JPH0636754B2 - 肺表面活性物質に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造法 - Google Patents
肺表面活性物質に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造法Info
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- JPH0636754B2 JPH0636754B2 JP11673685A JP11673685A JPH0636754B2 JP H0636754 B2 JPH0636754 B2 JP H0636754B2 JP 11673685 A JP11673685 A JP 11673685A JP 11673685 A JP11673685 A JP 11673685A JP H0636754 B2 JPH0636754 B2 JP H0636754B2
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Description
【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 本発明は、ヒトの肺表面活性物質を構成している分子量
約６２，０００および約３４，０００〜３７，０００の
アポ蛋白に対するＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗
体、及びそれの製造法に関する。かかるモノクローナル
抗体は、肺表面活性物質の動態を知る指標として、臨床
及び病理診断の試薬として用いることができる。
約６２，０００および約３４，０００〜３７，０００の
アポ蛋白に対するＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗
体、及びそれの製造法に関する。かかるモノクローナル
抗体は、肺表面活性物質の動態を知る指標として、臨床
及び病理診断の試薬として用いることができる。
(ロ)従来の技術 動物の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主
成分とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁
を覆い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸
機能を維持する上に重要な生理的機能を有している。即
ち、肺表面活性物質は、呼気時、吸気時における肺胞内
面の表面張力を変化させるといった特異な表面活性を有
しており、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作
用を示すと云われている。かかる肺表面活性物質が不足
すると肺胞は虚脱し、安定した換気能力を維持できなく
なり、例えば、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）のご
とき症状が現われる。肺表面活性物質の約90％はリン脂
質や中性脂質等の脂質であるが、約10％は蛋白であり、
これらは脂質と蛋白の複合体、即ちリポ蛋白として存在
している。肺表面活性物質から脂質を除去すると水不溶
性の蛋白が得られ、これをアポ蛋白と呼んでいるが、分
子量約３６，０００(36K)の蛋白が主成分である。肺表
面活性物質のアポ蛋白の構造，機能，代謝についてはこ
れまで詳細に検討され、ポリクロナール抗体による免疫
学的定量、免疫組織学的検討も行われてきた。しかし、
今日、アポ蛋白が肺表面活性物質の動態を知る指標とし
て、臨床および病理診断に広く用いられるに至っていな
い。
成分とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁
を覆い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸
機能を維持する上に重要な生理的機能を有している。即
ち、肺表面活性物質は、呼気時、吸気時における肺胞内
面の表面張力を変化させるといった特異な表面活性を有
しており、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作
用を示すと云われている。かかる肺表面活性物質が不足
すると肺胞は虚脱し、安定した換気能力を維持できなく
なり、例えば、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）のご
とき症状が現われる。肺表面活性物質の約90％はリン脂
質や中性脂質等の脂質であるが、約10％は蛋白であり、
これらは脂質と蛋白の複合体、即ちリポ蛋白として存在
している。肺表面活性物質から脂質を除去すると水不溶
性の蛋白が得られ、これをアポ蛋白と呼んでいるが、分
子量約３６，０００(36K)の蛋白が主成分である。肺表
面活性物質のアポ蛋白の構造，機能，代謝についてはこ
れまで詳細に検討され、ポリクロナール抗体による免疫
学的定量、免疫組織学的検討も行われてきた。しかし、
今日、アポ蛋白が肺表面活性物質の動態を知る指標とし
て、臨床および病理診断に広く用いられるに至っていな
い。
(ハ)発明が解決しようとする問題点 肺表面活性物質のマーカーとして、羊水中のＬ／Ｓ比
（レシチンとスフィンゴミエリンの比）、羊水および気
管支肺洗浄液中のジパルミトイルホスファチジルコリン
量が測定されているが、これらリン脂質に比べ、蛋白は
特異性に優れまた高感度に検出し得るので、肺表面活性
物質のマーカーとして蛋白を用いることが期待されてい
る。
（レシチンとスフィンゴミエリンの比）、羊水および気
管支肺洗浄液中のジパルミトイルホスファチジルコリン
量が測定されているが、これらリン脂質に比べ、蛋白は
特異性に優れまた高感度に検出し得るので、肺表面活性
物質のマーカーとして蛋白を用いることが期待されてい
る。
このためには、アポ蛋白に対するモノクローナル抗体を
得る必要があるが、現在までその様なモノクローナル抗
体は得られていない。
得る必要があるが、現在までその様なモノクローナル抗
体は得られていない。
(ニ)問題点を解決するための手段 本発明者らは、肺表面活性物質が大量蓄積する肺胞蛋白
症患者の気管支肺洗浄液から、肺表面活性物質のアポ蛋
白を分離精製し、その分子量６２，０００および約３
４，０００〜３７，０００のアポ蛋白に特異的なモノク
ローナル抗体を作製し、これを用いて免疫学的定量試薬
および免疫組織学的診断試薬としての検討を行った。そ
の結果、本発明に係るモノクローナル抗体は、肺表面活
性物質の動態を知るマーカーとして極めて有用であるこ
とが明らかとなった。
症患者の気管支肺洗浄液から、肺表面活性物質のアポ蛋
白を分離精製し、その分子量６２，０００および約３
４，０００〜３７，０００のアポ蛋白に特異的なモノク
ローナル抗体を作製し、これを用いて免疫学的定量試薬
および免疫組織学的診断試薬としての検討を行った。そ
の結果、本発明に係るモノクローナル抗体は、肺表面活
性物質の動態を知るマーカーとして極めて有用であるこ
とが明らかとなった。
即ち、本発明は、ヒトの肺表面活性物質の分子量約６
２，０００および約３４，０００〜３７，０００のアポ
蛋白を認識するＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗体で
ある。
２，０００および約３４，０００〜３７，０００のアポ
蛋白を認識するＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗体で
ある。
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒトの肺
表面活性物質の分子量約６２，０００および約３４，０
００〜３７，０００のアポ蛋白で免疫されたマウスの抗
体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させることによ
って、該アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得、次いで、該ハイブリドーマ及
び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からヒ
トの肺表面活性物質の分子量約６２，０００および約３
４，０００〜３７，０００のアポ蛋白を認識するモノク
ローナル抗体を採取することによって得られる。
表面活性物質の分子量約６２，０００および約３４，０
００〜３７，０００のアポ蛋白で免疫されたマウスの抗
体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させることによ
って、該アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得、次いで、該ハイブリドーマ及
び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からヒ
トの肺表面活性物質の分子量約６２，０００および約３
４，０００〜３７，０００のアポ蛋白を認識するモノク
ローナル抗体を採取することによって得られる。
本発明における肺表面活性物質は、ヒトの肺及び／又は
気管支の洗浄液から、好ましくは肺胞蛋白症患者の気管
支肺洗浄液から分離・採取される。肺表面活性物質は、
約90％の脂質と約10％の蛋白との複合体（リポ蛋白）で
あり、これから公知の方法、例えばFrosolonoの方法
（J.Lipid Res.11,439-457(1970)参照）によって肺表面
活性物質を得、次いで脂質を除去すると、本発明におけ
るアポ蛋白から得られる。アポ蛋白は分子量約６２，０
００と約３６，０００の蛋白が主成分であるが、分子量
約３６，０００の蛋白は、ソジウムドデシルサルフェー
ト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）では幅広いバンドとして分離し、この中には分子量
約３７，０００と約３４，０００の蛋白も含んでいると
考えられる。従って、本発明におけるアポ蛋白とは、こ
れらの糖蛋白又はそれらのフラグメントを意味するもの
である。なお、蛋白の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
測定した。
気管支の洗浄液から、好ましくは肺胞蛋白症患者の気管
支肺洗浄液から分離・採取される。肺表面活性物質は、
約90％の脂質と約10％の蛋白との複合体（リポ蛋白）で
あり、これから公知の方法、例えばFrosolonoの方法
（J.Lipid Res.11,439-457(1970)参照）によって肺表面
活性物質を得、次いで脂質を除去すると、本発明におけ
るアポ蛋白から得られる。アポ蛋白は分子量約６２，０
００と約３６，０００の蛋白が主成分であるが、分子量
約３６，０００の蛋白は、ソジウムドデシルサルフェー
ト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）では幅広いバンドとして分離し、この中には分子量
約３７，０００と約３４，０００の蛋白も含んでいると
考えられる。従って、本発明におけるアポ蛋白とは、こ
れらの糖蛋白又はそれらのフラグメントを意味するもの
である。なお、蛋白の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
測定した。
本発明のアポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマは、手法それ自体は公知である細胞
融合法によって製造することができる。まず、分子量約
６２，０００および約３４，０００〜３７，０００のヒ
ト肺表面活性物質のアポ蛋白でマウスを免疫し、次いで
マウスの脾臓やリンパ節等から抗体産生細胞（リンパ
球）を採取し、そして、この細胞をヒト又は動物のミエ
ローマ細胞と融合させる。ミエローマ細胞としてはマウ
スのミエローマ細胞を用いるのが便利であり、これらの
例としては、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ3-Ｘ63-Ａg8，Ｐ3
-Ｘ63−Ａg8−Ｕ１，Ｐ3-ＮＳ１／１−Ａg4-1，Ｐ3-Ｘ6
3−Ａg8-6.5.3，ＳＰ２／Ｏ−Ａg14，ＦＯ，ＭＰＣ11−
45.6ＴＧ1.7などがある。
するハイブリドーマは、手法それ自体は公知である細胞
融合法によって製造することができる。まず、分子量約
６２，０００および約３４，０００〜３７，０００のヒ
ト肺表面活性物質のアポ蛋白でマウスを免疫し、次いで
マウスの脾臓やリンパ節等から抗体産生細胞（リンパ
球）を採取し、そして、この細胞をヒト又は動物のミエ
ローマ細胞と融合させる。ミエローマ細胞としてはマウ
スのミエローマ細胞を用いるのが便利であり、これらの
例としては、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ3-Ｘ63-Ａg8，Ｐ3
-Ｘ63−Ａg8−Ｕ１，Ｐ3-ＮＳ１／１−Ａg4-1，Ｐ3-Ｘ6
3−Ａg8-6.5.3，ＳＰ２／Ｏ−Ａg14，ＦＯ，ＭＰＣ11−
45.6ＴＧ1.7などがある。
細胞融合の条件は、例えば次の通りである。抗体産生細
胞とミエローマ細胞を10：１〜１〜10，好ましくは１：
１〜１：３の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液、例
えば約35％ポリエチレングリコール（分子量1,000〜6,0
00程度）および約7.5％ジメチルスルホキシドを含むＲ
ＰＭＩ1640を加えて、室温〜37℃で１〜数分間撹拌し、
その後10％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ1640で徐々に希釈し、洗浄
の後ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５×105個／ｍと
なるように調整する。これを0.2ｍずつ、例えば96穴
プレートに分注し、５％ＣＯ２を含む空気中で35〜38℃
で２〜３週間培養する。ＨＡＴ培養液中ではハイブリド
ーマのみが存在し、８−アザグアニン耐性のミエローマ
細胞及びミエローマ同士の融合細胞は生存し得ない（未
融合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。次に、このハ
イブリドーマ集落から、ヒトの肺表面活性物質の分子量
約６２，０００および約３４，０００〜３７，０００の
ヒトのアポ蛋白に対し特異的なモノクローナル抗体を分
泌するものだけ選別する。この選別工程（スクリーニン
グ）は、それぞれのハイブリドーマより産生されたモノ
クローナル抗体が、目的とするアポ蛋白と抗原抗体反応
をするか否かを酵素抗体法で調べることによって行なう
事ができる。目的とするモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマは、次にクローニングによりクローン化
細胞にしなくてはならない。この工程は、具体的には限
界希釈法を用い行う事ができる。約２〜３週間後、96穴
のプレート中で生育したコロニーを拾い、再び酵素抗体
法でアポ蛋白に対する抗体活性を調べ選別したハイブリ
ドーマを培養して、所望のアポ蛋白に特異的なモノクロ
ーナル抗体を生成させる。
胞とミエローマ細胞を10：１〜１〜10，好ましくは１：
１〜１：３の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液、例
えば約35％ポリエチレングリコール（分子量1,000〜6,0
00程度）および約7.5％ジメチルスルホキシドを含むＲ
ＰＭＩ1640を加えて、室温〜37℃で１〜数分間撹拌し、
その後10％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ1640で徐々に希釈し、洗浄
の後ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５×105個／ｍと
なるように調整する。これを0.2ｍずつ、例えば96穴
プレートに分注し、５％ＣＯ２を含む空気中で35〜38℃
で２〜３週間培養する。ＨＡＴ培養液中ではハイブリド
ーマのみが存在し、８−アザグアニン耐性のミエローマ
細胞及びミエローマ同士の融合細胞は生存し得ない（未
融合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。次に、このハ
イブリドーマ集落から、ヒトの肺表面活性物質の分子量
約６２，０００および約３４，０００〜３７，０００の
ヒトのアポ蛋白に対し特異的なモノクローナル抗体を分
泌するものだけ選別する。この選別工程（スクリーニン
グ）は、それぞれのハイブリドーマより産生されたモノ
クローナル抗体が、目的とするアポ蛋白と抗原抗体反応
をするか否かを酵素抗体法で調べることによって行なう
事ができる。目的とするモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマは、次にクローニングによりクローン化
細胞にしなくてはならない。この工程は、具体的には限
界希釈法を用い行う事ができる。約２〜３週間後、96穴
のプレート中で生育したコロニーを拾い、再び酵素抗体
法でアポ蛋白に対する抗体活性を調べ選別したハイブリ
ドーマを培養して、所望のアポ蛋白に特異的なモノクロ
ーナル抗体を生成させる。
モノクローナル抗体を得るためのもう一つの方法は、抗
体産生細胞にエプスタイン・バー・ウイルス（Epstein-
Barr Virus,以下Ｅ−Ｂウイルスと略称する）を感染さ
せて形質転換細胞を作成し、該形質転換細胞及び／又は
それに由来する細胞株を培養し、培養物からヒトの肺表
面活性物質の分子量約６２，０００および約３４，００
０〜３７，０００のアポ蛋白に結合する性質を有するモ
ノクローナル抗体を採取する方法である。
体産生細胞にエプスタイン・バー・ウイルス（Epstein-
Barr Virus,以下Ｅ−Ｂウイルスと略称する）を感染さ
せて形質転換細胞を作成し、該形質転換細胞及び／又は
それに由来する細胞株を培養し、培養物からヒトの肺表
面活性物質の分子量約６２，０００および約３４，００
０〜３７，０００のアポ蛋白に結合する性質を有するモ
ノクローナル抗体を採取する方法である。
Ｅ−Ｂウイルスは、バーキットリンパ種や鼻咽頭ガンの
原因ウイルスとされている、ヘルペスウイルス群に属す
るウイルスである。抗体産生細胞をＥ−Ｂウイルスに感
染させ、約２〜３週間，５％ＣＯ２インキュベータで培
養し、多くの異質集落から成る形質転換細胞（トランス
フォームドセル）を形成させる。次に、この形質転換細
胞から、ヒトの肺表面活性物質の分子量約６２，０００
及び約３４，０００〜３７，０００のアポ蛋白に対し特
異的なモノクローナル抗体を分泌するものだけを、前記
と同様な方法で選別する。そして、前記と同様にして、
クローン化された形質転換細胞を得ることができる。
原因ウイルスとされている、ヘルペスウイルス群に属す
るウイルスである。抗体産生細胞をＥ−Ｂウイルスに感
染させ、約２〜３週間，５％ＣＯ２インキュベータで培
養し、多くの異質集落から成る形質転換細胞（トランス
フォームドセル）を形成させる。次に、この形質転換細
胞から、ヒトの肺表面活性物質の分子量約６２，０００
及び約３４，０００〜３７，０００のアポ蛋白に対し特
異的なモノクローナル抗体を分泌するものだけを、前記
と同様な方法で選別する。そして、前記と同様にして、
クローン化された形質転換細胞を得ることができる。
次に、本発明においては、選択したハイブリドーマ又は
形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナル
抗体を生成させる。クローニングによって選択された、
肺表面活性物質の分子量約６２，０００および約３４，
０００〜３７，０００のアポ蛋白を認識する抗体を産生
するハイブリドーマ又は形質転換は凍結して保存するこ
とができ、また、これを適当な方法で大量に培養するこ
ともできる。そして、培養上清から該アポ蛋白に特異的
に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。ま
た、かかる細胞を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や
血清から目的とする抗体を得ることもできる。本発明の
モノクローナル抗体の精製は、プロテインＡ等を用いる
アフィニティクロマトグラフィー等の方法によって行な
われる。
形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナル
抗体を生成させる。クローニングによって選択された、
肺表面活性物質の分子量約６２，０００および約３４，
０００〜３７，０００のアポ蛋白を認識する抗体を産生
するハイブリドーマ又は形質転換は凍結して保存するこ
とができ、また、これを適当な方法で大量に培養するこ
ともできる。そして、培養上清から該アポ蛋白に特異的
に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。ま
た、かかる細胞を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や
血清から目的とする抗体を得ることもできる。本発明の
モノクローナル抗体の精製は、プロテインＡ等を用いる
アフィニティクロマトグラフィー等の方法によって行な
われる。
(ホ)発明の効果 本発明のモノクローナル抗体は、ヒトの肺表面活性物質
の分子量約６２，０００および約３４，０００〜３７，
０００のアポ蛋白を認識するので、肺表面活性物質のマ
ーカーとして、ヒト肺洗浄液やヒト羊水中の肺表面活性
物質の免疫学的定量のために用いることができる。ま
た、ヒトの肺胞表面や肺胞II型細胞（肺表面活性物質の
産生細胞）の免疫組織学的検討のための試薬として使用
することができる。
の分子量約６２，０００および約３４，０００〜３７，
０００のアポ蛋白を認識するので、肺表面活性物質のマ
ーカーとして、ヒト肺洗浄液やヒト羊水中の肺表面活性
物質の免疫学的定量のために用いることができる。ま
た、ヒトの肺胞表面や肺胞II型細胞（肺表面活性物質の
産生細胞）の免疫組織学的検討のための試薬として使用
することができる。
(ヘ)以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例１ (1)肺胞蛋白症患者の肺及び気管支を、治療の目的で、
0.15Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、気管支肺洗浄液
（ＢＡＬＦ）を３得た。このＢＡＬＦを300×ｇで10
分間遠心分離し、細胞及び細胞破片を除去した。次い
で、得られた上清を48000×ｇで20分間遠心分離し、沈
渣画分を採取した。
0.15Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、気管支肺洗浄液
（ＢＡＬＦ）を３得た。このＢＡＬＦを300×ｇで10
分間遠心分離し、細胞及び細胞破片を除去した。次い
で、得られた上清を48000×ｇで20分間遠心分離し、沈
渣画分を採取した。
この沈渣画分を、145mMの塩化ナトリウム，１mMのエチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む10mMのトリス緩
衝液(pH7.4)80ｍに懸濁し、0.25Ｍと0.65Ｍの不連続
ショ糖密度勾配による遠心分離を、40000×ｇで60分間
行なった。0.25Ｍと0.65Ｍのショ糖溶液のＩＢ画分を採
取し、上記緩衝液400ｍに再懸濁した。そして、この
懸濁液を、48000×ｇで30分間遠心分離し、沈澱物（肺
表面活性物質）を得た。
レンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む10mMのトリス緩
衝液(pH7.4)80ｍに懸濁し、0.25Ｍと0.65Ｍの不連続
ショ糖密度勾配による遠心分離を、40000×ｇで60分間
行なった。0.25Ｍと0.65Ｍのショ糖溶液のＩＢ画分を採
取し、上記緩衝液400ｍに再懸濁した。そして、この
懸濁液を、48000×ｇで30分間遠心分離し、沈澱物（肺
表面活性物質）を得た。
アルブミン等の不純物を除くためにこの沈澱物を、１％
のトリトンＸ−100（ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテル），３mMのＥＤＴＡ，１mMのフェニルメチ
ルスルホニルフロリド，0.5mMのジチオスレイトールを
含む５mMのトリス緩衝液（pH7.8，以後トリトン緩衝液
という）27ｍに静かに分散させた。この分散液を1500
00×ｇで60分間遠心分離し、沈澱物（精製肺表面活性物
質）を得た。
のトリトンＸ−100（ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテル），３mMのＥＤＴＡ，１mMのフェニルメチ
ルスルホニルフロリド，0.5mMのジチオスレイトールを
含む５mMのトリス緩衝液（pH7.8，以後トリトン緩衝液
という）27ｍに静かに分散させた。この分散液を1500
00×ｇで60分間遠心分離し、沈澱物（精製肺表面活性物
質）を得た。
この沈澱物を、上記トリトン緩衝液４ｍに再分散し、
この再分散液に４ｍのブタノール−エタノール混合液
（容量比６：１）を添加し、激しく振とうして、０℃で
10分間放置し脂質を抽出除去した後、2000r.p.m.で15分
間遠心分離し、沈澱物（アポ蛋白）を得た。この操作を
もう３回繰り返し、最終的なアポ蛋白の沈澱を得た。
この再分散液に４ｍのブタノール−エタノール混合液
（容量比６：１）を添加し、激しく振とうして、０℃で
10分間放置し脂質を抽出除去した後、2000r.p.m.で15分
間遠心分離し、沈澱物（アポ蛋白）を得た。この操作を
もう３回繰り返し、最終的なアポ蛋白の沈澱を得た。
この沈澱物をトリトン緩衝液20ｍに懸濁し、同じトリ
トン緩衝液に対してセロハン膜を用いて透析し（ブタノ
ール−エタノールの除去）、透析内液を得た。この透析
内液を、150000×ｇで60分間遠心分離し上清を得た。沈
澱物には再びトリトン緩衝液20ｍを添加し可溶化した
後、150000×ｇで60分間遠心分離し上清を得た。この操
作をもう６回行ない上清を集めた。得られた上清は合算
して150ｍであった。この上清を、トリトン緩衝液で
平衡化したブルーセファロース４Ｂカラム（直径1.8cm
×3.5cm）に注加し、同緩衝液を用いて溶出し、素通り
画分を採取することによって混在するアルブミンを完全
に除去した。
トン緩衝液に対してセロハン膜を用いて透析し（ブタノ
ール−エタノールの除去）、透析内液を得た。この透析
内液を、150000×ｇで60分間遠心分離し上清を得た。沈
澱物には再びトリトン緩衝液20ｍを添加し可溶化した
後、150000×ｇで60分間遠心分離し上清を得た。この操
作をもう６回行ない上清を集めた。得られた上清は合算
して150ｍであった。この上清を、トリトン緩衝液で
平衡化したブルーセファロース４Ｂカラム（直径1.8cm
×3.5cm）に注加し、同緩衝液を用いて溶出し、素通り
画分を採取することによって混在するアルブミンを完全
に除去した。
この画分を、トリトン緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−ト
ーヨーパールカラム（直径1.4cm×19cm）に注加し、ま
ず、同緩衝液200ｍを用いて流速15ｍ／hr.で溶出
し、次に、同緩衝液に含まれる塩化ナトリウムの濃度を
０から0.5Ｍまで直線的に連続的に上げながら溶出し、
塩化ナトリウム濃度が0.30Ｍと0.35Ｍの間の画分を得
た。この画分に含まれる蛋白の分子量は約６２０００と
約３６０００であった。
ーヨーパールカラム（直径1.4cm×19cm）に注加し、ま
ず、同緩衝液200ｍを用いて流速15ｍ／hr.で溶出
し、次に、同緩衝液に含まれる塩化ナトリウムの濃度を
０から0.5Ｍまで直線的に連続的に上げながら溶出し、
塩化ナトリウム濃度が0.30Ｍと0.35Ｍの間の画分を得
た。この画分に含まれる蛋白の分子量は約６２０００と
約３６０００であった。
(2)前記の塩化ナトリウム濃度が0.30Ｍと0.35Ｍの間で
溶出された画分に含まれるＬＳアポ蛋白を、以下の実験
に用いた。
溶出された画分に含まれるＬＳアポ蛋白を、以下の実験
に用いた。
ＬＳアポ蛋白をフロイント完全アジュバントに乳化し、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与した。そして、30日後
にマウスに追加免疫を行った。一方、15％の牛胎児血清
を添加したＲＰＭＩ 1640（ギブコ社製）で、ミエロー
マ細胞Ｐ３−Ｘ63−Ａg8−Ｕ１を維持培養しておいた。
追加免疫３日後，マウスから得た脾臓細胞とＰ3-Ｘ63−
Ａg8−Ｕ１を、Ｏｉ等の方法（Selective methods ince
llular immunology 1980,p351-372,参照）によりポリエ
チレングリコール4000を用い細胞融合させ、96穴マイク
ロプレートにまいた。細胞融合後、培地を100μＭヒポ
キサンテン，0.4μＭアミノプテリン，16μＭチミジン
を添加したＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）に置き換えた。
ＨＡＴ培地で培養中２〜３週間で、脾臓細胞とミエロー
マ細胞のハイブリドーマのみが生育した。ハイブリドー
マの培養液中の抗体活性を、以下に述べるＥＬＩＳＡ法
で調べた。
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与した。そして、30日後
にマウスに追加免疫を行った。一方、15％の牛胎児血清
を添加したＲＰＭＩ 1640（ギブコ社製）で、ミエロー
マ細胞Ｐ３−Ｘ63−Ａg8−Ｕ１を維持培養しておいた。
追加免疫３日後，マウスから得た脾臓細胞とＰ3-Ｘ63−
Ａg8−Ｕ１を、Ｏｉ等の方法（Selective methods ince
llular immunology 1980,p351-372,参照）によりポリエ
チレングリコール4000を用い細胞融合させ、96穴マイク
ロプレートにまいた。細胞融合後、培地を100μＭヒポ
キサンテン，0.4μＭアミノプテリン，16μＭチミジン
を添加したＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）に置き換えた。
ＨＡＴ培地で培養中２〜３週間で、脾臓細胞とミエロー
マ細胞のハイブリドーマのみが生育した。ハイブリドー
マの培養液中の抗体活性を、以下に述べるＥＬＩＳＡ法
で調べた。
［抗体のスクリーニング］ ＬＳアポ蛋白をＥＬＩＳＡ用のプレートに付着させ、10
mMリン酸生理食塩液(pH7.4)に３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ
を添加した液で、ブロッキングを行った。ブロッキング
後、ハイブリドーマ培養液50μをＥＬＩＳＡプレート
に添加し、室温で２時間又は４℃で一夜培養した。その
後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧイムノグロブリン
（２μｇ／ｍ）50μの２次抗体を添加、室温で１時
間反応させ。これに、50μの西洋ワサビパーオキシダ
ーゼアビジンＤ溶液（１μｇ／ｍ）を加え、ＬＳアポ
蛋白に結合した抗体を、100μの基質溶液（0.1％Ｏ−
フェニレンジアミン，0.015％Ｈ２Ｏ２，0.1Ｍクエン酸
緩衝液，pH4.6）を加える事により検出した。
mMリン酸生理食塩液(pH7.4)に３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ
を添加した液で、ブロッキングを行った。ブロッキング
後、ハイブリドーマ培養液50μをＥＬＩＳＡプレート
に添加し、室温で２時間又は４℃で一夜培養した。その
後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧイムノグロブリン
（２μｇ／ｍ）50μの２次抗体を添加、室温で１時
間反応させ。これに、50μの西洋ワサビパーオキシダ
ーゼアビジンＤ溶液（１μｇ／ｍ）を加え、ＬＳアポ
蛋白に結合した抗体を、100μの基質溶液（0.1％Ｏ−
フェニレンジアミン，0.015％Ｈ２Ｏ２，0.1Ｍクエン酸
緩衝液，pH4.6）を加える事により検出した。
(3)ＬＳアポ蛋白に対する抗体を産生するハイブリドー
マを選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行な
い、最終的に単一クローンのハイブリドーマ２種が得ら
れた。このハイブリドーマを、それぞれ、プリスタン投
与ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔で増殖させ、モノクローナ
ル抗体を含む腹水を得た。得られた腹水に50％飽和硫安
を加え抗体を沈澱させ、この沈澱物を0.1Ｍリン酸生理
食塩液(pH8.0)に溶解させた。そして透析後、プロテイ
ンＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社
製）にかけ、抗体を0.2Ｍグリシン−塩酸バッファー(pH
3.0)で溶出して精製した。
マを選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行な
い、最終的に単一クローンのハイブリドーマ２種が得ら
れた。このハイブリドーマを、それぞれ、プリスタン投
与ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔で増殖させ、モノクローナ
ル抗体を含む腹水を得た。得られた腹水に50％飽和硫安
を加え抗体を沈澱させ、この沈澱物を0.1Ｍリン酸生理
食塩液(pH8.0)に溶解させた。そして透析後、プロテイ
ンＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社
製）にかけ、抗体を0.2Ｍグリシン−塩酸バッファー(pH
3.0)で溶出して精製した。
２種類のハイブリドーマから得たモノクローナル抗体
を、それぞれＰＣ６，ＰＥ10と命名した。
を、それぞれＰＣ６，ＰＥ10と命名した。
(4)モノクローナル抗体の性質 ウエスタン ブロッティング(Western blotting)法で、
ＰＣ６とＰＥ10は、肺胞蛋白症患者の気管支肺洗浄液の
ＩＢ画分から得られた36Ｋと62Ｋの両アポ蛋白を認識し
た。また、両抗体はヒト羊水と正常ヒト気管支肺洗浄液
中の、37Ｋと34Ｋ及び62Ｋアポ蛋白を認識した。36Ｋ蛋
白はＳＤＳ−ＰＡＧＥで幅広いバンドとして分離し、こ
の中に37Ｋと34Ｋ蛋白を含むので、36Ｋ蛋白と37Ｋ，34
Ｋ蛋白は同一の蛋白である。ＰＣ６とＰＥ10は、ドット
−免疫結合(dot-immunobinding)法による交叉反応の結
果から、近接する相互に異なったエピトープ（抗原部
位）を認識することが示された。これらの抗体は、ヒト
の肺表面活性物質のアポ蛋白に特異的であり、ラット，
ブタ，ウサギ等の動物の肺表面活性物質のアポ蛋白とは
反応せず、またヒトの血清蛋白とも反応しなかった。
ＰＣ６とＰＥ10は、肺胞蛋白症患者の気管支肺洗浄液の
ＩＢ画分から得られた36Ｋと62Ｋの両アポ蛋白を認識し
た。また、両抗体はヒト羊水と正常ヒト気管支肺洗浄液
中の、37Ｋと34Ｋ及び62Ｋアポ蛋白を認識した。36Ｋ蛋
白はＳＤＳ−ＰＡＧＥで幅広いバンドとして分離し、こ
の中に37Ｋと34Ｋ蛋白を含むので、36Ｋ蛋白と37Ｋ，34
Ｋ蛋白は同一の蛋白である。ＰＣ６とＰＥ10は、ドット
−免疫結合(dot-immunobinding)法による交叉反応の結
果から、近接する相互に異なったエピトープ（抗原部
位）を認識することが示された。これらの抗体は、ヒト
の肺表面活性物質のアポ蛋白に特異的であり、ラット，
ブタ，ウサギ等の動物の肺表面活性物質のアポ蛋白とは
反応せず、またヒトの血清蛋白とも反応しなかった。
［ウエスタン ブロッティング法］ モノクローナル抗体に特異的な抗原を、Towb-in等の方
法（Pro.Ｎ．Ａ．Ｓ．76 4350-4354）によるウエスタン
ブロッティング法を用いて同定した。最初に肺表面活
性物質のアポ蛋白を有する抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後電解液バッファーが25mMトリ
ス−塩酸，pH8.3，192mMグリシン，20％（ｖ／ｖ）メタ
ノールであり、電圧傾斜が７Ｖ／cm，２時間の条件でス
ラブ(slab)ゲルからニトロセルロースシートへ蛋白を移
した。ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し
た。片一方のシートを、アミドブラックで蛋白染色を行
い、他方は次の様な酵素免疫アッセイに処した。
法（Pro.Ｎ．Ａ．Ｓ．76 4350-4354）によるウエスタン
ブロッティング法を用いて同定した。最初に肺表面活
性物質のアポ蛋白を有する抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後電解液バッファーが25mMトリ
ス−塩酸，pH8.3，192mMグリシン，20％（ｖ／ｖ）メタ
ノールであり、電圧傾斜が７Ｖ／cm，２時間の条件でス
ラブ(slab)ゲルからニトロセルロースシートへ蛋白を移
した。ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し
た。片一方のシートを、アミドブラックで蛋白染色を行
い、他方は次の様な酵素免疫アッセイに処した。
３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、１次
抗体としてモノクローナル抗体（ＰＣ６又はＰＥ10）を
加えた。２次抗体としてビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ
イムノグロブリンを加えた。各シートは、0.05％（ｖ／
ｖ）トウィーン(Tween)20を含むＰＢＳで洗浄した。西
洋ワサビパーオキシダーゼアビジンＤでインキュベート
後、基質溶液（0.05％ジアミノベンジジン，0.03％Ｈ２
Ｏ２，0.01ＭＰＢＳ）を加えることにより検出し同定し
た。
抗体としてモノクローナル抗体（ＰＣ６又はＰＥ10）を
加えた。２次抗体としてビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ
イムノグロブリンを加えた。各シートは、0.05％（ｖ／
ｖ）トウィーン(Tween)20を含むＰＢＳで洗浄した。西
洋ワサビパーオキシダーゼアビジンＤでインキュベート
後、基質溶液（0.05％ジアミノベンジジン，0.03％Ｈ２
Ｏ２，0.01ＭＰＢＳ）を加えることにより検出し同定し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】ヒトの肺表面活性物質の分子量約６２，０
００および約３４，０００〜３７，０００のアポ蛋白を
認識する、ＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗体。 - 【請求項２】ヒトの肺表面活性物質の分子量約６２，０
００および約３４，０００〜３７，０００のアポ蛋白で
免疫されたマウスの抗体産生細胞と、ミエローマ細胞を
融合させることによって、該アポ蛋白を認識するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで、
該ハイブリドーマおよび／またはそれに由来する細胞株
を培養し、培養物からヒトの肺表面活性物質の分子量約
６２，０００および約３４，０００〜３７，０００のア
ポ蛋白を認識するＩｇＧ型のマウスモノクローナル抗体
を採取することを特徴とするヒトの肺表面活性物質の分
子量約６２，０００および３４，０００〜３７，０００
のアポ蛋白を認識する、ＩｇＧ型のマウスモノクローナ
ル抗体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11673685A JPH0636754B2 (ja) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | 肺表面活性物質に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11673685A JPH0636754B2 (ja) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | 肺表面活性物質に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61277699A JPS61277699A (ja) | 1986-12-08 |
| JPH0636754B2 true JPH0636754B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
ID=14694513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11673685A Expired - Lifetime JPH0636754B2 (ja) | 1985-05-31 | 1985-05-31 | 肺表面活性物質に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0636754B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR920001533B1 (ko) * | 1987-09-01 | 1992-02-18 | 데이진 가부시끼가이샤 | 인간 폐표면 활성물질의 측정방법 |
| JPH0715469B1 (ja) * | 1987-09-01 | 1995-02-22 | ||
| US5670328A (en) * | 1992-06-09 | 1997-09-23 | Yamasa Corporation | Monoclonal antibodies to human pulmonary surfactant apoprotein D and use thereof |
| CA2115171C (en) * | 1992-06-09 | 1998-05-05 | Takeshi Inoue | Monoclonal antibodies to human pulmonary surfactant apoprotein d and use thereof |
-
1985
- 1985-05-31 JP JP11673685A patent/JPH0636754B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）日本界面医学会雑誌，１６（２），３４−４２（１９８５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61277699A (ja) | 1986-12-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |