JPS6245530A - 肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ
ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ　：　ＨＧ　Ｆ　）　、
詳しくは肝実質細胞を生体外（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　）
で培養でき、これにより該細胞の維持、増殖を可能とす
る新しい生理活性を有する蛋白質に関する。

従　　来　　の　　技　　術 肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の原性器
官である。これは主に各秤栄養素（糖Ｙ１、蛋白質、脂
質、ビタミン、ホルモン等）の処理（代１）、貯蔵、解
毒、分解、排泄等の重要な多種の機能を兼ね備えており
、なかでも生体内中間代謝の中心的役割を果たすことが
知られている。

また該肝臓の機能は、肝臓を構成する各肝実￥ｉ細胞が
夫々担っていることが知られている。しかるに生体内（
ｉｎ　　ｖｉｖｏ）において肝臓は各種のホルモンをは
じめとする極めて複雑な環境下におかれており、これを
構成する上記肝実質細胞の拡能専の研究は甚だ困難であ
る。

従って本発明者は、上記肝実質細胞を、生体内ど同等の
機能を維持した状態で、単純な生体外の系で再現するこ
とができれば、上記した肝機能の研究、あるいは種々の
ホルモン類、薬物等の肝実質細胞に対する作用等の研究
に極めて有用であるとの観点から、上記肝実質細胞を、
安定に継代培養できる生体外培養系の確立を目的として
鋭意研究を重ねてきた。

しかしながら、肝実質細胞は近年組織培養技術の急速な
発展に伴い、既に確立された各種の株細胞が活発に増殖
する哺乳動物血清の存在下でも、全く増殖が認められず
、通常約１週間で脱落が起り、その生体外長期継代培養
は不可能であった。

また本発明者らの研究によって、公知の各種株細胞の増
殖を支持する因子（ｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ）等
、例えば線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　
　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ　；　Ｆ　Ｇ　Ｆ　、　Ｇ
ｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ　、、Ｊ　。

（３ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５０．２５１５　（１９７
５））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ　−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：　ＰＤＧＦ
、　Ｒｏｓｓ　、　Ｒ，、ｅｔ　　ａｌ、ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、７１　、１
２０７（１９７４＞）、ソマトメジン（ｓｏｍａｔｏｍ
ｅｄｉｎｅｓ　；Ｖａｎ　　Ｗｙｋ、Ｊ、　　Ｊ、ｅｔ
　　ａｔ、、Ｒｅｃ、　　Ｐｒｏｇ。

ｔ−１ｏｒｍｏｎｅ　　Ｒｅｓ、３０，２５９　　（１
９７４））　　、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉ
ｎ　１ｉｋｅ　　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：　ＩＧＦ
ｌＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　、　Ｅ、　ｅｔ　　ａｔ
、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５３．２７６９（１９
７８）、マルチプリケーション　ステイムレーティング
　アクティビティ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔ
ｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　ａｃｔｉｖｉｔｙ　：　Ｍ　Ｓ
　Ａ　、　ｏ　ｕｌａｋ、　ｘ　。

Ｃ，ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　、　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、　８上。

１５３（１９７３））、　トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉ
ｎ　）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　
）等は、いずれも上記肝実質細胞の増殖には、効果を奏
しえないことが確認された。僅かにインスリン（ｉｎｓ
ｕｌｉｎ　）及び表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　
ｇｒｏ＊ｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ、　Ｃａｒｐｅ
ｎｔｅｒ、　Ｇ、　ｅｔ　　ａｔ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４８，１９３　（１９７９））に、
肝実質細胞のＤＮＡ合成の促進活性が認められたが、こ
れ等もまたその利用により上記肝実質細胞の生体外継代
培養は困難であった。

本発明者らは引続く研究において、肝実質細胞は、上記
の通り血清自体の存在下では全く増殖し得ないにかかわ
らず、該血清中に含まれるある特定の蛋白成分の存在下
において生体外で極めて良好に増殖し、継代培養が行な
い得ることを見い出し、該特定の血清成分の分離に成功
し、この知見に基づ〈発明を先に完成したく特開昭６０
−４５５３４号公報）。

発明が解決しようとする問題点 更に本発明者らは引続き鋭意研究を重ねた結果、吐乳動
物の血小板より、特定の蛋白質性の肝実質細胞増殖因子
を単離するに成功し、これが生体外において肝実質細胞
を極めて良好に増殖させる活性を有することを見出し、
この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 すなわち本発明は、下記理化学的性質及び生理活性を有
する塩基性蛋白質であることを特徴とする肝実質細胞増
殖因子く以下ｒＨＧＦＪと呼ぶ）に係る。

ａ　）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約２７００
０である、 ｂ）陽イオン交換樹脂（モノＳ；ファルマシア社製）及
びヘパリンに吸着する、 ｃ）７０〜１００℃、２０分間の加熱処理により肝実質
細胞増殖活性が失活する、 ｄ）１Ｎ酢酸水溶液による２０℃、５時間の’Ｂ＝によ
り肝実質細胞増殖活性が失活する、ｅ）トリプシン消化
（１０μｇ／噌、２時間、３７℃）により肝実質細胞増
殖活性が失活する、ｆ）肝実質細胞を生体外において増
殖させる活性を有する。

本発明のＨＧ　Ｆは、例えば哺乳動物の血小（々より高
収率で単離され、且つ上記特性を有する点において特徴
付けられる。従来、吐乳動物の血小板由来の物質につい
ても各種の研究がなされているが、該血小板由来物質中
に上記肝実質細胞の増殖活性を有する因子が存在するこ
とは全く知られておらず、勿論かかる因子を血小板より
分離した例は皆無であり、また現在までに血小板より分
餌８れた既知の物質は、いずれも上記活性を有していな
い。更に、前記の血小板に由来するＰＤＧＦは、ｔｌ維
芽細胞、例えばＢａ１ｂ　１０３Ｔ３細胞を生体外で増
殖させる活性を有することにより特徴付けられるが、本
発明のＨＧＦは該活性を有していない。

本発明ＨＧＦの上記特性及びその他の性状については、
後記実施例において詳述する。

本・発明のＨＧＦは急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、劇症
肝炎等の肝疾患の治療薬や創傷治療薬として、また上記
各疾忠の診断薬として有用である。更に該ＨＧＦの利用
によれば、ヒトをはじめとして各種動物由来の肝実質細
胞を、該ＨＧＦの存在下に生体外で極めて容易に増殖、
維持することができ、かくして増殖、維持される肝実質
細胞は、例えば肝機能等の基礎的研究用に、また各種ホ
ルモン若しくは薬剤等の肝実質細胞に対する作用の研究
用に、肝疾患治療薬等のスクリーニング試験用に、更に
発癌試験用及び肝炎ウィルスの生体外培養における宿主
細胞としても極めて有用である。本発明はかかる有用な
生理活性物質を提供するものである。

以下、本発明のＨＧＦの製造方法につき詳述づる。

本発明ＨＧＦは、例えば哺乳動物の血小板より効率よく
、しかも高収率で単離することができる。

ここで原料として用いられる哺乳動物の血小板どしては
、特に限定はなく例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツ
ジ、ウサギ、マウス等に由来する血小板をいずれも利用
することができる。之等の血小板は、その起源とする哺
乳動物の血液より、常法に従い分離される。

本発明ＨＧＦは、上記により分離された血小板に、好ま
しくは適当な溶剤中で血小板凝集活性化物質を作用させ
て目的とする１＠Ｇ　Ｆを血小板外に放出させ、これを
精製することにより単離される。

ここで用いられる血小板凝集活性化物質としては、公知
のもの、例えばコラーゲン、トロンビン、１−Ｏ−ヘキ
サデカノイル−又は１−○−オクタデカノイルー２−０
−アセチル−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン等の血
小板活性化因子（ＰＡＦ）等を例示できる。また溶媒と
しては、血小板を破壊しない等張渡であればよく、その
具体例としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）等を例示できる。

ＨＧＦの精製は、該ＨＧＦの物理的、化学的性質を利用
した各種の分離手段により実施することができる。該方
法としては具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処
理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル清
適）、遠心分離、電気泳動、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、透析法、こ
れらの組み合せ等が挙げられる。特に好ましい精製手段
の一例としては、陽イオン交換クロマトグラフィーとヘ
パリンアフイニテイクロマトグラテイーとを組合せた方
法を例示できる。

該陽イオン交換クロマトグラティーに用いられる担体と
しては、蛋白分離のために用いられている通常の各種陽
イオン交換クロマトグラフィー用の担体をいずれも用い
ることができる。その具体例としては、例えばＣＭ−セ
ルロース（ワット７ン社！’ｌ）　、ＣＭ−セファデッ
クス（ファルマシア社’ｌ）、Ｐ−セルロース（ワット
マン社製）、ＣＭ−トＥパール（ＣＭ　−Ｔ　ｏｙｏｐ
ｅａｒｌ、東洋ソーダー社製）、ＳＰ−トヨバール（Ｓ
Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、同上社製）、モノＳ　（Ｍｏ
ｎｏ　Ｓ、ファルマシア社製）等の陽イオン交換樹脂を
例示できる。

ヘバリンアフイニテイクロマトグラフイーに用いられる
担体としては、例えばセルロース、セファデックス、セ
ファロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等の各
種の不溶性担体にヘパリンを共有結合により不溶化させ
た担体であればいずれも使用できる。

上記精製手段により精製された本発明のＨＧ　Ｆは、通
常の蛋白質の純度検定手段、例えば５Ｏ３−ＰＡＧＥ、
逆相高速液体クロマトグラフィー害により均一な単品で
あることが確認される。

以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１ ＜ＨＧＦ活性の測定〉 ウィスター系雄ラット（１８０〜２００（＋　）を用い
、コラーゲン還流法（Ｔ　ａｎａｋａ、）（、ｅｔ　　
ａｔ、。

Ｊ、　３ｉｏｃｈｅｍ、　　（Ｔｏｋｙｏ）　、　８４
．９３７〜９４６　（１９７８））により肝実質細胞を
分離、調製した。この肝実質細胞を５％牛血清及び１０
−’Ｍゼインリンを添加したウィリアムスＥ培地（フロ
ーラボラトリー社製）に懸濁させ、１２ウェル−マルチ
プレート（リンブロン社製）に３．３Ｘ１０’個／　ｃ
ｍ２の低濃度でまき込み、５％炭酸ガス及び３０％酸素
ガスの存在下で培養した。培養４時間後、培地を５％牛
血清及び５×１０−７Ｍデキサメサゾンを含むウィリア
ムスＥ培地に変換し、同時に所定量の被検試料〈本発明
ＨＧＦ又は他の各種増殖因子〉を添加した。２０時間後
、更に同−培地交換及び試料の添加を行なつた。

１２時間後、３日−チミジンの２．５μＣ１／ｍＤ　（
５４，２Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌ　）を添加し、２４時間培
養した。尚、上記３Ｈ−チミジンによるラベルの１５分
前にアフイデイコリンの５μ（Ｊ／ｍＱを添加した群を
コントロール群とした。上記２４時間の培養によるラベ
ル後、細胞をＰＢＳで洗い、冷１０％トリクロル酢酸（
ＴＣＡ）水溶液で固定した。細胞を１ウェル当り０．５
ｍＱの１Ｎ水酸化ヅトリウム水溶液により可溶化し、一
部をとって蛋白質をローリ−法に従って測定した。残液
にＴＣＡを２０％となるように添加し、ＴＣ△不溶性画
分を遠心沈澱により集め、５％ＴＣＡ水溶液で洗浄後、
１０％ＴＣＡ水溶液１鵬を加え、９０℃で１５分間煮沸
し、上清画分の放射能をトルエン−エタノール系シンチ
レータ−により測定した。

被検試料により肝実質細胞ＤＮＡに取込まれた３日−チ
ミジン吊をコントロールとのカウントの差として求め、
これを肝実質細胞１ｍｏ蛋白員当りに換算してＤＮＡ合
成活性（ｄｐｍ　／ｍｇｉ白）とし、これを被検試料の
ＨＧＦ活性の指標とした。

尚、ＨＧＦ活性を単位（Ｕ）で示す場合は、同一試験に
おいてＥＧＦ２０ｎＭ鵬を用いた場合のＤＮＡ合成活性
（ＥＧＦは該用量で最大活性を示す）の５０％に相当す
る活性を１単位として定義する。

参考例２ ＜ＰＤＧＦ活性の測定〉 ＰＤＧＦ活性の測定は、Ｂａ１ｂ　／ｃ　３Ｔ３細胞の
ＤＮＡ合成促進活性により行なった。

即ち、該３Ｔ３細胞を、１０％０％牛血清むダルベツコ
改質ＭＥＭ培地（ＤＭＥ、日本産業社製〉に懸濁させ、
１２ウエルーマルヂプレートに１．２５Ｘ１０’個／ｍ
！２の濃度でまき込み、５％炭酸ガスの存在下で４〜５
日培養した。次いで０．５％牛血清を含むＤ　Ｉｖｌ　
Ｅに培地交換し、同時に所定量の被検試料を添加して２
０時間培養後、３日−チミジン５４．２Ｃｉ　／ｍ　ｍ
ｏｌを添加（２，５μＣｉ／鴨）し、更に４時間培養を
続けた。尚、上記３日−チミジンによるラベルの１５分
前にハイドロキシウレア２５ｍ〜１を添加した群をコン
トロール群とした。上記４時間の培養によ。

るラベル後、細胞をＰＢＳで洗い、冷１０％ＴＣＡ水溶
液で固定し、更に５％ＴＣＡ水溶液で２回洗浄した。

細胞を１ウェル当り０．５ｍＧの０．１Ｎ水す春化ナト
リウム水溶液によって可溶化し、その放）１能をトルエ
ン−エタノール系シンチレータ−によりヨ陽定した。被
検試料により３Ｔ３細胞ＤＮＡにとり込まれた３日−チ
ミジン吊をコントロールとのカウントの差として求め、
これをウェル当りに換のしてＤＮＡ合成活性（ｄｌ）ｍ
／ウェル）とし、これを被検試料のＰＤＧＦ活性の指標
とした。

実施例１ ■　１００匹のラット（２００〜４００（＋　）から採
血した血液を遠心分離（２００Ｘｇ、１５分）して上清
を得、これを更に遠心分子ｆｌ（２５００ＸＱ、１５分
）して血小板を沈漬として得た。これをリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）にて２回遠心洗浄して、９９％以上の
純度の血小板を得た。これをＰＢＳに１Ｘ１０”個／鵬
の濃度に懸濁させ、２単位／鵬のトロンビン（シグマ社
製）の存在下に３７℃で１５分間インキュベートして、
血小板凝集を誘発させた。

凝集完了後、血小板懸濁液に、フェニルメチルスルホニ
ルフルオリド（ＰＭＳＦ）を最終濃度１ｍＭとなるよう
に加え、遠心分離（１５０００ｘ９．１０分間）して上
清を得た。以下これを「血小板遊出液」という。該血小
板遊出液のＨＧＦ活性を下記第１表に示す。

第　　１　　表 被検試料　　　添加ｆｆｉ　　　　ＤＮＡ合成活性（ｄ
ｐｉｌ／ｍｇ蛋白） 無添加　　　　　　　　　　　　　７１００インスリン
　　１０−７ ＋ＥＧＦ　　　　２０ｎａ／ｍｆ２　　１０２７００血
小板遊出液　８０μ！ＩＩ／ｍ！２　　６７４００■　
上記■で得た血小板遊出液を、あらかじめ０．１５ＭＮ
ａ　ＣＱ　、１０ｍ　ＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタンスルホンＭ　（ＨＥＰＥＳ）
及び２ｍＭＣａＣＱ２を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐ　Ｈ＝８．５）で平衡化したモノＳカラム（Ｍｏ
ｎｏ　Ｓ　：ファルマシア社製、カラムサイズ１Ｘ１０
Ｃｍ）の陽イオン交換クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ；
ファルマシア社製）に付し、同緩衝液にて洗浄後、０．
１から１．０ＭＮａ　ＣＱの直線濃度勾配により溶出さ
せた（流速６０ｍ１２／ｈｒ、２ｍＱ／チューブ）。そ
’７）　ＦＡ果を第１図に示す。

図において縦軸（１）は２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ
　２８０）を、（２）はｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆ活性（ＤＮＡ合
成活性）を、（３）はＰＤＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）
を、また（４）はＮａＣ９８度を各々示し、横軸はフラ
クションＮｏ、を示す。

該図よりＨＧＦは、約０．６８ＭのＮａ０９５度（フラ
クションＮｏ、２６〜３０）に溶出され、ＰＤＧＦとは
明確に区別されることが判る。

■　上記■のフラクションＮｏ、２６〜３０の画分を、
１　ＮＨＣＱにてｐＨ７，５に調製し、蒸留水にて３倍
希釈した。これを０．３ＭＮａ　ＣＱを含む１０ＩＩＩ
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝７．５）で平衡化した
ヘパリン−セファロースＣＬ−６８（ファルマシア社製
、ベッドボリウム２．２ｍｆ２）に付し、同緩衝液で洗
浄後、０．３から２．０ＭＮａＣＱの濃度勾配溶出〈流
速２０ｍＱ／ｈｒ１．１　ｍＵ／チューブ）を行なった
。結果を第２図に示す。

図において（１）は２１５ｎｍにおける吸光度（Ａ　２
１５）を、（２）はＨＧＦ活性（ＤＮＡ合成活性）を、
（３）はＮａＣＱ濃度を各々示し、横軸はフラクション
Ｎｏ、を示す。

該図よりＮａＣ（！１度約ＩＭ（フラクションＮｏ、３
７〜４０）にＨＧＦを得た。

■　上記■〜■の精製工程の結果を下記第２表に示す。

第　　２　　表 精製工程　　　■血小板　■で得た　■で得た遊出液　
　ＨＧＦ　　　ＨＧＦ 蛋白量（ｍｇ）　　　１５０　　　０．５　　　０．０
０４７総ＨＧＦ活性 ＜　Ｕ　）　　　４６４９　　　２９４１　　　　１８
２３比活性 （Ｕ／ｍｃ＋蛋白）　　　３１　　　５８８２　　　３
８４６００精製度　　　　　１　　　１８８　　　１２
４０８回収率〈％）　　　１００　　　　６３　　　　
　３９また上記各工程で得られたＨＧＦの肝実質細胞増
殖に与える効果（ＨＧＦ活性）の用子依存効果を下記第
３表に示す。

第　　３　　表 被検試料　　　添加＠　　　　　ＤＮＡ合成活性１０μ
ｇ／陽陽２　　　１２５００血小板遊出液　２０μｇ／
噌　　　１６５００９０μ（Ｊ　／ｍＱ　　　　３２５
０００．２μＧ　／ｍ１２　　　２２５００■で得たＨ
ＧＦｏ、４μｇ／噌　　　　３００００１．４μｇ／ｍ
１２４７０００ ６　ｎｇ／　ｍＱ　　　　　２８６００■で得た）−Ｉ
Ｇ　Ｆ　１２μｇ／ｎ［６２５００２４ｒ＋ｇ／　ｍ１
２　　　　５６２００また上記■で得たＨＧＦと、ＥＧ
Ｆ及びインスリン（ｉｎｓ）のＨＧＦ活性を下記第４表
に示す。

第　　４　　表 被検試料　　　添加量　　　　ＤＮＡ合成活性−（ｄｐ
ｍ／ｍ（＋蛋白） 無添加　　　　　　　　　　　　　　７１００Ｉｎｓ　
　　　　　１０−７Ｍ　　　　　１５３００Ｅ　Ｇ　Ｆ
　　　　　２０ｎｑ／ｍＱ　　　　　１０８３００Ｉ　
ｎｓ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　　　　　　　　　　　陽３４００
ＨＧ　Ｆ　　　　　　５　ｎｇ／　ｍＱ　　　　　６７
４００１　ｎｓ＋　ＨＧ　Ｆ　　　　　　　　　　　７
３９００Ｅ　Ｇ　Ｆ　＋　ＨＧ　Ｆ　　　　　　　　　
　１７０２００１　ｎｓ＋　Ｅ　Ｇ　Ｆ　＋ ＨＧ　Ｆ　　　　　　　　　　　　　　２１２９００第
４表より、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びｌｎｓの効果は、各々相
加的であることが判る。

■　上記■で得たＨＧＦの２００μＱを、０．１（ｖ　
／ｖ　）％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び１０（ｖ
／ｖ）％のアセトニトリル水溶液で平衡化したプロＲＰ
ＣＨＲ５１５カラム（Ｐ　ｒｏＲＰ　ＣＨＲ５１５（Ｃ
８）　、ファルマシア社製）の逆相クロマトグラフィー
（ＦＰＬＣ１ファルマシア社製）に付し、平衡化液（Ａ
液）からアセトニトリル５０（Ｖ／Ｖ）の０．１　（ｖ
／ｖ　）％ＴＦＡ液（Ｂ液）までの直線濃度勾配（９０
分）により溶出させたく流速３０−／ｈｒ、１ｍ１２／
チユーブ）。

その結果を第３図に示す。

図において（１）は２１５ｎｍにおける吸光度（Ａ　２
１５）を、（２）はＢ液の百分率（８％）を示し、横軸
はフラクションＮｏ、である。

該図より、上記■で得たＨＧＦは、単一の蛋白ピークを
示し、均一であることが判る。

■　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動＜５Ｏ８
−ＰＡＧＥ） １２．５％アクリルアミドを用い、ラムリらの方法（ｌ
　ａｅｍｍｅｌｉ　ｅｔ　　ａｔ、ＪＪａｔｕｒｅ　、
　２２７　。

６８０−６８５　（１９７０））に従って、上記■で得
たＨＧＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動後、ゲル
を４０％メタノール−１０％酢酸で９０分にて固定化し
、１０％エタノール−５％酢酸で洗浄後、銀染色を行な
った。

ト＋ＧＦは、単一のバンドとして染色され、その相対移
動度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｖｉｌ目ｙ）より、約２
７キロダルトン（ＫＤ）の分子量を有すると推定された
。

その結果を第４図に示す。

図において・は）−ＩＧＦを示し、○の１〜６はそれぞ
れ以下の分子量を有する分子量マーカーを示す。

０１・・・フォスホリラーゼｂ　　：９４ＫＤＯ２・・
・ＢＳＡ　　　　　　　　；６７ＫＯ○３・・・オバア
ルブミン　　　；４３ＫＤ○４・・・炭酸脱水酵素　　
　　；　３０ＫＤ○５・・・大豆トリプシンインヒビタ
ー：２０．１ＫＤ ○６・・・α−ラクトアルブミン；１４．４ＫＤ■　Ｈ
ＧＦの安定性試験 前記■で得たＨＧＦを、５ｎｑ蛋白偵／閾に調製し、以
下の処理によるＨＧＦ活性の変化を調べた。

０熱処理　；７０°Ｃｌ２Ｏ分処理した。

Ｏｖｉ処理　；酢酸を１Ｎとなるように加え、２０℃、
５時間処理した。

Ｏトリプシン処理；トリプシン（シグマ社製）を１０μ
ｇ／噌となるように加 え、３７℃、２時間処理後、 ＰＭＳＦを１ｍＭとなるよう に加えて反応を停止した。

結果を下記第５表に示す。なお、第５表におけるラベリ
ングインデックスは、肝実質細胞の増殖を反映する。該
インデックスとは、前記参考例１において２４時間の培
養によるラベル後、細胞を冷ＰＢＳで２回数洗浄し、固
定化（ジエンダー溶液、５分）後、サクシＮＲ−Ｍ２　
（小西六写真工業社製）でコートし、ラジオオートグラ
ムの調製に１０日間感光させ、細胞をエオシン染色後、
５０個の細胞を測定し、３Ｈ−チミジンでラベルされた
核数（％、１ａｂｅｌｌｅｄ　　ｎｕｃｌｅｉ）の測定
値により表わされる。

第　　５　　表 試料　　　ＤＮＡ合成活性　　ラベリングＮ　Ｏ，（ｄ
ｐｍ　／ｍＱ蛋白）インデックス（％）無添加　　　１
７５００　　　　　５．３５ＧＦ 未処理　　４６４００　　　　１４．８８熱処理　　　
０．００　　　　　１．９６酸処理　　　ｏ、ｏｏ　　
　　　　ｏ、ｏ。

トリプシン 処理　　　　０．００ 一一一一一一一一−−−−−−−−−−−矢一工四）−
一

【図面の簡単な説明】

第１図はモノＳカラムを用いた陽イオン交換クロマトグ
ラフィーによる本発明ＨＧＦ及び他の因子の溶出曲線を
示すものである。第２図はヘパリン−セファロースＣＬ
−６Ｂを用いたヘパリン親和性カラムクロマトグラフィ
ーによる本発明ＨＧＦの精製を示すグラフである。第３
図はプロＲＰＣ）−ＩＲ５１５カラムを用いた逆相クロ
マトグラフィーによる本発明ＨＧＦの溶出曲線を示すも
のである。第４図は５ＤＳ−ＰＡＧＥによる本発明ＨＧ
Ｆの推定分子量を求めたグラフである。 （以　上） 二−−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記理化学的性質及び生理活性を有する塩基性蛋
   白質であることを特徴とする肝実質細胞増殖因子。 ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約２７０００
   である、 ｂ）陽イオン交換樹脂（モノＳ；ファルマシア社製）及
   びヘパリンに吸着する、 ｃ）７０〜１００℃、２０分間の加熱処理により肝実質
   細胞増殖活性が失活する、 ｄ）１Ｎ酢酸水溶液による２０℃、５時間の処理により
   肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｅ）トリプシン消化（１０μｇ／ｍｌ、２時間、３７℃
   ）により肝実質細胞増殖活性が失活する、 ｆ）肝実質細胞を生体外において増殖させる活性を有す
   る。