JPH0655136B2 - ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａにより形質転換されている細胞 - Google Patents

ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａにより形質転換されている細胞

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JPH0655136B2
JPH0655136B2 JP62307341A JP30734187A JPH0655136B2 JP H0655136 B2 JPH0655136 B2 JP H0655136B2 JP 62307341 A JP62307341 A JP 62307341A JP 30734187 A JP30734187 A JP 30734187A JP H0655136 B2 JPH0655136 B2 JP H0655136B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、天然ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮ
Ａ（配列）及びそれから推定された該エリスロポエチン
のアミノ酸配列を知見したことに基づくものである。本
発明は、上記知見に基づき、組換ＤＮＡ技術を利用し
た、ヒトエリスロポエチンの生産に関するものである。
背景 Ａ．遺伝物質の操作 遺伝物質とは、細胞及びウィルスの構成成分の生産をプ
ログラムしかつ誘導し、更に細胞及びウィルスにおける
応答を支配する化学物質、として広く定義することがで
きる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として知られる長鎖
高分子物質は、リボ核酸（ＲＮＡ）でプログラムされる
ある種のウィルスを除き、全ての生細胞及びウィルスに
おける遺伝物質を構成する。ＤＮＡ高分子における繰返
し単位は４つの異なるヌクレオチドであり、各ヌクレオ
チドはリン酸基がついたデオキシリボース糖に結合する
プリン（アデニン又はグアニン）又はピリミジン（チミ
ン又はシトシン）のいずれかからなる。直鎖高分子型で
のヌクレオチドの結合は、一つのヌクレオチドの５′リ
ン酸と他のそれの３′水酸基との連結による。機能的Ｄ
ＮＡは一本鎖ヌクレオチド（デオキシオリゴヌクレオチ
ドとして知られている）の安定な二重らせん結合型をな
しており、その結合はプリン及びピリミジン塩基間の水
素結合［即ち、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はグ
アニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間で起こる「相補
的」結合］による。慣習的に、ヌクレオチドはそれらの
構成成分たるプリン又はピリミジン塩基名で呼ばれ、二
重鎖ＤＮＡにおけるヌクレオチドの相補的結合（即ち、
Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ）は「塩基対」と称される。リボ核酸
は、リボース及びリン酸基と結合したアデニン、グアニ
ン、シトシン及びチミンとは別のウラシル（Ｕ）からな
るポリヌクレオチドである。
最も簡単に言うならば、ＤＮＡのプログラム機能は特定
のＤＮＡヌクレオチド鎖（遺伝子）が比較的不安定なメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）高分子に転写される過
程で一般に発揮される。一方、ｍＲＮＡは、アミノ酸か
ら構造、調節及び触媒蛋白質を形成するための鋳型とし
て機能する。このｍＲＮＡの「翻訳」過程では、ｍＲＮ
Ａ鎖に沿って個々のアミノ酸を運搬配列させて適切なア
ミノ酸配列からなるポリペプチドを形成させる小さなＲ
ＮＡ鎖（ｔＲＮＡ）の作用がある。ＤＮＡから誘導さ
れ、ポリペプチドの「発現」に関与する20個のアミノ酸
のいずれか一つのｔＲＮＡ供給及び配向のための基礎と
なるｍＲＮＡの「メッセージ」は、３つのヌクレオチド
塩基連続群たるトリプレット（三量体）「コードン」の
形になっている。ある意味では、蛋白質の形成は、遺伝
子のヌクレオチド鎖によりプログラムされた遺伝情報の
最終的「発現」形態である。
「プロモーター」ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ高分子における
遺伝子に通常は「前置」されていて、ｍＲＮＡへの転写
開始部位をなしている。「レギュレーター」ＤＮＡ配列
もまた所与のＤＮＡ高分子中の遺伝子の通常は「上流」
にあって（即ち、前置されている）、転写開始頻度（あ
るいは速度）を決定づける蛋白質と結合する。一まとめ
に「プロモーター／レギュレーター」又は「コントロー
ル」ＤＮＡ配列と称され、機能的ＤＮＡ高分子での任意
の遺伝子（あるいは一連の任意の遺伝子）に前置される
これらの配列は、遺伝子の転写（及び最終的には発現）
が生じるか否かを決するように作用し合う。ＤＮＡ高分
子の遺伝子に「後置」されてｍＲＮＡへの転写終了の暗
号を与えるＤＮＡ配列は、転写「ターミネーター」配列
と呼ばれる。
最近10年間における微生物学的操作の焦点は、それらの
ＤＮＡ中に所望の生成物に関する遺伝子暗号情報を最初
から有しておらず、あるいは（哺乳類の培養細胞におい
て）通常相当程度まで染色体遺伝子を発現させることの
ない生物を用いて、工業的及び薬学的に重要な物質を生
産しようとすることにあった。簡潔に述べると、所望の
ポリペプチド生成物の構造を特定する遺伝子が「ドナ
ー」生物から単離されるか、あるいは化学的に合成さ
れ、次いで細菌、酵母菌又は哺乳類の培養細胞のように
好ましくは自己複製単細胞生物たる他の生物に安定的に
導入されることにある。一旦これがなされれば、「トラ
ンスフォーメーション」又は「トランスフェクション」
を受けた単細胞宿主細胞内で遺伝子の発現に関与する既
存の機構は、ｍＲＮＡ転写の鋳型として外来性ＤＮＡを
用い、しかる後アミノ酸残基の連鎖に翻訳させて所望の
生成物が得られるように作用する。
選択された宿主生物の形質転換に用いられる遺伝物質の
単離、合成、精製及び増幅のための「組換えＤＮＡ」方
法論に関する技術については、特許及び文献の刊行物が
豊富にある。コーエン(Cohen)らの米国特許第4,237,224
号は、例えば、選択された外来性ＤＮＡ鎖を有する「ハ
イブリッド」ウィルス性又は環状プラスミドＤＮＡによ
る単細胞宿主生物の形質転換に関する。コーエンらの特
許方法では、まず、ウィルス性又は環状プラスミドＤＮ
Ａを酵素的に開裂して直鎖状ＤＮＡ鎖を得ることにより
形質転換ベクターを製造する。所望の生成物を暗号コー
ドする配列を通常有している選択された外来の（「外来
性」又は「異質」）ＤＮＡ鎖は、類似酵素の作用により
直鎖型とされる。直鎖ウィルス性又はプラスミドＤＮＡ
は、修復過程で作用し得る連結酵素の存在下にて外来Ｄ
ＮＡとインキュベートされ、ウィルス性又は環状ＤＮＡ
プラスミドに「つなぎかえられた」選択的外来性ＤＮＡ
断片を含む「ハイブリッド」ベクターが得られる。
ハイブリッドベクターによる適合単細胞宿主生物の形質
転換によって、宿主細胞群で多数の外来性ＤＮＡのコピ
ーが形成される。いくつかの場合において、望ましい結
果は外来ＤＮＡの増加という単純なものであり、得られ
る「生成物」はＤＮＡである。更に多くの場合におい
て、形質転換の目標は、外来ＤＮＡによりコードされた
商業的に重要な蛋白質又はポリペプチドフラグメントの
単離可能な量での大規模合成が、外来性ＤＮＡの宿主細
胞により発現されることである。例えば、米国特許第4,
264,731号（シャイン）、第4,273,875号（マニス）、第
4,293,652号（コーエン）及び1983年11月９日に公開さ
れた欧州特許出願第093,619号も参照のこと。
ＤＮＡベクターにつなぎかえるための特定のＤＮＡ配列
をつくるには多数の技術によることができるが、予定さ
れた宿主に対する「ドナー」としての「異質性」の度
合、及び宿主において発現されるべきポリペプチドの大
きさによってかなり左右される。単純化しすぎるという
ことを承知していえば、３つの選択可能な重要な方法、
即ち、(1)ドナーのゲノムＤＮＡからの二重鎖ＤＮＡの
「単離」、(2)目的とするポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ鎖の化学的合成、及び(3)ドナー細胞から単離され
たｍＲＮＡの酵素的「逆転写」による二重鎖ＤＮＡのイ
ン・ビトロ合成を採択し得るということができる。ｍＲ
ＮＡの「相補的」ＤＮＡの形成を含む最後に述べた方法
は、一般に「ｃＤＮＡ」法と称される。
ＤＮＡ配列合成法は、所望のポリペプチド生成物のアミ
ノ酸残基の完全な配列が公知である場合にしばしば選ば
れる方法である。共同所有に係る係属中のアルトン(Alt
on)らによる米国特許出願第483,451号（1983年４月15日
出願、1983年11月24日にＷＯ83／04053として公開され
たPCTUS83/00605に相当）のＤＮＡ合成方法は、例えば
下記のような高度に望ましい結果を生じる優れた手段で
ある。即ち、その結果とは、発現のために選ばれた宿主
生物にて高度に発現する遺伝子中に共通して見出される
代替性のあるコードンを存在させることができ（例え
ば、酵母菌又は大腸菌の「優先」コードンを与える）、
原核宿主細胞により容易には加工されない非翻訳性の
「イントロン」配列（哺乳類のゲノムＤＮＡ鎖及びその
ｍＲＮＡ転写体に共通して存在する）の存在を避けるこ
とができ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡに共通してコード
されているが、細菌又は酵母菌の宿主細胞にて目的とす
るポリペプチドからさほど容易には開裂されない非所望
の「リーダー」ポリペプチド配列の発現を避けることが
でき、所望のプロモーター／レギュレーター及びターミ
ネーター配列と結合する好都合の発現ベクターにＤＮＡ
を容易に導入させることができ、並びに、所望のポリペ
プチドのフラグメント及び類縁体をコードする遺伝子を
容易に調製できることである。
望まれるポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知で
ない場合は、ＤＮＡ配列の直接的生産は不可能であり、
ｃＤＮＡ法によりポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を単離することが、したがって前記した高レベルでの微
生物における発現を可能化する発現ベクターの組み立て
の平易さにおける欠点にもかかわらず選択される方法と
なる。目的とするｃＤＮＡ配列を単離するための標準的
操作としては、高レベルでの遺伝子発現能のあるものと
して選ばれるドナー細胞中に多量に存在するｍＲＮＡの
逆転写により得られるプラスミド担持ｃＤＮＡ「ライブ
ラリー」（例えば、比較的多量の成長ホルモン生成物を
発現する脳下垂体細胞由来のｃＤＮＡライブラリー）の
調製がある。ポリペプチドアミノ酸配列の実質的部分が
公知である場合は、「標的」ｃＤＮＡに存在すると推定
される配列の複製からなる標識化一本鎖ＤＮＡプローブ
配列を、一本鎖型に変性させたｃＤＮＡのクローンコピ
ーにて行なわれるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン法において使用してもよい［一般に、ワイスマン(Wei
ssman)らの米国特許第4,394,443号明細書における技術
の開示及び論議、並びにウォレスら；［「ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ」、第６巻、第3543-3557頁、197
9年（Wallace et al.,Nuc.Acids Res.,6,pp 3543-3557
(1979)、レイズら；「P.N.A.S.」（米国）、第79巻、第32
70-3274頁、1982年、(Reyes,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、
79,pp3270-3274(1982))及びジェイら；「ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ」、第11巻、第2325-2335頁、198
3年(Jaye et al.,Nuc.Acids Res.,11,pp2325-2335(198
3))に報告された長鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションプローブを用いた最近の実例を参照された
い。更に、診断に有効なＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション操作に関するフォールコー(Falkow)らの米国特
許第4,358,535号明細書、一本鎖ポリヌクレオチドプロ
ーブにおける光放射標識に関する欧州特許出願第007068
5号及び0070687号明細書、コロニー及びプラークハイブ
リダイゼーション技術に関する、ニューヨーク州、コー
ルスプリングハーバー所在、コールドスプリングハーバ
ー研究所のデービス(Davis)ら；「ア・マニュアル・フ
ォー・ジェネティック・エンジニアリング−アドバンス
ト・バクテリアル・ジェネティックス」（1980年）第55
-58頁及び第174-176頁、並びに、ＤＮＡ及びＲＮＡのト
ランスファー及びハイブリダイゼーションについての指
針マニュアルとなる「ジーン・スクリーン」ハイブリダ
イゼーショントランスファー膜物質に関するニュー・イ
ングランド・ヌクレア（マサチューセッツ州、ボスト
ン）のカタログ第NEF-972号も参照のこと］。
組換えクローンのスクリーニングに関するハイブリダイ
セーション操作について更に重要な最近の進歩の中に
は、標識化された混合の合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを使用したものがあるが、各プローブは、一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡの不均一混合体を含むハイブリダイゼー
ション試料中の特定のＤＮＡ鎖に対して潜在的に完全な
る相補性を有している。これらの操作は、目的とするポ
リペプチドについて極めて低量のｍＲＮＡ配列供給源か
ら得られるｃＤＮＡクローンを検出する上で特に有用で
あることが知られている。簡単に言えば、非特異的結合
を回避し得る厳格なハイブリダイゼーション条件を適用
するならば、例えば、その完全な相補体である混合体中
の一つのプローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイズする
ことによって、特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオ
グラフィーによる視覚化が可能になる。一般に、ウォレ
スら；「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、第９
巻、第879-897頁、1981年、[Wallace,et al.,Nuc.Acids
Res.,9,pp879-897(1981)]、サッグスら；「P.N.A.S.」
（米国）、第78巻、pp6613-6617、1981年、[Suggs,et a
l.,P.N.A.S.(U.S.A.)、78、pp6613-6617(1981)]、チュー
ら；「ネイチャー」、第299巻、第178-180頁、［1982
年、[Choo,et al.,Nature,299,pp178-180(1982)]、クラ
チら；「P.N.A.S.」（米国）、第79巻、第6461-6464頁、1
982年、[Kurachi,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、79、pp6461-
6464(1982)]、オークボら；「P.N.A.S.」（米国）、第80
巻、第2196-2200、1983年、[Ohkubo,et al.,P.N.A.S.
(U.S.A.)、80、pp2196-2200(1983)]及びコーンブリット
ら、「P.N.A.S.」（米国）、第80巻、第3218-3222頁、198
3年[Kornblihtt,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、80、pp3218-3
222(1983)]参照。一般にウォレスらの混合プローブ手順
（前記1981年）は、目的とするｃＤＮＡの存在を二つの
部位で「陽性」と確認するために一つの11塩基鎖（11-
マー）と一緒に、一様に変異したＤＮＡ鎖よりなる16塩
基鎖（16-マー）オリゴヌクレオチドプローブ32種類の
混合「プール」を用いると、ｃＤＮＡクローンの単離に
おいて信頼すべき結果が得られたと報告されたことか
ら、様々な研究者にまで広がっていった。シンガー−サ
ムら、「P.N.A.S.」（米国）、第80巻、第802-806頁、198
3年[Singer-Sam,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、80、pp802-80
6(1983)]参照。
ゲノムＤＮＡ単離物を使用することは、組換え操作で用
いられる特定のＤＮＡ配列をつくる上記３つの方法にお
いて最も一般性の少ないものである。これは、哺乳類ポ
リペプチドの微小生物での発現を行なわせようとする組
換え操作領域において特に真実であって、主に哺乳類ゲ
ノムＤＮＡの複雑性に起因するものである。このよう
に、信頼すべき操作が、ヒト及び他の哺乳種起源である
ゲノムＤＮＡのファージ担持ライブラリーをつくるため
にあるが［例えば、「マニアティス・ライブラリー」と
通常呼ばれるヒトゲノムライブラリーを得る操作に関す
るローンら：「セル」、第15巻、第1157-1174頁、1978
年、(Lawn,et al.,Cell,15，pp1157-1174(1978))、別の
制限酵素フラグメント操作によるヒトゲノムライブラリ
ーに関するカーン等：「P.N.A.S.」（米国）、第77巻、第
5172-5176頁、1980年、(Karn,et al.,P.N.A.S.(U.S.
A.)、77、pp5172-5176(1980))、及びウシゲノムライブラ
リーの構築を述べたブラットナーら：「サイエンス」、
第196巻、第161-169頁、1977年［Blattner,et al.,Scie
nce,196、pp161169(1977)参照］、アミノ酸又はＤＮＡ配
列についてさほど予備的情報のないゲノムＤＮＡの単離
において、ハイブリダイゼーション操作を用いる試みは
さほど成功していなかった。一例として、フィデスら：
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライ
ド・ジェネティクス」、第１巻、第3-18頁、1981年[Fid
des,et al.,J.Mol.and App.Genetics,1,pp3-18(1981)]
では、α−サブユニットについて予め単離されたｃＤＮ
Ａ鎖たる全体で621塩基対のフラグメントを有する「全
部の長さ」のプローブを用いて、マニアティス・ライブ
ラリーから、ヒト脳下垂体糖蛋白質ホルモンのα−サブ
ユニットをコードする遺伝子の単離に成功したと報告し
ている。別の例として、ダスら：「P.N.A.S.」（米国）、
第80巻、第1531-1535頁、1983年、[Das,et al.,P.N.A.
S.(U.S.A.)、80、pp1531-1535(1983)]では、175塩基対の
合成オリゴヌクレオチドを用いた、ヒトHLA-DRのヒトム
ゲノムクローンの単離を報告している。最後に、アンダ
ーソンら：「P.N.A.S.」（米国）、第80巻、第6838-6842
頁、1983年[Anderson,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.),80,pp6
838-6842(1983)]では、長さが86塩基対で、ウシ膵臓ト
リプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の既知アミノ酸配列
に基づき構成された一本のプローブを用いてＢＰＴＩの
ゲノムクローンを単離したと報告している。その著者
は、初期の標的たる耳下腺及び肺組織源におけるｍＲＮ
Ａが明らかに低量であることから、ｃＤＮＡライブラリ
ーの合成に適したｍＲＮＡを単離できる可能性が少ない
と結論づけており、更には以下のことを述べて、標識化
プローブ混合体を用いるゲノムライブラリーのプロービ
ングの成功の可能性について言及している：「より一般
的には、混合配列オリゴデオキシヌクレオチドプローブ
が、ｃＤＮＡライブラリーから未知配列蛋白質遺伝子を
単離するために用いられていた。このようなプローブ
は、典型的には、アミノ酸配列のわずかな範囲（５〜６
残基）についての可能な全てのコードンの組合せを示す
長さが14〜17のヌクレオチドの８〜32種類のオリゴヌク
レオチドの混合体である。不正確な塩基対プローブを識
別できる厳格なハイブリダイゼーション条件下では、こ
れらの混合体により、低度から中度の複雑性があるクロ
ーンライブラリーから特定の遺伝子配列を見つけ出すこ
とができる。しかしながら、それらの短鎖性と異質性と
のために、混合プローブは哺乳類のゲノムほど複雑な鎖
をプロービングするのに要する特異性をしばしば欠如し
ている。このことは、相当するｍＲＮＡを利用できない
場合に、哺乳類の蛋白質遺伝子を単離する上で、このよ
うな方法を実施不可能とするものである。」（引例省
略） このように、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列
がさほど知られておらず、またｍＲＮＡに富む組織源を
ｃＤＮＡライブラリーの調製に使用する上で容易に入手
できないような場合において、迅速かつ効果的にｃＤＮ
Ａクローンを単離するのに有効な改良方法の技術的必要
性が存在し続けている。このような改良方法は、求めら
れている遺伝子によってコードされたポリペプチドのア
ミノ酸配列に関して乏しい情報しか得られていない哺乳
類のゲノムクローンの単離にそれらが適用できれば、特
に有用であろう。
Ｂ．目的とするポリペプチドとしてのエリスロポエチン 血球増生、即ち赤血球の産生は、人間が生きている限
り、細胞破壊を補うために継続して行なわれる。血球増
生は、循環を妨げる程多くはない充分な数の赤血球を、
適切な組織に酸素供給する血液中で利用可能にさせる、
非常に正確に制御された生物学的メカニズムである。赤
血球の産生は骨髄で行なわれ、ホルモン、即ちエリスロ
ポエチンで制御されている。
エリスロポエチンは分子量約34,000ダルトンの酸性糖蛋
白質であって、α、β及びアシアロの３種の型として得
られる。α及びβ型は炭水化物成分がわずかに異なって
いるが、同様の性質、即ち生物学的活性及び分子量を有
している。アシアロ型は末端の炭水化物（シアル酸）が
除去されたα又はβ型である。エリスロポエチンは、組
織が実在数の赤血球から充分な酸素供給を受けている健
康状態に体がある場合、血漿中において極めて低濃度で
存在している。この正常な低濃度であっても、普通時間
を経るにつれて減少する赤血球の補充を促進するには充
分である。
エリスロポエチンの循環量は、血球の循環による酸素輸
送量が減少する低酸素症状態下では増加する。低酸素症
は、出血による多量の血液の喪失、放射線への過度露出
による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識喪失によ
る酸素摂取量の減少又は各種貧血によって起こる可能性
がある。組織が低酸素ストレスを受けると、エリスロポ
エチンは、骨髄中の原始前駆細胞が、前赤芽球（前赤芽
球はひき続いて成熟し、ヘモグロビンを合成し、赤血球
として循環系に放出される）に変換されるのを促進する
ことにより、赤血球の産生を増大させる。循環系の赤血
球数が正常組織での酸素要求量よりも多い場合は、循環
系エリスロポエチンは減少する。
一般的には、テスタら：エクスペリメンタル・ヘマトロ
ジー、第８巻（第８増刊号）、第144-152頁、1980年[Te
sta,et al.,Exp.Hematol.,8(Supp.8),144-152(1980)]；
トングら：「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー」、第256巻、第24号、第12666-12672頁、1981
年、[Tong,et al.,J.Biol.Chem.,256(24),12666-12672
(1981)]；ゴールドワッサー：「ジャーナル・オブ・セ
ルラー・フィジオロジー」、第110巻、（第１増刊
号）、第133-135頁、1982年、[Goldwasser,J.Cell.Phys
iol.,110(Supp.1),133-135(1982)]；フィンチ：「ブラ
ッド」、第60巻、第６号、第1241-1246頁、1982年、[Fi
nch,Blood,60(6)，1241-1246(1982)]；シト−スキー
ら：「エクスペリメンタル・ヘマトロジー」、第８巻
（第８増刊号）、第52-64頁、1980年、[Sytowski,et a
l.,Exp.Haematol.,8[Supp8],52-64(1980)]；ノートン；
「アナルス・オブ・クリニカル・ラボラトリー・サイエ
ンス」、第13巻、第５号、第432-438頁、1983年[Naught
on.Ann.Clin.Lab.Sci.,13(5),432-438(1983)]；ワイス
ら：「アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・
リサーチ」、第44巻、第10号、第1832-1835頁、1983年
[Weiss,et al.,Am.J.Vet.Res.,44(10)、1832-1835(198
3)]：ラッピンら：「エクスペリメンタル・ヘマトロジ
ー」、第11巻、第７号、第661-666頁、1983年、[Lappi
n,et al.,Exp.Haematol.,11(7),661-666(1983)]；バシ
ューら：「アナルス・オブ・ニューヨーク・アカデミー
・オブ・サイエンス」、第414巻、第66-72頁、1983年[B
aciu,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,414,66-72(1983)]；マ
ーフィーら：「アフタ・ヘマトロジカ・ジャポニカ」、
第46巻、第７号、第1380-1396頁、1983年[Murphy,et a
l.,Acta Haematologica Japonica,４６（７），1380-13
96(1983)]；デシプリスら：「ブリティッシュ・ジャー
ナル・オブ・ヘマトロジー」、第56巻、第295-306頁、1
984年[Dessypris,et al.,Brit.J.Haematol.,56,295-306
(1984)]、及びエマヌエルら：「アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・フィジオロジー」、第247巻、第１号、第２
部、第F168-176頁、1984年[Emmanouel,et al.,Am.J.Pyh
siol.,247(1Pt2)、F 168-176(1984)]参照。
エリスロポエチンは赤血球形成過程で欠かせないもので
あるため、このホルモンは赤血球の産生能が低く又は欠
陥がある血液疾患の診断及び治療に有効に適用すること
ができる。一般的には、鎌型赤血球疾患の治療における
エリスロポエチンに関するペナサーダスら：「ブラッ
ド」、第63巻、第５号、第1168-1171頁、1984年[Pennat
hur-Das,et al.,Blood,63(5),1168-1171(1984)]及びハ
ディ：「アメリカン・ジャーナル・オブ・ペディアトリ
ック・ヘマトロジー／オンコロジー」、第４巻、第191-
196頁、1982年[Haddy,Am.Jour.Ped.Hematol./Oncol.,4,
191-196(1982)]、並びにエリスロポエチンに富む血漿の
注入によるイン・ビボの応答を基礎とする尿毒症のヒツ
ジの治療法について記し、更に慢性腎疾患を伴う貧血の
治療剤として15〜40日間、10単位EPO／kg／日の用量を
提案するエッシュバッハら：「ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベストメント」、第74巻、第２号、第434-
441頁、1984年[Eschbach,et al.,J.Clin.Inbest.,74
(2),pp434-441(1984)]参照。更には、クレーン：「ヘン
リー・フォード・ホスピタル・メディカル・ジャーナ
ル」、第31巻、第３号、第177-181頁、1983年[Krane,He
nry Ford Heap.Med.J.,31(3),177-181(1983)]も参照の
こと。
最近、エリスロポエチンが大量に入手可能になれば、米
国だけで毎年160万人の貧血患者の治療に使えるであろ
うと予測された。例えば「ザ・ワールド・バイオテック
・レポート」(The World Biotech Report)1984年、第２
巻：米国（ニューヨーク州、ニューヨーク、オンライン
・パブリケーションズ社、1984年）のモリソン：「バイ
オプロセッシング・イン・スペース・……アン・オーバ
ービュー(Bioprocessing in Space……an Overvie
w)」、第557-571頁参照。最近の研究により、各種の病
態、疾患及び血液異常状態において、エリスロポエチン
治療の有効性を予想する基礎が与えられた。ベドバト
ら：「アクタ・ヘマトロギカ」、第71巻、第211-213
頁、1984年（β−サラセミア）[Vedovato,et al.,Acta.
Haematol.,71,211-213(1984)]；ビチンスキーら：ジャ
ーナル・オブ・ペディアトリックス」、第105巻、第１
号、第15-21頁、1984年（嚢胞性繊維症）[Vichinaky,et
al.,J.Pediatr.,105(1)、15-21(1984)]；コーツら：
「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・オブステトリッ
クス・アンド、ギネコロジー」、第90巻、第４号、第30
4-311頁、1983年（妊娠、月経における疾患）[Cotes,et
al.,Brit.J.Obstet.Gyneacol.,90(4),304-311(198
3)]；ハガら：「アクタ・ペディアトリックス・スカン
ジナビア」、第72巻、第827-831頁、1983年（未熟児性
早期貧血）[Haga.et al.,Acta.Pediatr.Scand.,72,827-
831(1983)]；クラウス−ウォーカーら：「アーカイブス
・オブ・フィジカル・アンド・メディカル・リハビリテ
ーション」、第65巻、第370-374頁、1984年（脊髄損
傷）[Claus-Walker,et al.,Arch.Phys.Med.Rehabil.,6
5,370-374(1984)]；ダンら：「ユーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・アプライド・フィジオロジー」、第52巻、第
178-182頁、1984年（宇宙飛行）[Dunn,et al.,Eur.L.Ap
pl.Physiol.,52,178-182(1984)]；ミラーら：「ブリテ
ィッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー」、第52
巻、第545-590頁、1984年（急性の血液喪失）[Miller,e
t al.,Brit.J.Haematol.,52,545-590(1982)]；ユドゥー
パら：「ジャーナル・オブ・レーバー・アンド・クリニ
カル・メディスン」、第103巻、第４号、第574-580及び
第581-588頁、1984年[Udupa,et al.,J.Lab.Clin.Med.,1
03(4),574-580 and 581-588(1984)]、リップシッツら：
「ブラッド」、第63巻、第３号、第502-509頁、1983年
（老化）[Lipschitz,et al.,Blood,63(3),502-509(198
3)]、並びに、ダイニアックら：「キャンサー」、第51
巻、第６号、第1101-1106頁、1983年[Dainiak,et al.,C
ancer,51(6),1101-1106(1983)]及びシュワルツら：「オ
トラリンゴロジー」、第109巻、第269-272頁、1983年[S
chwartz,et al.,Otolaryngol.,109,269-272(1983)]（異
常な血球増生を伴う各種新生物疾患状態）。
血漿又は尿から高収率でエリスロポエチンを得ようとす
る以前の試みは不成功に終った。複雑で高度な実験技術
が必要とされるが、一般には不純で不安定な微量のエリ
スロポエチン含有抽出物を集められるにしかすぎない。
米国特許第3,033,753号明細書には、ヒツジ血漿からエ
リスロポエチンを部分的に精製するための方法が記載さ
れているが、低収率でエリスロポエチン含有粗製固体抽
出物が得られただけである。
尿からエリスロポエチンを単離する初期の試みでは、不
安定で生物学的に不活性なそのホルモン調製物が得られ
た。米国特許第3,865,801号明細書には、尿から回収さ
れたエリスロポエチン含有粗製物質の生物学的活性を安
定化させる方法が開示されている。得られるエリスロポ
エチン含有粗製物は、称するところでは、90％のエリス
ロポエチン活性を有しており、しかも安定である。
再生不良性貧血患者の尿からヒトエリスポエチンを精製
する別の方法が、ミヤケら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリィ、第252巻、第15号、pp5558-55
64（1977年８月月10日）[Miyake,et al.,J.Biol.Chem.,
Vol252,No.15,pp5558-5564]に記載されている。この７
工程の操作には、イオン交換クロマトグラフィー、エタ
ノール沈澱、ゲル過及び吸着クロマトグラフィーが含
まれ、21％の収率で、70,400単位／mgの比活性がある純
粋なエリスロポエチン調製物が得られている。
タケザワらの米国特許第4,397,840号明細書には、弱塩
基性イオン交換物にて健康なヒトの尿試料から「エリス
ロポエチン生成物」を製造する方法が記されており、エ
リスロポエチン阻害効果のない低分子量生成物が得られ
たと述べている。
1982年５月６日に公開されたスギモトらによる英国特許
出願第2,085,887号明細書には、ハイブリッドヒトリン
パ芽球細胞の産生方法が述べてあり、哺乳類宿主増殖物
が107細胞／mlとなった後、培地に分配された細胞懸濁
液１ml当り３〜420単位のエリスロポエチン産生量があ
ると報告されている。達成されたとする最大の産生レベ
ルでは、エリスロポエチン産生速度は、イン・ビボ増殖
系から細胞が移し変えられたイン・ビトロ培地におい
て、40〜4,000単位／106細胞／48時間と計算された（対
応する米国特許第4,377,513号明細書も参照）。多数の
提案が新生物細胞をはじめとする組織源からエリスロポ
エチンを単離するためになされたが、収率は極めて低か
った。例えば、ジェルクマンら：「エクスペリメンタル
・ヘマトロジー」、第11巻、第７号、第581-588頁、198
3年[Jelkman,et al.,Exp.Hematol.,11(7),581-588(198
3)]；タンブランら；「P.N.A.S.」（米国）、第80巻、第6
269-6273頁、1983年[Tambourin,et al.,P.N.A.S.(U.S.
A.),80,6269-6273(1983)]；カツオカら：「ガン」、第7
4巻、第534-541頁、1983年[Katzuoka,et al.,Gann,74,5
34-541(1983)]；ハギワラら：「ブラッド」、第63巻、
第４号、第828-835頁、1984年[Hagiwara,et al.,Blood.
63(4),828-835(1984)]、及びチョッピンら：「ブラッ
ド」、第64巻、第２号、第341-347頁、1984年[Choppin,
et al.,Blood,64(2),341-347(1984)]参照。
精製エリスロポエチンの取得のために利用される他の単
離技術としては、免疫学的操作がある。ポリクローナル
な血清由来のエリスロポエチンに対する抗体は、動物、
好ましくはラット又はウサギにヒトエリスロポエチンを
注射することにより得られる。注射されたヒトエリスロ
ポエチンは動物の免疫系により外来抗原物質として認識
され、抗原に対する抗体の産生を誘導する。抗原物質に
よる刺激に感応する細胞が異なれば、別の感応細胞から
産生されたものとはわずかに異なる抗体が産生されて、
循環系に放出される。抗体活性は、その血液を採取した
場合に、動物の血清中に残存している。未精製の血清、
又は血清免疫グロブリンＧ画分として精製された抗体調
製物は次いでヒトエリスロポエチン検出分析に用いら
れ、それと複合化するが、その物質には大きな欠点があ
る。この血清抗体は個々の細胞から産生された多数の異
なる抗体からなるが、その性質上ポリクローナルであっ
て、エリスロポエチンのみではない粗抽出物中の他の成
分と複合化する。
本発明の背景にあって重要なのは、選択された抗原にお
ける一つの抗原決定基と特異的に免疫応答する一種の抗
体のみを産生できるという継続細胞培養の開発技術に関
する最近の進歩である。一般的には、キスホルム：「ハ
イテクノロジー」、第３巻、第１号、第57-63頁、1983
年[Chisholm,High Technology,Vol3,No.1,57-63(1983)]
参照。エリスロポエチンに対する「モノクローナル」抗
体を得るために細胞融合とハイブリッド形成技術を用
い、更にヒトエリスロポエチンの単離と定量化のために
これらの抗体を用いる試みが行なわれた。一例として、
ヒトエリスロポエチンに対するモノクローナル抗体を分
泌するマウス−マウスハイブリドーマ細胞系の開発に成
功したという報告が、リー−ファン：「フェデラル・プ
ロシーディングス」の抄録第1463号、第41巻、第520
頁、1982年[Lee-Huang,Abstract No.1463 of Fed.Pro
c.,41,520(1982)]において抄録という形でなされた。別
の例として、モノクローナルエリスロポエチン抗体の産
生及び使用に関する詳細な説明が、ワイスら：「P.N.A.
S.」（米国）、第79巻、第5465-5469頁、1982年[Weiss,e
t al.,P.N.A.S.(U.S.A.),79,5465-5469(1982)]にある。
ササキ：「ビオメディカ・ビオキミカ・アクタ」、第42
巻、第11/12号、第S202-S206頁、1983年[Sasaki,Biome
d.Biochim.Acta.,42(11/12),S202-S206(1983)]；ヤナガ
ワら：「ブラッド」、第64巻、第２号、第357-364頁、1
984年[Yanagawa,et al.,Blood,64(2),357-364(1984)]；
ヤナガワら：「ジャーネル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー」、第259巻、第５号、第2707-2710頁、1984
年[Yanagawa,et al.,J.Biol.Chem.,259(5)、2707-2710(1
984)]、及び米国特許第4,465,624号明細書も参照のこ
と。
更に、本発明の背景にあって重要なのは、天然蛋白質、
糖蛋白質及び核蛋白質中のアミノ酸配列と実質上同一で
ある合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告である。
更に具体的には、比較的低分子量のポリペプチドが、ウ
ィルス抗原、ポリペプチドホルモン等のような生理学上
重量な蛋白質の免疫反応に対し、時間及び程度の点で類
似した免疫反応に関与していることが示された。このよ
うなポリペプチドの免疫反応の中には、免疫活性な動物
において特異的抗体形成を刺激することが含まれる。例
えば、ラーナーら：「セル」、第23巻、第309-310頁、1
981年[Lerner,et al.,Cell,23,309-310(1981)]；ロス
ら：「ネーチャー」、第294巻、第654-656頁、1981年[R
oss.et al.,Nature,294,654-656(1981)]；ウォルター
ら：「P.N.A.S.」（米国）、第77巻、第5197-5200頁、198
0年[Walter,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、77,5197-5200(19
80)]；ラーナーら：「P.N.A.S.」（米国）、第78巻、第34
03-3407頁、1981年[Lerner,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、7
8,3403-3407(1981)]；ウォルターら：「P.N.A.S.」（米
国）、第78巻、第4882-4886頁、1981年[Walter,et al.,
P.N.A.S.(U.S.A.)、78,4882-4886(1980)]；ウォングら：
「P.N.A.S.」（米国）、第78巻、第7412-7416頁、1981年
[Wong,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、78,7412-7416(1981)]
グリーンら：「セル」、第28巻、第477-487頁、1982年
[Green,et al.,Cell,28,477-487(1982)]；ニッグら：
「P.N.A.S.」（米国）、第79巻、第5322-5326頁、1982年
[Nigg,et al.,P.N.A.S.(U.S.A.)、79,5322-5326(198
2)]：バロンら：「セル」、第28巻、第395-404頁、1982
年[Baron,et al.,Cell,28,395-404(1982)]；ドリースマ
ンら：「ネーチャ」、第295巻、第158-160頁、1982年[D
reesman,et al.,Nature,295,295,158-160(1982)]：及び
ラーナー：「サイエンティフィック・アメリカン」、第
248巻、第２号、第66-74頁、1983年[Lerner,Scientific
American,248,No.2,66-74(1983)]参照。更には、ペプ
チドホルモンの一次構造配列ではなく、その二次構造を
おおむね有している合成ペプチドの生物学的及び免疫学
的活性に関するカイザーら：「サイエンス」、第223
巻、第249-255頁、1984年[Kaiser,et al.,Science,223,
pp249-255(1984)]も参照のこと。上記研究は、勿論、エ
リスロポエチン（即ち実質的なアミノ酸配列の情報がま
だ知られていなかった物質）以外の蛋白質アミノ酸配列
に関するものである。共同所有に係る継続中のエグリー
(J.Egrie)により1983年２月４日に出願され、欧州特許
第0 116 446号として1984年８月22日に公開された米国
特許出願463,724号明細書には、マウス−マウスハイブ
リドーマ細胞系（A.T.C.C.第HB8209号）が記載されてお
り、この細胞系は、下記のアミノ酸配列：NH2Ala-Pro-P
ro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr
-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.からなるポリペプチドとも
特異的に免疫応答する高度に特異的なモノクローナル抗
エリスロポエチン抗体を産生する。このポリペプチド鎖
は、ミヤケら：「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー」、第252巻、第5558-5564頁、1977年[Miy
ake,et al.,J.Biol.Chem.,252,5558-5564(1977)]の方法
により単離され、ヒューイック・エムら：「ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、第256巻、
第7990-7997頁、1981年[Hewick,M.,et al.,J.Biol.Che
m.,256,7990-7997(1981)]の操作によりアミノ酸分析が
気相配列決定装置［アプライド・バイオシステム社(App
lied Biosystems,Inc)］によって行なわれた成熟ヒトエ
リスロポエチンの最初の20個のアミノ酸残基に対応する
ものである。別個のアミノ酸鎖に基づく、合成26マーに
対するポリクローナル抗体の産生に関するスーら：「プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ」（米国）、第80巻、第3651-3655
頁、1983年[Sue,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A),8
0,pp3651-3655(1983)]及びシトウスキーら：「ジャーナ
ル・オブ・イムノロジカル・メソッズ」、第69巻、第18
1-186頁、1984年[Sytowski,et al.,J.Immunol,Methods,
69,pp181-186(1984)]も参照。
上記ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、エリス
ロポエチンの定性及び定量のためのイムノアッセイに使
用される高度に有用性のある物質を提供し、更にエリス
ロポエチンのアフィニティー精製においても有用性を有
する。しかしながら、詳細な分析、臨床試験及び例えば
疾患組織がエリスロポエチン産生をになうことができな
い慢性疾患の治療のような、該物質の潜在的に広範な治
療用途にとって充分なだけ多量のエリスロポエチンを哺
乳類源から単離する目的には、前記抗体を有効に活用す
ることは難しいと考えられている。したがって、哺乳類
エリスロポエチンを充分に特定化でき、しかも可能性の
ある診断的及び臨床的用途のためにそれを大量に供給す
る為には、大規模な哺乳類エリスロポエチンの微生物に
よる大規模な合成をもたらす組換え操作の実用化を成功
させることにあると、当業者間では考えられている。
ヒト及び他の哺乳類のエリスロポエチンをコードしてい
るＤＮＡ配列を実験的に単離する実質的な努力がこれま
でなされてきたが、誰もまだ成功していない。これは主
に、エリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列を従来の
技術により単離することのできるｃＤＮＡライブラリー
を構成し得るｍＲＮＡに富む組織源、特にヒド組織源、
の欠乏に起因するものである。更に、エリスロポエチン
のアミノ酸残基連鎖についてはほとんど未知であるた
め、例えばｃＤＮＡ特にゲノムＤＮＡライブラリーのＤ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションスクリーニングに
おいて安心して直ちに使用することができる長鎖ポリヌ
クレオチドプローブを調製することができない。実際の
例として、A.T.C.C.HB 8209で産生された上記モノクロ
ーナル抗体を得るために用いられる20個のアミノ酸配列
は、上記アンダーソンらの方法における、明確な60塩基
オリゴヌクレオチドプローブの構築には使えないもので
ある。エリスロポエチンのためのヒト遺伝子はヒトゲノ
ム内で「単一の遺伝子」として存在しているらしく、い
かなる場合も、ヒトエリスロポエチンをコードする遺伝
子物質はゲノムライブラリーに存在する総ヒトゲノムＤ
ＮＡの0.00005％未満を構成するにしかすぎないと推定
される。
現在までのところ、単離可能量の哺乳類エリスロポエチ
ンの微生物発現における使用に適したＤＮＡ配列を与え
る組換え関連方法において、最も成功した既知報告例で
も、目標にはほど遠いものであった。一例として、ファ
ーバーら：「エクスペリメンタル・ヘマトロジー」、第
11巻、第14増刊号、抄録101、1983年[Farber,et al.,Ex
p.Hematol.,11,Supp.14,Abstract101(1983)]では、フェ
ニルヒドラジン処理ヒヒの腎臓組織からｍＲＮＡを抽出
し、このｍＲＮＡをアフリカツメガエル(Xenopus laevi
s)卵母細胞に注入したが、それらの中に含まれエリスロ
ポエチンの生物学的性質を示す「翻訳生成物」の混合体
がイン・ビトロで産生するのはむしろ一時的な結果であ
ったと報告している。更に最近において、ファーバー
ら：「ブラッド」、第62巻、第５号、第１増刊号、抄録
392、第122a頁、1983年[Farber,et al.,Blood,62,No.
5,Supp.No.1,Abstract 392,at page 122a(1983)]は、カ
エル卵母細胞によるヒト腎臓ｍＲＮＡのイン・ビトロ翻
訳について報告した。その得られた翻訳生成混合体に
は、注入されたｍＲＮＡ１μｇ当り、エリスロポエチン
活性を有する翻訳生成物が220mU含有されていると推定
された。エリスロポエチンをコードしている外来性ｍＲ
ＮＡのこのようなイン・ビトロ翻訳量が（従来報告され
た、必要とする生成物へのヒヒｍＲＮＡ翻訳量と比べ
て）著しく低いと認められたが、この結果は、ヒト腎臓
を、所望の遺伝子が単離され得る豊富なヒト腎ｃＤＮＡ
ライブラリーの構成を可能にするエリスロポエチン発現
部位としてみなさせるものであると考えられた［ファー
バー：「クリニカル・リサーチ」、第31巻、第４号、第
769A頁、1983年[Farber,Clin.Res.,31(4),769A(1983)]
も参照］。
米国特許出願第561,024号及び第582,185号の出願以後、
大腸菌内で、ヒトエリスロポエチンｃＤＮＡとみなされ
ていた物質のクローニングと発現に関する一つの報告が
なされた。簡単に言えば、多数のｃＤＮＡクローンが大
腸菌プラスミドに挿入され、β−ラクタマーゼ融合生成
物がヒトエリスロポエチンの不特定の「エピトープ」に
対するモノクローナル抗体と免疫応答性を有することが
着目されたのである。リー−ファン：「プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ」（米国）、第81巻、第2708-2712頁、1984年[Lee-
Huang,Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A),81,pp2708-2712(198
4)]参照。
発明の概要 本発明は、その対立遺伝子変異体をも含む天然エリスロ
ポエチンの一次構造形状（即ち、アミノ酸残基の連続配
列）の一部もしくは全部、及び一以上の生物学的性質
（例えば、免疫学的性質並びにイン・ビボ及びイン・ビ
トロでの生物学的活性）を有する新規な精製単離された
ポリペプチド生成物をはじめて提供するものである。こ
れらのポリペプチドは、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ
のクローニング又は遺伝子の合成によって得られる外来
性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主での発現生成物
（例えば、細菌、酵母、及び哺乳類の培養細胞による）
であるということによっても独特に特徴づけられる。脊
椎動物（例えば、哺乳類及び鳥類）細胞における微生物
発現生成物は、自然の哺乳類細胞環境又は血漿もしくは
尿のような細胞外液におけるエリスロポエチンと関連性
があるであろうヒト蛋白質又は他の夾雑物とは全く関係
がないということによって、更に特徴づけられるかもし
れない。典型的な酵母［例えば、サッカロマイセス・セ
レビシエ(Saccaromyces cerevisiae)］又は原核生物
（例えば、大腸菌）を宿主細胞とする生成物は、いかな
る哺乳類の蛋白質とも関連性を有していない。使用する
宿主によっては、本発明のポリペプチドは哺乳類もしく
は他の真核生物の炭水化物によってグリコシル化され、
あるいはグリコシル化されないかもしれない。本発明の
ポリペプチドはまた、最初にメチオニンアミノ酸残基
（１番目の位置）を含んでいてもよい。
本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その一以上の生物
学的性質が得られるのに充分な天然（例えばヒト）エリ
スロポエチンの複製である一次構造形状を有し、天然
（例えばヒト）エリスロポエチンのそれとは異なる平均
的炭水化物組成を有するものが含まれる。
更に、本発明によって、初めて解明されたエリスロポエ
チンアミノ酸残基の連続配列の全体的もしくは部分的複
製である合成ポリペプチドが提供される。これらの配列
は、天然エリスロポエチンの一次、二次又は三次構造形
状特性を有しているため、治療及び免疫過程でエリスロ
ポエチンの生物学的活性なもしくは免疫学的な代用物と
して用いられるような、天然産物に共通した生物学的活
性及び（又は）免疫的性質を有しているであろう。これ
に付随して、標準的手段によって得られ、このようなポ
リペプチドと免疫応答し、好ましくは天然エリスロポエ
チンとも免疫応答するモノクローナル及びポリクローナ
ル抗体が提供される。
本発明では、サル及びヒト種起源のクローンＤＮＡ配列
並びにそれから適切に誘導されたポリペプチド配列につ
いても解明しており、それらはそれぞれサル及びヒト種
起源エリスロポエチンの一次構造形状を表わしている。
更に本発明により、本発明のＤＮＡを取り込んだ新規な
生物学的機能性のウィルス及び環状プラスミドＤＮＡの
ベクター、並びにそのようなベクターにより安定にトラ
ンスフォーメーション又はトランスフェクションがなさ
れた微生物（例えば、細菌、酵母及び哺乳類の細胞）宿
主生物も提供される。これに対応し、外来性ベクター担
持ＤＮＡ配列の大規模な発現を促進する条件下におい
て、このようなトランスフォーメーション又はトランス
フェクションされた微生物宿主を培養増殖させ、増殖培
地、細胞ライセート又は細胞膜画分から所望のポリペプ
チドを単離することからなる有用なポリペプチドの新規
製造方法が、本発明によって提供される。
上記方法で得られる微生物発現ポリペプチドの単離精製
は、例えばプレパラティブ・クロマトグラフィー分離、
並びにモノクローナル及び（又は）ポリクローナル抗体
調製物を用いる免疫学的分離のような従来の手段によっ
て行なってもよい。
エリスロポエチンのアミノ酸残基配列が解明されたの
で、本発明により、エリスロポエチンをコードするＤＮ
Ａ配列の全体的及び（又は）部分的製造がなされるが、
そのＤＮＡ配列には、選ばれた非哺乳類宿主による発現
に「好適な」コードンの取り込み、制限エントヌクレア
ーゼ酵素による開裂部位の具備及び容易に発現するベク
ターの構築を容易にする別の開始、終末又は中間ＤＮＡ
配列の具備というような有利な特性が備えられている。
これに伴い、本発明は、一以上のアミノ酸残基の同一性
又は位置に関して天然型とは異なるが、天然型の一部も
しくは全部の性質を有しているエリスロポエチンペプチ
ド類似体もしくは誘導体（即ち、エリスロポエチンの特
定の残基を全てではないが有する削除類似体、及び（又
は）一以上の特定の残基が他の残基と置換された置換類
似体、及び（又は）一以上のアミノ酸残基がポリペプチ
ドの終末又は中間部位に付加された付加類似体）の微生
物発現をコードしているＤＮＡ配列の製造法（並びにcD
NA及びゲノムＤＮＡの部位特定突然変異誘発による生成
法）を提供する。
本発明のＤＮＡは、微生物宿主細胞における発現によっ
て、天然ヒトエリスロポエチンの生物学的性質を有する
ポリペプチド生成物を産生させることのできる配列であ
って、具体的には、表VIIにヒトＥＰＯポリペプチドと
して示したアミノ酸配列（−27〜166又は１〜166）をコ
ードする塩基配列を含むＤＮＡ配列（縮重を含む）であ
り、例えば、表VIに示したゲノムＤＮＡ配列及び表V
I′，表ＸIV及び表ＸＸＩに示したイントロンを含まな
いＤＮＡ配列を挙げることができる。これらのＤＮＡ
は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとして取得されたもので
あっても、又は、その一部又は全部が化学合成されたも
のであってもよい。
本発明には、エリスロポエチン治療、具体的には貧血症
の状態及び最も具体的には慢性腎疾患を伴うような貧血
状態の治療に使用し得る、本発明のポリペプチド生成物
の治療上有効量と薬学上許容される希釈剤、及びアジュ
バント及び（又は）担体とからなる医薬組成物も含まれ
る。
本発明のポリペプチド生成物は、固体組織及び血液又尿
のようにな液体試料中のエリスロポエチンの定性及び定
量に有用な試薬とするために、検出可能なマーカー物質
と共有結合させて標識化してもよい（例えば125Ｉで放
射線標識化する。）。本発明のＤＮＡ生成物もまた、
（放射線標識及びビオチンのような非同位元素標識のよ
うな）検出可能なマーカーで標識化されていてもよく、
ヒト、サル及び他の哺乳類種の染色体地図におけるエリ
スロポエチン遺伝子座及び（又は）それに関連したすべ
ての遺伝子群の座を決定するために、ＤＮＡハイブリダ
イゼーション過程で用いられてもよい。それらはまた、
ＤＮＡレベルにおけるエリスロポエチン遺伝子の欠陥を
見出すために用いることができ、更には隣接する遺伝子
及びそれらの欠陥を見出すための遺伝子マーカーとして
用いることもできる。
本明細書で詳細に記したように、本発明では更に、マル
チプル一本鎖ポリヌクレオチドを含む不均一な細胞もし
くはウィルス試料において、配列未知の特定の一本鎖ポ
リヌクレオチドを検出するための重要な改良方法も提供
するが、この方法は下記のとおりである。
(a)一様に変異した塩基鎖を有する標識化一本鎖ポリヌ
クレオチドプローブの混合体が調製される。このプロー
ブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特である、と推
定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である。
(b)試料が固体基質に固定される。
(c)前記基質が、該試料のポリヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションによらないで、ポリヌクレオチドが更
にそれと結合するのを抑制するように処理される。
(d)処理済みの基質を、全体的に相補性のポリヌクレオ
チド間でのみハイブリッド形成し易い条件下で、一時的
に前記標識化プローブの混合体と接触させる。次いで、 (e)特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化プロー
ブ混合物内の全体的に相補的なプローブとのハイブリッ
ド形成反応の存在を確認することによって検出される。
これは標識化プローブの基質との非特異的結合に起因す
る標識化物質の背景密度と比較して特定のポリヌクレオ
チド位置における基質上の標識化物質の密度が高いとい
うことにより証明される。
この操作は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ／ＲＮＡハイブリッド形成において、17〜20塩基を有
する64、128、256、512、1024又はそれ以上の混合ポリ
ヌクレオチドプローブを使用することが指示された状況
下で特に有効である。
以下に記すように、上記改良方法により、サル種起源の
エリスロポエチンをコードし、貧血サル腎細胞ｍＲＮＡ
から誘導されたライブラリー内のｃＤＮＡクローンを実
際に同定することができた。より具体的には、ヒトエリ
スロポエチンのフラクションを配列決定して導かれたア
ミノ酸配列情報に基づく、128種類の一様に変異した20-
merプローブ混合体が、コロニーハイブリダイゼーショ
ン操作で用いられ、合計200,000のコロニーの中から７
つの「＋（陽性）」エリスロポエチンＤＮＡクローンが
同定された。更に特記すべきは、本発明の改良操作を実
施することにより、ヒトゲノムライブラリーを構成する
1,500,000のファージプラークのスクリーニングの中か
ら３つの陽性クローンを迅速に単離することができたこ
とである。これは、ヒトエリスロポエチンの別の連続配
列のアミノ酸分析による第二の128種類の17-merプロー
ブと一緒に上記した128種類の20-merプローブ混合体を
用いて実現されたものである。
上記で説明した操作は、哺乳類ゲノムクローンを単離す
るためのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成過程におい
て、多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを使用した
最初の例であり、しかもｃＤＮＡクローンの単離におい
て32種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ混合体を使
用した最初の例である。
本発明に多数の側面と利点があることは、本発明の実際
に好ましい態様での実施を説明している以下の詳細な説
明を読むならば、当業者においては明らかとなるであろ
う。
発明の具体的な説明 本発明によれば、ヒト及びサルエリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）のポリペプチド配列の一部又は全部をコードしてい
るＤＮＡ配列が単離され、特定化された。更に、サル及
びヒト起源ＤＮＡは、イン・ビボ及びイン・ビトロのＥ
ＰＯ生物学的活性のみならず、天然ＥＰＯの生物学的
（例えば免疫学的）特性も発揮する単離可能な量のポリ
ペプチドを与える真核及び原核細胞発現の主体をなし
た。
サル種起源のＤＮＡは、化学的に誘導された貧血状態を
呈し、その血清が免疫学的測定によると正常なサル血清
と比べて高レベルのＥＰＯを含有するサルの腎組織から
得られたｍＲＮＡにより構成されたｃＤＮＡライブラリ
ーから単離された。ＥＰＯをコードするＤＮＡを含む所
望ｃＤＮＡクローンの単離は、128種類が混合され、放
射線標識化された20-merのオリゴヌクレオチドプローブ
のプールを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡコロニーハイブリダ
イゼーションにより実現されたが、200,000コロニーの
迅速なスクリーニングが必要とされた。オリゴヌクレオ
チドプローブの設計は、少量のヒトＥＰＯ試料の酵素的
切断とアミノ酸配列決定により得られたアミノ酸配列情
報に基づいた。
ヒト種起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡライブラリーか
ら単離された。ＥＰＯをコードするＤＮＡを含むクロー
ンの単離は、128種類が混合された20-merのオリゴヌク
レオチドプローブの上記プールと、別の酵素によるヒト
ＥＰＯフラグメントから得られたアミノ酸配列情報に基
づく128種類の放射線標識化17-merプローブの第二のプ
ールとを用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡプラークハイブリダイ
ゼーションにより行なわれた。
陽性のコロニー及びプラークは、20-merプローブのプー
ル内の16塩基鎖サブセットを用いたクローンＤＮＡのジ
デオキシ配列法により確認され、選択されたクローン
は、それによりコードされるＥＰＯポリペプチドの一次
構造形状を推定させるヌクレオチド配列分析に供され
た。推定されたポリペプチド配列は互いに、またヒトＥ
ＰＯフラグメントのアミノ酸分析により得られた部分配
列に対しても高度の相同性を示した。
選択された陽性のサルｃＤＮＡクローン及び選択された
陽性のヒトゲノムクローンは、それぞれ「シャトル」Ｄ
ＮＡベクターに挿入され、このベクターは大腸菌に導入
されて、培養哺乳類細胞をトランスフェクションするた
めに用いられた。トランスフェクションされた宿主細胞
の培養増殖により、培養液１ml当り3000ＵのＥＰＯを含
有していると推定される培地上澄標品が得られた。
以下の諸例は本発明の説明のために掲げられており、特
にＥＰＯをコードするサルｃＤＮＡクローン及びヒトゲ
ノムクローンの同定に先立って実施される操作、この同
定のための操作、並びに配列決定、発現系の生成及びこ
の系におけるＥＰＯ発現の免疫学的確認に関するもので
ある。
更に具体的には、例１はヒトＥＰＯフラグメントのアミ
ノ酸配列及びこの配列に基づく放射線標識化プローブ混
合体の調製に関する。例２は一般に、陽性サルｃＤＮＡ
クローンの同定に必要な操作に関するものであり、この
ため動物の処置及び動物血清の予備的ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）分析に関する情報が得られる。例３は、
ｃＤＮＡライブラリーの調製、陽性クローンのコロニー
ハイブリダイゼーションスクリーニングおよび確認、陽
性ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列並びにサルＥＰＯのポ
リペプチド一次構造形状（アミノ酸配列）の情報に関す
る。例４は陽性ヒトゲノムクローンの同定に必要な操作
に関するものであり、このためゲノムライブラリー、プ
ラークハイブリダイゼーション操作および陽性クローン
の確認に関する情報が得られる。例５は、陽性ゲノムク
ローンのＤＮＡ配列及びサルＥＰＯ鎖の情報との違いも
含めた、ヒトＥＰＯポリペプチドアミノ酸配列の情報に
関する。例６は、陽性サルｃＤＮＡクローンから得られ
たＥＰＯをコードするＤＮＡを取り込んだベクターの調
製方法、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションするた
めのベクターの使用法及びトランスフェクションされた
細胞の培養増殖法に関する。例７は、陽性ヒトゲノムク
ローンから得られたＥＰＯをコードするＤＮＡを取り込
んだベクターの調製方法、ＣＯＳ−１細胞をトランスフ
ェクションするためのベクターの使用法及びトランスフ
ェクションされた細胞の培養増殖法に関する。例８は、
例６及び７におけるトランスフェクションされた細胞の
培養増殖により得られた培地上澄で実施されたイムノア
ッセイ法に関する。例９は、例６及び７における微生物
発現によるＥＰＯのイン・ビトロ及びイン・ビボ生物学
的活性に関する。
例10は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細
胞による、サル種ＥＰＯｃＤＮＡ及び及びヒト種ゲノム
ＤＮＡについての哺乳類宿主発現系の調製並びにこれら
の発現系による生産物の免疫的及び生物学的活性、およ
びこれらの生産物の特徴づけに関する。例11は、ヒトＥ
ＰＯおよびＥＰＯ類縁体をコードする合成遺伝子、それ
らは大腸菌及び酵母菌の宿主細胞での発現のための多数
の優先コードンを含むものであるが、の調製及びそれに
基づく発現系に関する。例12は、例11の系における発現
生成物の免疫学的及び生物学的活性面に関する。
例１ Ａ．ヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸配列決定 ヒトＥＰＯを尿から単離し、トリプシン切断させて、約
100〜150ピコモル量の17個に分断されたフラグメントと
し、単離した。
フラグメントに任意に数字を付し、気相配列決定装置
（アプライド・バイオシステムス）を用いて微細配列順
序分析によりアミノ酸配列を分析し、以下の表Ｉに示し
た配列情報を得た。表では、単一文字符号が用いられて
おり、「Ｘ」は明確に決定されなかった残基を表わす。
Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ混合体の設計と調製 表Ｉに示したアミノ酸配列に関し、混合プローブ操作が
ｃＤＮＡ及び（又は）ゲノムＤＮＡライブラリーでのＤ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に適用し得るかにつ
いて確認する目的で、遺伝暗号の縮重関係を精査した。
この分析では、フラグメントNo.T35の中に７つのアミノ
酸残基(Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lsy)が存在していた
ことが判明したが、この鎖は20塩基対について可能な12
8種類のＤＮＡ鎖のうちの一つによりコードされている
ということにより独特に特徴づけることができる。128
種類の20塩基オリゴヌクレオチドの第一の組は、したが
って下記表IIに示した配列に従い、固体支持体上での標
準ホスホアミデート法［例えば、ビューケージら；「テ
トラヘドロン・レターズ」、第22巻、第1859-1862頁、1
981年(Beaucage,et al.,Tetrahedron Letters,22,pp185
9-1862(1981))参照］により合成される。
更に分析すると、フラグメントNo.T38の中に、６つのア
ミノ酸残基(Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu)の存在が確認さ
れ、それに基づけぱ、下記表IIIに示したように128種類
の混合オリゴヌクレオチドの17-merプローブのプールを
調製することができる。
オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ＮＥＮ）を用いて7500〜8000Ci/mmol（ＩＣ
Ｎ）のγ−32Ｐ−ＡＴＰにより５′末端で標識化した。
例２ Ａ．サルの処理操作 メスのカニクイザル(Cynomolgus monkey)マカカ・ファ
シキュラリアス(Macaca fascicularias)（2.5〜３kg，
1.5〜２年齢）に１、３及び５日目；12.5mg/kgの用量で
pH7.0の塩酸フェニルヒドラジン溶液を皮下注射して処
理した。ヘマトクリット値をそれぞれ注射する前に測定
した。７日目に、あるいはヘマトクリット値が初期値の
25％低下した際、塩酸ケタミン25mg/kgを投与して、血
清及び腎臓を採取した。採取物を直ちに液体窒素で凍結
し、−70℃で保存した。
Ｂ．ＥＰＯのＲＩＡ 試料中のＥＰＯ定量のためのラジオイムノアッセイ操作
を以下の操作に従い実施した。
エリスロポエチンの標準（この標準は、ＣＡＴ−１と呼
ばれる人尿由来のエリスロポエチンで、そのエリスロポ
エチン活性はエリスロポエチンの国際的標準であるWHO
IRP#1に対し検定されているものである。なお、この標
準はシカゴ大学のゴールドワッサー(Dr.E.Goldwasser)
より入手した。又は未知試料を37℃で２時間抗血清と一
緒にインキュベートした後、試験管を氷冷し、125Ｉ−
標識化エリスロポエチンを加え、管を15時間以上０℃で
インキュベートした。各試験管には、希釈免疫血清50μ
ｌ、125Ｉ−エリスロポエチン10,000cpm.トラシロール
５μｌ及びＥＰＯ標準もしくは未知試料０〜250μｌか
らなり、残部が0.1％ＢＳＡ含有ＰＢＳであるインキュ
ベート混合物500μｌが入っていた。使用した抗血清
は、ヒト尿エリスロポエチンの純粋の１％標品で免疫さ
れたウサギの第２回目採血液であった。試験のための最
終的抗血清希釈液は、抗体−結合125Ｉ−ＥＰＯが入力
総カウント数の10〜20％を超えないように調整された。
一般に、これは１：50,000〜１：100,000の最終的抗血
清希釈液に相当した。
抗体−結合125Ｉ−エリスロポエチンは、スタスＡ(stap
h A)150μｌの添加により沈澱した。40分間インキュベ
ートした後、試料を遠心分離し、ペレットを0.15M NaC
l、2mM EDTA及び0.05％トリトンＸ−100含有10ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ0.75ml(pH8.2)で二回洗浄した。洗浄したペ
レットをガンマーカウンターで計測し、125Ｉ−エリス
ロポエチン結合体の％を求めた。免疫前の血清のカウン
ト数を、非特異的沈澱について補正するため、全ての最
終値から差し引いた。未知試料のエリスロポエチン含量
を標準曲線と比較して求めた。
上記操作を、未処理サル血清のみならず、前記Ａ部で得
られたサル血清にも適用した。正常血清値を分析すると
含有量は約36mU/mlであったが、処理サル血清では含有
量は1000〜1700mU/mlであった。
例３ Ａ．サルｃＤＮＡライブラリーの構築 メッセンジャーＲＮＡを、チャーグウィンら：「バイオ
ケミストリー」第18巻、第5294頁、1979年[Chirgwin,et
al.,Biochemistry 18,p 5294(1979)]のチオシアン酸グ
アニジウム法によって正常と貧血サル腎臓から単離し、
ポリ(A)＋ｍＲＮＡを、マニアティスら：「モレキュラ
ー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル」
（1982年、ニューヨーク州、ハーバー、コールドスプリ
ングス所在、コールドスプリングスハーバーラボラトリ
ー）[Maniatis,et al.,"Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual"(Cold Springs Harbor Laboratory,Cold Spr
ings Harbor,N.Y.,1982)]第197-198頁に記載されている
ように、オリゴ(dT)−セルロースカラムクロマトグラフ
ィーで二回精製した。ｃＤＮＡライブラリーを、オカヤ
マら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー」、第２巻、第161-170頁、1982年[Okayma,et al.,Mo
l.and Cell.Biol.,2,pp161-170(1982)]の一般的方法の
修正法により調整した。本発明での好ましい操作のキー
ポイントは以下のとおりであった：(1)pCH8を唯一のベ
クターとして使用し、ＰstＩで切断し、次いで60〜80塩
基鎖のオリゴｄＴの尾部をつけた。(2)Ｈinc II切断に
よりベクターの一端からオリゴｄＴ尾部を取り除いた、
(3)第一の鎖の合成とオリゴｄＧの尾部づけを公表され
た方法により実施した、(4)ＢamＨＩ切断によりベクタ
ーの一端からオリゴｄＧ尾部を取り除いた、及び(5)Ｄ
ＮＡによるＲＮＡ鎖の置換には、オリゴｄＧ尾部つきベ
クターよりも３倍モル過剰の２つのリンカー(GATCTAAAG
ACCGTCCCCCCCCCおよびACGGTCTTTA)を用いた。
Ｂ．サルｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めのコロニーハイブリダイゼーション トランスフォーメーションを受けた大腸菌を、50μｇ／
mlのアンピシリン含有栄養平板上に、10×10cmプレート
当り9000コロニーの密度で分散させた。ジーン・スクリ
ーン・フィルター(Gene Screen filter)（ニューイング
ランド・ヌクレア・カタログNo.NEF-972）をＢＨＩ−Ｃ
ＡＭプレート（バクト(Bacto)脳心臓浸出液37ｇ／カ
ザミノ酸２ｇ／及び寒天15ｇ／、クロラムフェニコ
ール500μｇ／ml含有）にて予め湿潤させ、プレートか
らコロニーを採取するのに用いた。コロニーを同一の培
地で12時間以上増殖させて、プラスミド複製数を増やし
た。増殖したコロニー（コロニ・サイド・アップ）を、
以下の溶液でそれぞれ飽和された２枚のワットマン３Ｍ
Ｍ紙上にフィルターを連続的におくことにより処理し
た： (1)５分間は50mMグルコール−25mMトリスＨＣｌ(pH8.0)
-10mM EDTA(pH8.0)、 (2)10分間は0.5MＮａＯＨ、及び (3)３分間は、1.0MトリスＨＣｌ(pH7.5) フィルターを次いで、80℃にて２時間減圧乾燥させた。
フィルターを次に、プロティナーゼＫで消化に付し、緩
衝液Ｋ［0.1MトリスＨＣｌ(pH8.0)-0.15MＮａＣｌ−10m
M EDTA(pH8.2)-0.2％ＳＤＳ］中に該プロテアーゼ酵素5
0μｇ／mlを含む溶液で処理した。具体的には、該溶液
５mlを各フィルターに加え、55℃で30分間消化処理し、
しかる後溶液を除去した。
フィルターを次いで、プレハイブリダイゼーション緩衝
液（5×SSPE-0.5％SDS-100μｇ／ml SS大腸菌DNA-5×BF
P）４mlで処理した。プレハイブリダイゼーション処理
を55℃で、おおむね４時間以上行ない、その後、プレハ
イブリダイゼーション緩衝液を除去した。
ハイブリッド形成操作を以下の方法で行なった。各フィ
ルターに、表IIの128種類のプローブ配列（ＥＰＶ混合
体とされる全ての混合体）をそれぞれ0.025ピコモル含
有するハイブリダイゼーション緩衝液（5×SSPE-0.5％S
DS-酵母菌ｔＲＮＡ100μｇ／ml）３mlを加え、フィルタ
ーを48℃で20時間保持した。この温度は、全てのプロー
ブについて決定された計算解離温度（Ｔｄ）の最低のも
のより２℃低かった。
ハイブリッド形成後、フィルターを振盪器にて10分間、
室温で６×SSC-0.1％SDSにより３回洗浄し、ハイブリッ
ド形成温度（48℃）にて２〜３回６×SSC-1％SDSで洗浄
した。
フィルータのオートラジオグラフィーにより、スクリー
ニングされた200,000コロニーの中から７つの陽性クロ
ーンが見出された。
推定されるサルｃＤＮＡクローンの一つ（クローン＃8
3）の最初の配列分析が、ウォレスら：「ジーン」、第1
6巻、第21-26頁、1981年[Wallace,et al.,Gene,16,pp21
-26(1981)]の方法を修正して確認のために行われた。即
ち、サルｃＤＮＡクローン＃83からのプラスミドＤＮＡ
をＥcoＲＩで切断して直鎖状となし、沸騰水浴上で過熱
して変性させた。ヌクレオチド配列をサンガーら：「P.
N.A.S.」（米国）、第74巻、第5463-5467頁、1977年[San
ger,et al.,P.N.A.S.(U.S.A)、74,pp5463-5467(1977)]の
ジデオキシ法で調べた。16の配列からなるＥＰＶプロー
ブ混合体の一部を塩基配列決定のプライマーとして用い
た。
Ｃ．サルＥＰＯｃＤＮＡ配列 クローン＃83のヌクレオチド配列分析をメッシング：
「メソッド・イン・エンザイモロジー」、第101巻、第2
0-78頁、1983年[Messing,Methods in Enzymology,101、p
p20-78(1983)]の方法に従って行なった。表IVに示した
のは、クローン＃83における約1600塩基対のＥcoＲＩ／
Ｈind IIIクローン化フラグメントの予備的な制限酵素
地図分析結果である。制限エンドヌクレアーゼ酵素認識
部位のおおよその位置は、該フラグメントの５′末端の
ＥcoＲＩ部位に対する３′側の塩基数によって表わされ
る。ヌクレオチドの配列決定は、重複するフラグメント
を重ね合せるように、個々の制限フラグメントをつなげ
ることにより行なわれた。例えば、Ｃ113の制限フラグ
メント（111のＳau3A/324のＳmaＩ）におけるヌクレオ
チド分析で得られる配列情報とＣ73のフラグメント（42
4のＡluＩ／203のＳstＥII）の逆方向配列決定により得
られる配列情報との重複である。
約1342塩基対（ＥcoＲＩ部位の３′側のＳau３Ａ部位か
らＨind III部位までの範囲内で）の配列を決め、全て
の解読可能な構造を分析して、表Ｖに示したＤＮＡ及び
アミノ酸鎖の情報を解明することができた。表中、成熟
ＥＰＯのアミノ末端と推定される最初のアミノ酸残基
（ヒューイック・エムら：「ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー」、第256巻、第7990-7997頁、
1981年[Hewick,M.,et al.,J.Biol.Chem.,256,7990-7997
(1981)]の操作によりアミノ酸分析が気相配列決定装置
［アプライド・バイオシステム社(Appllied Biosystem
s,Inc)］によって行なわれた成熟ヒトエリスロポエチン
の最初の20個のアミノ末端残基配列分析と対比させて確
認されるような）は、数値の＋１で示されている。成熟
蛋白質アミノ酸鎖において一番目の残基である最初のア
ミノ末端アラニン残基の「上流」に位置していて、メチ
オニンを特定化するＡＴＧコドン（−27で示される）の
存在は、成熟ＥＰＯが循環系に入る前に切除される27の
アミノ酸「リーダー」領域を含む前駆体型として、ＥＰ
Ｏが細胞質中でまず発現される可能性のあることを示し
ている。ポリペプチド中の潜在的グリコシル化部位は＊
で示されている。翻訳領域の分子量は2117ダルトンであ
り、成熟サルＥＰＯを構成するポリペプチドの165残基
の分子量は18236ダルトンであった。
表Ｖのポリペプチド鎖は、例えばホップら：「P.N.A.S.」
（米国）、第78巻、第3824-3828頁、1981年[Hopp,et a
l.,P.N.A.S.(U.S.A.)、78、pp3824-3828(1981)]、カイト
ら：「ジャーネル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー」、第157巻、第105-132頁、1982年[Kyte,et al.,J.M
ol.Biol.,157、pp105-132(1982)]及び（又は）チュー
ら：「バイオケミストリー」、第13巻、第222-245頁、1
974年[Chou,et al.,Biochem,13,pp222-245(1974)]及び
「アドバンシズ・イン・エンザイモロジー」、第47巻、
第45-47頁、1978年[Advance in Enzymology,47,pp45-47
(1978)]の方法により、高度に親水性の領域及び（又
は）潜在的に高度な免疫原性領域を示す二次構造特性の
存在に関する分析に容易に付されるであろう。ホップら
の方法によるコンピュータ補助分析は、カリフォルニア
州、パロアルト、ユニバーシティアベニュ124のインテ
リジェネティックス社から入手可能なＰＥＰレファレン
スのセクション６、７に示すプログラムにより実施可能
である。
例４ Ａ．ヒトゲノムライブラリー ローンら：前記「セル」、［Lawn,et al,前記Ｃｅｌ
ｌ］の方法により調整されたCh4Aファージ担持ヒト胎児
肝ゲノムライブラリーを得、プラークハイブリーダイゼ
ーション分析で使用するために保存した。
Ｂ．ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするため
のプラークハイブリダイゼーション操作 ファージ粒子を溶解し、ＤＮＡを、ジーンスクリーン・
プラス・フィルタ（ニューイングランド・ヌクレア・カ
タログNo.NEF-972）及びNZYAMプレート・（１リットル
につき、NaCl５ｇ、MgCl２-6Ｈ２Ｏ２ｇ、ＮＺ−アミン
Ａ10ｇ、酵母エキス５ｇ、カザミノ酸２ｇ、マルトース
２ｇ、及び寒天15ｇを使用することを除いては、ウー：
「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、第68巻、第38
9-395頁、1979年[Woo,methods In Enzymology,68,pp389
-395(1979)]の方法により、フィルター（フィルター当
り50,000プラーク）に固定した。
風乾したフィルターを80℃で１時間焼付し、次いで例３
のＢに記したように、プロティナーゼＫで消化した。プ
レハイブリダイゼーションを55℃で４時間以上１ＭNaCl
-1％SDS緩衝液で行ない、しかる後緩衝液を除去した。
ハイブリッド形成及びハイブリッド後洗浄を例３のＢに
記したように行なった。ＥＰＶで示される128種類の20-
merプローブ混合体及びＥＰＱ混合体で示される表IIIの
128種類の17-merプローブ混合体を用いた。ハイブリッ
ド形成は、ＥＰＶプローブ混合体を用い、48℃で行なわ
れた。ＥＰＱプローブ混合体ハイブリッド形成は46℃、
即ち混合体中の最低の計算Ｔｄ値より４℃低い温度、で
行なわれた。再ハイブリッド形成のためのハイブリッド
形成プローブの除去を、１×SSC-0.1％SDSと一緒に２分
間煮沸することにより行なった。フィルターのオートラ
ジオグラフィーにより、調べられた1,500,000のファー
ジプラーク中３つの陽性クローン（いずれのプローブ混
合体とも反応する）が見出された。ＥＰＯをコードして
いるような陽性クローンの確認が、ＤＮＡシークエンシ
ングと、例３のサルｃＤＮＡとのヘテロ二重鎖形成の電
子顕微鏡写真による視覚化とによってなされた。この操
作によっても、ゲノムＤＮＡ鎖における多数のイントロ
ンの存在が実証された。
例５ （λｈＥ１で示される）陽性クローンの一つのヌクレオ
チド配列分析（前記サンガーらのジデオキシ法）を行な
ったが、これまでに得られた結果は表VIに示されてい
る。
表VI中、最初のＤＮＡ配列は、ヒトＥＰＯ遺伝子の翻訳
部分の直前の非翻訳配列と思われる最前の620塩基を示
す。より具体的には、その配列は、リーダー配列（「前
配列」）における最初の４つのアミノ酸（-27〜-24）を
コードする翻訳ＤＮＡ領域（この領域は、後述する表VI
Iに示されるヒトＥＰＯゲノムＤＮＡとサルＥＰＯｃＤ
ＮＡがコードするアミノ酸配列の間の相同性等に基づい
て決定された。）まで続く５′末端遺伝子からなってい
るようである。リーダーの始まりをコードする遺伝子の
前に位置する鎖中の４つの塩基対はまだ明確には確認さ
れなかったため、「Ｘ」で表わされている。次いで、約
639塩基対（そのうち439塩基対が配列決定されたが、残
りの200塩基対は「I.S.」で表わされている）からなるイ
ントロンに続いており、翻訳されるポリペプチドの残基
−23として示されたグルタミン酸のコードンの直前に位
置している。その直後に続くエキソン鎖は、（成熟ヒト
ＥＰＯのアミノ酸鎖残基＋１として示される）アラニン
残基から、＋26のスレオニンを特定化するコードンまで
のアミノ酸残基をコードしていることが判明し、しかる
後具体的に示した256塩基からなる第二にイントロンに
続いている。このイントロンの後、27〜55のアミノ酸残
基のエキソン配列が続き、その後612塩基対からなる第
三のイントロンが始まる。次のエキソンはヒトＥＰＯの
56〜115の残基をコードしており、次いで特定化された1
34塩基からなる第四のイントロンが始まる。第四のイン
トロンに続くのは、第116〜166の残基をコードするエキ
ソンと「停止」コードン（ＴＧＡ）である。最後に、表
VIでは、ヒトＥＰＯ遺伝子の非翻訳３′領域と思われる
568塩基対鎖を明らかにしているが、「Ｘ」で示される
２つの塩基対はまだ明確には配列決めされなかった。
表VIはこのように、166個の特定のアミノ酸残基の成熟
ヒトＥＰＯ（推定分子量＝18,399）の一次構造形状（ア
ミノ酸配列）を確認するのに役立つ。表で同時に示され
ているのが、ヒト遺伝子オペロンのプロモーター／オペ
レーター機能にとって重要な５′−３′ＤＮＡ鎖ととも
に、27残基のリーダー配列をコードするＤＮＡ配列であ
る。成熟ヒトＥＰＯポリペプチドの潜在的グリコシル化
部位は、表中に＊で示されている。表VIの特定のアミノ
酸配列がヒトエリスロポエチンの自然発生的対立遺伝型
のそれを構成している可能性があることに注意すべきで
ある。この立場に関する支持が、残基126において表に
示したセリンと対立するメチオニンを有する多くのエリ
スロポエチン分子の発見に至った、尿中ヒトエリスロポ
エチンの単離物を配列決定するという長年の努力の結果
の末に見出された。
以下の表VIIはヒトおよびサルのＥＰＯにおけるポリペ
プチド配列の相同性の程度を示している。表中の上部の
連続列において、一文字の符号は残基−27で始まるヒト
ＥＰＯについて推定翻訳されたポリペプチド配列を示す
ために用いられており、下部の連続列は指定の残基−27
で始まるサルＥＰＯについて推定されたポリペプチド配
列を示している。＊は、配列相同性を強調するために用
いられている。推定されたヒトおよびサルＥＰＯ配列
は、ヒトにおける部位116「付加的」リジン（Ｋ）残基
を示していることに注目すべきである。表VIと相互に参
照することにより、この残基が丁度ゲノム配列において
推定されるｍＲＮＡのスプライス部位にあることが明ら
かとなる。ヒトポリペプチド配列におけるリジン残基の
存在は、下記例７でヒトゲノムＤＮＡによりトランスフ
ォーメーションされたＣＯＳ−１細胞から単離されたｍ
ＲＮＡより得られるヒトｃＤＮＡ鎖クローンを配列決定
することによっても更に確認された。尚、リーダー領域
を含む前駆体型のヒトＥＰＯをコードするイントロンを
含まない本発明のＤＮＡ配列を表VI及び表VIIに基づい
て作成し、これをまとめて表VI′に示す。
例６ 例３の操作で得たサルｃＤＮＡによりコードされるＥＰ
Ｏポリペプチド物質を単離可能な量で微生物合成するた
めに最初の試みとして選択された発現系は、哺乳類宿主
細胞のうちの一種（即ち、ＣＯＳ−１細胞、A.T.C.C.N
o.CRL-1650）であった。その細胞は、大腸菌宿主（pＢ
Ｒ322由来ＤＮＡの存在下にて）および哺乳類宿主（Ｓ
Ｖ40ウィルス由来ＤＮＡの存在下にて）内で自立的に複
製することが可能な「シャトル」ベクターによりトラン
スフェクションされた。
更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製
された。例３のプラスミドクローン＃83を大腸菌で増殖
させ、約1.4kbのサルＥＰＯをコードするＤＮＡをＥco
ＲＩおよびＨind III切断により単離した。分別して単
離されたのは、約4.0kbのpＢＲ322由来Ｈind III／Sal
Ｉフラグメントであった。約30bpのＥcoＲＩ／ＳalＩ
「リンカー」フラグメントがＭ13mp 10RF DNA（Ｐアン
ドＬラボラトリーズ）から得られた。このリンカーはＥ
coＲＩ付着端を含んでおり、順にＳstＩ、ＳmaＩ、Ｂam
ＩおよびＸbaＩ認識部位さらにはＳalＩ付着端が続いて
いる。上記３つのフラグメントは約5.4kbの中間プラス
ミド（「pERS」）の形成のために連結されたが、このプラ
スミドにおいて、ＥＰＯ ＤＮＡは有効な制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位の「バンク」近傍の一端に位置して
いた。pERSを次いでＨind IIIおよびalＩで消化する
と、ＥＰＯ ＤＮＡおよびＥcoＲＩからのＳalＩ（Ｍ13
mp 10）までのリンカーが得られた。1.4kbのフラグメン
トを約4.0kbのｐＢＲ322のＢamＨＩ／ＳalＩおよび約30
bpの他の13mp 10・Ｈind III／ＢamＨＩ ＲＦフラグメ
ントリンカーと結合させた。Ｍ13リンカーフラグメント
は、Ｈind III付着端、それに続くＰstＩ、ＳalＩ、Ｘb
aＩに認識部位およびＢamＨＩ付着端という特徴を有し
ていた。結合生成物は、再び、制限部位バンクをＥＰＯ
ＤＮＡの近傍両端に有する有用な中間プラスミド
（「ｐＢＲ−ＥＰＯ」）であった。
ＣＯＳ−１細胞におけるＥＰＯ ＤＮＡ発現のために選
択されたベクター（「pDSVL1」）は大腸菌にて選別および
自律的に複製させられるよう予め調製された。これらの
特徴は、ｐＢＲ322ヌクレオチド2448〜4362の領域に存
在する複製起点とアンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ鎖によ
り付与される。この配列は、ベクターに取込まれる前
に、ヌクレオチド2448に直接隣接するようにＨind III
認識部位を付与するリンカーを付加することにより構造
的に変換された。選択されたベクターの他の有用な特性
としては、ＣＯＳ−１細胞において自律的に複製しうる
能力と哺乳動物細胞中で機能するウィルス性プロモータ
ー配列の存在であった。これらの特徴は、ＳＶ40ゲノム
におけるヌクレオチド数5171〜270の343bp配列に存在す
る複製ＤＮＡ配列の起点および「後期遺伝子」ウィルス
性プロモーターＤＮＡ配列により示される。市販のリン
カー［コラボレーティブ・リサーチ(Collaborative Res
earch)］を用いて唯一の制限部位（ＢamＨＩ）をベクタ
ーにつけ、ウィルス性プロモーター配列に直接接合させ
た。更にベクターには、「後期遺伝子」ウィルスｍＲＮ
Ａポリアデニル化信号（通常、転写ターミネーターと称
される）を有する238塩基対配列（ＳＶ40のヌクオレチ
ド数2533〜2770に由来する）が取込まれていた。このフ
ラグメントは、ベクターにおいて、「後期遺伝子」ウィ
ルス性プロモーターから唯一のＢamＨＩ部位までに対応
し、適切に配向していた。更に、ベクターには、ウィル
ス性プロモーターとターミネーターとの間の配列におい
て、唯一のＢamＨＩ部位に挿入された遺伝子の潜在的転
写に関与しない部位に別の哺乳類遺伝子が存在していた
［哺乳類遺伝子は、ガッサーら：P.N.A.S.」（米国）、
第79巻、第6522-6526頁、1982年(Gasser,et al.,P.N.A.
S.(U.S.A)、79、pp6522-6526(1982)]のように、プラスミ
ドｐＭＧ−１から単離された約2,500bpのマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）小遺伝子からなってい
た］。pDSYL1の構築について以下に補足説明を加える。
このプラスミドベクターは5049bpから成り、４種のＤＮ
Ａフラグメントから合成により得られるものである。こ
れら４種のＤＮＡフラグメント及び合成リンカーはいず
れも容易に入手可能なものであり、その塩基配列もすで
に決定されている。
各ＤＮＡフラグメントは夫々次のように調製することが
できる。
(1)ヌクレオチド１−2520： この2520bpのＥcoＲＩ−ＰstＩフラグメントはｐＭＧ１
から得られ、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ小遺伝子
をコードするものである。ｐＭＧ１はスタンフォード大
学のDr.R.Schimkeから入手したもので、このプラスミド
は一般に入手可能なものである（前掲ガッサーら参
照）。
(2)ヌクレオチド2521-2783： この263bpから成るＰstＩ−ＢamＨＩフラグメントは、
ＳＶ40ゲノムのヌクレオチド数2533-2770由来のＢamＨ
Ｉ−ＢclＩフラグメント(238bp)のＢclＩ部位に合成リ
ンカーを付加してＰstＩ部位に変換することにより調製
したものである。尚、ＳＶ40及びここで用いた合成リン
カーは市販されているものである。
(3)ヌクレオチド2784-3129： この346bpから成るＢamＨＩ−ＨinｄIIIフラグメント
は、ＳＶ40ゲノムのヌクレオチド数5171-270由来のＰvu
II−ＨinｄIIIフラグメント(343bp)のＰvuII部位（ヌク
レオチド数270）に、市販の合成リンカーを接合させて
ＢamＨＩ部位に変換することにより調製したものであ
る。
(4)ヌクレオチド3130-5049： この1920bpから成るＨinｄIII−ＥcoＲＩフラグメント
は、pBR322のヌクレオチド数2448-4362領域のヌクレオ
チド数2448にＨinｄIII認識部位を付与する合成リンカ
ーを直接付加することによって調製したものである。
例えば、上記マニアティスらの方法により、ＥＰＯをコ
ードするＤＮＡをＢamＨＩフラグメントとしてプラスミ
ドｐＢＲ−ＥＰＯから単離し、ＢamＨＩで切断されたプ
ラスミドｐＤＳＶＬ１に結合させた。制限酵素分析を行
ない、２つの得られたクローンベクター（複製ベクター
ＨおよびＬ）が正確に配向してＥＰＯ遺伝子が挿入され
たことを確認した。プラスミドｐＤＳＶＬ−ＭＫＥを示
した第２図参照。誤って配向したＥＰＯ遺伝子を有する
ベクター（ベクターＦ，ＸおよびＧ）は、正確に配向し
たＥＰＯＭ ＤＮＡを有するベクターでトランスフォー
メーションされた宿主のＥＰＯ発現量を測定するための
トランスフェクション実験において、ネガティブコント
ロールとして使用するために保存した。
キャリアＤＮＡ（マウス肝および脾ＤＮＡ）と結合した
ベクターＨ、Ｌ、Ｆ、ＸおよびＧを用い、リン酸カルシ
ウム微細沈澱法により、二重60mmプレートをトランスフ
ェクションした。二重60mmプレートはまた、「にせ」の
トランスフォーメーションのネガティブコントロールで
あるキャリアＤＮＡによってもトランスフェクションさ
れた。５日後、全ての培地について、天然ＥＰＯの免疫
学的性質を有するポリペプチドの有無に関し試験した。
例７ Ａ．ＣＯＳ−１細胞を含む第一ＥＰＯ発現系 ヒトゲノムのＤＮＡ ＥＰＯクローンによりコードされ
たヒトＥＰＯポリペプチド物質を単離可能な量で微生物
合成する最初の試みのために選択された系は、また哺乳
類宿主細胞（即ち、ＣＯＳ−１細胞、A.T.C.C.No.CRL-1
650）での発現が包含される。ヒトＥＰＯ遺伝子を、ま
ず、大腸菌宿主（ｐＢＲ322由来ＤＮＡの存在下にて）
および哺乳類細胞系ＣＯＳ−１（ＳＶ40由来ＤＮＡの存
在下にて）内で自律的に複製することが可能な「シャト
ル」ベクターにてまずサブクローン化した。ＥＰＯ遺伝
子含有シャトルベクターを次いでＣＯＳ−１にトランス
フェクションした。ＥＰＯポリペプチド物質がトランス
フェクションされた細胞から産生され、細胞培地に分泌
された。
更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製
された。ラムダクローンλｈＥ１から単離され、ヒトゲ
ノムＥＰＯ遺伝子を含むＤＮＡをＢamＨＩおよびＨind
III制限エンドヌクレアーゼで消化して、全ＥＰＯ遺伝
子を含む5.6kbＤＮＡフラグメントを単離した。このフ
ラグメントを、同様に消化された細菌プラスミドｐＵＣ
８［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社(Bethesda
Research Laboratories,Inc.)］と混合し、結合させ
て、この制限フラグメントの簡便な供給源となる中間プ
ラスミド「pUC8-HuE」を得た。
ＣＯＳ−１細胞におけるＥＰＯ ＤＮＡ発現のために選
択される3338bpから成るベクター(pSV4SEt)を予め調製
した。プラスミドpSV4SEtは３種のＤＮＡフラグメント
から合成されており、各フラグメントは市販のＤＮＡに
入手可能な合成リンカーを付加して修飾したものであ
る。このプラスミドは、大腸菌における選択および自律
的な複製をなすＤＮＡ配列を含んでいた。これらの特徴
は、細菌プラスミドpBR322のヌクレオチド2448〜4362領
域に存在している複製起点およびアンピシリン耐性遺伝
子ＤＮＡ配列により付与される。この領域を、ヌクレオ
チド数2448にＨinｄIII認識部位を付与するリンカーを
付加することにより構造的に変換し、pSV4SEtのヌクレ
オチド数1422-3338（ＨinｄIII−ＥcoＲＩ）領域とし
た。このＨinｄIII−ＥcoＲＩ領域は、カリフォルニア
大学のティジャン(R.Tjian)により分与を受けたプラス
ミドｐＳＶ08（メイヤーら：「セル」、第25巻、第373-
384頁、1981年[Myers,R.M.,et al.,Cell,25,pp373-384
(1981)]をＨinｄIIIおよびＥcoＲＩで消化することによ
り得た。得られたＨinｄIIIリンカー部分を含む該断片
概略を以下に示す。
尚、該ＨinｄIII−ＥcoＲＩ断片は、以下に述べるよう
な方法によっても、調製することができる。まず、pBR3
22よりＳfaＮＩ−ＢglＩ断片（約914bp）を単離する。
次に、pBR322よりアンピシリン耐性遺伝子領域にかかる
部分を含むＢglＩ−ＨinｄIII断片（約908 bp）を単離
する。最後に、以下に示す配列［pBR322のヌクレオチド
数2448から2567（ＳfaＮＩ部位）の配列に、更にＨinｄ
III部位を2448側に付加した配列］を有する129 bpのＤ
ＮＡ断片を合成する。
これら３つのＤＮＡ断片を連結して得られたプラスミド
を、ＨinｄIIIおよびＥcoＲＩで消化することにより、
唯一の大断片として該ＨinｄIII−ＥcoＲＩ断片が得ら
れる。
プラスミドpSV4SEtは、ＣＯＳ−１細胞においても自律
的に複製することができた。この特徴は、ＳＶ40のウィ
ルス複製起点を含む343bpのＨinｄIIIおよびＰvuIIのフ
ラグメント（ヌクレオチド数5171〜270）にあった。こ
のフラグメントを、ＥcoＲＩ認識部位をヌクレオチド27
0に接合させるリンカー、およびＳalＩ認識部位をヌク
レオチド5171に接合させるリンカーを付加することによ
り変換し、pSV4SEtのヌクレオチド数1-353（ＥcoＲＩ−
ＳalＩ）領域とした。ＳＶ40由来の1063bpのＨinｄIII
−ＢclＩフラグメント（ヌクレオチド数1708〜2770）
を、ＳalＩ認識部位をヌクレオチド数2770に接合させる
リンカーを付加することにより変換し、pSV4SEtのヌク
レオチド数354-1421（ＳalＩ−ＨinｄIII）領域とし
た。このフラグメント中には、唯一のＢamＨＩ認識配列
も含まれていた。即ち、以上の３種のフラグメントから
成るプラスミドpSV4SEtは、ヒトＥＰＯ遺伝子が挿入さ
れるＢamＨＩおよびＨinｄIII認識部位、大腸菌内で複
製および選択される配列、並びにＣＯＳ−１細胞内で複
製される配列を含んでいた。
ＥＰＯ遺伝子をpSV4SEtに挿入するため、プラスミドpUC
8-HuEをＢamＨＩおよびＨinｄIII制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、ＥＰＯをコードする5.6kbのＤＮＡフラグ
メントを単離した。pSV4SEtもＢamＨＩおよびＨinｄIII
で切断し、2513bpの大フラグメントを単離した（全ての
必要な機能を保有している）。これらのフラグメントを
混合連結して、最終的ベクター「pSVgHu EPO」を得た（第
３図参照）。このベクターを大腸菌（ＨＢ101株）中で
増殖させ、ベクターＤＮＡを単離した。制限酵素分析を
行ない、ＥＰＯ遺伝子の挿入を確認した。
プラスミドpSVgHuEPO DNAを用いＣＯＳ−１細胞におい
てヒトＥＰＯポリペプチド物質を発現させた。更に具体
的には、pSVgHuEPO DNAをキャリアＤＮＡとともに、Ｃ
ＯＳ−１細胞の三重60mmプレートにトランスフェクショ
ンした。コントロールとして、キャリアＤＮＡのみをＣ
ＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。細胞培養培
地を５日後および７日後に採取し、天然ヒトＥＰＯの免
疫学的性質を有するポリペプチドの有無について試験し
た。
Ｂ．ＣＯＳ−１細胞を含む第二ＥＰＯ発現系 更に別の系が、ＣＯＳ−１細胞(A.T.C.C.No.CRL-1650）
において、ヒトゲノムＤＮＡ ＥＰＯクローンによりコ
ードされたヒトＥＰＯポリペプチド物質の改良生産法を
得るために設計された。
直前のシステムにおいて、ＥＰＯが、5.6kbのＢamＨＩ
からＨinｄIIIまでの制限フラグメント中に存在するそ
れ自身のプロモーターを用いて、ＣＯＳ−１細胞にて発
現された。下記調製例では、ＥＰＯ遺伝子を、ＳＶ40後
期プロモーターにより発現しうるように変換させる。
更に具体的には、クローン化された5.6kbのＢamＨＩか
らＨinｄIIIまでのゲノムヒトＥＰＯ制限フラグメント
を以下の操作により変換した。前記プラスミドpUC8-HuE
をＢamＨＩおよびＳstＥII制限エンドヌクレアーゼで切
断した。ＳstＥIIは、ペプチド前駆体をコードする開始
ＡＴＧから５′方向に44塩基対であり、ＨinｄIII制限
部位から３′方向に約680塩基対である部位において、
5.6kbＥＰＯ遺伝子を切断する。約4900塩基対のフラグ
メントを単離した。ＳalＩおよびＢstＥII付着端並びに
内在ＢamＨＩ認識部位を有する合成リンカーＤＮＡフラ
グメント を合成し、精製した。２つのフラグメントをＳalＩおよ
びＢamＨＩで切断されたプラスミドｐＢＲ322と混合
し、連結させて、中間プラスミドｐＢＲｇＨＥを得た。
ゲノムヒトＥＰＯ遺伝子は、アミノ末端をコードする領
域に近接したＢamＨＩ部位から３′方向に53塩基対であ
る部位に一つのＡＴＧを含む完全な構造の遺伝子を保有
する4900塩基対のＢamＨＩ切断フラグメントとして、そ
れらから単離することができる。
このフラグメントを単離し、ＢamＨＩフラグメントとし
て、ＢamＨＩ切断発現ベクタープラスミドｐＤＳＶＬ１
に挿入した。得られるプラスミド、即ち第４図に示すｐ
ＤＳＶＬ−ｇＨｕＥＰＯを用い、例６および７Ａに示し
たように、ＣＯＳ−１細胞からＥＰＯポリペプチド物質
を発現させた。
例８ 例６における６つのトランスフェクションされたＣＯＳ
−１の増殖後の培地を、例２のＢに示した操作に従い、
ラジオイムノアッセイによって分析した。各試料を25
0、125、50および25μｌ量で分析した。不正確なＥＰＯ
遺伝子配向を有するベクターでトランスフェクションさ
れたにせの細胞増殖物の上澄は、明らかにＥＰＯ免疫応
答性に関し陰性であった。正確な配列のＥＰＯ ＤＮＡ
を有するベクター（ＨおよびＬ）でトランスフェクショ
ンされたＣＯＳ−１細胞の増殖物から得た２つの上澄の
それぞれの試料に関し、抗体に対する125Ｉ−ＥＰＯ結
合阻害率は72〜88％の範囲であり、全ての値が標準曲線
の上位に位置していた。培地上澄の正確なＥＰＯ濃度
は、このため、信頼すべき程度までには調べることがで
きなかった。しかしながら、最大量（250μｌ）の計算
値から控えめに推定すると、300mU/mlであった。
例６の代表的培養液、並びに例７Ａで得た５日目および
７日目の培養液を、組換えサルおよびヒトＥＰＯ物質お
よび天然ヒトＥＰＯ標準と比較するために、ＲＩＡで試
験し、結果を第１図のグラフで示した。即ち、結果は予
期されたように、組換えサルＥＰＯは抗ヒトＥＰＯ抗体
と著しく競合したが、試験条件下では完全に結合を阻害
できないことを示した。組換えヒトＥＰＯに関する最大
の％阻害率はしかしながら、ヒトＥＰＯ標準の値と極め
て近似していた。用量応答曲線が平行関係であること
は、一般に免疫学的な配列（エピトープ）の同一性を示
唆している。サルＥＰＯ培養液の先の評価をそれよりも
高い希釈レベルで再度実施すると、2.91〜3.12Ｕ／mlの
範囲であった。調べられたヒトＥＰＯ生産量は、５日間
増殖試料が392ｍＵ／mlで、７日間増殖試料が567ｍＵ／
mlであった。例７Ｂの発現系におけるＥＰＯ測定値は同
レベルかそれ以上であった。
例９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドワッサー
ら：「エンドクリノロジー」、第97巻、第２号、第315-
323頁、1975年[Goldwasser,et al.,Endocrinology,97,
2,pp 315-323(1975)]方法によるＥＰＯ活性イン・ビト
ロ分析に供した。被検培養液のサルＥＰＯ測定値は3.2
〜4.3Ｕ／mlの範囲であった。ヒトＥＰＯ培養液もこの
イン・ビトロ分析では活性を示し、この活性は抗ＥＰＯ
抗体で中和することができた。例６の組換えサルＥＰＯ
培養液も、コーツら：「ネーチャー」、第191巻、第106
5-1067頁、1961年[Cotes,et al.,Nature,191,pp1065-10
67(1961)]およびハモンドら：「アナルス・オブ・ニュ
ーヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス」、第149
巻、第516-527頁、1968年[Hammond,et al.,Ann,N.Y.Aca
d.Sci.,149,pp.516-527(1968)]の一般的方法によるイン
・ビボ生物学的活性分析に供したところ、活性値は0.94
〜1.24Ｕ／mlであった。
例１０ 前述の諸例において、組換えサルまたはヒトＥＰＯ物質
を、ＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションするのに用
いたベクターからつくった。これらのベクターは、細胞
内におけるＳＶ40のＴ抗原とベクター上のＳＶ40の複製
起点との存在によって、ＣＯＳ−１細胞内で複製する。
これらのベクターはＣＯＳ−１細胞内で有効量のＥＰＯ
を産生するが、その発現はベクターが最終的に減少して
いくため、まさしく一時的である（７〜14日）。更にま
た、少量のＣＯＳ−１のみが該ベクターでトランスフェ
クションされた。本例では、チャイニーズハムスターの
卵巣（ＣＨＯ）ＤＨＦＲ−細胞および選別可能なマーカ
ーＤＨＦＲを用いた発現系を述べている［関連する発現
系の議論については、いずれも米国特許第4,399,216号
並びに1984年８月29日に公開された欧州特許出願第1170
58号、第117059号および第117060号参照］。
ウルラウブら：「プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」（米国）、第77
巻、第4461頁、1980年[Urlaub,et al.,Proc.Nat.Acad.S
ci.(U.S.A.)Vol.77,4461(1980)]で示されたＣＨＯ Ｄ
ＨＦＲ−細胞(DuX-Bll)CHO K1細胞は、構造遺伝子の突
然変異によってジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（ＤＨＦ
Ｒ）を欠如しており、このため培地中にグリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジンの存在を要求する。プラスミ
ドpDSVL-MKE（例６）またはpDSVL-gHuEPO（例７Ｂ）
を、60mm培養プレート中のヒポキサンチン、チミジンお
よびギリシン含有培地で増殖するＣＨＯ ＤＨＦＲ−細
胞内に、キャリアＤＮＡと一緒にトランスフェクション
した。プラスミドpSVgHuEPO（例７Ａ）を、細菌プラス
ミドベクターｐＢＲ322でクローン化されたマウスジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ遺伝子含有プラスミドｐＭＧ２と
混合した。
ｐＭＧ２は、Gasser C.S.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,U
SA,79,p6522-6526(1982)にその調製方法が記載されてい
るｐＭｇ２と同一のプラスミドである。本プラスミド
は、前述の文献の著者のひとちであるDr.Schimke R.D.
より、分与を受けた。本願出願時点で、Dr.Schimkeは、
希望者に対し本プラスミドを分譲している。従って、本
プラスミドの入手については、Dr.Schimkeから分譲を受
ける事により可能である。また、以下に述べるように当
該文献に従い、調製することもできる。
ｐＭｇ２は、マウス染色dhfr遺伝子の５′上流領域の後
に、マウスdhfr遺伝子ｃＤＮＡを接続し、更にｃＤＮＡ
の３′非翻訳領域中に、マウス染色体dhfr遺伝子の３′
下流領域を挿入した約4.3Kbのいわゆる「dhfr mini遺伝
子」を含むプラスミドである。まず、マウス染色体dhfr
遺伝子の５′上流〜エクソンＩ，IIまでの領域を持つプ
ラスミドｐＤＲ34(Crouse G.F.et al,J.Biol.Chem.257,
p7887-7897(1982))より、1.0KbのＥcoＲＩ−ＴaqＩ断片
（５′上流領域とエクソンＩの一部を含む）を単離し
た。また、マウスdhfr遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミド
ｐＤＨＦＲ11(Chang.A.C.Y.et al.,Nature 275,p617-62
4(1978))より、0.19KbのＴaqＩ断片及び1.3KbのＴaqＩ
−ＰstＩ断片（両断片は、ｃＤＮＡ中における連続した
断片である。）を単離した。1.0KbのＥcoＲＩ−ＴaqＩ
断片のＴaqＩ部位は、エクソンＩ中に単一に存在する認
識部位であり、ｃＤＮＡ中の最初のＴaqＩ部位に相当す
る。
これらの３つの断片は、ＥcoＲＩ−ＴaqＩ断片(1.0K
b)、ＴaqＩ断片(0.19Kb)、ＴaqＩ−ＰstＩ断片(1.3Kb)
の順に正しく並ぶよう連結し、ＴaqＩ断片が正方向に入
っている方のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片(2.49Kb)をｐＢＲ32
2のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（大きい方）に挿入し、ｐＭ
ｇ１を得た。
次に、マウス染色体dhfr遺伝子の最終エクソンと2.7Kb
の３′下流領域を持つプラスミドｐＤＨＦＲｇ１(Nunbe
rgJ.H.et al,Cell,19,p355-364(1980))より、1.8KbのＢ
gl II断片（マウス染色体dhfr遺伝子３′下流領域）を
単離した。このＢgl II断片(1.8Kb)を、ｐＭｇ１の２番
目のＢgl II部位に挿入し、ｐＭｇ２を得た。プラスミ
ド混合体及びキャリアＤＮＡをＣＨＯＤＨＦＲ−細胞に
トランスフェクションした（一つのプラスミドを獲得し
た細胞は一般に第二のプラスミドをも獲得する）。３日
後、細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン欠如培地の
数個の100mm培養プレートに、トリプシン処理して分散
させた。ＤＨＦＲ遺伝子で安定的にトランスフォーメー
ションされその結果ＥＰＯ遺伝子によってもトランスフ
ォーメーションされたそれらの細胞のみがこの培地で生
存する。７〜21日後、生存する細胞のコロニーが明確に
なった。これらのトランスフォーマントコロニーは、ト
リプシン処理で分散された後、ヒポキサンチンおよびチ
ミジン欠如培地中で継続して増殖することができ、新種
の細胞株（例えば、CHO pDSVL-MkEPO、CHO pSVgHuEPO、
CHO-pDSVL-gHuPO）が得られた。
上記細胞株の培養液を、組換えサルまたはヒトＥＰＯの
有無についてＲＩＡで分析した。CHO pDSVL-MkEPO株培
地は、プラスミドpDSVL-MkEPOでトランスフェクション
されたＣＯＳ−１細胞から得たＥＰＯと同様の免疫学的
性質を有するＥＰＯを含有していた。代表的な65時間培
養液は0.60U/mlのサルＥＰＯを含有していた。
CHO pSVgHuEPOおよびCHO pDSVL-gHuEPOの培養液は、プ
ラスミドpSVgHuEPOまたたpDSVL-gHuEPOでトランスフェ
クションされたＣＯＳ−１細胞から得たものと同様の免
疫学的性質を有する組換えヒトＥＰＯを含有していた。
ＲＩＡにより測定すると、代表的なCHO pSVgHuEPOの３
日間培養液は2.99U/mlのヒトＥＰＯを含有し、CHO pDSV
L-gHuEPOの5.5日間試料は18.2U/mlのヒトＥＰＯを有し
ていた。
前記細胞株から得られるＥＰＯ量は、遺伝子を増幅させ
て産生能の高い新規細胞株をつくることによって増加さ
せることができる。ＤＨＦＲ遺伝子によりコードされた
産物たるジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（ＤＨＦＲ）
は、薬物メソトレキセート（ＭＴＸ）で阻害することが
できる。更に具体的には、ヒポキサンチンおよびチミジ
ン欠如培地で増殖した細胞は、ＭＴＸにより阻害されま
たは殺される。適切な条件下（例えば最低のＭＴＸ濃
度）では、ＭＴＸに耐性でかつＭＴＸ下でも増殖可能な
細胞を得ることができる。これらの細胞は、ＤＨＦＲ遺
伝子数が増殖し、その結果ＤＨＦＲ酵素量が増加するこ
とにより、ＭＴＸ耐性であることが判明する。残存した
細胞を次いで、徐々に濃度を高めてＭＴＸで処理しても
よく、これにより更に多量のＤＨＦＲ遺伝子を含む細胞
株が得られる。ＤＨＦＲ遺伝子と一緒に発現ベクター上
に乗せられ、またはＤＨＦＲ遺伝子とともにトランスイ
ンフォーメーションされた「パッセンジャー遺伝子」
（例えばＥＰＯ）は、それらの遺伝子コピー数の増加が
しばしば見出されている。
この増幅系の実施例として、細胞株CHO pDSVL-MkEを徐
々に増加させたＭＴＸ濃度（０nM、30nMおよび100nM）
に供した。各増加段階から得た代表的な65時間培地試料
をＲＩＡ分析すると、それぞれ0.60、2.45および6.10U/
ml含有していた。細胞株CHO pDSVL-gHuEPOを、30nM、50
nM、100nM、200nM、１μＭ及び５μＭにＭＴＸ濃度を増
加させて試験に供した。100nMＭＴＸ段階から得た代表
的な３日間培地試料は、ＲＩＡで調べると、3089±129U
/mlのヒトＥＰＯを含有していた。100nM及び１μＭＭＴ
Ｘ段階から得た代表的な48時間培地試料は、ＲＩＡで調
べると（３回分析の平均）、それぞれ466および1352U/m
lのヒトＥＰＯを含有していた。これらの操作では、１
×106個の細胞を60mm培養皿中の培地５mlに接種した。2
4時間後、培地を除去し、無血清培地（0.1mMの非必須ア
ミノ酸およびＬ−グルタミンが添加された高グルコース
ＤＭＥＭ）５mlで置き換えた。ＥＰＯを無血清培地で48
時間蓄積させた。培地をＲＩＡ分析用に集め、細胞をト
リプシン処理し、計数した。100nMおよび１μＭＭＴＸ
で増殖した細胞に関する467U/mlおよび1352U/mlの平均
ＲＩＡ値から、それぞれ実際の収量2335U／プレートお
よび6750U／プレートが求められた。一プレート当りの
平均細胞数はそれぞれ1.94×106および3.12×106であっ
た。これらの培養条件下での有効産生速度は、したがっ
て、1264および2167U／106細胞／48時間であった。
直ぐ上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均一な群であ
る。標準的スクリーニング操作が、最大産生能を有する
おおむね均一なクローンを単離するために用いられてい
る。米国食品薬局(U.S.Food and Drug Administratio
n)、薬品および生物学センター(Center for Drugs and
Biologics)、生物学研究調査庁(Office of Biologics R
esearch Review)、1984年６月１日、「生物の産生に用
いられる株化細胞の特徴において考慮すべき点(Points
to Consider in the Characterization of Cell Lines
Used to Produce Biologics)］のセクションＡ、パート
２参照。
前記ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞系の生産性は、適切な細胞培
養技術により改善することができる。哺乳類培養細胞の
増殖には、成長培地に血清の存在を要する。血清を含有
しない培地でＣＨＯ細胞からエリスロポエチンを産生す
る方法は、培地からのエリスロポエチンの精製を著しく
容易化するものである。下記方法によれば、産生に充分
な多量の無血清培地において、経済的にエリスロポエチ
ンを産生させることができる。
標準的細胞培養条件下で増殖させたCHO pDSVL-gHuEPO細
胞株を用い、スピナー細胞培養フラスコに接種する。こ
の細胞を、５％胎児牛血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシンが添加された高グルコース
ＤＭＥＭおよびＨam′ｓＦ12の50−50混合物、0.05mM非
必須アミノ酸並びに適当な濃度のメソトレキセートから
なる培地が入ったスピナー細胞培養フラスコ内で、懸濁
液細胞系として増殖させる。懸濁細胞培養では、ＥＰＯ
産生ＣＨＯ細胞を容易に多量に増殖させることができ
る。懸濁液中で増殖したＣＨＯ細胞を用い、培地200ml
が入った850cm2のローラー瓶に1.5×107個の生育細胞の
初期接種密度で、ローラー瓶に接種する。細胞を３日間
にわたり、付着細胞系として一面に広がるまで増殖させ
る。この増殖相に使用される培地は、懸濁増殖に用いら
れたものと同様である。３日の増殖期間の最後に、血清
含有培地を除去し、100mlの無血清培地、即ち0.05mM非
必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添加された高グル
コースＤＭＥＭおよびＨam′ｓＦ12の50−50混合物で置
き換える。ローラー瓶をローラー瓶インキュベーターに
１〜３時間戻し、培地を再び除去し、新しい無血清培地
100mlで置き換える。無血清培地を１〜３時間インキュ
ベートすると、汚染血清蛋白質濃度が減少する。ローラ
ー瓶を７日間インキュベーターに戻し、その間にエリス
ロポエチンが無血清培地中で蓄積する。７日間の産生期
の最後に、培養済み培地を除去し、第二の産生サイクル
のために新しい無血清培地で置き換える。この産生系の
実施例では、代表的な７日間無血清培地試料は、ＲＩＡ
によると3982±409U/mlのヒトエリスロポエチンを含有
していた。0.9〜1.8×105細胞／cm2の推定細胞密度に基
づけば、各850cm2のローラー瓶は0.75〜1.5×108個の細
胞を含有しており、したがって７日間の100mlの培養に
ついてのＥＰＯ産生速度は750〜1470U/106細胞／48時間
であった。
10mM MTXで処理された細胞株CHO pDSVL-MkEPOの培養液
をＲＩＡイン・ビトロおよびイン・ビボＥＰＯ活性分析
に供した。培養済み培地試料は、ＲＩＡで測定すると4
1.2±1.4U/ml、イン・ビトロ生物学的活性分析で測定す
ると41.2±0.064U/mlおよびイン・ビボ生物学的活性分
析で測定すると42.5±5U/ml、のＭｋＥＰＯを含有して
いた。ポリペプチド生成物のアミノ酸の配列を調べると
ＥＰＯ生成物の存在が示されており、基本的な種では推
定アミノ末端アラニンに隣接する「リーダー」配列の３
残基分を有していた。これは、ＣＨＯ細胞内でのポリペ
プチドの膜処理が不正確であることの結果なのか、ある
いはヒトＥＰＯと比較したサルＥＰＯアミノ末端構造の
違いを反映しているのかはまだわかっていない。
細胞株CHO pDSVL-gHuEPO培養液を３つの分析に供した。
5.5日目の試料は、培地中に組換えヒトＥＰＯを、ＲＩ
Ａ分析で18.2U/ml、イン・ビトロ分析で15.8±4.6U/ml
およびイン・ビボ分析で16.8±3.0U/ml含有していた。
徐々に100nMのＭＴＸまで増加させて得たCHO pDSVL-gHu
EPO細胞の培養液を３つの分析に供した。３日間の試料
は、組換えヒトＥＰＯをＲＩＡで3089±129U/ml、イン
・ビトロ分析で2589±71.5U/mlおよびイン・ビボ分析で
2040±160U/ml含有していた。この生成物のアミノ酸配
列は表VIに示したアミノ末端と一致している。
10nMのＭＴＸ中、プラスミドpDSVL-MkEでトランスフェ
クションされたＣＨＯ細胞培養済み培地をプールし、数
日間にわたりＭＴＸを透析除去すると、221±5.1U/ml(E
PO-CCM)のＥＰＯ活性がある培地が得られた。正常BALB/
cマウスのヘマトクリット値に及ぼすEPO-CCMのイン・ビ
ボ効果を調べるため、以下の実験を行なった。トランス
フェクションしてないＣＨＯ細胞の細胞培養済み培地
（ＣＣＭ）およびEPO-CCMをＰＢＳで調製した。ＣＣＭ
をコントロール群（マウス３匹）に用い、２つの用量の
EPO-CCM（４単位（Ｕ）の注射および44単位（Ｕ）の注
射）を実験群（１群２匹）に用いた。５週間の間、７匹
のマウスを週３回腹腔内注射した。８回目の注射後にお
ける、コントロール群の平均ヘマトクリット値は50.4
％、４Ｕ群は55.1％、および44Ｕ群は67.9％であった。
従って、本発明によって得られる組換ＥＰＯは、イン・
ビボに於いて、赤血球の産生を増大させる機能を有する
ことが実証された。
哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾配をかけ、好
ましくはpH７でＨＰＬＣ（Ｃ４）に付すことにより、培
地から実質的に精製された形で容易に回収することがで
きる。
予備実験を行ない、ＣＯＳ−１およびＣＨＯ細胞におけ
るヒトＥＰＯ遺伝子発現調整培地から得られる組換え糖
蛋白質生成物を、ウェスタン・ブロット分析およびＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによってヒト尿ＥＰＯ単離物と比較して、
その特徴を調べた。これらの研究では、ＣＨＯ由来ＥＰ
Ｏ物質はＣＯＳ−１発現生成物よりもやや高分子量であ
ったが、この生成物はプールされたヒト尿抽出よりもわ
ずかに大きいことが判明した。全ての生成物はやや不均
一であった。シアル酸を除去するためのノイラミニダー
ゼ酵素処理により、ほぼ同じ分子量であるにもかかわら
ず、いずれも得られたアシアロヒト尿抽出物よりも大で
あるＣＯＳ−１およびＣＨＯ組換え生成物が得られた。
組換えＣＨＯ生成物および尿抽出生成物を（両者から炭
水化物を全て除去するため）エンドグリコシダーゼＦ酵
素（ＥＣ3.2.1）処理して比較した結果、本質的に同一
の分子量を有する実質的均一生成物を得た。
精製されたヒト尿ＥＰＯおよび本発明による組換え型の
ＣＨＯ細胞産生ＥＰＯを、ネッサーら：「アナリチカル
・バイオケミストリー」、第142巻、第58-67頁、1984年
[Nesser,et al.,Anal.Biochem.,142,58-67(1984)]の加
水分解方法を用いて修正したレディーンら：「メソッズ
・イン・エンザイモロジー」、第83巻（Ｄ部）、第139-
191頁、1982年[Ledeen,et al.,Methods in Enzymology,
83(Part D),139-191(1982)]の方法により炭水化物分析
に供した。尿単離物について実験的に求めた炭水化物組
成値（生成物中の炭水化物モル比で示される）は次のと
おりであった：ヘキソース1.73、N-アセチルグルコサミ
ン１、N-アセチルニューラミン酸0.93、フコース０、お
よびN-アセチルガラクトサミン０。組換え生成物（100n
MのＭＴＸを含むCHO pDSVL-gHuEPOの３日間培地から得
たもの）の値は次のとおりであった：ヘキソース15.0
9、N-アセチルグルコサミン１、N-アセチルニューラミ
ン酸0.998、フコース０、およびN-アセチルガラクトサ
ミン０。これらの値は、上記ウェスタンおよびＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析ともに一致している。
本発明で得られる糖蛋白質生成物は、このように、天然
エリスロポエチンの一以上の生物学的性質を保有するの
に充分なその複製である一次構造形状を有し、しかも天
然エリスロポエチンのものとは異なる平均的炭水化物組
成を有する生成物として理解される。
例１１ 本例は、表VIに示したヒト種ＥＰＯ配列をコードし、大
腸菌および酵母菌［サッカロマイセス・セレビシエ(S.c
erevisiae)］細胞での発現におけるそれぞれの「優先」
コードンで取込んでいる２つの構造遺伝子ヌクレオチド
塩基集合体の全体的製造に関する。また、ヒトＥＰＯ類
縁体をコードする遺伝子の構造についても述べられてい
る。簡単に言うと、用いられたプロトコールは、先に示
したアルトンらの開示（1983年11月24日にＷＯ83／0405
3として公開）に掲載されているものとほぼ同じであっ
た。遺伝子はまず成分オリゴヌクレオチドを組み立てて
マルチプル・ジュープレックスとし、これを次いで３つ
の別個のセクションに組み立てるように設計した。これ
らのセクションは、容易に増幅するように設計してあ
り、増幅系から除いてから順番に、あるいは多数フラグ
メントの結合により、適切な発現ベクターに構築され
た。
下記表VIII〜ＸIVは、いかなるリーダーまたはプレ配列
も欠如しているが、−１位に第一のメチオニン塩基を有
するヒトＥＰＯ翻訳生成物をコードする合成遺伝子の設
計と組立体を示している。更に遺伝子は実質的部分に大
腸菌の優先コードンを取込んでおり、このためその構築
は「ＥＣＥＰＯ」遺伝子と呼ばれる。
更に具体的には、表VIIIは、ヒト種ポリペプチドのアミ
ノ末端残基をコードするセクション１のＥＣＥＰＯの遺
伝子を得るために用いられるオリゴヌクレオチドを示し
ている。オリゴヌクレオチドは二重鎖（１と２、３と４
等）として組立てられ、二重鎖は次いで結合され、表IX
のようなＥＣＥＰＯセクション１が得られた。組立てら
れたセクションは末端ＥcoＲＩ及びＢamＨＩ付着端をそ
れぞれ含み、ＥcoＲＩ付着端の「下流」にはＸbaＩ制限
酵素認識部位が存在し、ＢamＨＩ付着端の「上流」には
ＫpnＩ認識部位が存在していることに注目されたい。セ
クション１は、このセクションの配列の確認のために用
いられるＭ13ファージベクターを用いて、容易に増幅さ
せることができた。いくつかの困難な点が、大腸菌由来
ＲＦ ＤＮＡからＸbaＩ／ＫpnＩフラグメントとしてセ
クションを単離する上で現われたが、それはおそらく宿
主内でＫpnＩ認識部位塩基がメチル化されるためであろ
う。一本鎖ファージＤＮＡがしたがって単離され、プラ
イマー・エクステンション法によりイン・ビトロで二重
鎖型とされ、しかる後所望の二重鎖フラグメントが容易
に単離された。
ＥＣＥＰＯ遺伝子セクション２および３（表XIおよびXI
II）を、表ＸおよびXIIのオリゴヌクレオチドからそれ
ぞれ同様の方法で調製した。各セクションは配列の認識
に用いられるＭ13ベクターで増幅され、ファージＤＮＡ
から単離された。表XIから明らかなように、ＥＣＥＰＯ
セクション２はＥcoＲＩおよびＢamＨＩ付着端から構成
されており、ＫpnＩ／Ｂgl IIフラグメントとして単離
することができた。同様に、ＥＣＥＰＯセクション３は
ＢamＨＩおよびＳalＩ付着点から調製し、Ｂgl lI／Ｓa
lＩフラグメントとしてファージＲＦ ＤＮＡから単離
することができた。このように調製された３つのセクシ
ョンは、大腸菌翻訳開始のアミノ末端メチオニンコドン
（ＡＴＧ）を含み、完全なヒトＥＰＯポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ連鎖（表ＸIV）として容易に組立てする
ことができる。開始ＡＴＧの「上流」には、大腸菌の高
度な発現ＯＭＰ−ｆ遺伝子におけるリボソーム結合部位
配列を実質的に複製する一連の塩基対が存在しているこ
とにも注目されたい。
適切な発現ベクターを用いてＥＣＥＰＯを運搬すること
ができる。特定のベクターとして、チャールズ・エフ・
モーリス(Charles F.Morris)により1984年８月６日に出
願され、同時に係属中の米国特許出願第636,727号（公
開された欧州特許出願No,136,490）に記載された、プラ
スミドpCFM414(A.T.C.C.40076)の誘導体である「温度感
受性」プラスミドpCFM536をＥＣＥＰＯ遺伝子発現用に
選択した。より具体的にはpCFM536をＸbaＩおよびＨind
IIIで消化し、大フラグメントを単離して、ＥＣＥＰＯ
遺伝子と２つの部分で結合させるのに用いた。セクショ
ン１（ＸbaＩ／ＫpnＩ）、２（ＫpnＩ／Ｂgl II）およ
び３（Ｂgl II／ＳalＩ）をＭ13内で正確な順序で予め
組立てておき、ＥＰＯ遺伝子をそれから一本のＸbaＩ／
Ｈind IIIフラグメントとして単離した。このフラグメ
ントは、Ｍ13mp９ファージ由来のＳalＩからＨind III
までの部位のポリリンカーの部分を有していた。得られ
た発現プラスミドp536による発現の制御はラムダＰＬプ
ロモーターによりなされたが、このプロモーター自体、
ＣI857リプレッサー遺伝子（例えば、大腸菌株Ｋ12ΔＨ
trpから得られる）の支配下にある。
上記合成ＥＣＥＰＯ遺伝子は、下記のような［Ｓsn２、
des-Pro２〜Ｉle６］ｈＥＰＯおよび［Ｈis７］ｈＥＰ
Ｏのようなエリスロポエチン類縁体をコードするように
様々に変更してもよい。
Ａ．［Ａsn２、des-Pro２〜Ｉle６］ｈＥＰＯ ＸbaＩ〜Ｈind III挿入体として、表ＸIVのＥＣＥＰＯ
合成遺伝子を担持するプラスミド536をＨind IIIおよび
ＨhoＩで消化した。後者のエンドヌクレアーゼは、Ａsp
８をコードするコードンの最後の塩基からＡrg10コード
ンの二番目の塩基までの唯一の６塩基対認識部位におい
てＥＣＥＰＯ遺伝子を切断する。ＸbaＩ／ＸhoＩ「リン
カー」配列を製造したが、それは次の配列を有してい
た。
ＸbaＩ／ＸhoＩリンカーおよびＸhoＩ／Ｈind III ECEP
O遺伝子鎖フラグメントを、チャールズ・エフ・モーリ
ス(Charles F.Morris)により1984年８月６日に出願さ
れ、同時に係属中の米国特許出願第636,727号明細書に
記載された、プラスミドpCFM414(A.T.C.C.40076)の誘導
体であるプラスミドpCFM526のＸbaＩおよびＨind III切
断により得られる大フラグメントに挿入し、所望の類似
体のＭet-1型の大腸菌発現をコードするプラスミド担持
ＤＮＡ配列を得た。
Ｂ．［Ｈis７］ｈＥＰＯ プラスミド536を、前記ＡのようにＨind IIIおよびＸho
Ｉで切断した。ＸbaＩ／ＸhoＩリンカーを製造したが、
それは次の配列を有していた。
リンカーおよびＸhoＩ／Ｈind III ECEPO配列フラグメ
ントを次いでpCFM526に挿入し、所望の類縁体のＭet-1
型の大腸菌発現をコードするプラスミド担持ＤＮＡ配列
を得た。
酵母菌の優先コードンを取込んだ合成遺伝子（「SCEP
O」）の構造は、以下の表ＸＶ〜ＸXIに示したとおりであ
る。ECEPO遺伝子の場合と同様に、完全な構築には３組
のオリゴヌクレオチド（表ＸＶ、ＸVIIおよびＸIX）形
成が含まれており、これを二重鎖に形成し、各セクショ
ン（表ＸVI、ＸVIIIおよびＸＸ）に組立てた。合成は、
SCEPOおよびECEPOの構造においていくらか適合性のある
(sub-optimal）コードン（即ち、各遺伝子におけるセク
ション２のオリゴヌクレオチド１〜６と同様に、各遺伝
子のセクション１のオリゴヌクレオチド７〜12が一致す
る）を用いることにより、部分的に容易化されたことに
注目されたい。
組立てられたSCEPOセクションがＭ13にて配列決定さ
れ、セクション１、２および３はＨind III／ＫpnＩ、
ＫpnＩ／Ｂgl IIおよびＢgl II／ＳalＩフラグメントし
てファージから単離可能であった。
SCEPO遺伝子生成物にとり現在好ましい発現系は、グラ
ンド・エー・ビッターにより1983年４月22日に出願さ
れ、同時に欧州特許出願第0123,294号として1984年10月
31日に公開された、係属中の米国特許出願第487,753号
明細書に記載されているようなサッカロマイセス・セレ
ビシエのα−因子分泌に基づく分泌系である。簡単に言
えば、この系は、酵母α−因子遺伝子生成物のリーダー
配列をコードするＤＮＡが、発現すべき外来性遺伝子の
暗号領域の５′側に直接位置している構造からなる。そ
の結果、翻訳された遺伝子生成物は、余剰生成物の分泌
時に、内在酵母酵素によって「切離される」リーダーま
たはシグナル配列を含んでいる。この構築ではα−因子
翻訳開始（ＡＴＧ）コードンを利用しているため、SCEP
O遺伝子の−１位にそのようなコードンを付与する必要
がなかった。表ＸXIから明らかになるであろうように、
アラニン(+1)暗号配列は、α−因子プロモーターに続く
α−因子リーダーの最初の80残基のＤＮＡを含むプラス
ミドに直接挿入されるリンカー配列の後にきている。SC
EPO遺伝子発現のための特定の好ましい構築において
は、前記SCEPOセクションフラグメントおよびプラスミ
ドｐαＣ３のＨind III／ＳalＩ消化による大フラグメ
ントからなる４部分の結合が行なわれる。得られるプラ
スミドｐαＣ３−SCEPOから、α−因子プロモーター、
リーダー配列およびSCEPO遺伝子をＢamＨＩ消化により
単離し、ＢamＨＩ消化プラスミドｐＹＥと連結させて、
発現プラスミドpYE/SCEPOを形成した。
例１２ 本例は、例１１の発現系における、合成ECEPOおよびSCE
PO遺伝子の組換え生成物の発現に関する。
大腸菌宿主細胞に用いられる発現系において、例１１の
プラスミドｐ536を、ＣI857遺伝子を有する適切なプラ
スミドpMW1で予めトランスフォメーションされたＡＭ７
大腸菌細胞に移入させた。ＬＢブロス（アンピシリン50
μｇ／mlおよびカナマイシン５μｇ／ml、好ましくは10
mMＭｇＳＯ４も添加）中の培養細胞を28℃に維持し、O.
D.600＝0.1となるまで培養細胞が増殖してから、培養温
度を42℃に上げてＥＰＯ発現を誘導した。約40O.D.まで
増殖した細胞は、約５mg／OD.リットルのＥＰＯ生成物
（ゲルで評価）を産生した。
細胞を採取し、分離し、フレンチプレス(10000psi)で破
壊し、リゾチームおよびＮＰ−40界面活性剤で処理し
た。24000xg遠心分離で得たプレットを塩酸グアニジン
で溶解し、Ｃ４（バイダック、Ｖydac）、リバース・フ
ェース(Reverse Phase)ＨＰＬＣ（ＥtoＨ０〜80％、50m
MＮＨ４Ａｃ、pH4.5）により一工程で更に精製した。分
離した蛋白質は95％以上純粋な生成物であり、得られた
生成物は、約３：１の量比で、二つの異なるアミノ末端
A-P-P-R……およびP-P-R……を有していた。ｈＥＰＯお
よび［desＡla１］ｈＥＰＯ生成物について後者の観察
は、宿主細胞におけるアミノ末端「プロセッシング」
が、末端メチオニンおよびある場合には開始アラニンを
除去するように作用することを示している。単離物のラ
ジオイムノアッセイ活性は150000〜160000Ｕ／mgであ
り、イン・ビトロ分析活性では30000〜62000Ｕ／mgであ
り、更にイン・ビボ分析活性では約120〜720Ｕ／mgであ
った（参考のために、各分析におけるヒト尿単離物標準
は70000Ｕ／mgである）。イン・ビボ分析における組換
え生成物の用量応答曲線は、ヒト尿ＥＰＯ標準のものと
は著しく異なっていた。
例１１のＡおよびＢで形成されたＥＰＯ類似プラスミド
を、ｐＭＷ１でトランスフォーメーションされたＡＭ７
大腸菌細胞にそれぞれ移入させ、細胞を上記のように培
養した。精製単離物をＲＩＡおよびイン・ビトロ分析で
試験した。［Ａsn２、des-Ｐro２〜Ｉle６］ｈＥＰＯ発
現生成物のＲＩＡおよびイン・ビトロ分析値はそれぞれ
約11000U/mgおよび6000Ｕ／mg蛋白質であったが、［His
７］ｈＥＰＯの分析値はそれぞれ約41000U/mgおよび140
00U/mg蛋白質であって、類似生成物が分析によると
「親」発現生成物の1/4〜1/10「活性」であることが示
された。
サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞に用いられる発
現系において、プラスミドpYE/SCEPOを二つの異なる
株、即ち、YSDP４（遺伝子型αpep4-3trp1）およびＲＫ
81（遺伝子型ααpep4-3trp1）に移入させた。トランス
フォーメーションされたYSDP４宿主を、カザミノ酸が0.
5％添加されたpH6.5のＳＤ培地［ニューヨーク州、コー
ルドスプリングハーバー所在、コールドスプリングハー
バーラボラトリー、「酵母遺伝学の方法(Methods in Ye
ast Genetics)、第62頁、1983年］で30℃にて増殖させ
た。細胞が36O.D.まで増殖したときに採取した培地は、
ＥＰＯ生成物を約244U/ml（ＲＩＡで97μｇ／OD・リッ
トル（含有していた。6.5 O.D.または60 O.D.まで増殖
した形質転換ＲＫ８１細胞は、約80〜90U/mlのＥＰＯ濃
度（ＲＩＡで34μｇ／OD・リットル）の培地を与えた。
予備分析では、発現系により得られる生成物は極めて不
均一であったが、それはおそらく発現される蛋白質のグ
リコシル化が様々であり、関連する炭水化物の中でマン
ノース含量が比較的高かったためであろう。
ＨＢ101大腸菌細胞に含まれるプラスミドＰαＣ３およ
びｐＹＥを、1984年９月27日に米国特許庁施行規則に従
い、それぞれ受託番号A.T.C.C.No.39881およびA.T.C.C.
No.39882として、メリーランド州、ロックビル、パーク
ローン・ドライブ12301のアメリカン・タイプ、カルチ
ャー・コレクション(American Type Culture Collectio
n)に寄託した。ＡＭ７細胞中のプラスミドpCFM526、Ｊ
Ｍ103細胞中のpCFM536およびＪＭ103細胞のpMW1を同様
に、それぞれA.T.C.C.No.39932、No.39934およびNo.399
33として、1984年11月21日に寄託した。サッカロマイセ
ス・セレビシエ株YSPD4およびＲＫ81をそれぞれA.T.C.
C.No.20734およびNo.20733として1984年11月21日に寄託
した。
多数の極めて貴重な生成物および操作法が様々な面で本
発明により提供されることは、前記実施例を考慮すれば
容易に明らかとなるであろう。
本発明により提供されるポリペプチドは、それらが微生
物で発現された生成物であろうと、あるいは合成生成物
であろうと、それらの一次、二次または三次構造形状は
本発明で初めて公けになったものであるが、極めて有用
な物質である。
前述のように、本発明の組換え体由来および合成生成物
は、天然源からのＥＰＯ単離物のイン・ビトロ生物学的
活性を様々な程度で保有しており、したがって赤血球形
成細胞の増殖に用いられる培地において、ＥＰＯ単離物
に対する代替物としての利用性を有するものと考えられ
る。同様に、本発明のポリペプチド生成物が天然ＥＰＯ
単離物のイン・ビボ活性を有する範囲内において、それ
らはヒトをはじめとする哺乳動物におけるエリスロポエ
チン治療処置に用いるのに極めて好適であり、イン・ビ
ボでのＥＰＯに起因する効果、例えば、網状赤血球応答
の刺激、鉄動態効果の促進（例えばプラズマ鉄回転効果
および骨髄通過時間効果）、赤血球質量変化、ヘモグロ
ビン合成促進および例１０に示した哺乳動物におけるヘ
マトクリット値の増加などのあらゆる効果を促進させ
る。本発明の生成物で治療可能なヒトの分類の中には、
一般に輸血を要する患者、外傷者などの外科患者、透析
患者などの腎疾患患者並びに血友病、鎌型赤血球病及び
生理学的貧血などのような各種血液組織に影響を及ぼす
疾患の患者が含まれる。ＥＰＯ治療の採用による輸血治
療の必要性の最小化は感染物質による感染の抑制につな
がると期待される。本発明の生成物は、組換え法により
生産されたものであるため、発熱物質、天然阻害物質等
が混入しておらず、このため天然由来生成物と比べ、高
い総合的な治療効果を発揮すると予想される。本発明の
生成物によるエリスロポエチン治療は、低酸素環境条件
下にある固体において酸素供給能を高め、更には可能性
として有益な心臓脈管効果をもたらすと期待される。
本発明のポリペプチド生成物を投与するための好ましい
方法は、非経口投与（例えば、静注、筋注、皮下注また
は腹腔内注）であり、投与される組成物には、治療上有
効量の生成物が、薬学上許容される希釈剤、担体および
（または）アジュバントとともに通常含有されている。
予備的な薬物動力学的研究では、サルＥＰＯ生成物に関
し、静注よりも筋注投与の場合に、イン・ビボでより長
い半減期を示す。有効量は治療条件によって実質上変動
すると思われるが、治療量は実際には活性物質の7U〜70
00Ｕ／kg体重の範囲内であると予想される。ヒト血清ア
ルブミンのような標準的希釈剤が本発明の医薬組成物用
として考えられ、生理食塩水のような標準的担体が同様
に考えられる。
本発明の組成物に使用するのに好適なアジュバント物質
には、テストステロン、前駆細胞刺激剤、インシュリン
様成長因子、プロスタグランジン類、セロトニン、サイ
クリックＡＭＰ、プロラクチンおよびトリヨードチロニ
ンのように赤血球生成刺激効果に関して独立に注目され
る化合物、並びにメテノレン、スタノゾロールおよびナ
ンドロロンのように、再生不良性貧血の治療に一般に用
いられる薬物が含まれる。それぞれのエリスロポエチン
刺激効果について注目される化合物が挙げられる［例え
ば、レセゴッチら：「パンミナーバ・メディカ」、第23
巻、第243-248頁、1981年[Resegotti,et al.,Panminerv
a Medica,23,243-248(1981)]、マックゴニグルら：「キ
ドニー・イント」、第25巻、第２号、第437-444頁、198
4年[McGonigle,et al.,Kidney Int.,25(2),437-444(98
4)]、バブロビック−カンテラら：「エクスペリメンタ
ル・ヘマトロジー」、第８巻（増刊第８号）、第283-29
1頁、1981年[Pavlovic-Kantera,et al.,Expt.Hematol.,
8(Supp.8),283-291(1980)]、およびクルツ：「FEBSレタ
ーズ」、第14a巻、第１号、第105-108頁、1982年[Kurt
z,FEBS Letters,14a(1),105-108(1982)]参照］。更にア
ジュバントとして考えられるものには、アドレナリン作
動性物質、甲状腺ホルモン、男性ホルモンおよびＢＰＡ
のように、エリスロポエチンまたはアシアロ−ＥＰＯの
効果を高めること、あるいは補強すること、が報告され
た物質［ダン：「血球増生の最近の概念」[Dunn,"Curre
nt Concepts in Erythropiesis"]、ジョン・ワイリーお
よびサンズ（イングランド、チェスター、1983年）[Jon
Wiley and Sons(Chichester,England,1983)]、ウィー
ランドら：「ブルート」、第44巻、第３号、第173-175
頁、1982年[Weiland,et al.,Blut,44(3),173-175(198
2)]、カルマンチ：「キドニー・イント」、第22巻、第3
83-391頁、1982年[Kalmanti,Kidney Int.,22,383-391(1
982)]，シャヒジ：［ニュー・イングランド・ジャーナ
ル・オブ・メディスン」、第289巻、第72-80頁、1973年
[Snahidi,New Eng.J.Med.,289,72-80(1973)]、フィッシ
ャーら：「ステロイズ」、第30巻、第６号、第833-845
頁、1977年[Fisher,et al.,Steroids,30(6),833-845(19
77)]、ウラベら：「ジャーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メディスン」、第149巻、第1314-1325頁、1979年
[Urabe,et al.,J.Exp.Med.,149,1314-1325(1979)]、お
よび、ビラットら：「エクスペリメンタル・ヘマトロジ
ー」、第10巻、第１号、第133-140頁、1982年[Billat,e
t al.,Expt.Hematol.,10(1),133-140(1982)]参照］、並
びに「肝造血因子」と目される化合物類［ノートンら：
「アクタ・ヘマティカ」、第69巻、第171-179頁、1983
年[Naughton,et al.,Acta.Haemat.,69,第171-179頁(198
4)］参照］、「エリスロトロピン類」(Erythrotropins)
［コンゴート(Congote)ら：第７回内分泌学国際会議（1
984年７月1-7日、ケベック、ケベック市）の会誌、抄録
364、コンゴート：「バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ」、第115巻、第
２号、第447-483頁、1983年[Congote,Biochem.Biophys.
Res.Comm.,115(2),447-483(1983)]およびコンゴート：
「アナリチカル・バイオケミストリー」、第140巻、第4
28-433頁、1984年[Congote,Anal.Biochem.,140,428-433
(1984)]に記載］および「エリスロジェニン類」(erythr
ogenins)［ロマンスら：ジャーナル・オブ・サージカル
・オンコロジー」、第20巻、第105-108頁、1982年[Roth
man,et al,.J.Surg.Oncol.,20,105-108(1982)]に記載］
が挙げられる。予備スクリーニングでは、5-α−ジヒド
ロテストステロンまたはナンドロロンで前処理された超
低酸素赤血球増加マウスの造血応答性を調べたが、前記
本発明のエリスロポエチンについて明確な結果が得られ
なかった。
本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に広範であり、
ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ等の各種イムノアッセイ技術、
並びに各種のイン・ビトロおよびイン・ビボ活性分析に
おいて標識および未標識型での使用が挙げられる。例え
ば、ダンら：「エクスペリメンタル・ヘマトロジー」、
第11巻、第７号、第590-600頁、1983年[Dunn,et al.,Ex
pt.Hematol.,11(7),590-600(1983)]、ギブソンら：「パ
ソロジー」、第16巻、第155-156頁、1984年[Gibson,et
al.,Pathology,16,155-156(1984)]，クリスタル：「エ
クスペリメンタル・ヘマトロジー」、第11巻、第７号、
第590-600頁、1983年[Krystal,Expt.Hematol.,11(7),64
9-660(1983)]，サイトーら：「ジャパニーズ・ジャーナ
ル・オブ・メディスン」、第23巻、第１号、第16-21
頁、1984年[Saito,et al.,Jap.J.Med.,23(1),16-21(198
4)]、ネーザンら：「ニューイングランド・ジャーナル
・オブ・メディスン」、第308巻、第９号、第520-522
頁、1983年[Nathan,et al.,New Eng.J.Mes.,308(9),520
-522(1983)]、およびそれに関する分析についての各種
文献参照。ここに初めて開示されたＥＰＯ残基配列から
なる合成ペプチドをはじめとする本発明のポリペプチド
は、また、ポリクローナル抗体、並びに各種の連続的お
よび非連続的ＥＰＯエピトープに対して特異的なモノク
ローナル抗体の「ハング」を得るために極めて有用な純
粋物質を提供する。一例として、ホップら：「P.N.A.S.」
（米国）、第78巻、第3824-3828頁、1981年[Hopp,et a
l.,P.N.A.S(U.S.A),78,pp3824-3828(1981)]による親水
性に関し、またチューら：「アナルス・レヴュー・バイ
オケミストリー」、第47巻、第251頁、1978年[Chou,et
al.,Ann.Rev.Biochem.,47,p251(1978)]による二次構造
について、表VIのアミノ酸配列の予備分析では、41-57
位、116-128位および144-166位を含む連続残基配列の複
製である合成ペプチドは高い抗原応答性を生み出すであ
ろうこと並びに合成ペプチドおよび完全蛋白質と免疫応
答する有用なモノクローナルおよびポリクローナル抗体
を与えるであろうことを示している。このような抗体
は、ＥＰＯおよびＥＰＯ関連生成物の検出およびアフィ
ニティ精製に有用であると予想される。
実際に、下記三種の合成ペプチドが製造された： (1)hEPO 41-57,V-P-D-T-K-V-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G; (2)hEPO 116-128,K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A; (3)hEPO 144-166,V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-
C-R-T-G-D-R. 上記ポリペプチドを用いた予備免疫試験では、125Ｉ−
標識化ヒト尿ＥＰＯ単離物を免疫沈降させるウサギ血清
抗体能を測定すると、ｈＥＰＯ41-57に対して比較的弱
い陽性応答性を示し、ｈＥＰＯ116-128に対しては明確
な応答を示さず、ｈＥＰＯ144-166に対し強い陽性応答
性を示した。三種のペプチドについての予備的なイン・
ビボ活性試験では、単独ででもまた組合せでも、さほど
活性を示さなかった。
前記諸例で得られた哺乳類ＥＰＯのアミノ酸残基の配列
を推定してみると、これは成熟ＥＰＯの一次構造形状を
本質的に示しているが、表Ｖのサル種ＥＰＯの165アミ
ノ酸残基の特定配列および表VIのヒト種ＥＰＯの166残
基により、本発明で得られる有用なポリペプチドの範囲
が制限されるものではないことを理解されたい。本発明
には、ヒトγ−インターフェロンのような生物学的活性
哺乳類ポリペプチドの過去の研究により明らかにされた
ところからおそらくは存在するであろうところのＥＰＯ
の各種天然対立遺伝子型が含まれる［例えば、ＥＰＯ出
願第0077670号として公開され、140位にアルギニン残基
を有すると報告されたヒト免疫インターフェロン種、お
よびグレーら「ネイチャー」、第295巻、第503-508頁、
1982年[Gray,et al.,Nature,295,pp503-508(1982)]にお
いて、140位にグルタミンを有するとして報告された種
と比較されたい。］両種とも「成熟」ヒトγ−インター
フェロン配列を構成するものとされている。成熟ＥＰＯ
ポリペプチドの対立遺伝子型は、配列の長さに関しおよ
び（または）配列内のアミノ酸の欠如、置換、挿入また
は付加に関して、交互に、又表ＶおよびVIの配列との間
で異なっているであろう。その結果、グルコシル化能に
おいて潜在的な多様性が生じる。前述したように、一つ
の推定されるヒト種ＥＰＯの対立遺伝子型には、126位
にメチオニン残基を含むものが考えられる。予期したよ
うに、ＥＰＯをコードするＤＮＡゲノムおよびｃＤＮＡ
配列の天然対立遺伝子型として、上記型の対立遺伝子ポ
リペプチドとコードするか、あるいは特定の同様のポリ
ペプチドを示す別のコードンを単に有するものも発生し
ているようである。
成熟ＥＰＯの天然対立遺伝子型の他に、本発明ではＥＰ
Ｏのポリペプチド類縁体および「成熟」ＥＰＯフラグメ
ントのような他の「ＥＰＯ生成物」を包含するものであ
る。アルトンらによる前記公開出願(wo/83/04053)の方
法により、一以上の残基の同一性または存在位置（例え
ば、置換、末端および中間的付加並びに削除）について
ここに特定された成熟ＥＰＯとは異なる一次構造を有す
るポリペプチドの微小生物発現をコードしている遺伝子
を容易に設計し、製造することができよう。あるいは、
ｃＤＮＡおよびゲノムＥＰＯ遺伝子の改変は、周知の特
定部位突然変異誘発技術により容易に実施でき、またＥ
ＰＯ類縁体および誘導体を得るために利用することがで
きる。このようなＥＰＯ生成物は少なくとも一つのＥＰ
Ｏの生物学的性質を有するが、他の点では異なっていて
もよい。例えば、本発明で計画されるＥＰＯの生成物に
は、例えば削除によって短縮された形のもの［Ｓsn２、
des-Ｐro２〜Ｉle６］ｈＥＰＯ、［des-Ｔhr163〜Ａrg
166］ｈＥＰＯおよび「Δ27-55ｈＥＰＯ」があって、特
にこの後者は完全なエキソンによってコードされた残基
を欠いたものである。また、本発明のＥＰＯ生成物に
は、加水分解に対しより安定なもの（したがって、天然
ＥＰＯよりも著しい、または長い持続性を有するであろ
う）、一以上のグリコシル化可能部位を削除して変換さ
れたもの（酵母産生生成物ではより高い活性を有するよ
うになるかもしれない）、一以上のシステイン残基が削
除されまたは例えばヒスチジンもしくはセリン残基で置
換され（例えば、［Ｈis７］ｈＥＰＯ類縁体）、微小生
物系から更に容易に活性型で単離され得るもの、あるい
は、一以上のチロシン残基がフェニルアラニルで置換さ
れ（例えば、類縁体の［Ｐhe15］ｈＥＰＯ、［Ｐhe49］
ｈＥＰＯおよび［Ｐhe145］ｈＥＰＯ）、多少なりとも
標的細胞のＥＰＯレセプターと容易に結合し得るもの、
が含まれる。更には、成熟ＥＰＯ内の一部のアミノ酸配
列または二次構造のみを複製したものであって、フラグ
メントが一つのＥＰＯ活性（例えばレセプター結合性）
を有し、他の活性（例えば、造血機能）を有していない
ポリペプチドフラグメントも含まれる。この点に関しと
くに重要であるのは、表VIのヒトゲノムＤＮＡ配列によ
り解明されたこれらの可能なＥＰＯフラグメントであ
り、即ちイントロン配列で示されかつ生物学的機能のう
えで独立の「ドメイン」を構成する全体的ＥＰＯ配列の
「フラグメント」である。本発明のいかなる一以上の
「ＥＰＯ生成物」におけるイン・ビボ活性が欠如して
も、治療上の有用性（前記ウィーランドら参照）または
ＥＰＯ分析もしくはＥＰＯ拮抗作用のような他の関連分
野での有用性を全体的には阻害しないことが注目され
る。エリスロポエチン拮抗剤は、赤血球増加症またはＥ
ＰＯ過剰産生時の治療に極めて有用であろう［例えば、
アダムソン：「ホスピタル・プラクティス」、第18巻、
第12号、第49-57頁、1983年[Adamson,Hosp.Practice,18
(12),49-57(1983)]およびヘルマンら：「クリニカル・
アンド・ラボラトリー・ヘマトロジー」、第５巻、第33
5-342頁、1983年[Hellmann,et al.Clin.Lab.Haemat.,5,
335-342(1983)]参照］。
本発明の他の面によれば、ここに記載された、ヒトおよ
びサルＥＰＯポリペプチドをコードするクローンＤＮＡ
配列は、天然生成物の単離物についての数10年間にわた
る分析にもかかわらず今まで利用できなかった哺乳類エ
リスロポエチンアミノ酸配列に関し、それらが与える情
報において極めて価値が高い。このＤＮＡ配列は、また
各種組換え技術によって大量のエリスロポエチンを微生
物合成するのに役立つ生成物としても極めて価値があ
る。即ち、本発明で得られるＤＮＡ配列は、新規でかつ
有用なウィルス性および環状プラスミドＤＮＡベクタ
ー、新規でかつ有用なトランスフォーメーションおよび
トランスフェクションされた原核ならび真核宿主細胞
（培地で増殖される細菌、酵母細胞および哺乳類細胞が
含まれる）およびＥＰＯ、並びにＥＰＯ生成物の発現が
可能な微生物宿主細胞の新規でかつ有用な培養増殖方法
を得る上で有益である。本発明のＤＮＡ配列は、ここに
具体的に説明したヒトおよびサル種以外の哺乳動物種に
おけるＥＰＯおよび関連蛋白質をコードするｃＤＮＡお
よびゲノムＤＮＡ配列を単離する上で、標識化プローブ
として使用するのに極めて適した物質でもある。本発明
のＤＮＡ配列が、各種の別の蛋白質合成方法において
（例えば昆虫の細胞）、あるいはヒトおよび他の哺乳動
物の遺伝子治療において使用される範囲は計算できな
い。本発明のＤＮＡ配列は、エリスロポエチンおよびエ
リスロポエチン生成物を大量に産生する真核「宿主」と
して機能する遺伝子変異哺乳動物種を得る上で有用であ
ると予想される。一般的には、パーミターら：「サイエ
ンス」第222巻、第4625号、第809-814頁、1983年[Palmi
ter,et al.,Science,222(4625),809-814(1983)]参照。
この観点からすれば、したがって、特定の実施例の開示
は本発明の範囲を制限するものでないことは明白であ
り、多数の改変および変更が当業者において考えられ
る。一例として、実施例で得られるＤＮＡ配列はｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡ配列を含み、それは本出願がＤＮ
Ａ配列の製造に必要なアミノ酸配列情報を提供するため
のものだからであるが、本発明にはＥＰＯアミノ酸配列
の情報に基づいて調製されるような合成ＤＮＡ配列も含
まれる。これらは、ＥＰＯをコードし（例12のよう
に）、また一以上の天然ＥＰＯの生物学的性質を有する
けれども他の性質は有しない（または、程度の異なる他
の性質を有する）ＥＰＯフラグメントおよびＥＰＯポリ
ペプチド類縁体（即ち、「ＥＰＯ生成物」）をコードす
るものであろう。
本発明で得られるＤＮＡ配列には、このように、エリス
ロポエチンの少なくとも一部の一次構造配列と一以上の
その生物学的性質を有するポリペプチド生成物を原核ま
たは真核宿主細胞において発現させる上で使用するのに
適し、かつ(a)表Ｖおよび(VI)に示したＤＮＡ配列、(b)
(a)で定義したＤＮＡ配列またはそのフラグメントとハ
イブリッド形成するＤＮＡ配列、および(c)と遺伝暗号
の縮重は別にして、(a)および(b)で定義されたＤＮＡ配
列とハイブリッド形成するであろうＤＮＡ配列の中から
選択されるＤＮＡ配列が全て含まれる。この点に関し注
目すべきは、例えば存在するサルおよびヒトＥＰＯ対立
遺伝子配列並びに他の哺乳動物種遺伝子配列が、表Ｖお
よびVIの配列およびそのフラグメントとハイブリッド形
成すると期待されることである。更に、遺伝暗号の縮重
は別にしてＳＣＥＰＯおよびＥＣＥＰＯ遺伝子並びに各
種ＥＰＯフラグメントおよび類縁体をコードする合成も
しくは突然変異のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列は上
記ＤＮＡ配列ともハイブリッド形成するであろう。この
ようなハイブリダイゼーションは、サルおよびヒトのＥ
ＰＯをコードするＤＮＡの最初の単離に関してここに記
載された条件またはより厳格な条件下で、所望ならば背
景のハイブリッド形成を抑制して容易に実施することが
できるであろう。
同様の意味で、前記諸例は、細菌性プラスミドおよびウ
ィルス性ゲノム起源のハイブリッドベクターに挿入され
たＤＮＡの哺乳動物細胞発現に関し、ＥＰＯ生成物を微
生物発現させる発明を説明するものであるが、広範な発
現系が本発明の概念の中に含まれる。特に、培養された
各種細菌、酵母菌および哺乳動物細胞に適用される均一
源からのベクターを含む発現系、並びにベクターを含ま
ない発現系（例えば、リン酸カルシウムでトランスフェ
クションされた細胞）が含まれる。この点に関し、例え
ば、サル宿主培養細胞およびヒト宿主培養細胞において
サル起源ＤＮＡが発現するのは現実に「外来性」ＤＮＡ
による発現の場合であると理解されたいが、その理由は
高レベルの発現が求められるＥＰＯ ＤＮＡは宿主ゲノ
ムに起源を有さないからである。本発明の発現系は、Ｅ
ＰＯ生成物が細胞質で形成されて宿主細胞の細胞質また
は膜に（例えば、細菌ペリプラズム空隙に蓄積され
る）、または前記培地上澄に、または縁膿菌(P.aerugin
osa)発現系［グレイら：「バイオテクノロジー」、第２
巻、第161-165頁、1984年[Gray,et al.,Biotechnology,
2,pp161-165(1984)]のようにどちらかといえば、まれな
系に、グリコシル化されたＥＰＯ生成物およびグリコシ
ル化されないＥＰＯ生成物が蓄積されるという実施態様
を意図するものである。
本発明のハイブリッド形成改良方法は、実際には上記Ｄ
ＮＡ／ＤＮＡスクリーニングに用いられたが、これはＲ
ＮＲ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＤＮＡスクリーニングにて
同様に適用可能である。ここで説明したような混合プロ
ーブ技術は、一般に、より迅速にかつ信頼をもってポリ
ヌクレオチドを単離できるハイブリッド形成過程におい
て多くの改良点を有している。これらの多数の個々の操
作上の改良点とてしては、改良されたコロナー移転およ
び保存方法、および同様のフィルターで再プローブ化で
き、フィルターの繰返し使用が可能で、新規なプロテア
ーゼ処理の適用を可能にするジーンスクリーン(Gene Sc
reen)およびジーンスクリーン・プラス(Gene Screen Pl
us)のようなナイロン基質フィルターの使用［例えば、
タウブら：「アナリテイカル・バイオケミストリー」、
第126巻、第222-230頁、1982年[Taub,et,et al.,Anal.B
iochem.,126,pp222-230(1982)]と比較されたい］、多数
の混合プローブ（例えば32種類を超える数）のそれぞれ
の極めて低い濃度（0.025ピコモルのオーダー）での使
用、および、用いられる全ての混合プローブの中の最低
の計算解離温度に非常に近い厳格な温度下での（足ち、
それより４℃以内、好ましくは２℃以内での）ハイブリ
ダイゼーションおよびポストハイブリダイゼーション工
程の実施、が挙げられる。これらの改良点を組合わせる
と、それらの実施によるものとは予想できない程の結果
が得られる。このことは、比較的低めの充分量なるメッ
センジャーＲＮＡ種にｃＤＮＡスクリーンを用いると好
結果が得られたと今までに報告されたプローブ数の４倍
量を含む混合プローブ操作を、1,500,000のファージプ
ラークのゲノムライブラリースクリーニングにおいて唯
一の遺伝子配列を単離するのに適用して成功した、とい
う事実により詳細に説明される。この偉業は、前記アン
ダーソンらの「混合プローブスクリーニング法は相当す
るＲＮＡの遺伝子が利用できない限り、哺乳類蛋白質遺
伝子を単離するのは実際上不可能である」との論評の公
開と実質上同時に行なわれたものである。
【図面の簡単な説明】
第１図はラジオイムノアッセイによる組換ヒト及びサル
ＥＰＯの活性を示したものである。 第２図、第３図及び第４図は、夫々、ベクターｐＤＳＶ
Ｌ−ＭｋＥ，ｐＳＶｇＨｕＥＰＯ及びｐＤＳＶＬ−ｇＨ
ｕＥＰＯを示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/16 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９８８１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９８８２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９９３２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９９３３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９９３４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ２０７３３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ２０７３４ 早期審査対象出願

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
    を含むＤＮＡを含有するベクターによって形質転換され
    ていることを特徴とする、細菌、酵母及び哺乳動物細
    胞。
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