JPH0560359B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、モノクローナル抗体、詳しくは各種
の肝疾患のスクリーニング並びに診断ヒト肝細胞
増殖因子（human hepatocyte growth factor；
hHGF）の精製等に有用な新規なモノクローナル
抗体に関する。 従来の技術 hHGFは、本発明者である合田らにより、劇症
肝炎患者の血液から分離精製された蛋白性物質で
ある〔E.Gohda et al.、Exp.Cell Res.、166、栄
39−156（1986）；H.Nakayama et al.、Biomed.
Res.、６、231−237（1985）；特願昭61−166495号
等参照〕。 かかるhHGFは、肝細胞の増殖を著明に促進す
る活性を有し、血中におけるその活性は、劇症肝
炎の病態、殊に昏睡度の変動と密接に関連して変
動し、回復期には低下することが知られている。 発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、hHGFが、例えば急性肝炎、慢
性肝炎、肝硬変、劇症肝炎等の各種肝疾患の治療
薬ないしは肝切除術後の治療薬として、更に臨床
サンプルにおけるその測定が、それら肝疾患のス
クリーニング並びに診断ないしは病態把握等に、
それぞれ有用であることを既に見出している。 しかしながら、かかるhHGFの製造ないしは精
製工程は、前記報告にもある通り、極めて厖大且
つ複雑であり、その収量の低さからも、上記技術
分野への提供に大きな問題を残している。 更に、hHGFの測定は、前記報告のバイオアツ
セイ（生物学的検定法）による活性量としての測
定技術が確立されているに過ぎず、かかる方法で
は操作性及び精度に劣ることはもとより、常に測
定値（活性）に干渉する成分の存在を考慮する必
要があることから、上記目的の、斯界の要求に到
底添うものではなく、かかる技術的課題の克服が
望まれている。 本発明は、之等の技術的課題をよく解決するも
のであり、上記所望の技術を達成するための新規
な抗体を提供することをその目的とする。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、非還元条件のSDS−PAGEに
より泳動される分子量約88000及び約83000の２つ
のバンドのhHGFに反応性を有することを特徴と
するhHGFに対するモノクローナル抗体が提供さ
れる。 本発明抗体の利用によれば、hHGFの免疫学的
精製手段並びにhHGFの免疫学的測定手段が提供
される。 本発明抗体は、hHGF、殊に非還元条件のSDS
−PAGEにより泳動される分子量約88000及び約
83000に２つのバンドのhHGFに特異的に反応
（結合）することをその最大の特徴としており、
かかる抗体には、hHGFの肝細胞増殖活性を阻害
ないしは阻止するタイプの抗体が包含される。 以下、本発明抗体の製造法につき詳述する。 本発明抗体は、hHGFを免疫抗原として使用し
て、通常の抗体の製造方法に準じて製造すること
ができる。上記方法において、用いられる免疫抗
原としてのhHGFは、前述の通り公知である。本
発明抗体の製造においては、必ずしもhHGFの精
製標品を用いる必要はなく、これを含む粗製品を
使用することも可能である。上記本発明抗体の製
造方法は、より具体的には、例えば上記免疫抗原
としてのhHGFで免疫した哺乳動物の形質細胞
（免疫細胞）を、哺乳動物の形質細胞腫細胞と融
合させてハイブリドーマ（hybridoma）を作成
し、これより上記hHGFを認識する抗体を産生す
るクローンを選択し、該クローンより目的とする
抗体（モノクローナル抗体）を得る方法を好まし
く例示できる。 上記方法において免疫抗原、即ちhHGFで免疫
される哺乳動物としては、特に限定されないが、
細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、一般には、マウ
ス、ラツト等が有利に使用される。 免疫は一般的方法により、例えば上記hHGFを
哺乳動物に静脈内投与もしくは腹腔内注射等によ
り投与することにより行なわれる。より具体的に
はhHGFをPBSや生理食塩水等で適当な濃度に希
釈し、これを所望により通常のアジユバンドを併
用して、動物に２〜21日毎に数回投与し、総投与
量が約１〜100μｇ／動物程度になるようにする
のが好ましい。また、上記投与に際しては通常の
担体（シユレツパー）を採用することもできる。
免疫細胞としては、上記hHGFの最終投与の約３
日後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。 上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として
の哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知
の種々の細胞株、例えばp3（p3／×63−Ag8）
〔Nature、256、495−497（1975）〕、p3−U1
〔Current Topics in Microbiology and
Immunology、81、１−７（1978）〕、NS−１
〔Eur.J.Immunol.、６、511−519（1976）〕、MPC
−11〔Cell、８、405−415（1976）〕、SP2/0
〔Nature、276、269−270（1978）〕、FO〔J.
Immunol.Meth.、35、１−21（1980）〕、×63.6.5.3
〔J.Immunol.、123、1548−1550（1979）〕、S194
〔J.Exp.Med.、148、313−323（1978）〕等や、ラ
ツトにおけるR210〔Nature、277、131−133
（1979）〕等の骨髄腫細胞が使用される。 上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応
は、基本的には公知の方法、例えばマイルスタイ
ンら（Milstein et al.）の方法〔Methods
Enzymol.、73、３−46（1981）〕等に準じて行な
い得る。より具体的には上記融合反応は、例えば
融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行なわ
れる。融合促進剤としては通常用いられるもの、
例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダ
イウイルス（HVJ）等が使用され、更に所望に
より融合効率を高めるためにジメチルスルホキシ
ド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫
細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法
と変りがなく、例えば形質細胞腫細胞に対し、免
疫細胞を約１〜10培程度用いればよい。上記融合
時の培地としては、例えば上記形質細胞腫細胞株
の増殖に使用される如きRPMI−1640培地、
MEM培地、そ他この種の細胞培養に使用される
通常の各種培地を利用でき、通常は牛胎児血清
（FCS）等の血清補液を抜いておくのがよい。融
合は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量
を上記培地内でよく混合し、予め37℃程度に加温
したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6000程
度のものを、通常培地に約30〜60％（Ｗ／Ｖ）の
濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。
以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を
除去する操作を繰返すことにより所望のハイブリ
ドーマが形成される。 得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常
の選別用培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で
培養することにより行なわれる。該HAT培地で
の培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞
（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通
常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化
が行なわれる。 該産生株の検索は、例えばELISA法
〔Engvall、E.、Methods Enzymol.、70、419−
439（1980）〕、プラーク法、スポツト法、凝集反応
法、オクタロニー（Ouchterlony）法、ラジオイ
ムノアツセイ（RIA）法等の一般に抗体の検出に
用いられている種々の方法〔「ハイブリドーマ法
とモノクローナル抗体」、(株)Ｒ＆Ｄプランニング
発行、pp30〜53、昭和57年３月５日〕に従つて
行なわれる。尚、上記検索における抗原としては
前記hHGF標品を好ましく使用できる。 かくして得られる所望のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養でき、また液体窒素中で長期間保存可能であ
る。 該ハイブリドーマからの本発明モノクローナル
抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従つて
培養し、その培養上清として、或いはハイブリド
ーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増
殖させ、その腹水として得る方法等が採用され
る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適して
いる。 更に、上記により得られる抗体は、塩析法、ゲ
ル過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の
通常の精製手段により精製することもできる。 かくして得られる本発明抗体は、これを利用し
て、例えば免疫沈降法、アフイニテイクロマトグ
ラフイー等の通常の免疫学的精製手段により、
hHGFを簡易且つ特異的に精製できる。 更に、本発明抗体の利用によれば、放射免疫測
定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA）、凝集法等
の通常の免疫学的手段により、高感度、高精度に
且つ高い特異性をもつてhHGFを簡易に測定する
ことができる。 かかる本発明抗体を利用した、精製系並びに測
定系の設定、その改変ないし応用は、当業者にと
り自明である。 発明の効果 本発明によれば、hHGFの特異抗体が提供され
る。該抗体の利用によれば、hHGFの免疫学的精
製手段による精製が可能であり、その製造に際し
て極めて有用である。また本発明抗体の利用によ
れば、hHGFの免疫学的測定手段が提供され、こ
れは殊に臨床サンプルのhHGFの測定に利用さ
れ、これによつて各種の肝疾患のスクリーニング
並びに診断ないしは病態の把握等を極めて有効に
行なうことができる。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため参考
例、実施例及び試験例を挙げる。 参考例１ ＜hHGFの製造＞ hHGFは、合田らの方法〔Exp.Cell Res.、
166、139−150（1986）；特願昭61−166495号〕に
従い、劇症肝炎の患者血漿から単離、精製した。 肝細胞増殖活性（以下、「HGF活性」と略記す
る）も、上記報告の方法に従つた。 上記hHGFのHGF活性は、加熱処理（80℃、
10分間）及び酵素処理（0.1mg／mlトリプシン、
37℃、30分間及び0.1mg／mlキモトリプシン、37
℃、30分間）により失活する。また、0.5M酢酸、
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）、同（PH5.0）、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.4）及び0.1Mグリシン緩衝液
（PH9.5）のいずれの処理（４℃、20時間）によつ
ても安定である。 上記hHGFのSDS−PAGE（上記文献に記載の
方法に準じた。但し12％分離ゲルを用い、染色は
銀染色によつた）によれば、非還元条件下で、該
hHGFは、分子量約88000及び約83000の２本のバ
ンドとして泳動された。 また還元条件下でのSDS−PAGEによれば、分
子量56000〜65000及び32000〜35000の両グループ
にメインバンドを与えた。このことにより、
hHGFは、之等がジスルフイド結合により結合し
た蛋白性物質であり、上記の分子型はいずれも実
質的にhHGFとして同一であると推定された。 実施例 １ ＜抗体の製造＞ 上記参考例１で得たhHGF0.01mg／mlの生理
食塩水溶液を、等量のフロインド コンプリー
ト アジユバント（Freund complete
adjuvant、DIFCO Laboratories、Detroit
Michigan USA）と混和し、懸濁させた。得
られた懸濁液の上記hHGF2μｇ含有分を、
Balb／ｃ系マウスに皮下投与した。２週間目
に、同液のhHGF2μｇ含有分を同様に投与し、
更に３週間後、生理食塩水に溶解させたhHGF
の2μｇを腹腔内投与した。最終投与の４日後
に脾臓を摘出し、脾細胞をRPMI−1640培地で
３回洗浄した。 マウス骨髄腫細胞株P3−U1〔Current
Topics in Microbiology and Immunology、
81、１−７（1978）〕を同様に洗浄後、その１×
107個と上記脾細胞１×108個とを50ml遠心管に
入れ混合した。200×Ｇ、５分遠心後、上清を
パスツールピペツトで除去した。37℃に保温し
たポリエチレングリコール1500（ベーリンガー
マンハイム山之内社製）50％（Ｗ／Ｖ）を含む
RPMI−1640溶液１mlを１分間を要して滴下
し、次いで37℃に保温したFCSを含まない
RPMI−1640溶液１mlを加えて１分間放置し、
次に同液２mlを加えて２分間放置し、更に同液
４mlを加えた。４分間放置後、37℃に保温した
15％FCS、0.05ｇ力価／−硫酸ストレプトマ
イシン、60000U／−ペニシリンＧカリウム、
54mg／−ゲンタマイシン及び１ｍＭピルベー
トを含有するRPMI−1640（以下これを「完全
RPMI」という）の８mlを加え、200×Ｇで５
分間遠心分離した。 上清を除去し、37℃に保温した完全RPMI
に、脾細胞１×106個／mlとなるように懸濁し、
24穴のマイクロプレート（コースター社）に１
mlずつ分注し、37℃下に５％炭酸ガスインキユ
ベーター内で培養した。24時間後1.0×10-4M
ヒポキサンチン、4.0×10-7Mアミノプテリン
及び1.6×10-5Mチミジンを含む完全RPMI培地
（以下「HAT培地」という）１mlを各ウエル
に添加した。以後上清の半分を第２、３及び４
日目にそれぞれ新しいHAT培地に代え、第６
日目に同様に上清の半分を、1.0×10-4Mヒポ
キサンチン及び1.6×10-5Mチミジンを含む完
全RPMI培地（以下「HT培地」という）に代
えた。以後、完全RPMI培地で増殖維持した。 かくして得られるハイブリドーマを、限界希
釈法によりクローニングした。即ちハイブリド
ーマ３×102個及びBalb／ｃ系マウス胸腺細胞
１×108個を含むように調製した10％FCS加
RPMI−1640培地の20mlを用いて、ハイブリド
ーマ３個／ウエルとなるように96ウエルのプレ
ートに播き、培養した。増殖してくるハイブリ
ドーマを同様にハイブリドーマ１個／ウエルと
してクローニングし、更に増殖してくるハイブ
リドーマを同様にハイブリドーマ0.3個／ウエ
ルとしてクローニングした。 目的の抗体を産生するクローンは、免疫原に
用いたhHGFを抗原とするELISA法により検
索した。 かくして、所望の反応特異性を有する本発明
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ（クローンNo.OAL−Ｈ−２−14）を得た。 上記で得られたクローンNo.OAL−Ｈ−２
−14を、完全RPMI培地にて５％炭酸ガスイン
キユベーター中で、37℃にて48時間培養した。
培養液を遠心分離（3000rpm、10分）して、目
的のモノクローナル抗体（以下これを「Ｈ−２
−14」という）を含む培養上清を得た。 尚、上記抗体のサブクラスはIgG1であつた。
これはオクタロニーキツト（Serotec社製）を
用いて確認された。 前記で得たクローンNo.OAL−Ｈ−２−14
の１×106個を、予めプリスタン（pristan、
Aldrich Chemicals社製）を接種しておいた
Balb／ｃ系マウスに腹腔内投与した。10〜14
日後、蓄積した腹水を採取し、本発明抗体を含
む腹水を得た。この抗体の濃度は、約0.2〜５
mg／mlであつた。 該腹水より、IgG精製キツト〔MAPS Kit；
バイオ・ラツド社製〕を用いて、精製抗体Ｈ−
２−14を得た。 試験例 １ 96ウエルプレートの各ウエルに、免疫原として
用いたhHGFの150ｍＭ NaCl及び0.04％NaN3
含有20ｍＭトリス塩酸溶液（8.6μｇ／10ml）を加
え、４℃で24時間放置した。洗浄後、2.5％BSA
のPBS溶液を各ウエルに200μづつ入れ、４℃
で24時間以上放置してブロツクし、抗原を不溶化
したプレートを得た。 次いで、上記各ウエルに、実施例１ので得た
上清の倍々希釈液各100μを添加し、室温下に、
1.5時間振盪した。 各ウエルを洗浄後、パーオキシダーゼで標識し
たヤギ抗（マウスIgM＋IgG）抗体（ジヤツクソ
ン（Jackson Immunoresearch Lab.）社製、×
5000）100μを加え、室温、振盪下に1.5時間放
置し、洗浄後、オルト−フエニレンジアミン（25
mg／10ml）溶液100μを加えて、20〜30分間放
置後、2N−H2SO4100μを添加して反応を停止
させた。 得られた反応液の492nｍでの吸光度を、タイ
ターテツク・マルチスキヤン（フローラボラトリ
ーズ社製）により測定した。 その結果を第１図に示す。 図において横軸は本発明抗体を含む培養上清の
希釈倍数を、縦軸はOD492を示す。 試験例 ２ （ウエスタン・ブロテイング） この試験は、タウビンら（H.Towbin et al.）
の方法に準じた〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、
4350−4354（1979）〕。 即ち、hHGFをSDS−PAGE（参考例１に記載）
後、ゲルをニトロセルロース膜と合せ、ゲルのあ
る側を−極、ニトロセルロース膜のある側を＋極
として電流を流し、ゲル上で泳動された蛋白質を
ニトロセルロース膜にブロツトした。ブロツトさ
れたニトロセルロース膜を２％BSA含有PBS液
に浸してブロツキングを行なつた後、一次抗体と
して前記実施例１ので得た精製抗体Ｈ−２−14
を反応させた。洗浄後、二次抗体とするパーオキ
シダーゼで標識したヤギ抗（マウスIgM＋IgG）
抗体（ジヤクソン社製）を添加して、２％BSA
含有PBS液中で反応させた。次いで50ｍＭトリ
ス塩酸（PH7.5）＋0.2M NaCl液を用いてニトロセ
ルロース膜を洗浄後、ワーキング溶液［50ｍＭト
リス塩酸（PH7.5）＋0.2M NaClの31ml、３mg／ml
４−クロロナフトールのメタノール溶液の５ml及
び30％H2O2水溶液の25μの混合液］を加えて、
発色させた。 上記ウエスタン・ブロツテイングの結果を第２
図に示す。 第２図において、１の３レーンは、非還元条件
下のSDS−PAGEでの結果を、２の３レーンは還
元条件下での結果を夫々示し、各結果におけるレ
ーンＡは参考例１で得たhHGFを、レーンＢ及び
レーンＣは参考例１と同様にして得た別ロツトの
hHGFを夫々示す。 該図より、本発明抗体−２−14は、ロツトの別
を問わず、非還元条件下のSDS−PAGEにより泳
動されたhHGF（２本のバンド共）に反応性を有
し、また還元条件下のhHGFには反応しないこと
が確認された。 試験例 ３ （吸収試験） 抗原（hHGF液）と抗体（実施例１ので得た
Ｈ−２−14を含む培養上清の10倍希釈液）とを、
37℃で一夜反応させた。この溶液に、プロテイン
Ａを固相化したゲル（バイオ・ラツド（Bio−
Rad.）社製）を添加し、プロテインＡにモノク
ローナル抗体を結合させ、遠心分離してこのゲル
を落し、上清を回収した〔J.Biol.Chem.、260、
7219−7225（1985）〕。 この上清のHGF活性を、参考例１に準じて125I
−durd取込み〔Biochem.、23、6295−6299
（1984）〕により調べた。 結果を第３図に示す。 図において、横軸はHGF活性測定に供した上
記上清（サンプル）の量（μ）を、縦軸は125I
−durdの取込み量（cpm×10-4：サンプル非添加
時のブランク値を引いた結果）を夫々示し、図中
曲線１は上記試験の結果を、曲線２は上記試験に
おいて抗体の代りに同量のRPMI−1640培地を用
いた対照の結果を夫々示す。 上記試験結果から、本発明抗体Ｈ−２−14は、
hHGFに特異な反応性を有する抗体であることが
判る。
の肝疾患のスクリーニング並びに診断ヒト肝細胞
増殖因子（human hepatocyte growth factor；
hHGF）の精製等に有用な新規なモノクローナル
抗体に関する。 従来の技術 hHGFは、本発明者である合田らにより、劇症
肝炎患者の血液から分離精製された蛋白性物質で
ある〔E.Gohda et al.、Exp.Cell Res.、166、栄
39−156（1986）；H.Nakayama et al.、Biomed.
Res.、６、231−237（1985）；特願昭61−166495号
等参照〕。 かかるhHGFは、肝細胞の増殖を著明に促進す
る活性を有し、血中におけるその活性は、劇症肝
炎の病態、殊に昏睡度の変動と密接に関連して変
動し、回復期には低下することが知られている。 発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、hHGFが、例えば急性肝炎、慢
性肝炎、肝硬変、劇症肝炎等の各種肝疾患の治療
薬ないしは肝切除術後の治療薬として、更に臨床
サンプルにおけるその測定が、それら肝疾患のス
クリーニング並びに診断ないしは病態把握等に、
それぞれ有用であることを既に見出している。 しかしながら、かかるhHGFの製造ないしは精
製工程は、前記報告にもある通り、極めて厖大且
つ複雑であり、その収量の低さからも、上記技術
分野への提供に大きな問題を残している。 更に、hHGFの測定は、前記報告のバイオアツ
セイ（生物学的検定法）による活性量としての測
定技術が確立されているに過ぎず、かかる方法で
は操作性及び精度に劣ることはもとより、常に測
定値（活性）に干渉する成分の存在を考慮する必
要があることから、上記目的の、斯界の要求に到
底添うものではなく、かかる技術的課題の克服が
望まれている。 本発明は、之等の技術的課題をよく解決するも
のであり、上記所望の技術を達成するための新規
な抗体を提供することをその目的とする。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、非還元条件のSDS−PAGEに
より泳動される分子量約88000及び約83000の２つ
のバンドのhHGFに反応性を有することを特徴と
するhHGFに対するモノクローナル抗体が提供さ
れる。 本発明抗体の利用によれば、hHGFの免疫学的
精製手段並びにhHGFの免疫学的測定手段が提供
される。 本発明抗体は、hHGF、殊に非還元条件のSDS
−PAGEにより泳動される分子量約88000及び約
83000に２つのバンドのhHGFに特異的に反応
（結合）することをその最大の特徴としており、
かかる抗体には、hHGFの肝細胞増殖活性を阻害
ないしは阻止するタイプの抗体が包含される。 以下、本発明抗体の製造法につき詳述する。 本発明抗体は、hHGFを免疫抗原として使用し
て、通常の抗体の製造方法に準じて製造すること
ができる。上記方法において、用いられる免疫抗
原としてのhHGFは、前述の通り公知である。本
発明抗体の製造においては、必ずしもhHGFの精
製標品を用いる必要はなく、これを含む粗製品を
使用することも可能である。上記本発明抗体の製
造方法は、より具体的には、例えば上記免疫抗原
としてのhHGFで免疫した哺乳動物の形質細胞
（免疫細胞）を、哺乳動物の形質細胞腫細胞と融
合させてハイブリドーマ（hybridoma）を作成
し、これより上記hHGFを認識する抗体を産生す
るクローンを選択し、該クローンより目的とする
抗体（モノクローナル抗体）を得る方法を好まし
く例示できる。 上記方法において免疫抗原、即ちhHGFで免疫
される哺乳動物としては、特に限定されないが、
細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、一般には、マウ
ス、ラツト等が有利に使用される。 免疫は一般的方法により、例えば上記hHGFを
哺乳動物に静脈内投与もしくは腹腔内注射等によ
り投与することにより行なわれる。より具体的に
はhHGFをPBSや生理食塩水等で適当な濃度に希
釈し、これを所望により通常のアジユバンドを併
用して、動物に２〜21日毎に数回投与し、総投与
量が約１〜100μｇ／動物程度になるようにする
のが好ましい。また、上記投与に際しては通常の
担体（シユレツパー）を採用することもできる。
免疫細胞としては、上記hHGFの最終投与の約３
日後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。 上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として
の哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知
の種々の細胞株、例えばp3（p3／×63−Ag8）
〔Nature、256、495−497（1975）〕、p3−U1
〔Current Topics in Microbiology and
Immunology、81、１−７（1978）〕、NS−１
〔Eur.J.Immunol.、６、511−519（1976）〕、MPC
−11〔Cell、８、405−415（1976）〕、SP2/0
〔Nature、276、269−270（1978）〕、FO〔J.
Immunol.Meth.、35、１−21（1980）〕、×63.6.5.3
〔J.Immunol.、123、1548−1550（1979）〕、S194
〔J.Exp.Med.、148、313−323（1978）〕等や、ラ
ツトにおけるR210〔Nature、277、131−133
（1979）〕等の骨髄腫細胞が使用される。 上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応
は、基本的には公知の方法、例えばマイルスタイ
ンら（Milstein et al.）の方法〔Methods
Enzymol.、73、３−46（1981）〕等に準じて行な
い得る。より具体的には上記融合反応は、例えば
融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行なわ
れる。融合促進剤としては通常用いられるもの、
例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダ
イウイルス（HVJ）等が使用され、更に所望に
より融合効率を高めるためにジメチルスルホキシ
ド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫
細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法
と変りがなく、例えば形質細胞腫細胞に対し、免
疫細胞を約１〜10培程度用いればよい。上記融合
時の培地としては、例えば上記形質細胞腫細胞株
の増殖に使用される如きRPMI−1640培地、
MEM培地、そ他この種の細胞培養に使用される
通常の各種培地を利用でき、通常は牛胎児血清
（FCS）等の血清補液を抜いておくのがよい。融
合は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量
を上記培地内でよく混合し、予め37℃程度に加温
したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6000程
度のものを、通常培地に約30〜60％（Ｗ／Ｖ）の
濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。
以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を
除去する操作を繰返すことにより所望のハイブリ
ドーマが形成される。 得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常
の選別用培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で
培養することにより行なわれる。該HAT培地で
の培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞
（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通
常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化
が行なわれる。 該産生株の検索は、例えばELISA法
〔Engvall、E.、Methods Enzymol.、70、419−
439（1980）〕、プラーク法、スポツト法、凝集反応
法、オクタロニー（Ouchterlony）法、ラジオイ
ムノアツセイ（RIA）法等の一般に抗体の検出に
用いられている種々の方法〔「ハイブリドーマ法
とモノクローナル抗体」、(株)Ｒ＆Ｄプランニング
発行、pp30〜53、昭和57年３月５日〕に従つて
行なわれる。尚、上記検索における抗原としては
前記hHGF標品を好ましく使用できる。 かくして得られる所望のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養でき、また液体窒素中で長期間保存可能であ
る。 該ハイブリドーマからの本発明モノクローナル
抗体の採取は、該ハイブリドーマを常法に従つて
培養し、その培養上清として、或いはハイブリド
ーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増
殖させ、その腹水として得る方法等が採用され
る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適して
いる。 更に、上記により得られる抗体は、塩析法、ゲ
ル過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の
通常の精製手段により精製することもできる。 かくして得られる本発明抗体は、これを利用し
て、例えば免疫沈降法、アフイニテイクロマトグ
ラフイー等の通常の免疫学的精製手段により、
hHGFを簡易且つ特異的に精製できる。 更に、本発明抗体の利用によれば、放射免疫測
定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA）、凝集法等
の通常の免疫学的手段により、高感度、高精度に
且つ高い特異性をもつてhHGFを簡易に測定する
ことができる。 かかる本発明抗体を利用した、精製系並びに測
定系の設定、その改変ないし応用は、当業者にと
り自明である。 発明の効果 本発明によれば、hHGFの特異抗体が提供され
る。該抗体の利用によれば、hHGFの免疫学的精
製手段による精製が可能であり、その製造に際し
て極めて有用である。また本発明抗体の利用によ
れば、hHGFの免疫学的測定手段が提供され、こ
れは殊に臨床サンプルのhHGFの測定に利用さ
れ、これによつて各種の肝疾患のスクリーニング
並びに診断ないしは病態の把握等を極めて有効に
行なうことができる。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため参考
例、実施例及び試験例を挙げる。 参考例１ ＜hHGFの製造＞ hHGFは、合田らの方法〔Exp.Cell Res.、
166、139−150（1986）；特願昭61−166495号〕に
従い、劇症肝炎の患者血漿から単離、精製した。 肝細胞増殖活性（以下、「HGF活性」と略記す
る）も、上記報告の方法に従つた。 上記hHGFのHGF活性は、加熱処理（80℃、
10分間）及び酵素処理（0.1mg／mlトリプシン、
37℃、30分間及び0.1mg／mlキモトリプシン、37
℃、30分間）により失活する。また、0.5M酢酸、
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）、同（PH5.0）、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.4）及び0.1Mグリシン緩衝液
（PH9.5）のいずれの処理（４℃、20時間）によつ
ても安定である。 上記hHGFのSDS−PAGE（上記文献に記載の
方法に準じた。但し12％分離ゲルを用い、染色は
銀染色によつた）によれば、非還元条件下で、該
hHGFは、分子量約88000及び約83000の２本のバ
ンドとして泳動された。 また還元条件下でのSDS−PAGEによれば、分
子量56000〜65000及び32000〜35000の両グループ
にメインバンドを与えた。このことにより、
hHGFは、之等がジスルフイド結合により結合し
た蛋白性物質であり、上記の分子型はいずれも実
質的にhHGFとして同一であると推定された。 実施例 １ ＜抗体の製造＞ 上記参考例１で得たhHGF0.01mg／mlの生理
食塩水溶液を、等量のフロインド コンプリー
ト アジユバント（Freund complete
adjuvant、DIFCO Laboratories、Detroit
Michigan USA）と混和し、懸濁させた。得
られた懸濁液の上記hHGF2μｇ含有分を、
Balb／ｃ系マウスに皮下投与した。２週間目
に、同液のhHGF2μｇ含有分を同様に投与し、
更に３週間後、生理食塩水に溶解させたhHGF
の2μｇを腹腔内投与した。最終投与の４日後
に脾臓を摘出し、脾細胞をRPMI−1640培地で
３回洗浄した。 マウス骨髄腫細胞株P3−U1〔Current
Topics in Microbiology and Immunology、
81、１−７（1978）〕を同様に洗浄後、その１×
107個と上記脾細胞１×108個とを50ml遠心管に
入れ混合した。200×Ｇ、５分遠心後、上清を
パスツールピペツトで除去した。37℃に保温し
たポリエチレングリコール1500（ベーリンガー
マンハイム山之内社製）50％（Ｗ／Ｖ）を含む
RPMI−1640溶液１mlを１分間を要して滴下
し、次いで37℃に保温したFCSを含まない
RPMI−1640溶液１mlを加えて１分間放置し、
次に同液２mlを加えて２分間放置し、更に同液
４mlを加えた。４分間放置後、37℃に保温した
15％FCS、0.05ｇ力価／−硫酸ストレプトマ
イシン、60000U／−ペニシリンＧカリウム、
54mg／−ゲンタマイシン及び１ｍＭピルベー
トを含有するRPMI−1640（以下これを「完全
RPMI」という）の８mlを加え、200×Ｇで５
分間遠心分離した。 上清を除去し、37℃に保温した完全RPMI
に、脾細胞１×106個／mlとなるように懸濁し、
24穴のマイクロプレート（コースター社）に１
mlずつ分注し、37℃下に５％炭酸ガスインキユ
ベーター内で培養した。24時間後1.0×10-4M
ヒポキサンチン、4.0×10-7Mアミノプテリン
及び1.6×10-5Mチミジンを含む完全RPMI培地
（以下「HAT培地」という）１mlを各ウエル
に添加した。以後上清の半分を第２、３及び４
日目にそれぞれ新しいHAT培地に代え、第６
日目に同様に上清の半分を、1.0×10-4Mヒポ
キサンチン及び1.6×10-5Mチミジンを含む完
全RPMI培地（以下「HT培地」という）に代
えた。以後、完全RPMI培地で増殖維持した。 かくして得られるハイブリドーマを、限界希
釈法によりクローニングした。即ちハイブリド
ーマ３×102個及びBalb／ｃ系マウス胸腺細胞
１×108個を含むように調製した10％FCS加
RPMI−1640培地の20mlを用いて、ハイブリド
ーマ３個／ウエルとなるように96ウエルのプレ
ートに播き、培養した。増殖してくるハイブリ
ドーマを同様にハイブリドーマ１個／ウエルと
してクローニングし、更に増殖してくるハイブ
リドーマを同様にハイブリドーマ0.3個／ウエ
ルとしてクローニングした。 目的の抗体を産生するクローンは、免疫原に
用いたhHGFを抗原とするELISA法により検
索した。 かくして、所望の反応特異性を有する本発明
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ（クローンNo.OAL−Ｈ−２−14）を得た。 上記で得られたクローンNo.OAL−Ｈ−２
−14を、完全RPMI培地にて５％炭酸ガスイン
キユベーター中で、37℃にて48時間培養した。
培養液を遠心分離（3000rpm、10分）して、目
的のモノクローナル抗体（以下これを「Ｈ−２
−14」という）を含む培養上清を得た。 尚、上記抗体のサブクラスはIgG1であつた。
これはオクタロニーキツト（Serotec社製）を
用いて確認された。 前記で得たクローンNo.OAL−Ｈ−２−14
の１×106個を、予めプリスタン（pristan、
Aldrich Chemicals社製）を接種しておいた
Balb／ｃ系マウスに腹腔内投与した。10〜14
日後、蓄積した腹水を採取し、本発明抗体を含
む腹水を得た。この抗体の濃度は、約0.2〜５
mg／mlであつた。 該腹水より、IgG精製キツト〔MAPS Kit；
バイオ・ラツド社製〕を用いて、精製抗体Ｈ−
２−14を得た。 試験例 １ 96ウエルプレートの各ウエルに、免疫原として
用いたhHGFの150ｍＭ NaCl及び0.04％NaN3
含有20ｍＭトリス塩酸溶液（8.6μｇ／10ml）を加
え、４℃で24時間放置した。洗浄後、2.5％BSA
のPBS溶液を各ウエルに200μづつ入れ、４℃
で24時間以上放置してブロツクし、抗原を不溶化
したプレートを得た。 次いで、上記各ウエルに、実施例１ので得た
上清の倍々希釈液各100μを添加し、室温下に、
1.5時間振盪した。 各ウエルを洗浄後、パーオキシダーゼで標識し
たヤギ抗（マウスIgM＋IgG）抗体（ジヤツクソ
ン（Jackson Immunoresearch Lab.）社製、×
5000）100μを加え、室温、振盪下に1.5時間放
置し、洗浄後、オルト−フエニレンジアミン（25
mg／10ml）溶液100μを加えて、20〜30分間放
置後、2N−H2SO4100μを添加して反応を停止
させた。 得られた反応液の492nｍでの吸光度を、タイ
ターテツク・マルチスキヤン（フローラボラトリ
ーズ社製）により測定した。 その結果を第１図に示す。 図において横軸は本発明抗体を含む培養上清の
希釈倍数を、縦軸はOD492を示す。 試験例 ２ （ウエスタン・ブロテイング） この試験は、タウビンら（H.Towbin et al.）
の方法に準じた〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、
4350−4354（1979）〕。 即ち、hHGFをSDS−PAGE（参考例１に記載）
後、ゲルをニトロセルロース膜と合せ、ゲルのあ
る側を−極、ニトロセルロース膜のある側を＋極
として電流を流し、ゲル上で泳動された蛋白質を
ニトロセルロース膜にブロツトした。ブロツトさ
れたニトロセルロース膜を２％BSA含有PBS液
に浸してブロツキングを行なつた後、一次抗体と
して前記実施例１ので得た精製抗体Ｈ−２−14
を反応させた。洗浄後、二次抗体とするパーオキ
シダーゼで標識したヤギ抗（マウスIgM＋IgG）
抗体（ジヤクソン社製）を添加して、２％BSA
含有PBS液中で反応させた。次いで50ｍＭトリ
ス塩酸（PH7.5）＋0.2M NaCl液を用いてニトロセ
ルロース膜を洗浄後、ワーキング溶液［50ｍＭト
リス塩酸（PH7.5）＋0.2M NaClの31ml、３mg／ml
４−クロロナフトールのメタノール溶液の５ml及
び30％H2O2水溶液の25μの混合液］を加えて、
発色させた。 上記ウエスタン・ブロツテイングの結果を第２
図に示す。 第２図において、１の３レーンは、非還元条件
下のSDS−PAGEでの結果を、２の３レーンは還
元条件下での結果を夫々示し、各結果におけるレ
ーンＡは参考例１で得たhHGFを、レーンＢ及び
レーンＣは参考例１と同様にして得た別ロツトの
hHGFを夫々示す。 該図より、本発明抗体−２−14は、ロツトの別
を問わず、非還元条件下のSDS−PAGEにより泳
動されたhHGF（２本のバンド共）に反応性を有
し、また還元条件下のhHGFには反応しないこと
が確認された。 試験例 ３ （吸収試験） 抗原（hHGF液）と抗体（実施例１ので得た
Ｈ−２−14を含む培養上清の10倍希釈液）とを、
37℃で一夜反応させた。この溶液に、プロテイン
Ａを固相化したゲル（バイオ・ラツド（Bio−
Rad.）社製）を添加し、プロテインＡにモノク
ローナル抗体を結合させ、遠心分離してこのゲル
を落し、上清を回収した〔J.Biol.Chem.、260、
7219−7225（1985）〕。 この上清のHGF活性を、参考例１に準じて125I
−durd取込み〔Biochem.、23、6295−6299
（1984）〕により調べた。 結果を第３図に示す。 図において、横軸はHGF活性測定に供した上
記上清（サンプル）の量（μ）を、縦軸は125I
−durdの取込み量（cpm×10-4：サンプル非添加
時のブランク値を引いた結果）を夫々示し、図中
曲線１は上記試験の結果を、曲線２は上記試験に
おいて抗体の代りに同量のRPMI−1640培地を用
いた対照の結果を夫々示す。 上記試験結果から、本発明抗体Ｈ−２−14は、
hHGFに特異な反応性を有する抗体であることが
判る。
第１図は抗体希釈による、本発明抗体とhHGF
との反応性を調べた結果を示すグラフである。第
２図はウエスタン・ブロツテイングによる、本発
明抗体とhHGFとの反応性を調べた結果を示す図
面に代る写真である。第３図は吸収試験による、
本発明抗体とhHGFとの反応性を調べた結果を示
すグラフである。
との反応性を調べた結果を示すグラフである。第
２図はウエスタン・ブロツテイングによる、本発
明抗体とhHGFとの反応性を調べた結果を示す図
面に代る写真である。第３図は吸収試験による、
本発明抗体とhHGFとの反応性を調べた結果を示
すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 非還元条件のSDS−PAGEにより泳動される
分子量約88000及び約83000の２つのバンドのヒト
肝細胞増殖因子に反応性を有することを特徴とす
るヒト肝細胞増殖因子に対するモノクローナル抗
体。 ２ 非還元条件のSDS−PAGEにより泳動される
分子量約88000及び約83000の２つのバンドのヒト
肝細胞増殖因子に反応性を有するヒト肝細胞増殖
因子に対するモノクローナル抗体を用いることを
特徴とするヒト肝細胞増殖因子の測定方法。 ３ 非還元条件のSDS−PAGEにより泳動される
分子量約88000及び約83000の２つのバンドのヒト
肝細胞増殖因子に反応性を有するヒト肝細胞増殖
因子に対するモノクローナル抗体を有効成分とす
ることを特徴とする肝疾患診断剤。 ４ 非還元条件のSDS−PAGEにより泳動される
分子量約88000及び約83000の２つのバンドのヒト
肝細胞増殖因子に反応性を有するヒト肝細胞増殖
因子に対するモノクローナル抗体を用いてヒト肝
細胞増殖因子を精製するヒト肝細胞増殖因子の精
製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-159149A JPH013199A (ja) | 1987-06-25 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-159149A JPH013199A (ja) | 1987-06-25 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS643199A JPS643199A (en) | 1989-01-06 |
| JPH013199A JPH013199A (ja) | 1989-01-06 |
| JPH0560359B2 true JPH0560359B2 (ja) | 1993-09-02 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045534A (ja) * | 1983-08-22 | 1985-03-12 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 肝実質細胞増殖因子 |
| JPS6245530A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-02-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 肝実質細胞増殖因子 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045534A (ja) * | 1983-08-22 | 1985-03-12 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 肝実質細胞増殖因子 |
| JPS6245530A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-02-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 肝実質細胞増殖因子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS643199A (en) | 1989-01-06 |
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