．Ｐ−４９２２）］を加え、充分発色させた後、
２Ｎ硫酸溶液５０μｌを各ウェルに加えて反応を停止さ
せた。基質液の発色を、エライザーアナライザー（タイ
ターテック社製）を用いて４９０ｎｍの吸光度により測
定した。
プレート（ヌンク社製）に、免疫感作に用いた免疫抗原
ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦをＰＢＳ（シグマ
社製、製造ＮＯ．Ｐ−４４１７）中に１０μｇ／ｍｌに
なるように希釈した抗原溶液を上記イムノプレートに１
００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で２時間静置してコ
ーティングを行なった。次に、抗原溶液を除去した後、
０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＰＢＳをそれ
ぞれ４００μｌ／ウェルずつ加え、室温で１時間静置し
た後、０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳを除去し、上清を１０
０μｌ／ウエルずつ加えた。室温で一晩インキュベート
した後、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０及び
ＰＢＳでウェルを３回洗浄した。次に、１００μｌ／ウ
エルのＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗ウ
サギＩｇＧ抗体（バイオ・ラッド社製）を加え、室温に
て２時間インキュベートした後、０．０５％ツイーン−
２０及びＰＢＳで５回洗浄した。最後に、１００μｌ／
ウェルのオルトフエニレンジアミン（ＯＰＤ）基質液
［４ｍｇＯＰＤ（シグマ社製、製造Ｎｏ．Ｐ−８２８
７）、４μ１３０％過酸化水素水及び１０ｍｌクエン酸
緩衝液（ＰＨ５．０）＝ＯＰＤ緩衝液（シグマ社製、製
造Ｎｏ．Ｐ−４９２２）］を加え、充分発色させた後、
２Ｎ硫酸溶液５０μｌを各ウェルに加えて反応を停止さ
せた。基質液の発色を、エライザーアナライザー（タイ
ターテック社製）を用いて４９０ｎｍの吸光度により測
定した。
【００７１】上記ＥＬＩＳＡにて陽性を示したウェルの
ハイブリドーマを直ちに限界希釈法［Ｍｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１）］に
よりクローニングした。即ち、Ｂａｌｂ／ｃ系マウス脾
細胞をフィーダー細胞として、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に希釈し、９６ウェルプレートに２×
１０６個／１００μｌ／ウェルとなるように調製して分
注した。上記ＥＬＩＳＡで発色したウェルの細胞を３個
／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４
０培地で希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウ
ェルずつ分注した。クローンがある程度増殖してきた
ら、再び上記と同様の方法にてスクリーニングを行な
い、シングルクローンのものは腹水化もしくは凍結保存
し、その他は再度同一クローニングを行なった。
ハイブリドーマを直ちに限界希釈法［Ｍｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３（１９８１）］に
よりクローニングした。即ち、Ｂａｌｂ／ｃ系マウス脾
細胞をフィーダー細胞として、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に希釈し、９６ウェルプレートに２×
１０６個／１００μｌ／ウェルとなるように調製して分
注した。上記ＥＬＩＳＡで発色したウェルの細胞を３個
／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４
０培地で希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウ
ェルずつ分注した。クローンがある程度増殖してきた
ら、再び上記と同様の方法にてスクリーニングを行な
い、シングルクローンのものは腹水化もしくは凍結保存
し、その他は再度同一クローニングを行なった。
【００７２】上記クロニング（３回）により、所望の反
応特異性を有する本発明モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ５株を得た。之等をそれぞれ「ＫＯＣＯ
５７１」〜「ＫＯＣＯ５７５」と命名した。また之等各
ハイブリドーマの産生する本発明モノクローナル抗体
は、それぞれハイブリドーマの番号と対応させて「ＡＮ
ＯＣ５７１」〜「ＡＮＯＣ５７５」と命名する。
応特異性を有する本発明モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ５株を得た。之等をそれぞれ「ＫＯＣＯ
５７１」〜「ＫＯＣＯ５７５」と命名した。また之等各
ハイブリドーマの産生する本発明モノクローナル抗体
は、それぞれハイブリドーマの番号と対応させて「ＡＮ
ＯＣ５７１」〜「ＡＮＯＣ５７５」と命名する。
【００７３】上記で得られたクローンＮｏ．ＫＯＣＯ５
７１〜ＫＯＣＯ５７５のそれぞれを、５０ｍｌのフラス
コ内にて、ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％ＣＯ２条件
下で、３７℃にて、９６時間培養した。培養液を３００
０ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、目的のモノクローナ
ル抗体を含む培養上清を得た。得られたクローンの内の
４株（本発明抗体産生ハイブリドーマＫＯＣＯ５７１〜
ＫＯＣＯ５７４）を選定した。
７１〜ＫＯＣＯ５７５のそれぞれを、５０ｍｌのフラス
コ内にて、ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％ＣＯ２条件
下で、３７℃にて、９６時間培養した。培養液を３００
０ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、目的のモノクローナ
ル抗体を含む培養上清を得た。得られたクローンの内の
４株（本発明抗体産生ハイブリドーマＫＯＣＯ５７１〜
ＫＯＣＯ５７４）を選定した。
【００７４】之等モノクローナル抗体産生細胞は、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に
「ＫＯＣＯ５７１」〜「ＫＯＣＯ５７４」なる表示で寄
託されており、それらの寄託番号は微工研菌寄第１２５
２２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２２）、微工研菌寄第１
２５２３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２３）、微工研菌寄
第１２５２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２４）及び微工
研菌寄第１２５２５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２５）で
ある。
産業省工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に
「ＫＯＣＯ５７１」〜「ＫＯＣＯ５７４」なる表示で寄
託されており、それらの寄託番号は微工研菌寄第１２５
２２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２２）、微工研菌寄第１
２５２３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２３）、微工研菌寄
第１２５２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２４）及び微工
研菌寄第１２５２５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５２５）で
ある。
【００７５】腹水の作製 上記で得た各ハイブリドーマを上記培養液で５％ＣＯ
２条件下に、３７℃にて４８時間、５０ｍｌフラスコ内
で培養した後、培養液を５００ｒｐｍ、５分間遠心分離
し、得られたペレットを２．５ｍｌのＰＢＳに懸濁させ
た。
２条件下に、３７℃にて４８時間、５０ｍｌフラスコ内
で培養した後、培養液を５００ｒｐｍ、５分間遠心分離
し、得られたペレットを２．５ｍｌのＰＢＳに懸濁させ
た。
【００７６】次に、予め２〜３日前にプリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、アルドリ
ッチ社製）を接種しておいたＢａｌｂ／ｃ系マウス５匹
に、１匹当り０．５ｍｌずつ上記細胞懸濁液を腹腔内投
与し、１０〜１４日後に、蓄積された腹水を最初の１匹
だけは無菌的に採取して、本発明抗体を含む腹水を得
た。上記腹水を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。
ペレットは１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及
び１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁さ
せ、冷凍保存した。上清は残りの４匹の腹水と合わせて
引き続く精製に用いた。
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、アルドリ
ッチ社製）を接種しておいたＢａｌｂ／ｃ系マウス５匹
に、１匹当り０．５ｍｌずつ上記細胞懸濁液を腹腔内投
与し、１０〜１４日後に、蓄積された腹水を最初の１匹
だけは無菌的に採取して、本発明抗体を含む腹水を得
た。上記腹水を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。
ペレットは１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及
び１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁さ
せ、冷凍保存した。上清は残りの４匹の腹水と合わせて
引き続く精製に用いた。
【００７７】抗体の精製 該腹水からの所望抗体の精製は、抗体精製キット（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ ＭＡＰＳ−ＩＩ Ｋｉｔ、バイオ・ラッド
社製）を用いて行なった。即ち、予めプロテインＡカラ
ムを約２０ｍｌの結合緩衝液で平衡化し、上記で得ら
れた各腹水に倍量の結合緩衝液を加えて混和し、４℃で
２時間静置後、３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し
た。得られた上清を４５μｍのメンブランフィルター
（マイレクスＨＡ：ミリポア社製）で濾過した。濾液を
プロテインＡカラムにアプライし、約３０ｍｌの結合緩
衝液で洗浄した。次に、１０ｍｌの溶出緩衝液でＩｇＧ
を溶出し、１Ｍトリス塩酸緩衝液１ｍｌを加えて中和し
た。更にＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。得られた
透析液を用いて、２８０ｎｍの吸収を測定し、抗体濃度
を決定した。
ｏ−Ｒａｄ ＭＡＰＳ−ＩＩ Ｋｉｔ、バイオ・ラッド
社製）を用いて行なった。即ち、予めプロテインＡカラ
ムを約２０ｍｌの結合緩衝液で平衡化し、上記で得ら
れた各腹水に倍量の結合緩衝液を加えて混和し、４℃で
２時間静置後、３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し
た。得られた上清を４５μｍのメンブランフィルター
（マイレクスＨＡ：ミリポア社製）で濾過した。濾液を
プロテインＡカラムにアプライし、約３０ｍｌの結合緩
衝液で洗浄した。次に、１０ｍｌの溶出緩衝液でＩｇＧ
を溶出し、１Ｍトリス塩酸緩衝液１ｍｌを加えて中和し
た。更にＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。得られた
透析液を用いて、２８０ｎｍの吸収を測定し、抗体濃度
を決定した。
【００７８】該精製抗体濃度は、ＡＮＯＣ５７１が０．
４２ｍｇ／ｍｌであり、ＡＮＯＣ５７２が０．６０ｍｇ
／ｍｌであり、ＡＮＯＣ５７３が１．３９ｍｇ／ｍｌで
あり、ＡＮＯＣ５７４が０．６０ｍｇ／ｍｌであった。
４２ｍｇ／ｍｌであり、ＡＮＯＣ５７２が０．６０ｍｇ
／ｍｌであり、ＡＮＯＣ５７３が１．３９ｍｇ／ｍｌで
あり、ＡＮＯＣ５７４が０．６０ｍｇ／ｍｌであった。
【００７９】
【実施例２】本発明モノクローナル抗体の性状 以下、上記で得られた本発明抗体の特性を示す。 抗体のサブクラス ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ抗原をＰＢＳで希
釈して１０μｌ／ｍｌとし、イムノプレートに１００μ
ｌ／ウェルずつ分注し、４℃で２時間静置してコーティ
ングを行なった。次に、抗原溶液を除去した後、０．１
％ＢＳＡ及びＰＢＳを４００μｌ／ウェルずつ加え、室
温で１時間静置した後、０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳを除
去し、上清を１００μｌ／ウェルずつ加えた。室温で一
晩インキュベート後、０．０５％ツイーン−２０及びＰ
ＢＳでウェルを３回洗浄した。
釈して１０μｌ／ｍｌとし、イムノプレートに１００μ
ｌ／ウェルずつ分注し、４℃で２時間静置してコーティ
ングを行なった。次に、抗原溶液を除去した後、０．１
％ＢＳＡ及びＰＢＳを４００μｌ／ウェルずつ加え、室
温で１時間静置した後、０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳを除
去し、上清を１００μｌ／ウェルずつ加えた。室温で一
晩インキュベート後、０．０５％ツイーン−２０及びＰ
ＢＳでウェルを３回洗浄した。
【００８０】次に、抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、Ｉ
ｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭポリクローナル抗体（ウ
サギ）（以上いずれもバイオネティクス社製）を０．１
％ＢＳＡ及びＰＢＳで１０００倍に希釈し、１００μｌ
／ウェルずつ添加した。室温で、２時間インキュベート
後、０．０５％ツイーン−２０及びＰＢＳで３回洗浄し
た。
ｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭポリクローナル抗体（ウ
サギ）（以上いずれもバイオネティクス社製）を０．１
％ＢＳＡ及びＰＢＳで１０００倍に希釈し、１００μｌ
／ウェルずつ添加した。室温で、２時間インキュベート
後、０．０５％ツイーン−２０及びＰＢＳで３回洗浄し
た。
【００８１】次にＨＲＰ標識ウサギＩｇＧ抗体（バイオ
・ラッド社製：カタログＮｏ．１７０−６５１５）を
０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳで５０００倍に希釈して１０
０μｌ／ウェルずつ加え、室温で２時間インキュベート
後、０．０５％ツイーン−２０及びＰＢＳで５回洗浄し
た。最後に、１００μｌ／ウェルの基質溶液を加え、約
５〜１０分間発色反応させ、充分に発色させた後、２Ｎ
硫酸溶液を１００μｌ／ウェルずつ加えて反応を停止さ
せた。
・ラッド社製：カタログＮｏ．１７０−６５１５）を
０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳで５０００倍に希釈して１０
０μｌ／ウェルずつ加え、室温で２時間インキュベート
後、０．０５％ツイーン−２０及びＰＢＳで５回洗浄し
た。最後に、１００μｌ／ウェルの基質溶液を加え、約
５〜１０分間発色反応させ、充分に発色させた後、２Ｎ
硫酸溶液を１００μｌ／ウェルずつ加えて反応を停止さ
せた。
【００８２】上記発色反応の結果、本発明ＣＨＯ［−３
２−５２２］Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体のサブタイ
プは表１に示す通りであった。
２−５２２］Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体のサブタイ
プは表１に示す通りであった。
【００８３】
【表１】
【００８４】抗体産生レベル 実施例１−で得られた培養上清を遠心分離し、得られ
る上清を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に
て、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１０日間インビトロで
培養した。ハイブリドーマが最大細胞密度となった時の
培養上清中のＫＯＣＯ５７１のＩｇＧ１量は約１０μｇ
／ｍｌであり、ＫＯＣＯ５７２のＩｇＧ１量は約１１μ
ｇ／ｍｌであり、ＫＯＣＯ５７３のＩｇＧ１量は約１５
μｇ／ｍｌであり、またＫＯＣＯ５７４のＩｇＧ１量は
約９μｇ／ｍｌであった。
る上清を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に
て、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１０日間インビトロで
培養した。ハイブリドーマが最大細胞密度となった時の
培養上清中のＫＯＣＯ５７１のＩｇＧ１量は約１０μｇ
／ｍｌであり、ＫＯＣＯ５７２のＩｇＧ１量は約１１μ
ｇ／ｍｌであり、ＫＯＣＯ５７３のＩｇＧ１量は約１５
μｇ／ｍｌであり、またＫＯＣＯ５７４のＩｇＧ１量は
約９μｇ／ｍｌであった。
【００８５】抗体の力価 参考例１で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
Ｆをヨードゲン法にて１２５Ｉを標識して、この標識体
１０ｋｃｐｍの内、５０％と結合できる抗体の濃度を抗
体価として求めた。得られた各抗体の抗体価を下記表２
に示す。
Ｆをヨードゲン法にて１２５Ｉを標識して、この標識体
１０ｋｃｐｍの内、５０％と結合できる抗体の濃度を抗
体価として求めた。得られた各抗体の抗体価を下記表２
に示す。
【００８６】
【表２】
【００８７】上記より、各抗体の力価はＡＮＯＣ５７３
＞ＡＮＯＣ５７２＞ＡＮＯＣ５７４＞ＡＮＯＣ５７１の
順であることが判る。
＞ＡＮＯＣ５７２＞ＡＮＯＣ５７４＞ＡＮＯＣ５７１の
順であることが判る。
【００８８】中和活性 マウスの骨髄細胞を使用したコロニーアッセイ法で中和
活性を求めた。
活性を求めた。
【００８９】その結果、ＡＮＯＣ５７３の中和活性は、
該ＡＮＯＣ５７３の１ｍｌ当りでＣＨＯ［−３２−５２
２］Ｍ−ＣＳＦを１．８０×１０５単位中和できるもの
であった。また、ＡＮＯＣ５７２では５．６８×１０４
単位中和できるものであった。更に、ＡＮＯＣ５７４と
ＡＮＯＣ５７１は検出限界以下であった。尚、上記注を
活性は、Ｍ−ＣＳＦ５００単位を５０％中和する活性を
中和２５０単位として求めたものである。
該ＡＮＯＣ５７３の１ｍｌ当りでＣＨＯ［−３２−５２
２］Ｍ−ＣＳＦを１．８０×１０５単位中和できるもの
であった。また、ＡＮＯＣ５７２では５．６８×１０４
単位中和できるものであった。更に、ＡＮＯＣ５７４と
ＡＮＯＣ５７１は検出限界以下であった。尚、上記注を
活性は、Ｍ−ＣＳＦ５００単位を５０％中和する活性を
中和２５０単位として求めたものである。
【００９０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法に従い、各精製抗体１０μｌと等量のレム
リのサンプルバッファー（２Ｍｅ＋）とを混合し、９５
℃で１０分間加熱処理し、ミニスラブゲル（１５％アク
リルアミド）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
尚、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用したＳＤＳは和光社製
であり、分子量マーカーとしては、ホスホリラーゼＢ
（分子量９４０００）、アルブミン（分子量６７００
０）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量３０００
０）、トリプシンインヒビター（分子量２０１００）及
びα−ラクトアルブミン（分子量１４４００）［いずれ
もファルマシア社製］を用いた。
リのサンプルバッファー（２Ｍｅ＋）とを混合し、９５
℃で１０分間加熱処理し、ミニスラブゲル（１５％アク
リルアミド）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。
尚、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用したＳＤＳは和光社製
であり、分子量マーカーとしては、ホスホリラーゼＢ
（分子量９４０００）、アルブミン（分子量６７００
０）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量３０００
０）、トリプシンインヒビター（分子量２０１００）及
びα−ラクトアルブミン（分子量１４４００）［いずれ
もファルマシア社製］を用いた。
【００９１】その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる重鎖と
軽鎖の分子量の和から、本発明抗体の分子量は、ＡＮＯ
Ｃ５７１が１６０ｋｄであり、ＡＮＯＣ５７２が１５５
ｋｄであり、ＡＮＯＣ５７３が１５８ｋｄであり、また
ＡＮＯＣ５７４が１５０ｋｄであると確認された。
軽鎖の分子量の和から、本発明抗体の分子量は、ＡＮＯ
Ｃ５７１が１６０ｋｄであり、ＡＮＯＣ５７２が１５５
ｋｄであり、ＡＮＯＣ５７３が１５８ｋｄであり、また
ＡＮＯＣ５７４が１５０ｋｄであると確認された。
【００９２】ウエスタンブロッティング また、ウエスタンブロッティングをトービンらの方法
［Ｈａｒｒｙ Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７６．４３５０（１９７９）］に従って、ＬＢＫ社製セ
ミドライブロッターを用いて行なった。即ち、参考例１
で得たＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ免疫抗原を
レムリの方法に従いレムリのサンプルバッファー［２Ｍ
Ｅ−及び２ＭＥ＋］のそれぞれ等量と混合し、９５℃で
１０分間加熱処理し、ミニスラブゲル（１５％ポリアク
リルアミド）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。上
記電気泳動後、ニトロセルロース膜に膜蛋白を転写し、
洗浄液［０．５％ツイーン−２０、ＰＢＳ（ｐＨ７．
２）］にて洗浄後、１％スキムミルク及びＰＢＳで室温
で一晩処理した。再び洗浄後、実施例１で得た本発明の
各抗ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦモノクローナ
ル抗体液１０μｇ／ｍｌと室温で２時間反応させた。Ｐ
ＢＳで３回洗浄した後、１０００倍に希釈したパーオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（バイオ・ラッド
社製）液に浸し、室温で２時間静置反応させた。前記洗
浄液で３回洗浄後、発色基質である４−クロロ−１−ナ
フトール液にニトロセルロース膜を浸して発色させた。
バンドが現れた時点で、蒸留水で洗浄して反応を停止さ
せた。
［Ｈａｒｒｙ Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７６．４３５０（１９７９）］に従って、ＬＢＫ社製セ
ミドライブロッターを用いて行なった。即ち、参考例１
で得たＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ免疫抗原を
レムリの方法に従いレムリのサンプルバッファー［２Ｍ
Ｅ−及び２ＭＥ＋］のそれぞれ等量と混合し、９５℃で
１０分間加熱処理し、ミニスラブゲル（１５％ポリアク
リルアミド）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。上
記電気泳動後、ニトロセルロース膜に膜蛋白を転写し、
洗浄液［０．５％ツイーン−２０、ＰＢＳ（ｐＨ７．
２）］にて洗浄後、１％スキムミルク及びＰＢＳで室温
で一晩処理した。再び洗浄後、実施例１で得た本発明の
各抗ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦモノクローナ
ル抗体液１０μｇ／ｍｌと室温で２時間反応させた。Ｐ
ＢＳで３回洗浄した後、１０００倍に希釈したパーオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（バイオ・ラッド
社製）液に浸し、室温で２時間静置反応させた。前記洗
浄液で３回洗浄後、発色基質である４−クロロ−１−ナ
フトール液にニトロセルロース膜を浸して発色させた。
バンドが現れた時点で、蒸留水で洗浄して反応を停止さ
せた。
【００９３】尚、上記においてプレステイン分子量マー
カーとしては、ホスホリラーゼＢ（分子量１０６００
０）、ウシ血清アルブミン（分子量８００００）、オボ
アルブミン（分子量４９５００）、カルボニックアンヒ
ドラーゼ（分子量３２５００）、ダイズトリプシンイン
ヒビター（分子量２７５００）及びリゾチーム（分子量
１８５００）［いずれもバイオ・ラッド社製］を用い
た。
カーとしては、ホスホリラーゼＢ（分子量１０６００
０）、ウシ血清アルブミン（分子量８００００）、オボ
アルブミン（分子量４９５００）、カルボニックアンヒ
ドラーゼ（分子量３２５００）、ダイズトリプシンイン
ヒビター（分子量２７５００）及びリゾチーム（分子量
１８５００）［いずれもバイオ・ラッド社製］を用い
た。
【００９４】上記ウエスタンブロッティングの結果を第
１図に示す。
１図に示す。
【００９５】該図より、ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−
ＣＳＦは、２ＭＥ（−）においてのみ分子量約８５ｋｄ
のバンドとして認められることが判る。
ＣＳＦは、２ＭＥ（−）においてのみ分子量約８５ｋｄ
のバンドとして認められることが判る。
【００９６】
【実施例３】抗ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦポ
リクローナル抗体の製造 参考例１で得たＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ
精製品１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解させ、これにフロイ
ンドの完全アジュバント液を等量加えて懸濁液を作成し
た。この懸濁液を数羽の家兎（Ｎｅｗ−Ｚｅａｌａｎｄ
Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔ、体重２．５〜３．０ｋ
ｇ）に、ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを免疫抗
原として１回量４０μｇ／ウサギとなる量で、１ケ月毎
に皮下投与して免疫した。最初の免疫を合わせて合計７
回免疫し、最終免疫の１週間後に各ウサギより全採血し
て抗血清を得た。得られた抗血清より、石川らの方法
［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９（１９８
３）］に従って、硫安分画及びジエチルアミノエチル−
セルロースカラム分画を行なってＩｇＧを採取し、これ
を精製品ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにて精製して、所望
のウサギ抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を得た。
リクローナル抗体の製造 参考例１で得たＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ
精製品１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解させ、これにフロイ
ンドの完全アジュバント液を等量加えて懸濁液を作成し
た。この懸濁液を数羽の家兎（Ｎｅｗ−Ｚｅａｌａｎｄ
Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔ、体重２．５〜３．０ｋ
ｇ）に、ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを免疫抗
原として１回量４０μｇ／ウサギとなる量で、１ケ月毎
に皮下投与して免疫した。最初の免疫を合わせて合計７
回免疫し、最終免疫の１週間後に各ウサギより全採血し
て抗血清を得た。得られた抗血清より、石川らの方法
［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９（１９８
３）］に従って、硫安分画及びジエチルアミノエチル−
セルロースカラム分画を行なってＩｇＧを採取し、これ
を精製品ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにて精製して、所望
のウサギ抗ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を得た。
【００９７】得られた抗体（３種）を「ＯＣＴ５１
１」、「ＯＣＴ５１２」及び「ＯＣＴ５１３」と命名す
る。之等は−８０℃で保存された。之等の内、ＯＣＴ５
１１については、前述したＰＣＴ特許国際公開ＷＯ９１
−０６５６７号公報に詳述されている。
１」、「ＯＣＴ５１２」及び「ＯＣＴ５１３」と命名す
る。之等は−８０℃で保存された。之等の内、ＯＣＴ５
１１については、前述したＰＣＴ特許国際公開ＷＯ９１
−０６５６７号公報に詳述されている。
【００９８】以下、上記で得られた抗体の性質を示す。
【００９９】抗体力価 ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを、ヨードゲン法
にて１２５Ｉで標識して、この１２５Ｉ標識ＣＨＯ［−
３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの１０ｋｃｐｍの内、５０％
と結合できる抗体の希釈倍率を抗体価として求めた。各
抗体の抗体力価を下記表３に示す。
にて１２５Ｉで標識して、この１２５Ｉ標識ＣＨＯ［−
３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの１０ｋｃｐｍの内、５０％
と結合できる抗体の希釈倍率を抗体価として求めた。各
抗体の抗体力価を下記表３に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】中和活性 マウスの骨髄細胞を使用したコロニーアッセイ法で中和
活性を求めた所、ＯＣＴ５１１の中和活性は、ＯＣＴ５
１１の１ｍｌ当りでＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
Ｆを１〜２×１０６単位中和できるものであり、ＯＣＴ
５１２では同１〜２×１０６単位を中和でき、またＯＣ
Ｔ５１３では同１〜２×１０６単位を中和できるもので
あった。
活性を求めた所、ＯＣＴ５１１の中和活性は、ＯＣＴ５
１１の１ｍｌ当りでＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳ
Ｆを１〜２×１０６単位中和できるものであり、ＯＣＴ
５１２では同１〜２×１０６単位を中和でき、またＯＣ
Ｔ５１３では同１〜２×１０６単位を中和できるもので
あった。
【０１０２】交差反応性 ＯＣＴ５１１、ＯＣＴ５１２及びＯＣＴ５１３は、いず
れもマウスＣＳＦ（Ｌ−Ｃｅｌｌの培養上清）及びヒト
ＧＭ−ＣＳＦ（アマシャム社）と全く交差せず、更にヒ
トＩＬ−１α（特開昭６３−１６４８９９号公報参
照）、ＩＬ−１β（特開昭６３−１５２３９８号公報参
照）、ＩＬ−２（アマシャム社）、ＴＮＦ−α（アマシ
ャム社）にもそれぞれ全く交差しなかった。
れもマウスＣＳＦ（Ｌ−Ｃｅｌｌの培養上清）及びヒト
ＧＭ−ＣＳＦ（アマシャム社）と全く交差せず、更にヒ
トＩＬ−１α（特開昭６３−１６４８９９号公報参
照）、ＩＬ−１β（特開昭６３−１５２３９８号公報参
照）、ＩＬ−２（アマシャム社）、ＴＮＦ−α（アマシ
ャム社）にもそれぞれ全く交差しなかった。
【０１０３】
【実施例４】本発明モノクローナル抗体の製造 抗Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを抗原とす
るモノクローナル抗体の製造 参考例２で製造したＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−Ｃ
ＳＦを免疫抗原として用いて、実施例１と同様にして所
望抗体を製造した。即ち、精製Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦにより感作したリンパ球細胞を作成し、
これをマウス骨髄腫細胞と融合させて得られたハイブリ
ドーマを培養し、Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳ
Ｆを免疫抗原とするＥＬＩＳＡ法により試験し、陽性と
なったウェルから限界希釈法によりクローニングを行な
った。３回のクローニングの後、所望の反応特異性を有
する本発明モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ４株を得た。之等はそれぞれ「ＭＭＣ−１」〜「ＭＭ
Ｃ−４」と命名された。
るモノクローナル抗体の製造 参考例２で製造したＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−Ｃ
ＳＦを免疫抗原として用いて、実施例１と同様にして所
望抗体を製造した。即ち、精製Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦにより感作したリンパ球細胞を作成し、
これをマウス骨髄腫細胞と融合させて得られたハイブリ
ドーマを培養し、Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳ
Ｆを免疫抗原とするＥＬＩＳＡ法により試験し、陽性と
なったウェルから限界希釈法によりクローニングを行な
った。３回のクローニングの後、所望の反応特異性を有
する本発明モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ４株を得た。之等はそれぞれ「ＭＭＣ−１」〜「ＭＭ
Ｃ−４」と命名された。
【０１０４】上記各クローンを培養後、遠心分離して目
的モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。得られた
クローンの内１株（本発明モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ）を選択した。
的モノクローナル抗体を含む培養上清を得た。得られた
クローンの内１株（本発明モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ）を選択した。
【０１０５】上記モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マＭＭＣ−１は、通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（微工研）に「ＭＭＣ−１」なる表示で寄託され
ており、その寄託番号は微工研菌寄第１２５３７号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２５３７）である。
マＭＭＣ−１は、通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（微工研）に「ＭＭＣ−１」なる表示で寄託され
ており、その寄託番号は微工研菌寄第１２５３７号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２５３７）である。
【０１０６】腹水の作製 上記で得た各ハイブリドーマを用いて、実施例１−
と同様の方法により腹水を作成した。
と同様の方法により腹水を作成した。
【０１０７】抗体の精製 上記で得た腹水からの所望抗体の精製を、抗体精製キ
ット（Ｂｉｏ−ＲａｄＭＡＰＳ−ＩＩ Ｋｉｔ、バイオ
・ラッド社製）を用いて、実施例１−同様にして実施
した。得られた精製抗体（各起源ハイブリドーマに対応
して之等抗体のそれぞれを「ＭＭＣ−１」〜「ＭＭＣ−
４」と呼ぶ）を含有する各透析液を用いて、２８０ｎｍ
の吸収を測定し、各抗体濃度を決定した。
ット（Ｂｉｏ−ＲａｄＭＡＰＳ−ＩＩ Ｋｉｔ、バイオ
・ラッド社製）を用いて、実施例１−同様にして実施
した。得られた精製抗体（各起源ハイブリドーマに対応
して之等抗体のそれぞれを「ＭＭＣ−１」〜「ＭＭＣ−
４」と呼ぶ）を含有する各透析液を用いて、２８０ｎｍ
の吸収を測定し、各抗体濃度を決定した。
【０１０８】その結果、ＭＭＣ−１は０．７４ｍｇ／ｍ
ｌであり、ＭＭＣ−２は１．００ｍｇ／ｍｌであり、Ｍ
ＭＣ−３は０．７２ｍｇ／ｍｌであり、ＭＭＣ−４は
１．３２ｍｇ／ｍｌであった。
ｌであり、ＭＭＣ−２は１．００ｍｇ／ｍｌであり、Ｍ
ＭＣ−３は０．７２ｍｇ／ｍｌであり、ＭＭＣ−４は
１．３２ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
【実施例５】モノクローナル抗体の性状 以下、上記実施例４で得られた本発明抗体の特性を、免
疫抗原として参考例２で得た精製品Ｅ．ｃｏｌｉ［３−
１５３］Ｍ−ＣＳＦを用いて実施例２と同様にして求め
た。
疫抗原として参考例２で得た精製品Ｅ．ｃｏｌｉ［３−
１５３］Ｍ−ＣＳＦを用いて実施例２と同様にして求め
た。
【０１１０】抗体のサブクラス 各抗体のサブクラスは下記表４に示す通りである。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】抗体産生レベル ハイブリドーマが最大細胞密度となった時の培養上清中
のＭＭＣ−１のＩｇＧ１量は約１２μｇ／ｍｌであり、
ＭＭＣ−２のＩｇＧ１量は約１０μｇ／ｍｌであり、Ｍ
ＭＣ−３のＩｇＧ２ｂ量は約８μｇ／ｍｌであり、また
ＭＭＣ−４のＩｇＧ１量は約９μｇ／ｍｌであった。
のＭＭＣ−１のＩｇＧ１量は約１２μｇ／ｍｌであり、
ＭＭＣ−２のＩｇＧ１量は約１０μｇ／ｍｌであり、Ｍ
ＭＣ−３のＩｇＧ２ｂ量は約８μｇ／ｍｌであり、また
ＭＭＣ−４のＩｇＧ１量は約９μｇ／ｍｌであった。
【０１１３】抗体の力価 参考例２で得たＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ
を用いて各抗体の段階希釈液を作成し、之等各抗体溶液
と固相化したＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦプ
レートとを反応させて、実施例２−の方法に従って各
抗体の力価を求めた。その結果を下記表５に示す。
を用いて各抗体の段階希釈液を作成し、之等各抗体溶液
と固相化したＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦプ
レートとを反応させて、実施例２−の方法に従って各
抗体の力価を求めた。その結果を下記表５に示す。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 実施例２−と同様にして求めた。その結果、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる重鎖と軽鎖の分子量の和から、本発明抗
体の分子量は、ＭＭＣ−１が１５２ｋｄであり、ＭＭＣ
−２が１６１ｋｄであり、ＭＭＣ−３が１５９ｋｄであ
り、またＭＭＣ−４が１５５ｋｄであると確認された。
ＰＡＧＥによる重鎖と軽鎖の分子量の和から、本発明抗
体の分子量は、ＭＭＣ−１が１５２ｋｄであり、ＭＭＣ
−２が１６１ｋｄであり、ＭＭＣ−３が１５９ｋｄであ
り、またＭＭＣ−４が１５５ｋｄであると確認された。
【０１１６】ウエスタンブロッティング 実施例２−と同様にして、参考例２で得られた精製
Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを免疫抗原とし
て可溶化後、ポリアクリルアミドゲルに付し、電気泳動
にかけてウエスタンブロッティングを行なった。その結
果、Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦは分子量約
３２ｋｄのバンドとして検出された。
Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを免疫抗原とし
て可溶化後、ポリアクリルアミドゲルに付し、電気泳動
にかけてウエスタンブロッティングを行なった。その結
果、Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦは分子量約
３２ｋｄのバンドとして検出された。
【０１１７】
【実施例６】抗Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ
ポリクローナル抗体の製造 参考例２で得たＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−Ｃ
ＳＦ精製品１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解させて免疫抗原
として用いて、実施例３と同様にして、所望のウサギ抗
ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を得た。
ポリクローナル抗体の製造 参考例２で得たＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−Ｃ
ＳＦ精製品１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解させて免疫抗原
として用いて、実施例３と同様にして、所望のウサギ抗
ヒトＭ−ＣＳＦポリクローナル抗体を得た。
【０１１８】得られた抗体（３種）を「ＯＣＴ５２
１」、「ＯＣＴ５２３」及び「ＯＣＴ５２４」と命名す
る。之等は−８０℃で保存された。
１」、「ＯＣＴ５２３」及び「ＯＣＴ５２４」と命名す
る。之等は−８０℃で保存された。
【０１１９】以下、各抗体の性質を実施例３と同様にし
て求めた結果を示す。 抗体力価 Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを、ヨードゲン
法にて１２５Ｉで標識し、この１２５Ｉ標識Ｅ．ｃｏｌ
ｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦの１０ｋｃｐｍの内、５０
％と結合できる抗体の希釈倍率を抗体力価として求めた
結果を表６に示す。
て求めた結果を示す。 抗体力価 Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを、ヨードゲン
法にて１２５Ｉで標識し、この１２５Ｉ標識Ｅ．ｃｏｌ
ｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦの１０ｋｃｐｍの内、５０
％と結合できる抗体の希釈倍率を抗体力価として求めた
結果を表６に示す。
【０１２０】
【表６】
【０１２１】中和活性 マウスの骨髄細胞を使用したコロニーアッセイ法で中和
活性を求めた所、ＯＣＴ５２１は、１〜２×１０６単位
で、ＯＣＴ５２３では同１〜２×１０６単位で、またＯ
ＣＴ５２４では同１〜２×１０６単位で、それぞれＥ．
ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを中和できた。
活性を求めた所、ＯＣＴ５２１は、１〜２×１０６単位
で、ＯＣＴ５２３では同１〜２×１０６単位で、またＯ
ＣＴ５２４では同１〜２×１０６単位で、それぞれＥ．
ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを中和できた。
【０１２２】交差反応性 ＯＣＴ５２１、ＯＣＴ５２３及びＯＣＴ５２４は、いず
れもマウスＣＳＦ（Ｌ−Ｃｅｌｌの培養上清）及びヒト
ＧＭ−ＣＳＦ（アマシャム社）と全く交差せず、更にヒ
トＩＬ−１α（特開昭６３−１６４８９９号公報参
照）、ＩＬ−１β（特開昭６３−１５２３９８号公報参
照）、ＩＬ−２（アマシャム社）及びＴＮＦ−α（アマ
シャム社）にもそれぞれ全く交差しなかった。
れもマウスＣＳＦ（Ｌ−Ｃｅｌｌの培養上清）及びヒト
ＧＭ−ＣＳＦ（アマシャム社）と全く交差せず、更にヒ
トＩＬ−１α（特開昭６３−１６４８９９号公報参
照）、ＩＬ−１β（特開昭６３−１５２３９８号公報参
照）、ＩＬ−２（アマシャム社）及びＴＮＦ−α（アマ
シャム社）にもそれぞれ全く交差しなかった。
【０１２３】
【実施例７】ウエスタンブロッティングによる各抗体の
反応性 前記各例で得られたポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ及びＥ．
ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦの反応性を、ウエス
タンブロッティングにより検討した。その結果を表７に
示す。
反応性 前記各例で得られたポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ及びＥ．
ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦの反応性を、ウエス
タンブロッティングにより検討した。その結果を表７に
示す。
【０１２４】
【表７】
【０１２５】該表は縦に各ポリクローナル抗体及びモノ
クローナル抗体を、横に抗原として用いたＣＨＯ［−３
２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ及びＥ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦをとり、それぞれの反応性を示したもの
であり、２ＭＥ＋は還元状態での反応を、２ＭＥ−は非
還元状態での反応を示す。また表において、−は反応せ
ずを、（＋）は僅かに反応するを、＋は反応するを、ま
た＋＋は強く反応するをそれぞれ示す。
クローナル抗体を、横に抗原として用いたＣＨＯ［−３
２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ及びＥ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦをとり、それぞれの反応性を示したもの
であり、２ＭＥ＋は還元状態での反応を、２ＭＥ−は非
還元状態での反応を示す。また表において、−は反応せ
ずを、（＋）は僅かに反応するを、＋は反応するを、ま
た＋＋は強く反応するをそれぞれ示す。
【０１２６】該表より、ポリクローナル抗体の場合、Ｃ
ＨＯ由来のＭ−ＣＳＦで作成したポリクローナル抗体Ｏ
ＣＴ５１１〜ＯＣＴ５１３は、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦ
と強く反応するが、大腸菌由来のＥ．ｃｏｌｉ［３−１
５３］Ｍ−ＣＳＦとはあまり反応せず、逆に大腸菌由来
のＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦで作成したポ
リクローナル抗体ＯＣＴ５２１〜ＯＣＴ５２４は大腸菌
由来のＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦとは強く
反応するが、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦとはあまり反応し
ないことが判る。また、之等のポリクローナル抗体は還
元状態及び非還元状態のいずれの場合も反応性の違いは
認められないことが判る。
ＨＯ由来のＭ−ＣＳＦで作成したポリクローナル抗体Ｏ
ＣＴ５１１〜ＯＣＴ５１３は、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦ
と強く反応するが、大腸菌由来のＥ．ｃｏｌｉ［３−１
５３］Ｍ−ＣＳＦとはあまり反応せず、逆に大腸菌由来
のＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦで作成したポ
リクローナル抗体ＯＣＴ５２１〜ＯＣＴ５２４は大腸菌
由来のＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦとは強く
反応するが、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦとはあまり反応し
ないことが判る。また、之等のポリクローナル抗体は還
元状態及び非還元状態のいずれの場合も反応性の違いは
認められないことが判る。
【０１２７】モノクローナル抗体の場合、大腸菌由来の
Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦで作成したモノ
クローナル抗体ＭＭＣ−１〜ＭＭＣ−４は大腸菌由来の
Ｍ−ＣＳＦとは強く反応するが、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳ
Ｆとはあまり反応せず、また還元状態下でＭ−ＣＳＦに
は反応せず、非還元状態下で二量体のＭ−ＣＳＦのみに
反応することが判る。更に、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦで
作成したモノクローナル抗体ＡＮＯＣ５１１〜ＡＮＯＣ
５１４は、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦ及び大腸菌由来のＭ
−ＣＳＦの両者と反応し、二量体のＭ−ＣＳＦにのみ反
応することが判る。
Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦで作成したモノ
クローナル抗体ＭＭＣ−１〜ＭＭＣ−４は大腸菌由来の
Ｍ−ＣＳＦとは強く反応するが、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳ
Ｆとはあまり反応せず、また還元状態下でＭ−ＣＳＦに
は反応せず、非還元状態下で二量体のＭ−ＣＳＦのみに
反応することが判る。更に、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦで
作成したモノクローナル抗体ＡＮＯＣ５１１〜ＡＮＯＣ
５１４は、ＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦ及び大腸菌由来のＭ
−ＣＳＦの両者と反応し、二量体のＭ−ＣＳＦにのみ反
応することが判る。
【０１２８】免疫抗原として糖鎖をもつＣＨＯ由来のＭ
−ＣＳＦを使用して作成したＡＮＯＣ５７１〜ＡＮＯＣ
５７４は、大腸菌由来のＭ−ＣＳＦ（３−１５３）と結
合することから、蛋白部分を認識することが判った。更
にＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦはアミノ酸の配列として２０
０以上であると考えられるが、上記各抗体は大腸菌由来
のＭ−ＣＳＦと反応することから、之等各抗体の認識部
位は３−１５３であることが判る。
−ＣＳＦを使用して作成したＡＮＯＣ５７１〜ＡＮＯＣ
５７４は、大腸菌由来のＭ−ＣＳＦ（３−１５３）と結
合することから、蛋白部分を認識することが判った。更
にＣＨＯ由来のＭ−ＣＳＦはアミノ酸の配列として２０
０以上であると考えられるが、上記各抗体は大腸菌由来
のＭ−ＣＳＦと反応することから、之等各抗体の認識部
位は３−１５３であることが判る。
【０１２９】
【実施例８】モノクローナル抗体間の結合関係 モノクローナル抗体同士でＭ−ＣＳＦ分子上で立体障害
がなくサンドイッチできる関係を調べる目的で本試験を
行なった。モノクローナル抗体の結合部位が判れば、立
体的にＭ−ＣＳＦを考察できるデーターが得られ、また
Ｍ−ＣＳＦの測定系を作成する上で役立つと考えられ
る。以下に、その試験方法と結果を示す。
がなくサンドイッチできる関係を調べる目的で本試験を
行なった。モノクローナル抗体の結合部位が判れば、立
体的にＭ−ＣＳＦを考察できるデーターが得られ、また
Ｍ−ＣＳＦの測定系を作成する上で役立つと考えられ
る。以下に、その試験方法と結果を示す。
【０１３０】９６ウェルプレートに各モノクローナル抗
体を１００μｌ／ウェル加え、４℃で１時間以上放置し
た後、測定用緩衝液［０．１％ＢＳＡ、５００ｍｇチメ
ロザールをダルベッコＰＢＳに添加した緩衝液］にて洗
浄後、室温で１時間放置して固相化した各モノクローナ
ル抗体（ＭＭＣ−１、ＭＭＣ−２、ＡＮＯＣ５７１〜Ａ
ＮＯＣ５７４）とビオチン標識したモノクローナル抗体
［ＭＭＣ−１、ＭＭＣ−２及びＡＮＯＣ５７１〜ＡＮＯ
Ｃ５７４の各抗体を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
５）にて透析して濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、この各抗体
液１ｍｌと５０ｍｇ／ｍｌのスルホーＮＨＳ−ビオチン
（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＤＭＳＯに溶
解）６μｌとを混合し、室温で４時間放置し、４℃でＰ
ＢＳに対して一晩透析し、４℃に保存したもの］をまず
作成した後、モノクローナル抗体を固相化した９６ウェ
ルプレート上で１００ｎｇ／ｍｌの参考例１で得られた
精製標品Ｍ−ＣＳＦと室温で一夜以上放置し、充分に反
応させた。洗浄液で３回洗浄後、ビオチン標識したモノ
クローナル抗体各１００μｌを室温で２時間反応させた
後、洗浄液で洗浄し、次いでＨＲＰ標識アビジン溶液
［０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳ］を各ウェルに１００μｌ
ずつ加え、室温で２時間反応させ、反応液を除去し、各
ウェルを洗浄液で洗浄後、ＯＰＤ緩衝液を各１００μｌ
ずつ加え、室温で１０分間前後反応させた後、２Ｎ硫酸
を各ウェルに１００μｌずつ加えて反応を停止させた。
ＨＲＰ活性をＯＤ４９２ｎｍでＯＰＤの発色を測定し
て、各抗体同士の結合関係を調べた。
体を１００μｌ／ウェル加え、４℃で１時間以上放置し
た後、測定用緩衝液［０．１％ＢＳＡ、５００ｍｇチメ
ロザールをダルベッコＰＢＳに添加した緩衝液］にて洗
浄後、室温で１時間放置して固相化した各モノクローナ
ル抗体（ＭＭＣ−１、ＭＭＣ−２、ＡＮＯＣ５７１〜Ａ
ＮＯＣ５７４）とビオチン標識したモノクローナル抗体
［ＭＭＣ−１、ＭＭＣ−２及びＡＮＯＣ５７１〜ＡＮＯ
Ｃ５７４の各抗体を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
５）にて透析して濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、この各抗体
液１ｍｌと５０ｍｇ／ｍｌのスルホーＮＨＳ−ビオチン
（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＤＭＳＯに溶
解）６μｌとを混合し、室温で４時間放置し、４℃でＰ
ＢＳに対して一晩透析し、４℃に保存したもの］をまず
作成した後、モノクローナル抗体を固相化した９６ウェ
ルプレート上で１００ｎｇ／ｍｌの参考例１で得られた
精製標品Ｍ−ＣＳＦと室温で一夜以上放置し、充分に反
応させた。洗浄液で３回洗浄後、ビオチン標識したモノ
クローナル抗体各１００μｌを室温で２時間反応させた
後、洗浄液で洗浄し、次いでＨＲＰ標識アビジン溶液
［０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳ］を各ウェルに１００μｌ
ずつ加え、室温で２時間反応させ、反応液を除去し、各
ウェルを洗浄液で洗浄後、ＯＰＤ緩衝液を各１００μｌ
ずつ加え、室温で１０分間前後反応させた後、２Ｎ硫酸
を各ウェルに１００μｌずつ加えて反応を停止させた。
ＨＲＰ活性をＯＤ４９２ｎｍでＯＰＤの発色を測定し
て、各抗体同士の結合関係を調べた。
【０１３１】上記結果を表８に示す。
【表８】
【０１３２】該表において、−は結合せずを、＋は結合
するを、＋＋は強く結合するを、それぞれ示す。
するを、＋＋は強く結合するを、それぞれ示す。
【０１３３】該表より、最も発色の強い組合わせは、Ａ
ＮＯＣ５７１−ＡＮＯＣ５７４であることが明らかであ
り、またＡＮＯＣ５７２、ＡＮＯＣ５７３は同種の抗体
でサンドイッチが形成された。
ＮＯＣ５７１−ＡＮＯＣ５７４であることが明らかであ
り、またＡＮＯＣ５７２、ＡＮＯＣ５７３は同種の抗体
でサンドイッチが形成された。
【０１３４】
【実施例９】Ｍ−ＣＳＦの測定方法 大腸菌由来のＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ
のＥＬＩＳＡ法 実施例４で得たＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ
モノクローナル抗体を第１抗体として固相化し、これに
参考例２で得られた精製標品Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦを測定用緩衝液で１１段階希釈した溶液
を反応させ、更に実施例６−で得たウサギ抗ヒトＭ−
ＣＳＦポリクローナル抗体を第２抗体として反応させた
後、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を反応させ、基質とし
てｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いた本発明の
３ステップ固相サンドイッチ法にて以下の通り、本試験
を行なった。
のＥＬＩＳＡ法 実施例４で得たＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ
モノクローナル抗体を第１抗体として固相化し、これに
参考例２で得られた精製標品Ｅ．ｃｏｌｉ［３−１５
３］Ｍ−ＣＳＦを測定用緩衝液で１１段階希釈した溶液
を反応させ、更に実施例６−で得たウサギ抗ヒトＭ−
ＣＳＦポリクローナル抗体を第２抗体として反応させた
後、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体を反応させ、基質とし
てｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いた本発明の
３ステップ固相サンドイッチ法にて以下の通り、本試験
を行なった。
【０１３５】即ち、実施例４で得られた各抗Ｅ．ｃｏｌ
ｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体（ＭＭ
Ｃ−１〜ＭＭＣ−４）を、４℃下に９６ウェルプレート
に測定用緩衝液［２ｇのＢＳＡと５００ｍｇのチメロザ
ールを２１のＰＢＳ（シグマ社製）に溶解したもの、ｐ
Ｈ７．２］２００ｍｌで希釈して、１００μｌずつ加
え、１時間放置してコーティングを行なった。次に、室
温にて上記測定用緩衝液をプレートに３５０μｌずつ加
えて１時間ブロッキングを行なった。測定用緩衝液を除
去した後、再度測定用緩衝液１００μｌずつを加え、１
１段階希釈した参考例２で得た精製標品Ｅ．ｃｏｌｉ
［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを所定のウェルに１００μｌ
ずつ加えた。室温で１２時間以上（通常一晩）反応させ
た後、反応溶液を除き、各ウェルに洗浄液（生理食塩
水）３５０μｌずつを加えて洗浄した。この操作を３回
繰返した。
ｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体（ＭＭ
Ｃ−１〜ＭＭＣ−４）を、４℃下に９６ウェルプレート
に測定用緩衝液［２ｇのＢＳＡと５００ｍｇのチメロザ
ールを２１のＰＢＳ（シグマ社製）に溶解したもの、ｐ
Ｈ７．２］２００ｍｌで希釈して、１００μｌずつ加
え、１時間放置してコーティングを行なった。次に、室
温にて上記測定用緩衝液をプレートに３５０μｌずつ加
えて１時間ブロッキングを行なった。測定用緩衝液を除
去した後、再度測定用緩衝液１００μｌずつを加え、１
１段階希釈した参考例２で得た精製標品Ｅ．ｃｏｌｉ
［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦを所定のウェルに１００μｌ
ずつ加えた。室温で１２時間以上（通常一晩）反応させ
た後、反応溶液を除き、各ウェルに洗浄液（生理食塩
水）３５０μｌずつを加えて洗浄した。この操作を３回
繰返した。
【０１３６】次に実施例６−で得られたウサギ抗ヒト
Ｍ−ＣＳＦポリクローナル抗体（ＯＣＴ５２３）を０．
１％ＢＳＡ及びＰＢＳで２０００倍に希釈した抗体溶液
を、所定の各ウェルに１００μｌずつ分注し、室温で２
時間反応させた後、反応溶液を除去し、各ウェルに洗浄
液を３５０μｌずつ加えて洗浄した。この操作を３回繰
返した後、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体溶液（バイオ・
ラッド社製、カタログＮｏ．１７０−６５１５）を所定
のウェルに１００μｌずつ加え、室温で２時間反応させ
た後、反応液を除き、各ウェルに洗浄液を３５０μｌず
つ加えて洗浄した。この操作を３回繰返した。
Ｍ−ＣＳＦポリクローナル抗体（ＯＣＴ５２３）を０．
１％ＢＳＡ及びＰＢＳで２０００倍に希釈した抗体溶液
を、所定の各ウェルに１００μｌずつ分注し、室温で２
時間反応させた後、反応溶液を除去し、各ウェルに洗浄
液を３５０μｌずつ加えて洗浄した。この操作を３回繰
返した後、ＨＲＰ標識抗家兎ＩｇＧ抗体溶液（バイオ・
ラッド社製、カタログＮｏ．１７０−６５１５）を所定
のウェルに１００μｌずつ加え、室温で２時間反応させ
た後、反応液を除き、各ウェルに洗浄液を３５０μｌず
つ加えて洗浄した。この操作を３回繰返した。
【０１３７】その後、ＯＰＤ緩衝液［ＯＰＤ（シグマ社
製、製造Ｎｏ．Ｐ−８２８７）１個をＯＰＤ緩衝用タブ
レット（シグマ社製、製造Ｎｏ．Ｐ−４９２２を１００
ｍｌの純水に溶解したもの）１０ｍｌに溶解したもの］
１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間反応させ
た後、２Ｎ硫酸溶液を各ウェルに１００μｌずつ加えて
反応を停止させた。次に反応を終了した各ウェルをＯＤ
４９２ｎｍで測定して、Ｍ−ＣＳＦ標準曲線を作成し
た。
製、製造Ｎｏ．Ｐ−８２８７）１個をＯＰＤ緩衝用タブ
レット（シグマ社製、製造Ｎｏ．Ｐ−４９２２を１００
ｍｌの純水に溶解したもの）１０ｍｌに溶解したもの］
１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間反応させ
た後、２Ｎ硫酸溶液を各ウェルに１００μｌずつ加えて
反応を停止させた。次に反応を終了した各ウェルをＯＤ
４９２ｎｍで測定して、Ｍ−ＣＳＦ標準曲線を作成し
た。
【０１３８】上記で作成された標準曲線を第２図に示
す。
す。
【０１３９】図において縦軸は４９２ｎｍでのＯＤ（吸
光度）を、横軸はＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳ
Ｆの濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。
光度）を、横軸はＥ．ｃｏｌｉ［３−１５３］Ｍ−ＣＳ
Ｆの濃度（ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ示す。
【０１４０】ＣＨＯ由来ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ
−ＣＳＦのＥＬＩＳＡ法 上記実施例９−と同様にして、ＣＨ０由来ＣＨＯ［−
３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの標準曲線を作成した。
−ＣＳＦのＥＬＩＳＡ法 上記実施例９−と同様にして、ＣＨ０由来ＣＨＯ［−
３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの標準曲線を作成した。
【０１４１】その結果、得られた測定系の内、抗体が第
１抗体としてＡＮＯＣ５７３モノクローナル抗体を、第
２抗体としてＯＣＴ５１１ポリクローナル抗体を用いた
サンドイッチの系が、最も測定感度が良好であった。こ
のＡＮＯＣ５７３とＯＣＴ５１１の組合わせによるＭ−
ＣＳＦの標準曲線を第３図［横軸：４９２ｎｍでのＯ
Ｄ、縦軸：ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ濃度
（ｐｇ／ｍｌ）］に示す。
１抗体としてＡＮＯＣ５７３モノクローナル抗体を、第
２抗体としてＯＣＴ５１１ポリクローナル抗体を用いた
サンドイッチの系が、最も測定感度が良好であった。こ
のＡＮＯＣ５７３とＯＣＴ５１１の組合わせによるＭ−
ＣＳＦの標準曲線を第３図［横軸：４９２ｎｍでのＯ
Ｄ、縦軸：ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦ濃度
（ｐｇ／ｍｌ）］に示す。
【０１４２】該図より、本発明のヒトＭ−ＣＳＦ測定系
の感度は約２０ｐｇ／ｍｌであることが判る。
の感度は約２０ｐｇ／ｍｌであることが判る。
【図１】実施例２に従う本発明抗体のウエスタンブロッ
ティング分析結果を示す。
ティング分析結果を示す。
【図２】実施例９に従う大腸菌由来のＭ−ＣＳＦを利用
したＭ−ＣＳＦの標準曲線を示す。
したＭ−ＣＳＦの標準曲線を示す。
【図３】実施例９に従うＣＨＯ細胞由来のＭ−ＣＳＦを
利用したＭ−ＣＳＦの標準曲線を示す。
利用したＭ−ＣＳＦの標準曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｍ 8413−4Ｃ Ｕ 8413−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山西 一也 徳島県徳島市大原町東千代ケ丸19−139 (72)発明者 高橋 真行 徳島県鳴門市大津町木津野字仲ノ越79−７
Claims (13)
- 【請求項１】ヒトマクロファージコロニー刺激因子に特
異的に反応することを特徴とするヒトＭ−ＣＳＦモノク
ローナル抗体。 - 【請求項２】ヒトマクロファージコロニー刺激因子の蛋
白部位をエピトープとして認識する請求項１に記載のヒ
トＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項３】還元剤存在下でヒトマクロファージコロニ
ー刺激因子に反応性を有しない請求項１に記載のヒトＭ
−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項４】ヒトマクロファージコロニー刺激因子のア
ミノ酸配列の少なくとも１位Ｖａｌから１５１位Ｔｈｒ
までのアミノ酸配列を認識部位にもつ請求項１に記載の
ヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項５】組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞由
来のヒトマクロファージコロニー刺激因子を免疫抗原と
して免疫された哺乳動物の脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細
胞との融合により得られるハイブリドーマの産生する請
求項１に記載のヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項６】組換え大腸菌由来のヒトマクロファージコ
ロニー刺激因子を免疫抗原として免疫された哺乳動物の
脾細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により得られる
ハイブリドーマの産生する請求項１に記載のヒトＭ−Ｃ
ＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項７】免疫抗原がプラスミドｐｔｒｐＩＬ−２Ｘ
−Ｍ−ＣＳＦ１０１で形質転換された組換え大腸菌由来
のヒトマクロファージコロニー刺激因子である請求項６
に記載のヒトＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項８】ハイブリドーマがＫＯＣＯ５７１（微工研
菌寄第１２５２２号）である請求項６に記載のヒトＭ−
ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項９】ハイブリドーマがＫＯＣＯ５７２（微工研
菌寄第１２５２３号）である請求項６に記載のヒトＭ−
ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項１０】ハイブリドーマがＫＯＣＯ５７３（微工
研菌寄第１２５２４号）である請求項６に記載のヒトＭ
−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】ハイブリドーマがＫＯＣＯ５７４（微工
研菌寄第１２５２５号）である請求項６に記載のヒトＭ
−ＣＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項１２】ハイブリドーマがＭＭＣ−１（微工研菌
寄第１２５３７号）である請求項６に記載のヒトＭ−Ｃ
ＳＦモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】請求項１に記載のヒトＭ−ＣＳＦモノク
ローナル抗体を固相化した第１抗体と検体とを反応さ
せ、次いで反応物に他のヒトＭ−ＣＳＦ抗体を反応さ
せ、得られる反応複合体と酵素標識抗体とを反応させる
３ステップサンドスイッチ法により検体中のヒトＭ−Ｃ
ＳＦを測定することを特徴とするマクロファージコロニ
ー刺激因子の免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3324972A JPH0595794A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3324972A JPH0595794A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595794A true JPH0595794A (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=18171687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3324972A Pending JPH0595794A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0595794A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005030124A3 (en) * | 2003-09-10 | 2006-03-30 | Warner Lambert Co | Antibodies to m-csf |
| JP2006249083A (ja) * | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Pharmacia & Upjohn Co Llc | 抗ｍ−ｃｓｆ抗体組成物 |
| JP2008500806A (ja) * | 2004-01-07 | 2008-01-17 | カイロン コーポレイション | Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用 |
-
1991
- 1991-10-04 JP JP3324972A patent/JPH0595794A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005030124A3 (en) * | 2003-09-10 | 2006-03-30 | Warner Lambert Co | Antibodies to m-csf |
| US7326414B2 (en) | 2003-09-10 | 2008-02-05 | Warner-Lambert Company Llc | Antibodies to M-CSF |
| EA011669B1 (ru) * | 2003-09-10 | 2009-04-28 | Уорнер-Ламберт Компани Ллс | Антитела против m-csf |
| AU2004275700B2 (en) * | 2003-09-10 | 2009-09-24 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
| CN102807617A (zh) * | 2003-09-10 | 2012-12-05 | 沃尼尔·朗伯有限责任公司 | M-csf的抗体 |
| US9718883B2 (en) | 2003-09-10 | 2017-08-01 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
| US10280219B2 (en) | 2003-09-10 | 2019-05-07 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
| JP2008500806A (ja) * | 2004-01-07 | 2008-01-17 | カイロン コーポレイション | Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用 |
| US9079956B2 (en) | 2004-01-07 | 2015-07-14 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | M-CSF specific monoclonal antibody and uses thereof |
| US9522186B2 (en) | 2004-01-07 | 2016-12-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | M-CSF specific monoclonal antibody and uses therof |
| JP2006249083A (ja) * | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Pharmacia & Upjohn Co Llc | 抗ｍ−ｃｓｆ抗体組成物 |
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