JPS6043395A - エリスロポエチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト肝細胞癌よりエリスロボエチソを製造する
方法に関する エリスロポエチンは腎で産生されると考えられている分
子量約８６，０００の糖蛋白質で、赤血球系へと方向づ
けられた幹細胞に働き、前赤芽球に分化させることによ
り赤血球産生を促進させ、赤血球の産生量を調節する作
用をもつ一柵のホルモンであり、赤血球数を一定に保つ
のに必須の物質である。

一般に、生体が貧面杖態に陥いると、貧血の程度に応じ
て血中エリスロポエチン１度が増加し、貧血を改善させ
ようとする生体の恒常性機構が働く。しかし、慢性腎不
全に伴なう貧血症においては、腎の破壊によりエリスロ
ポエチンの産生が認められず、したがって血中エリスロ
ポエチン濃度は増加しない。このため、慢性腎不全患者
に不足のエリスロポエチンを補う意味でヱリスロボエチ
ンを授与すれば、慢性腎不全に伴なう貧血は改善される
ことが期待されており、エリスロポエチンは臨床的に慢
性腎不全に伴なう貧血の治療薬としての用途を有するも
のである。

慢性腎不全の患者の多くは難治性の貧血症を併発してお
り、このため、慢性腎不全に伴う貧血の治療薬としてエ
リスロボエチンが大１１　ニ供給されることが切望され
ているが、現在のところエリスロポエチンの大数純化は
成功していなＬ）、ｌ 従来、エリスロボエチンの製造法としては再生不良性貧
血患者の尿から製造する方法（Ｊ。

Ｂｊｏｌ、　Ｃｂａｍ、　２５２巻５５５８頁１９７７
年）、貧血動物（例えばヒツジ）の血”ｔから精製する
方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　
ＵＳＡ　５８巻６９７頁１９７１年）、ヒト腎細胞癌の
細胞培養物から製造する方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
　９９巻５０４頁、１９７６年及び特開昭５４−５５７
９０号公報）が知られているが、エリスロポエチンを貧
血症の治療薬きしてヒトに投与することを考えると、貧
血動物の血壊を原料とすることは抗原性の点で問題があ
り、また再生不良性貧血患者尿は安定的な大礒確保が困
難であるし、ヒト腎細胞癌の組織培養物を原料とする方
法においてもその産生量は十分とはいえず、エリスロボ
エチンの大嵐純化を困難にしている。

本発明者らはエリスロボエチンの大は生産を可能にすべ
く、鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝細胞癌の細胞培養物
中に高濃度のヒトエリスロポエチンが産生きれているこ
とを見い出し、本スロポエチンを採取するときからなる
エリスロホエチンの製造方法に関するものである。

従来、ある種の肝細胞癌をヌードマウスに移値したとこ
ろ、エリスロポエチン産生を認めろことがあることは知
られている（日本血液学会雑誌４２巻　２４１頁　１９
７９年）が、肝細胞癌を細胞培養した場合のエリスロボ
エチン産生性については全く知らねておらず本発明ＩＪ
肝細胞癌を細胞培養しその培養物からエリスロボエチン
を回収する方法をはじめて提供する゛ものである。

本発明（７）［料であるエリスロボエチン産生細胞は肝
癌患者より摘出された１ｌＩｌｌＮ細胞であって、該細
胞が増殖しうる動物に継代移植して維持することができ
るものである。

このような動物にヒト肝細胞癌を移植すると、該細胞は
次第に増殖し腫瘍を形成する。形成した腫瘍を動物より
摘出１７、トリプシンとコうゲナーゼの酵素液で処理し
腫瘍細胞を分離した後、インビトロで培養することによ
り培養液中に多量のエリスロボエチンを産生せしめるこ
とができる、ここで注目すべきことは、該細胞を移植さ
れた動物は、そのヘマトクリット値からみると典型的な
多血症を示しているとはいえず、がっ実際その面浦中に
エリスロポエチン活性は検出できないにもかかわらず、
形成した腫）醪より腫瘍細胞を分離しインビトロ培養す
ることによりはじめて多量のエリスロボエチンの産生が
なされることである、即ち、ヒト肝細胞癌を移植された
動物中ではエリスロポエチンの産生は明確ではなかった
が、これをインビトロの培養系に移すことによって、は
じめて、エリスａポエチンの産生が増大することが本発
明により明らカドｊｒ　’）、ヒト肝細胞癌からのエリ
スロボエチンの採取製造が可能になった。ヒト肝細胞癌
を維持する動物としては、免疫反応の弱い新生期のう１
ソト、マウス、ハムスター、モルモット等（５） また成長したものであっても工、ソウス曽照射や免疫抑
制剤等を投与して免疫能を弱めたもの、更には成長して
も先天的に免疫能の弱いヌードマウス、ヌードラ・ソト
等が選ばれる。細胞培養は、一般に動物細胞の培養に使
用される培地に必要に応じ哺乳動物の血清を加えたもの
を用い、２〜１０％の炭酸ガスを導入１．た湿度１００
％の大気中で温度８Ｏ−４ｏ’ｃのもとで行なうことが
できる。培養物からのエリスロボエチンの採取は公知の
単離精製法、例えば塩析、透析、限外沖過、凍結乾燥な
どにより可能であり、更にイオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル沖過、アフィニティウロマトグラフィーＩｔ気
泳動等を組合せることにより高度に精製することができ
る。以上のようにして、本発明で得らねたエリスロポエ
チンは、再生不良性貧血患者尿より精製したエリスロボ
エチンを用いて作製したラット抗エリスロボエチン血清
によって中和され、ヒトエリスロポエチンであることが
確認されたう次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
す（６） るが、本発明がこの実施例のみに限定されろものでない
ことはいうまでもない。

１力月後癌塊が２−３ｇ程度の大きさに成長した所で無
菌的に摘出し、メスで数ミリ角に細切しｊ、：、、これ
を２価金属イオンを除いたリン酸緩衝液中で数回洗浄し
、血液及び大部分の死細胞と細胞や組織等の破片物粒子
を除いた後、０．１％コラゲナーゼで処理し、分離して
くる細胞を集めた。更に０．１％トリプシンを含むイー
グルＭＥＭ培地で処理して、前記コラゲナーゼ処理によ
って分離せず強く組織に結合して残った細胞を分離した
１以上の操作によって生細胞のみをきわめて高率に回収
することに成功しｔこ、　７５　ｒｎｔ　の培養フラス
コに１０％牛脂仔而浦面　Ｆｅ＋、ａｌ　ｃａｌ「ｓｅ
ｒｕｍ：以下ＦＣ］８と絡記）添加イーグルｈＩ　Ｅ　
Ａｆを入れ、これにＬ配性細胞を加え、５％の炭Ｏガス
を導入したインキュベーター内で温度３７°Ｃ１湿度１
００％の条件のもとに培養を行ったっ培養後の培養液を
水に対して透析した後、凍結乾燥して粗エリスロボエチ
ン粉末を得た。

エリスロポエチン活性は福島の方法（福島幸隆、日本血
液学会雑誌４４巻、１０８Ｂ頁、１９８１年）に準じ、
０８Ｈマウス胎児肝細胞への肴本ゝ９Ｆ　ｅの取り込み
によって電縫１．た。

肝細胞癌の細胞培養開始後５日目から１１１日目での培
養液から得た粗エリスロボエチン粉末中のエリスロポエ
チン活性は、１０６細胞当たり０１単位であった。

この粉末を最初の培養液の１０倍濃度となるように水で
溶解した溶液５０μｌ　（５５ｊ　１１単位のエリスロ
ポエチンを含む）に、う・ｖ＋−抗ヒトエリスロボエチ
ン抗血清を１　μｍ　加え、４°Ｃで一晩おいた後、エ
リスロポエチン活性を測定したところ、著しいエリスロ
ボエチン活性の低下がみられ、肝癌由来腫瘍細胞による
エリスロボエチン産生が確認された。

実施例２ 実施例１と同様にヌードマウスに移植されたＩ：Ｉ　Ｐ
　−Ｉ　−Ｊ　ＯＫ癌塊より生細胞を回収し直径６０ｍ
ｍの培養シャー１／に２．５％のＦｅ２を含ムイーグル
ＭＥＭの培地を入れこれに２×１０６　個の生細胞を植
え込み５％の炭醋ガスを導入したインキュベーター内で
温度ａ７°Ｃ１湿度１００％の条件のもとに８日間培養
した。培養液を透析後凍結乾燥１１．０．４単位の粗エ
リスロポエチン粉末を得た、 （９完） −５、

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ヒト肝細胞癌を細胞培養し、その培養物からエ
   リスロポエチンを採取することを特徴とするエリスロポ
   エチンの製造法
2. （２）　ヒト肝細胞癌を動物に移植１７た後、該細胞を
   分離して細胞培養する特許請求の範囲第１第１項又は第
   ２項記載の方法