JPS61277699A - 肺表面活性物質に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）　産業上の利用分野 本発明は、ヒトの肺表面活性物質を構成しているアポ蛋
白に対するモノクローナル抗体、及びそれの製造法に関
する。かかるモノクローナル抗体は、肺表面活性物質の
動態を知る指標として、臨床及び病理診断の試薬として
用いることができる。

（０）従来の技術 動物の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主
成分とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁
を覆い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸
機能を維持する上に重要な生理的機能を有している。即
ち、肺表面活性物質は、呼気時、吸気時における肺胞内
面の表面張力を変化させるといった特異な表面活性を有
しており、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作
用を示すと云われている。かかる肺表面活性物質が不足
すると肺胞は虚脱し、安定した換気能力を維持できなく
なり、例えば、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）のご
とき症状が現われる。肺表面活性物質の約９０％はリン
脂質や中性脂質等の脂質であるが、約１０％は蛋白であ
り、これらは脂質と蛋白の複合体、即ちリポ蛋白として
存在している。

肺表面活性物質から脂質を除去すると水不溶性の蛋白が
得られ、これをアポ蛋白と−呼んでいるが、分子量約３
６，０００　（３６Ｋ　”）の蛋白が主成分であ°る。

肺表面活性物質のアポ蛋白の構造１機能９代謝について
はこれまで詳細に検討され、ポリクローナル抗体による
免疫学的定量、免疫組織学的検討も行われてきた。しか
し、今日、アポ蛋白が肺表面活性物質の動態を知る指標
として、臨床および病理診断に広く用いられるには至っ
ていない。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 肺表面活性物質のマーカーとして、羊水中のＬＺＳ比（
レシチンとスフィンゴミエリンの比）、羊水および気管
支肺洗浄液中のジパルミトイルホスファチジルコリン量
が測定されているが、これらリン脂質に比べ、蛋白は特
異性に優れまた高感度に検出し得るので、肺表面活性物
質のマーカーとして蛋白を用いることが期待されている
。

このためには、アポ蛋白に対するモノクローナル抗体を
得る必要があるが、現在までその様なモノクローナル抗
体は得られていない。

に）問題点を解決するための手段 本発明者らは、肺表面活性物質が大凶蓄積する肺胞蛋白
症患者の気管支肺洗浄液から、肺表面活性物質のアポ蛋
白を分離精製し、そのアポ蛋白に特異的なモノクローナ
ル抗体を作製し、これを用いて免疫学的定量試薬および
免疫組織学的診断試薬としての検討を行った。その結果
、本発明に係るモノクローナル抗体は、肺表面活性物質
の動態を知るマーカーとして極めて有用であることが明
らかとなった。

即ち、本発明は、ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白を認
識するモノクローナル抗体である。本発明のモノクロー
ナル抗体の中で反応性や安定性の点で特に好ましいのは
、分子量が約６２，０００及び／又は約３４，０００〜
３７，０００のアポ蛋白を認識する抗体であり、しかも
ＩｊＩＧ型のマウス抗体が好ましい。

本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは・ヒトの肺
表面活性物質のアポ蛋白で免疫された動物の抗体産生細
胞と、ミエローマ細胞とを融合させることによって、該
アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを得、次いで、該ハイブリドーマ及び／又は
それに由来する細胞株を培養し、培養物からヒトの肺表
面活性物質のアポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を
採取することによって得られる。

本発明における肺表面活性物質は、ヒトの肺及び／又は
気管支の洗浄液から、好ましくは肺胞蛋白症患者の気管
支肺洗浄液から分離・採取される。

肺表面活性物質は、約９０％の脂質と約１０％の蛋白と
の複合体（リポ蛋白）であり、これから公知の方法、例
えばＦ　ｒｏｓｏｌｏｎｏの方法（Ｊ　、　Ｌ　１ｐｉ
ｄＲｅｓ、１１．　４３９−４５７（１９７０）参照）
によって肺表面活性物質を得、次いで脂質を除去すると
、本発明におけるアポ蛋白が得られる。アポ蛋白は分子
量約６２，０００と約３６，０００の蛋白が主成分であ
るが、分子量約３６，０００の蛋白は、ソジウムドデシ
ルサルフェー°トーポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では幅広いバンドとして分離し、こ
の中には分子量約３７，０００と約３４，０００の蛋白
も含んでいると考えられる。従って、本発明におけるア
ポ蛋白とは、これらの糖蛋白及びその他のすべてのアポ
蛋白又はそれらのフラグメントを意味するものである。

なお、蛋白の分子量は５Ｏ８−ＰＡＧＥにより測定した
。

アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマは、手法それ自体は公知である細胞融合法に
よって製造することができる。まず、アポ蛋白でサル、
ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジウサギ、ラット、マウス等の
動物を免疫し、次いでこれらの動物の牌臓やリンパ節等
から抗体産生細胞（リンパ球）を採取し、そして、この
細胞をヒト又は動物のミエローマ細胞と融合させる。ミ
エローマ細胞としてはマウスのミエローマ細胞を用いる
のが便利であり、これらの例としては、ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスのＰ　３−Ｘ　６３〜Ａ　ｇ８．　ｐ　３−Ｘ　６
３−ＡＯ８−Ｕｌ　　、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１
．Ｐ３−Ｘ６３−　Ａ　０８−６．５，３．　　Ｓ　Ｐ
　２　／○−Ａｇ１４　　、ＦＯ，ＭＰＣ１１−４５，
６７Ｇ　１．７などがある。

細胞融合の条件は、例えば次の通りである。抗体産生細
胞とミエローマ細胞を１０：１〜１〜１０゜好ましくは
１：１〜１：３の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液
、例えば約３５％ポリエチレングリコール（分子量ｉ、
ｏｏｏ〜ｅ、ｏｏｏ程度）およ゛び約７３５％ジメチル
スルホキシドを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０を加えて、室
温〜３７℃で１〜数分間撹拌し、その後１０％ＦＯ８加
ＲＰＭＩＩ６４０で徐々に希釈し、洗浄の後）−ＩＡＴ
　（ヒボキ丈ンチンーアミノプテリンーチミジン）選択
培養液にて細胞濃度が１〜５×１０５個／−となるよう
に調整する。これを０．２蔵ずつ、例えば９６穴プレー
トに分注し、５％ＣＯ２を含む空気中で３５〜３８℃で
２〜３週間培養する。

ＨＡＴ培養液中ではハイブリドーマのみが存在し、８−
アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ同士
の融合細胞は生存し得ないく未融合の抗体産生細胞は数
日で死滅する）。次に、このハイブリドーマ集落から、
アポ蛋白に対し特異的なモノクローナル抗体を分泌する
ものだけ選別する。

この選別工程（スクリーニング）は、それぞれのハイブ
リドーマより産生されたモノクローナル抗体が、目的と
するアポ蛋白と抗原抗体反応をするか否かを酵素抗体法
で調べることによって行なう事ができる。目的とするモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、次にク
ローニングによ約２〜３週間後、９６穴のプレート中で
生育したコロニーを拾い、再び酵素抗体法でアポ蛋白に
対する抗体活性を調べ選別したハイブリドーマを培養し
て、所望のアポ蛋白に特異的なモノクローナル抗体を生
成させる。

モノクローナル抗体を得るためのもう一つの方法は、抗
体産生細胞にエプスタイン・バー・ウィルス（Ｅ　ｐｓ
ｔｅｉｎ　−Ｂ　ａｒｒ　Ｖ　１ｒｕｓ、以下Ｅ−Ｂウ
ィルスと略称する）を感染させて形質転換細胞を作成し
、該形質転換細胞及び／又はそれに由来する細胞株を培
養し、培養物からアポ蛋白に結合する性質を有するモノ
クローナル抗体を採取する方法である。

Ｅ−８ウイルスは、バーキットリンパ種や鼻咽頭ガンの
原因ウィルスとされている、ヘルペスウ、イルス群に属
するウィルスである。抗体産生細胞をＥ−Ｂウィルスに
感染させ、約２〜３週間、５％ＣＯ２インキユベータで
培養し、多くの異質集落から成る形質転換細胞（１〜ラ
ンスフオームドセル）を形成させる。次に、この形質転
換細胞から、アポ蛋白に対し特異的なモノクローナル抗
体を分泌するものだけを、前記と同様な方法で選別する
。

そして、前記と同様にして、クローン化された形質転換
細胞を得ることができる。

次に、本発明においては、選択したハイブリドーマ又は
形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナル
抗体を生成させる。クローニングによって選択された、
肺表面活性物質のアポ蛋白を認識する抗体を産生ずるハ
イブリドーマ又は形質転換は凍結して保存することがで
き、また、これを適当な方法で大口に培養することもで
きる。

そして、培養上清からアポ蛋白に特異的に結合するモノ
クローナル抗体を得ることができる。また、かかる細胞
を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清から目的と
する抗体を得ることもできる。

本発明のモノクローナル抗体の精製は、プロティンＡ等
を用いるアフィニティクロマトグラフィー等の方法によ
って行なわれる。

（ホ）発明の効果 本発明のモノクローナル抗体は、−ヒトの肺表面活性物
質のアポ蛋白を認識するので、肺表面活性物質のマーカ
ーとして、ヒト肺洗浄液やヒト羊水中の肺表面活性物質
の免疫学的定量のために用いるこ件ができる。また、ヒ
トの肺胞表面や肺胞■型細胞（肺表面活性物質の産生細
胞）の免疫組亭学的検討のための試薬として使用するこ
とができる。

（へ）以下、実施例により本発明を詳述す仝。

実施例１ （１）肺胞蛋白症患者の肺及び気管支を、治療の目的で
、０．１５　Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、気管支肺
洗浄液（ＢＡＬＦ＞を３見得た。このＢＡＬＦを３００
ｘ　ｇで１０分間遠心分離し、細胞及び細胞破片を除去
した。次いで、得られた上清を４８０ｏｏｘ　ｇで２０
分間遠心分離し、沈渣画分を採取した。

この沈渣画分を、１４５１Ｍの塩化ナトリウム、１、ｍ
Ｍのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・を含む１０
　ｍＭのトリス緩衝液（ｐｈ７．４　）　８０＊に懸濁
し、０．２５　Ｍと０．６５　Ｍの不連続ショ糖密度勾
配による遠心分離を、４００００Ｘ　９で６０分間行な
った。

０．２５　Ｍと０．６５　Ｍのショ糖溶液の１８画分を
採取し、上記緩衝液４００ｍに再懸濁した。そして、こ
の懸濁液を、４８０００Ｘ　９で３’０分間遠心分離し
、沈澱物（肺表面活性物質）を得た。

アルブミン等の不純物を除くためにこの沈澱物を、１％
のトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル）、３１ＭのＥＤＴＡ、　１　　ｍＭの
フェニルメチルスルホニルフロリド。

０．５　ｍＭのジチオスレイトールを含む５　ｍＭのト
リスｍ衝液ＣＤＩ−１７，８，以後トリトン緩衝液とい
う＞　２７ｄに静かに分散させた。この分散液を１５０
０００×３で６０分間遠心分離し、沈澱物（精製肺表面
活性物質）を得た。

この沈澱物を、上記トリトン緩衝液４ＩＲＲに再分散し
、この再分散液に４ｄのブタノール−エタノール混合液
（容量比６：１）を添加し、激しく振とうして、０℃で
１０分間放置し脂質を抽出除去した後、２００Ｏｒ、ｌ
）、１．で１５分間遠心分離し、沈澱物（アポ蛋白）を
得た。この操作をもう３回繰り返し、最終的なアポ蛋白
の沈澱を得た。

この沈澱物をトリトン緩衝液２０ｄに懸濁し、同じトリ
トン緩衝液に対してセロハン膜を用いて透析しくブタノ
ール−エタノールの除去）、透析内液を得た。この透析
内液を、１５００００Ｘ　９で６０分間遠心分離し上溝
を得た。沈澱物には再びトリトン緩衝液２０ｍを添加し
可溶化した後、１５００００ｘ　ｇで６０分間遠心分離
し上清を得た。この操作をもう６回行ない上清を集めた
。得られた上清は合憚して１５０Ｉ１１であった。この
上清を、トリトン緩衝液で平衡化したブルーセファロー
ス４Ｂカラム（直径１．８ａＲＸ　３．５ｃＩｉ）に注
加し、同緩衝液を用いて溶出し、素通り画分を採取する
ことによって混在するアルブミンを完全に除去した。、 この両分を、トリトン緩衝液で平衡化したＤＥ、ＡＥ−
トーヨーバールカラム（直径１，４ｃＩＲＸ　１９Ｃｒ
Ｒ）に注加し、まず、同緩衝液２００ｄを用いて流速１
５ｄ／ｈｒ、で溶出し、次に、同緩衝液に含まれる塩化
ナトリウムの濃度を０から０．５Ｍまで直線的に連続的
に上げながら溶出し、塩化ナトリウム濃度が０．３０　
Ｍと０．３５　Ｍの間の画分を得た。この画分ド含まれ
る蛋白の分子量は約６２０００と約３６０００であった
。

（２）前記の塩化ナトリウム濃度が０．３０　Ｍと０．
３５　Ｍの間で溶出された両分に含まれるＬＳアポ蛋白
を、以下の実験に用いた。

ＬＳアポ蛋白をフロイント完全アジュバントに乳化し、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与した。

そして、３０日後にマウスに追加免疫を行った。一方、
１５％の牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ　　１６４０（
ギブコ社製）で、ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｏ８
−（Ｊｌを維持培養しておいた。追加免疫３日後、マウ
スから得た牌臓細胞とＰ　３−Ｘ　６３−　Ａ　ａ８−
Ｕｌを、Ｏｌ等の方法（Ｓ　ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｎ＋ｅ
ｔｈｏｄｓ　　１ｎｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ　１９８０．　ｐ３５１−３７２．参照）により
ポリエチレングリコール４０００を用い細胞融合させ、
９６穴マイクロプレートにまいた。細胞融合後、培地を
１００μＭヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリン
、１６μＭチミジンを添加したＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培
地）に置き換えた。ＨＡＴ培地で培養中２〜３週間で、
牌臓細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみが生育
した。ハイプリドーマの培養液中の抗体活性を、以下に
述べるＥＬＩＳＡ法で調べた。

［抗体のスクリーニング〕 ＬＳアポ蛋白をＥＬＩＳＡ用のプレートに付着させ、１
０１Ｍリン酸生理食塩液（ｆ）Ｈ７，４）に３％（Ｗ　
／Ｖ　’）のＢＳＡを添加した液で、ブロッキングを行
った。ブロッキング後、ハイブリドーマ培養液５０μ文
をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２時間又は４℃
で一夜培養した。その後、ビオチン化つマ抗マウスＩｇ
Ｇイムノグロブリン（２μｇ／Ｉｄ）５０μ旦の２次抗
体を添加、室温で１時間反応させ。これに、５０μ塁の
西洋ワサビパーオキシダーゼアビジンＤ溶液（１μｇ／
ｌ１１）を加え、ＬＳアポ蛋白に結合した抗体を、１０
０μ磨の基質溶液（０，１％０−フェニレンジアミン。

０．０１５％Ｈ２０２、０，１Ｍクエン酸緩衝液、・ｐ
Ｈ４，６）を加える事により検出した。

（３）ＬＳアポ蛋白に対する抗体を産生ずるハイブリド
ーマを選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行
ない、最終的に単一クローンのハイブリドーマ２種が得
られた。このハイブリドーマを、それぞれ、プリスタン
投与ＢＡＬＢ／Ｃマ°ウスの腹腔で増殖させ、モノクロ
ーナル抗体を含む腹水を得た。得られた腹水に５０％飽
和硫安を加え抗体を沈澱させ、この沈澱物を０．１Ｍリ
ン酸生理食塩液（ＤＨ８，０）に溶解させた。そして透
析後、プロティンＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（フ
ァルマシア社製）にかけ、抗体を０．２Ｍグリシン−塩
酸バッファー（＋）Ｈ３，０）で溶出して精製した。

２種類のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗
体を、それぞれＰＯ２，ＰＥ１０と命名した。

（４）　　モノクローナル抗体の性質 ウェスタン　ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏ
ｔ−Ｈｎｇ）法で、ＰＯ２とＰ　Ｅ　１０は、肺胞蛋白
症患者の気管支肺洗浄液の１８画分から得られた３６に
と６２にの両アポ蛋白を認識した。また、両抗体はヒト
羊水と正常ヒト気管支線洗浄液中の、３７にと３４Ｋ及
び６２にアポ蛋白を認識した。３６に蛋白は５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで幅広いバンドとして分離し、この中に３７にと
３４に蛋白を含むので、３ＧＫ蛋白、と３７Ｋ。

３４に蛋白は同一の蛋白である。ＰＯ２とＰ　Ｅ　１０
は、　。

ドツト−免疫結合（ｄａｔ　−ｉ＋ｎｕｎｏｂｉｎｄｉ
ｎａ　）法による交叉反応の結果から、近接する相互に
異なったエピトープ（抗原部位）をＷ１３１することが
示された。これらの抗体は、ヒトの肺表面活性物質のア
ポ蛋白に特異的であり、ラット、ブタ、ウサギ等の動物
の肺表面活性物質のアポ蛋白とは反応せず、またヒトの
血清蛋白とも反応しなかった。

［ウェスタン　ブロッティング法］ モノクローナル抗体に特異的な抗原を、Ｔ　ｏｗｂ−１
ｎ等の方法（Ｐｒｏ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、、　７６　４
３５０−４３５４）によるウェスタン　ブロッティング
法を用いて同、定した。最初に肺表面活性物質のアポ蛋
白を有する抗原を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。５ＤＳ−
ＰＡＧＥ後電解液バッファーが２５　ｍＭ　トリス−塩
酸。

ＤＨ８，３，１９２ｍＭグリシン、　２０％（ｖ　／ｖ
　）メタノールであり、電圧傾斜が７Ｖ／ａＲ，２時間
の条件でスラブ（５ｌａｂ）ゲルからニトロセルロース
シートへ蛋白を移した。ニトロセルロースシートの各レ
ーンを切り離した。片一方のシートを、アミドブラック
で蛋白染色を行い、他方は次の様な酵素免疫アッセイに
処した。

３％（ｗ　／ｖ　）ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、
１次抗体としてモノクローナル抗体（ＰＯ２又はＰ　Ｅ
　１０）を加えた。２次抗体としてビオチン化つマ抗マ
ウスＩｇＧイムノグロブリンを加えた。

各シートは０．０５％（ｖ　／ｖ　）　トウィーン（Ｔ
’１ｌＴｅｅｎ）　２０を含むＰＢＳで洗浄した。西洋
ワサビバーオキシダーゼアごジンＤでインキュベート後
、基質溶液（００ＯＳ％ジアミノベンジジン。

０．０３％Ｈ２０ｚ　、０．Ｏｌ　ＭＰＢＳ）を加える
ことにより検出し同定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白を認識するモノク
   ローナル抗体。 ２、分子量約６２，０００及び／又は約３４，０００〜
   ３７，０００のアポ蛋白を認識する、特許請求の範囲第
   １項記載のモノクローナル抗体。 ３、モノクローナル抗体がＩｇＧ型のマウス抗体である
   特許請求の範囲第１項又は第２項記載のモノクローナル
   抗体。 ４、ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白で免疫された動物
   の抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させること
   によって、該アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマを得、次いで、該ハイブリドー
   マ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物か
   らヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白を認識するモノクロ
   ーナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル
   抗体の製造法。