JPH03259098A - エリスロポエチンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、本発明者の係属中の１９８３年１２月１３日
付米国特願第５６１．．０２４号、１９８４年２月２１
日付米国特願第５８２．１８５号および１９８４年９月
２８日付米国特願第６５５．８４１号の部分継続出願に
係るものである。

背　　　景 本発明は一般に遺伝物質の操作に関し、更に詳しくは、
天然エリスロポエチンの一次構造配列の一部もしくは全
部及び（又は）−以上の生物学的性買を有するポリペプ
チドの生産を可能とする組換え法に関する。

Ａ、遺伝物質の操作 遺伝物質とは、細胞及びウィルスの構成成分の生産をプ
ログラムしかつ誘導し、更に細胞及びウィルスにおける
応答を支配する化学物質、として広く定義することがで
きる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として知られる長鎖
高分子物質は、リボ核酸（ＲＮＡ）でプログラムされる
ある種のウィルスを除き、全ての生細胞及びウィルスに
おける遺伝物質を構成する。ＤＮＡ高分子における繰返
し単位は４つの異なるヌクレオチドであり、各ヌクレオ
チドはリン酸基がついたデオキシリボ核酸糖に結合する
プリン（アデニン又はグアニン）又はピリミジン（チミ
ン又はシトシン）のいずれかからなる。直鎖高分子型で
のヌクレオチドの結合は、一つのヌクレオチドの５′リ
ン酸と他のそれの３′水酸基との連結による。機能的Ｄ
ＮＡは一木組ヌクレオチド（デオキシオリゴヌクレオチ
ドとして知られている）の安定な二重らせん結合型をな
しており、その結合はプリン及びピリミジン塩基間の水
素結合［即ち、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はグ
アニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間で起こる「相補的
」結合］による。慣習的に、ヌクレオチドはそれらの構
成成分たるプリン又はピリミジン塩基名で呼ばれ、二重
鎖ＤＮＡにおけるヌクレオチドの相補的結合（即ち、Ａ
−Ｔ及びＧ−Ｃ）は「塩基対」と称される。リボ核酸は
、リボース及びリン酸基と結合したアデニン、グアニン
、シトシン及びチミンとは別のウラシル（Ｕ）からなる
ポリヌクレオチドである。

最も簡単に言うならば、ＤＮＡのプログラム機能は特定
のＤＮＡヌクレオチド鎖（遺伝子）が比較的不安定なメ
ツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）高分子に転写される過
程で一般に発揮される。一方、ｍＲＮ　Ａは、アミノ酸
から構造、調節及び触媒蛋白質を形成するための鋳型と
して機能する。このｍＲＮ　Ａの「翻訳」過程では、ｍ
ＲＮ　Ａ鎖に沿って個々のアミノ酸を運搬配列させて適
切なアミノ酸配列からなるポリペプチドを形成させる小
さなＲＮＡ鎖（ｅＲＮＡ）の作用がある。ＤＮＡから誘
導され、ポリペプチドの「発現」に関与する２０個のア
ミノ酸のいずれか一つの　ｌＲＮＡ供給及び配向のため
の基礎となる　ｍＲＮＡの「メツセージ」は、３つのヌ
クレオチド塩基連続群たるトリプレット（三量体）「コ
ードン」の形になっている。

ある意味では、蛋白質の形成は、遺伝子のヌクレオチド
鎖によりプログラムされた遺伝情報の最終的「発現」形
態である。

「プロモーターＪ　ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ高分子におけ
る遺伝子に通常は「前置」されていて、ｍＲＮＡへの転
写開始部位をなしている。「レギュレーターＪ　ＤＮＡ
配列もまた所与のＤＮＡ高分子中の遺伝子の通常は「上
流」にあって（即ち、前置されている）、転写開始頻度
（あるいは速度）を決定づける蛋白質と結合する。−ま
とめに「プロモーター／レギュレーター」又は［コント
ロールＪ　ＤＮＡ配列と称され、機能的ＤＮＡ高分子で
の遺伝子（あるいは一連の遺伝子）に前置されるこれら
の配列は、遺伝子の転写（及び最終的には発現）が生じ
るか否かを決するように作用し合う。

ＤＮＡ高分子の遺伝子に「後置」されてｍＲＮＡへの転
写終了の暗号を与えるＤＮＡ配列は、転写「ターミネー
タ−」配列と呼ばれる。

最近１０年間における微生物学的操作の焦点は、それら
のＤＮＡ中に所望の生成物に関する遺伝子暗号情報を最
初から有しておらず、あるいは（＠乳類の培養細胞にお
いて）通常相当程度まで染色体遺伝子を発現させること
のない生物を用いて、工業的及び薬学的に重要な物質を
生産しようとすることにあった。簡潔に述べると、所望
のポリペプチド生成物の構造を特定する遺伝子が「ドナ
ー」生物から単離されるか、あるいは化学的に合成され
、次いで細菌、酵母菌又は哺乳類の培養細胞のように好
ましくは自己複製単細胞生物たる他の生物に安定的に導
入されることにある。−旦これがなされれば、「トラン
スフォーメーション」又は「トランスフェクション」を
受けた単細胞宿主細胞内で遺伝子の発現に関与する既存
の機構は、ｍＲＮＡ転写の鋳型として外来性ＤＮＡを用
い、しかる後アミノ酸残基の連鎖に翻訳させて所望の生
成物が得られるように作用する。

選択された宿主生物の形質転換に用いられる遺伝物質の
単離、合成、精製及び増幅のための「組換えＤＮＡＪ方
法論に関する技術については、特許及び文献の刊行物が
豊富にある。コーエン（Ｃｏｈ＋ｎ）らの米国特許第４
．２３７．２２４号は、例えば、選択された外来性ＤＮ
Ａ鎖を有する「ハイブリッド」ウィルス性又は環状プラ
スミドＤＮＡによる単細胞宿主生物の形質転換に関する
。コーエンらの特許方法では、まず、ウィルス性又は環
状プラスミドＤＮＡを酵素的に開裂して直鎖状ＤＮＡ鎖
を得ることにより形質転換ベクターを製造する。

所望の生成物を暗号コードする配列を通常有している選
択された外来の（「外来性」又は「異質」）ＤＮＡ鎖は
、類似酵素の作用により直鎖型とされる。直鎖ウィルス
性又はプラスミドＤＮＡは、修復過程で作用し得る連結
酵素の存在下にて外来ＤＮＡとインキュベートされ、ウ
ィルス性又は環状ＤＮＡプラスミドに「つなぎかえられ
た」選択的外来性ＤＮＡ断片を含む「ハイブリッド」ベ
クターが得られる。

ハイブリッドベクターによる適合単細胞宿主生物の形質
転換によって、宿主細胞群で多数の外来性ＤＮＡのコピ
ーが形成される。いくつかの場合において、望ましい結
果は外来ＤＮＡの増加という単純なものであり、得られ
る「生成物」はＤＮＡである。更に多くの場合において
、形質転換の目標は、外来ＤＮＡによりコードされた商
業的に重要な蛋白質又はポリペプチドフラグメントの単
離可能な量での大規模合成が、外来性ＤＮＡの宿主細胞
により発現されることである。例えば、米国特許第４．
２６４．７３１号（シャイン）、第４、２７３．８３５
号（マニス）、第４．２９３．６５２号（コーエン）及
び１９８３年１１月　９日に公開された欧州特許出願第
０９３．６１９号も参照のこと。

ＤＮＡベクターにつなぎかえるための特定のＤＮＡ配列
をつくるには多数の技術によることができるが、予定さ
れた宿主に対する「ドナー」としての「異質性」の度合
、及び宿主において発現されるべきポリペプチドの大き
さによってかなり左右される。単純化しすぎるというこ
とを承知していえば、３つの選択可能な重要な方法、即
ち、（１）ドナーのゲノムＤＮＡからの二重鎖ＤＮＡの
「単離」、（２）目的とするポリペプチドをコードする
ＤＮＡ鎖の化学的合成、及び（３）ドナー細胞から単離
されたｍＲＮＡの酵素的「逆転写」による二重鎖ＤＮＡ
のイン・ビトロ合成を採択し得るということができる。

ｍＲＮＡの「相補的Ｊ　ＤＮＡの形成を含む最後に述べ
た方法は、一般にｒ　ｃＤＮＡＪ法と称される。

ＤＮＡ配列合成法は、所望のポリペプチド生成物のアミ
ノ酸残基の完全な配列が公知である場合にしばしば選ば
れる方法である。共同所有に係る係属中のアルドン（Ａ
ｌ＋ｏｎ）　　らによる米国特許出願第４８３．４５１
号（１９８３年　４月１３日出願、１９８３年１１月２
４日にＷ　Ｏ８３／　０４０５３　として公開されたＩ
’ＣＴＵＳｌ１３１００６０５に相当）のＤＮＡ合成方
法は、例えば下記のような高度に望ましい結果を生じる
優れた手段である。即ち、その結果とは、発現のために
選ばれた宿主生物にて高度に発現する遺伝子中に共通し
て見出される代替性のあるコードンを存在させることが
でき（例えば、酵母菌又は大腸菌の「優先」コードンを
与える）、原核宿主細胞により容易には加工されない非
翻訳性の「イントロン」配列（哺乳類のゲノムＤＮＡ鎖
及びそのｍＲＮＡ転写体に共通して存在する）の存在を
避けることができ、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡに共通し
てコードされているが、細菌又は酵母菌の宿主細胞にて
目的とするポリペプチドからさほど容易には開裂されな
い非所望の「リーダー」ポリペプチド配列の発現を避け
ることができ、所望のプロモーター／レギュレーター及
びターミネータ−配列と結合する好都合の発現ベクター
にＤＮＡを容易に導入させることができ、並びに、所望
のポリペプチドのフラグメント及び類縁体をコードする
遺伝子を容易に調製できることである。

望まれるポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知で
ない場合は、ＤＮＡ配列の直接的生産は不可能であり、
ｃＤＮＡ法によりポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を単離することが、したがって前記した高レベルでの微
生物における発現を可能化する発現ベクターの組み立て
の平易さにおける欠点にもかかわらず選択される方法と
なる。

目的とする　ｃＤＮＡ配列を単離するための標準的操作
としては、高レベルでの遺伝子発現能のあるものとして
選ばれるドナー細胞中に多量に存在するｍＲＮ　Ａの逆
転写により得られるプラスミド担持ｃＤＮＡｒライブラ
リー」　（例えば、比較的多量の成長ホルモン生成物を
発現する脳下垂体細胞由来の　ｅＤＮＡライブラリー）
の調製がある。ポリペプチドアミノ酸配列の実質的部分
が公知である場合は、「標的Ｊ　　ｃＤＮＡに存在する
と推定される配列の複製からなる標識化一本鎖ＤＮＡプ
ローブ配列を、一本鎖型に変性させたｃＤＮＡのクロー
ンコピーにて行なわれるＤＮＡ／ＤＮＡ／−イブリダイ
ゼーシラン法において使用してもよい［一般に、ワイス
マン（Ｗｅｉ＋ｓｍａｎ）らの米国特許第４、３９４．
４４３号明細書における技術の開示及び論議、並びにウ
ォレスら；［「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、
第６巻、第３５４３−３５５７頁、１９７９年（Ｗａｌ
ｌａｃｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎａｃ、Ａｃ１ｄ＋　Ｒ
ｅ３．　５．　ｐｐ　３５４３３５５７　（１９７９）
　　　レイズら、　　ｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　　（米国
）、第７９巻、第３２７０−３２７４頁、１．９８２年
、（Ｒｅ７ｅＳ、ｅｔｌｌ、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　
（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７９．　ｐｐ３２７０−３２７４　
ｆ１９８２）　）及びジエイら；　「ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ」、第１１巻、第２３２５−２３３５
頁、１９８３年（ｊａ７ｅｅｆ　　！Ｉ、、　　Ｎｏｃ
、Ａｅｉｄ＋　　Ｒｅ１．、　　ＩＬ、ｐｐ２３２５−
２３３５（Ｉｎ２））に報告された長鎖オリゴヌクレオ
チドハイブリダイゼーションプローブを用いた最近の実
例を参照されたい。更に、診断に有効なりＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリダイゼーション操作に関するフォールコー（Ｆ
ａｌｋｏｖ）らの米国特許第４．３５１１．５３５号明
細書、一本鎖ポリヌクレオチドプローブにおける光放射
標識に関する欧州特許出願第００７０６８５号及び００
７０６８７号明細書、コロニー及びプラークハイブリダ
イゼーション技術に関する、ニューヨーク州、コールド
スプリングハーバ−所在、コールドスプリングハーバ−
研究所のデービス（Ｄａｖ口）ら「ア・マニュアル・フ
ォー・ジェネティック・エンジニアリング−アドバンス
ト・バクチリアル・ジェネティックスＪ　　（１９８０
年）第５５−５８頁及び第１７４１７６頁、並びに、Ｄ
ＮＡ及びＲＮＡのトランスファー及びハイブリダイゼー
ションについての指針マニュアルとなる「ジーン・スク
リーンＪハイブリダイゼーショントランスファー膜物質
に関する二ニー・イングランド・ヌクレア（マサチュー
セッツ州、ボストン）のカタログ第ＮＥＦ−９７２号も
参照のこと］。

組換えクローンのスクリーニングに関するハイブリダイ
ゼーション操作について更に重要な最近の進歩の中には
、標識化された混合の合成オリゴヌクレオチドプローブ
を使用したものがあるが、各プローブは、一本鎖ＤＮＡ
またはＲＮＡの不均一混合体を含むハイブリダイゼーシ
ョン試料中の特定のＤＮＡ鎖に対して潜在的に完全なる
相補性を有している。これらの操作は、目的とするポリ
ペプチドについて極めて低量のｍＲＮ　Ａ配列供給源か
ら得られる　ｃＤＮＡクローンを検出する上で特に有用
であることが知られている。簡単に言えば、非特異的結
合を回避し得る厳格なハイブリダイゼーション条件を適
用するならば、例えば、その完全な相補体である混合体
中の一つのプローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイズす
ることによって、特定のｃＤＮＡクローンのオートラジ
オグラフィーによる視覚化が可能になる。一般に、ウオ
レスら：　「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、第
９巻、第８７９−８９７頁、１９８１年、［Ｗａｌｌａ
ｃｅ、　ｅｔｌｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｄ
、、　　９．　ｐｐ８７９−８９７　（１９Ｎ）］、サ
ッグスら、ｒＰ、Ｎ、＾、Ｓ、Ｊ（米国）、第７８巻、
ｐｐ６６１３−６６１７．１９８１年、［ＳｕｇＨ，ｒ
ｔ　ａｌ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

（Ｕ、　Ｓ、人、）、７８、ｐｐ　６６１３−６６１７
　（１９８１）　］　、チューら；「ネイチャー」、策
２９９巻、第１７８−１８０頁、［１９８２年、［Ｃｈ
ｏｏ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎｘｔｎ＋ｅ、　　２９
９．ｐｐ１７８−１８［１（１９８２）コ、クラチら；
　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　　（米国）、第７９巻、第６
４６１−６４６４頁、１９８２年、［Ｋｏｒａｃｂｉｅ
ｆ　ａｌ、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（υ、Ｓ、Ａ、）
　、７９．　　ｐｐ６４６１−６４６４Ｆ＋９１１２）
コ、オークボら、　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、Ｊ　　（、米
国）、第８０巻、ｐｐ　２１９６−２２００．１９８３
年、［０ｂｋａｂｏ、　　ｅｌａｌ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ
、ＳＩＵ、Ｓ、Ａ、）、８０．　　ｐｐ２１９６−２２
００　　（１９８３）］及びコーンブリットら、ｒＰ、
Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　　（米国）、第８０巻、第３２１８−
３２２２頁、１９８３年［Ｋｏ＋ｏｂｌｉｂｔｔｃｔ　
ａｔ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　ｐ（Ｕ、Ｓ、＾）、
　　８０．　　ｐｐ３２１８−３２２２（１９１ｔ３）
］参照。一般にウォレスらの混合プローブ手順（前記１
９８１年）は、目的とする　ｃＤＮＡの存在を二つの部
位で「陽性」と確認するために一つの１１塩基鎖（１１
−マー）と−緒に、−様に変異したＤＮＡ鎖よりなる１
６塩基鎖（１６〜マー）オリゴヌクレオチドプローブ３
２種類の混合「プール」を用いると、ｅＤＮＡクローン
の単離において信頼すべき結果が得られたと報告された
ことから、様々な研究者にまで広がっていった。シンガ
ーサムら、ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　　（米国）、第８０
巻、第８０２８Ｎ頁、１９８３年［Ｓｉｎｇｅｒ−３Ｇ
ｍ、　　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ（Ｕ、Ｓ、
Ａ、）、　　８Ｇ、　　ｐｐ８０２−８０６　（１９８
３）］参照。

ゲノムＤＮＡ単離物を使用することは、組換え操作で用
いられる特定のＤＮＡ配列をつくる上記３つの方法にお
いて最も一般性の少ないものである。これは、哺乳類ポ
リペプチドの微小生物での発現を行なわせようとする組
換え操作領域において特に真実であって、主に哺乳類ゲ
ノムＤＮＡの複雑性に起因するものである。このように
、信頼すべき操作が、ヒト及び他の哺乳種起源であるゲ
ノムＤＮＡのファージ担持ライブラリーをつくるために
あるが［例えば、「マニアナイス・ライブラリー」と通
常呼ばれるヒトゲノムライブラリーを得る操作に関する
ローンら：　「セル」、第１５巻、第１Ｉ５７−１１７
４頁、１９７８年、（Ｌａｖｌｌ、　　ｅｌ　！＋、、
　　Ｃｅ１ｌ。

Ｉｓ、　　ｐｐＨ５７−１１７４（１９７ｇ））　、別
の制限酵素フラグメント操作によるヒトゲノムライブラ
リーに関するカーノ等：　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　　（
米国）、第７７巻、第５１７２−５１．７６頁、１９８
０年、（Ｋａｈｎ、　　ｅｔ　ａｉ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ
Ｓ、　　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７７、　ｐｐ５１７２−５
１？６　（１９８０））　、及びウシゲノムライブラリ
ーの構築を述べたブラットナーら：　［サイエンス」、
第１９６巻、第１６１−１６９頁、１９７７年　［Ｂｌ
ａＮｎｅｒ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ
、　　１９６．ｐｐ１６１１６９　（１９７７）参照］
、アミノ酸又はＤＮＡ配列についてさほど予備的情報の
ないゲノムＤＮＡの単離において、ハイブリダイゼーシ
ョン操作を用いる試みはさほど成功していながった。−
例として、フィデスら：「ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・アンド・アプライド・ジェネティクス」、第１巻
、第３−１８頁、１９８１年［Ｆｉｄｄｅ＋、　　６１
　ｘｌ、　　Ｊ、Ｍａｌｘｎｄ　Ａｐｐ、　　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、　　１．　　ｐｐ３−１８（１９８１）］で
は、αサブユニットについて予め単離されたｃＤＮＡ鎖
たる全体で６２１塩基対のフラグメントを有する「全部
の長さ」のプローブを用いて、マニアナイス・ライブラ
リーから、ヒト脳下垂体糖蛋白質ホルモンのα−サブユ
ニットをコードする遺伝子の単離に成功したと報告して
いる。別の例として、ダスら：　　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、
Ｊ　　（米国）、第８０巻、第１５３１−１５３５頁、
１９８３年ＣＤａｓ、　　ｅｔ　！ｌ、、　　Ｐ、Ｎ、
Ａ、Ｓ、　（［１，ＳＡ、）、８Ｑ、　　ｐｐ１５３１
−１５３５（１９８３）］では、　１７５塩基対の合成
オリゴヌクレオチドを用いた、ヒト　ＨＬ人−ＤＲのヒ
トムゲノムクローンの単離を報告している。

最後に、アンダーソンら：ｒＰ、Ｎ、＾、Ｓ、Ｊ（米国
）、第８０巻、第６８３１１−６８４２頁、１９８３年
［Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　ｅｔｘｉ、、　　Ｐ、Ｎ、＾、
　Ｓ、　（Ｕ、　Ｓ、＾、）、８０．　　ｐｐ６８３Ｂ
−６８４２（１９１１３）コでは、長さが８６塩基対で
、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の既知
アミノ酸配列に基づき構成された一本のプローブを用い
てＢＰＴ　Ｉのゲノムクローンを単離したと報告してい
る。その著者は、初期の標的たる耳下腺及び肺組織源に
おけるｍＲＮ　Ａが明らかに低量であることから、ｅＤ
ＡＮライブラリーの合成に適したｍＲＮＡを単離できる
可能性が少ないと結論づけており、更には以下のことを
述べて、標識化プローブ混合体を用いるゲノムライブラ
リーのブロービングの成功の可能性について言及してい
る：　「より一般的には、混合配列オリゴデオキシヌク
レオチドプローブが、ｃＤＮＡライブラリーから未知配
列蛋白質遺伝子を単離するために用いられていた。この
ようなプローブは、典型的には、アミノ酸配列のわずか
な範囲（５〜６残基）についての可能な全てのコードン
の組合せを示す長さが１４〜Ｉ７のヌクレオチドの８〜
３２種類のオリゴヌクレオチドの混合体である。不正確
な塩基対プローブを識別できる厳格なハイブリダイゼー
ション条件下では、これらの混合体により、低度から中
度の複雑性があるクローンライブラリーから特定の遺伝
子配列を見つけ出すことができる。しかしながら、それ
らの短鎖性と異質性とのために、混合プローブは哺乳類
のゲノムはど複雑な鎖をブロービングするのに要する特
異性をしばしば欠如している。このことは、相当するｍ
ＲＮＡを利用できない場合に、哺乳類の蛋白質遺伝子を
単離する上で、このような方法を実施不可能とするもの
である。」　（引例省略） このように、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列
がさほど知られておらず、またｍＲＮ　Ａに富む組織源
をｃＤＮＡライブラリーの調製に使用する上で容易に入
手できないような場合において、迅速かつ効果的に　ｃ
ＤＮＡクローンを単離するのに有効な改良方法の技術的
必要性が存在し続けている。このような改良方法は、求
められている遺伝子によってコードされたポリペプチド
のアミノ酸配列に関して乏しい情報しか得られていない
哺乳類のゲノムクローンの単離にそれらが適用できれば
、特に有用であろう。

Ｂ、目的とするポリペプチドとしてのエリスロボエチン 血球増生、即ち赤血球の産生は、人間が生きている限り
、細胞破壊を補うために継続して行なわれる。血球増生
は、循環を妨げる稈長くはない充分な数の赤血球を、適
切な組織に酸素供給する血液中で利用可能にさせる、非
常に正確に制御された生物学的メカニズムである。赤血
球の産生は骨髄で行なわれ、ホルモン、即ちエリスロポ
エチンで制御されている。

エリスロポエチンは分子量約３４．ＯＮダルトンの酸性
糖蛋白質であって、α、β及びアシアロの３種の型とし
て得られる。α及びβ型は炭水化物成分がわずかに異な
っているが、同様の性質、即ち生物学的活性及び分子量
を有している。アシアロ型は末端の炭水化物（シアル酸
）が除去されたα又はβ型である。エリスロポエチンは
、組織が実在数の赤血球から充分な酸素供給を受けてい
る健康状態に体がある場合、血漿中において極めて低濃
度で存在している。この正常な低濃度であっても、昔通
時間を経るにつれて減少する赤血球の補充を促進するに
は充分である。

エリスロポエチンの循環量は、血球の循環による酸素輸
送量が減少する低酸素症状態下では増加する。低酸素症
は、出血による多量の血液の喪失、放射線への過度露出
による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識喪失によ
る酸素摂取量の減少又は各覆貧血によって起こる可能性
がある。組織が低酸素ストレスを受けると、エリスロボ
エチンは、骨髄中の原始前駆細胞が、前赤芽球（前赤芽
球はひき続いて成熟し、ヘモグロビンを合成し、赤血球
として循環系に放出される）に変換されるのを促進する
ことにより、赤血球の産生を増大させ秦。

循環系の赤血球数が正常組織での酸素要求量よりも多い
場合は、循環系エリスロポエチンは減少する。

一般的には、テスタら：エクスペリメンタル・ヘマトロ
ジー、第８巻（第８増刊号）、第１４４１５２　頁、１
９８０年［Ｔｅ５ｌａ、！ｌ　ａｔ、、　　ＥＩｐＨｅ
ｍａｆ。

Ｌ（Ｓｕｐｐ、　　８　）　、　　１４４−１５２　　
（１９８０）コ　；トングら：「ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー」、第２５６巻、第２４号
、第１２６６６−１２６７２頁、１９８１年、［Ｔｏｎ
ｇ、ｅｌｘｌ、、Ｊ、Ｂｉｏ！、Ｃｈｅｍ、、　　２５
６（２４）。

１２６６６−１２６７２　（１９８１）コ　；ゴールド
ヮッサ一二　「ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオ
ロジー」、第１１０巻、（第１増刊号）、第１３３−１
３５頁、１９８２年、［Ｇｏ１＋Ｉｖａｓｓｅｒ、Ｊ、
Ｃｅ１１．Ｐｈ７＋ｉｏ１．、　１１０ｆＳｕｐｐ、１
）１３３−＋３５　　（１！１８２）コ　；フィンチ、
「ブラッドコ、第６０巻、第６号、第１２４１−１２４
６頁、１９８２年、［Ｆｉｎｅｈ。

Ｂｌｏｏｄ　、　６０（６）　、　１２４１−１２４６
　（１９８２）］　；］シトースキら：　「エクスペリ
メンタル・ヘマトロジー」、第８巻（第８増刊号）、第
５２−６４頁、１９８０年、［５７ｔｏｖｓｋｉ、ｅｔ
　ａｌ、、　Ｅｘｐ、Ｈａｅ＋＋ａｌｏｌ、、　８［５
ｏｐｐ８］５２−６４（１９１１０）］　；ツートン　
「アナルス・オブ・クリニカル・ラボラトリ−・サイエ
ンス」、第１３巻、第５号、第４３２−４３８頁、１９
８３年［Ｎａｕｇｂｊｏｎ、　Ａ＋＋ｎＣ１１Ｉ１．Ｌ
ｊｂ、Ｓｃｉ、、１３（５）　、　　４３２−４３８　
（１９８３）］　　；ワイスら：「アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ」、第４４巻、第
１０号、第１８３２１８３５頁、１９８３年［Ｗｅｉ＋
＋、　　ｅｌ　ａｔ、、　　＾Ｉｎ、　　Ｊ、　　Ｙｅ
ｔＲｅ３　、　４４　（１（ｌｌ、１８３２−１ｆ１３
５　（ＩＮ３）コ　；ラッピンら：「エクスベリメンタ
ル・ヘマトロジー」、第１１巻、第７号、第６６１−６
６６頁、１９８３年、［１，ａｐｐｉｎ、　　ｅｌａ１
．、　　Ｅｒｐ、Ｈａｅｍａ＋ｏ１．、　１Ｎ７）、　
　６６１−６６６　（１９８３）　］　　；パシューら
：　「アナルス・オブ・ニューヨーク・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス」、第４１４巻、第６６−７２頁、１９
８３年［Ｂａｅｉｕ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　＾ｎｎ、
　　Ｎ、　　Ｙら：　「アクタ・ヘマトロジカ・ジャポ
ニカ」、第４６巻、第７号、第１．３１１０−１３９６
頁、１９８３年［ＭｕｒｐｆＢ。

ｅｔ　ｘｌ、　＾ｅｔａ　Ｈａｅｍａ＋ｏｌｏｇｉｃａ
　Ｉａｐｏｎｉｃａ　、　　４６（７）＋３８０−１３
９６　（１９８３）　］　　；デシプリスら二「ブリテ
ィッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー」、第５６
巻、第２９５−３０６頁、１９８４年［Ｄｅ＋ａｌｐ＋
ｉｓ、　　ｅｔａｔ、　　Ｂａ１ｔ　　　Ｊ、　　Ｉ（
ａｅｍａｌｏｔ、、　　５６．　２９５−３（１６（１
９８４）コ　、及びエマヌエルら：　「アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・フィジオロジー」、第２４７巻、第１
号、第２部、第Ｆ１６８−１７６頁、１９８４年［Ｅｍ
ｍｇｎｏｕｅｌ、ｅｔ　ａｔ、。

Ａｍ、　］、　Ｐ７ｂｓｉｏ１．．２４７（ＩＰｔ　２
）、Ｆ　１６８−１７６　（［８４）］参照。

エリスロポエチンは赤血球形成過程で欠かせないもので
あるため、このホルモンは赤血球の産生能が低く又は欠
陥がある血液疾患の診断及び治療に有効に適用すること
ができる。一般的には、鎌型赤血球疾患の治療における
エリスロボエチンに関するペナサーダスら：　「ブラッ
ド」、第６３巻、第５号、第１１６８−１１７１頁、１
９８４年［Ｐｅｎｎａ＋ｂｕ＋−Ｄａ＋。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｌｏｏｄ、６３（５）　、　　１．
１６８−１１７１　（１，９８４）］及びハディ：「ア
メリカン・ジャーナル・オブ・ペディアトリック・ヘマ
トロジー／オンコロジー」、第４巻、第１９１−１９６
頁、１９８２年［１（ａｄｄｙ、Ａｍ、　Ｊｏｕｒ。

Ｐｅｄ、　　Ｈｅｍａｔｏｌ、１０ｎｃｏｔ、、　　４
．　１９１−１９６　（１，９８２）］、並びにエリス
ロポエチンに富む血漿の注入によるイン・ビボの応答を
基礎とする尿毒症のヒツジの治療法について記し、更に
慢性腎疾患を伴う貧血の治療剤として１５〜４０日間、
１０単位Ｅｌ’Ｏ／ｋｇ／日の用量を提案するニッシュ
バッハら＝　「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベ
ストメント」、第７４巻、第２号、第４３４−４４１頁
、１９８４年［Ｅ＋ｃｈｈａｅｈ。

ｃ＋　ａｔ、、　　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｂｅ＋ｊ
、、　　７４（２）、　９９４月−４４１（ｅ９８４）
コ参照。更には、クレーン：　「へ：／リ−・フォード
・ホスピタル・メディカル・ジャーナル」、第３１巻、
策３号、第１７７−１８１頁、１９８３年［Ｋｒａｎｅ
、Ｈｅｎ＋７　　Ｆｏｌｄ　　）ｌｅａｐ、　　Ｍｅｄ
、　　Ｌ、　　３１（３）、１７７−１．８１　　（１
９８３１コも参照のこと。

最近、エリスロポエチンが大量に入手可能になれば、米
国だけで毎年１６６万人の貧血患者の治療に使えるであ
ろうと予測された。例えば、「ザ・ワールド・バイオチ
ック・レポートＪ　ｆＴｈｅ　Ｗｏｒｌｄ＆１ｏｌｅｃ
ｂ　Ｒｅｐｏｒｌ＞１９Ｂ４年、第２巻：米国にューヨ
ーク州、ニューヨーク、オンライン・パブリケーシラン
ズ社、１９８４年）のモリメン：　［バイオプロセッシ
ング・イン・スペース・・アン・オーバービュー　（ｔ
ｌｉｏｐｒａｃｅｓｓｉＢ　１ｌｌＳｐａｃｅ・・・ａ
ｎＯｖｅｒｖｉｅｗ）　Ｊ　、第５５７−５７１頁参照
。最近の研究により、各種の病態、疾患及び血液異常状
態において、エリスロポエチン治療の有効性を予想する
基礎が与えられた。ベドバトら＝［アクタ・ヘマトロギ
カ」、第７１巻、第２１１−２１３頁、１９８４年（β
サラセミア）　　［Ｖｅｄｏマａｔｅ、ｅｔ　ａｌ、、
Ａｃ１５．Ｈｘｅｍａｔｏｌ、。

７１．　２１１−２１３　（１９８４）］　　；ビチン
スキーら：ジャーナル・オブ・ペディアトリックス」、
第１０５巻、第１号、第１５−２１頁、１９８４年（嚢
胞性繊維症）［１ｃｈｉｎｘｋ７．ｓｌ　１１．、　　
Ｊ、Ｐｅｄｉａｔ＋、、　　１０５（１）、１５２Ｈ１
９８４）］　　；ココノら＝　「ブリティッシュ・ジャ
ーナル・オブ・オブステトリックス・アンド、ギネコロ
ジー」、第９０巻、第４号、第３０４−３１１頁、１９
８３年（妊娠、月経における疾患）　　［Ｃｏｔｅｓ、
　　ｅｔｓｌ　　Ｂｒ１１．　１．０ｂａｌｅ１．　Ｇ
７ｎｅａｃｏ１．、　９Ｇ（４）、　３０４３１１　（
１９８３）］　　；ハガら：　「アクタ・ペディアトリ
ックス・スカンジナビア」、第７２巻、第８２７−８３
１頁、１９８３年（未熟児性早期貧血）　　［ＢＢａ、
　ｅｔ　ａＡｃ［ｘ　　　Ｐｅｄｉａ＋ｒ、　　５ｃｘ
ｎｄ、、　　　？２．　　Ｈ７−１１３１（１９８３）
コ　：クラウスーウォーカーら：　「アーカイブス・オ
ブ・フィジカル拳アンド・メディカル・リノｈビリチー
ジョン」、第６５巻、第３７０−３７４頁、１９８４年
（を髄損傷）　　［Ｃ１ａｕ＋−Ｗａｌｋｅ＋、　　ｅ
ｊ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　　Ｐｂ７ｉＭｅｄ　Ｒｅｈ
ａｂｉｌ、　　６５　３７０−３７４　（１９８４）］
　　；ダンら：「ユーロピアン・ジャーナル・オブ・ア
プライド・フィジオロジー」、第５２巻、第１７８−１
８２頁、１９８４年（宇宙飛行）　　［Ｄｕｎｎ、ｅｌ
　！ｌ、、　Ｅｕ＋、Ｊ、ＡｐｐＰｈｙｓｉｏｌ、、　
　５２．　１７８−１８２　　（１９８４）　］　　；
ミラーら「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマト
ロジー」、第５２巻、第５４５−５９０頁、１９８４年
（急性の血液喪失）　　［Ｍｉｌｌｅｒ、ｃｌ　ａｌ、
、Ｂｒ１１．Ｊ、Ｈａｅｍａ＋。

５２、　５４５−５９０　（１９８２）コ　；ユドゥー
パら二　〇ジャーナル・オブ拳レーバー・アンド・クリ
ニカル・メディスン」、第１０３巻、第４号、第５７４
−５８０及び第５８１−５８８頁、１９８４年［υｄｕ
ｐａ、Ｎ　ａｌ、、　　］、ＬａｂＣｌｉｎ、　　　Ｍ
ｅｄ、、　　　１０３（４）、　　　　５７４−５８０
　　　　ｇｎｄ　　　　５８１−５８８（１９８４）　
］　、リリップシラら：　「ブラッド」、第６３巻、第
３号、第５０２−５０９頁、１９８３年（老化）［Ｌｉ
ｐ＋ｃｈｉｔｘ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｂｌｏｏｄ、
　　６３（３）　、　　５０２−５０９（１９８３）］
　、並びに、グイニアツクら：「キャンサー」、第５１
巻、第６号、第１１０１−１１．０６頁、１９８３年［
Ｄａｉｎｉａｋ、　　ｅｊ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ、　
　５１（６）、　　１１０１−１１０６（１９８３）　
］及びシュワルツら・　「オトラリンゴロジー」、第１
［１９巻、第２６９−２７２頁、１９８３年［５ｃｂｖ
ａｒ＋＋、　ｅｊ　ｘｌ、、　Ｏｔｏｌｘｒ７ｎｇｏ１
．、　１０９．２６９−２７２　（ｅ９８３）］　　（
異常な血球増生を伴う各種新生物疾患状態）。

血漿又は尿から高収率でエリスロポエチンを得ようとす
る以前の試みは不成功に終った。複雑で高度な実験技術
が必要とされるが、一般には不純で不安定な微量のエリ
スロポエチン含有抽出物を集められるにしかすぎない。

米国特許第３．０３３．７５３号明細書には、ヒツジ血
漿からエリスロポエチンを部分的に精製するための方法
が記載されているが、低収率でエリスロボエチン含有粗
製固体抽出物が得られただけである。

尿からエリスロポエチンを単離する初期の試みでは、不
安定で生物学的に不活性なそのホルモン調製物が得られ
た。米国特許第３．　［１６５，８０１号明細書には、
尿から回収されたエリスロポエチン含有粗製物質の生物
学的活性を安定化させる方法が開示されている。得られ
るエリスロボエチン含有粗製物は、称するところでは、
９０％のエリスロポエチン活性を有しており、しかも安
定である。

再生不良性貧血患者の尿からヒトエリスポエチンを精製
する別の方法が、ミャケら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリイ、第２５２巻、第１５号、ｐｐ
　５５５８−５５６４　（１９７７年８月月１０日）［
Ｍｉ７ａｋｅ、　　ｅｌ　ａｔ、、　　］、　　Ｂｉｏ
１．　Ｃｈｕｍ、、　　Ｖｏｌ　２５２Ｎｏ、Ｉ５．　
　ｐｐ　５５５８−５５６４］　１＝記載されテイル。

コノ７エ程の操作には、イオン交換クロマトグラフィ、
エタノール沈澱、ゲル濾過及び吸着クロマトグラフィー
が含まれ、２１％の収率で、７０，４００単位／■の比
活性がある純粋なエリスロポエチン調製物が得られてい
る。

タケザワらの米国特許第４．３９７．８４０号明細書に
は、弱塩基性イオン交換物にて健康なヒトの尿試料から
「エリスロポエチン生成物」を製造する方法が記されて
おり、エリスロポエチン阻害効果のない低分子量生成物
が得られたと述べられている。

１９８２年５月　６日に公開されたスギモトらによる英
国特許出願第２．０８５．８８７号明細書には、ハイブ
リッドヒトリンパ芽球細胞の産生方法が述べてあり、哺
乳類宿主増殖物カ月０７細胞／　ｍｌとなった後、培地
に分配された細胞懸濁液１ｍｌ当り　３〜４２０単位の
エリスロボエチン産生量があると報告されている。達成
されたとする最大の産生レベルでは、エリスロボエチン
産生速度は、イン・ビボ増殖系から細胞が移し変えられ
たイン・ビトロ培地において、４０〜４．０００単位／
１０６細胞／４８時間と計算された（対応する米国特許
第４．３７７、５１３号明細書も参照）。多数の提案が
新生物細胞をはじめとする組織源からエリスロポエチン
を単離するためになされたが、収率は極めて低かった。

例えば、ジエルクマンら：　「エクスペリメンタル・へ
マトロジー」、第１１巻、第７号、第５１１１−５１１
８頁、１９８３年［１ｅｌｋｍａｏ、ｅｌ　ａｌ、、　
　ＥＩｐ、　Ｒｅｍａｔｏｌ、、　　ＩＨ７）、　　５
１１１５ｇｇ　　［９１１３）　Ｅ　　：タンブランら
、　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ（米国）、第＆θ巻、第６２
６９−６２７３頁、１９８３年［Ｔａｍｂｏｕ＋ｉｎ、
ｅｔ　ａｌ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（［１，Ｓ、
Ａ、）、　　８０６２６９−６２７３　　（１９８３）
コ　；カッ才力らコ「ガン」、第７４巻、第５３４−５
４１頁、１９８３年［Ｋａｌ！ｕｏｋａ、　ｃｔｓｌ　
　ＧａｌＩｎ　　７４　５３４−５４１　（１９８３）
］　　；ハギワラら：「ブラッド」、第６３巻、第４号
、第８２８−８３５頁、１９８４年［Ｈａｇｉｖａ＋ａ
、　　ａｔ　ｘｉ、、　　Ｂｌｏｏｄ、　　６３（４）
、　　８２８１１３５　Ｆ１９８４Ｌ１　、及びチョッ
ピンら、「ブラッド」、第６４巻、第２号、第３４１−
３４７頁、１９８４年［Ｃｂｏｐｐｉｎ。

ｅｔ　ａｌ、　　　［１ｌｏｏｄ　　６４（２）、　　
３４１−３４７　（１９８４）］参照。

精製エリスロポエチンの取得のために利用される他の単
離技術としては、免疫学的操作がある。

ポリクローナルな血清由来のエリスロポエチンに対する
抗体は、動物、好ましくはラット又はウサギにヒトエリ
スロポエチンを注射することにより得られる。注射され
たヒトエリスロポエチンは動物の免疫系により外来抗原
物質として認識され、抗原に対する抗体の産生を誘導す
る。抗原物質による刺激に感応する細胞が異なれば、別
の感応細胞から産生されたものとはわずかに異なる抗体
が産生されて、循環系に放出される。抗体活性は、その
血液を採取した場合に、動物の血清中に残存している。

未精製の血清、又は血清免疫グロブリンＧ画分として精
製された抗体調製物は次いでヒトエリスロポエチン検出
分析に用いられ、それと複合化するが、その物質には大
きな欠点がある。

この血清抗体は個々の細胞から産生された多数の異なる
抗体からなるが、その性質上ポリクローナルであって、
エリスロポエチンのみではない粗抽出物中の他の成分と
複合化する。

本発明の背景にあって重要なのは、選択された抗原にお
ける一つの抗原決定基と特異的に免疫応答する一種の抗
体のみを産生できるという継続細胞培養の開発技術に関
する最近の進歩である。

般的には、キスホルム＝　「バイテクノロジー」、第３
巻、第１号、第５７−６３頁、１９８３年［Ｃｈｉ＋ｈ
ｏ１ｍ。

Ｈｉｇｈ　ＴｅｃｂｎｏｌｏＨ，Ｖｏｌ　３．　Ｎｏ、
１．　５７−６３　（１９８３）］参照。エリスロポエ
チンに対する「モノクローナル」抗体を得るために細胞
融合とハイブリッド形成技術を用い、更にヒトエリスロ
ポエチンの単離と定量化のためにこれらの抗体を用いる
試みが行なわれた。−例として、ヒトエリスロボエチン
に対するモノクローナル抗体を分泌するマウスーマウス
ハイブリドーマ細胞系の開発に成功したという報告が、
リーーファン：　「フエデラル・プロシーデインゲス」
の抄録第１４６３号、第４１巻、第５２０頁、１９８２
年［Ｌｅｅ−Ｈｕａｎｇ、　　＾ｂ＋ｔ＋ｇｃ＋　　Ｎ
ｏ、Ｉ４６３　ｏｆＦｅｄ、　　Ｐｒｏｃ、　　４１　
５２０　（１９８２）コにおいて抄録という形でなされ
た。別の例として、モノクローナルエリスロポエチン抗
体の産生及び使用に関する詳細な説明が、ワイスら、　
［Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　　（米国）、第７９巻、第５４
６５−５４Ｎ頁、１９８２年［Ｗ！ｉｓｓ、　ｅｌ　ａ
ｌ、。

Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、　
　７９．５４６５−５５６９　（１９８２）　］にある
。

ササキ：　「ビオメゾイカ・ビオキミカ・アクタ」、第
４２巻、第１ｆ／１２号、第５２０２−５２０６頁、１
９８３年［Ｓｘ＋ａｋｉ、　　Ｂｉｏｍｅｄ、　　Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、、　　４２　（ＩＩ／１２）
。

５２０２−Ｓ２０６　（１９１１３）］　　；ヤナガワ
ら：　「ブラッド」、第６４巻、第２号、第３５７−３
６４頁、１９８４年［ＹａｎｘｇａＷｌ　　ｅｌ　ＩＩ
　　Ｂｌｏｏｄ　　６４（２）、　　３５７−３６４　
（１９８４）］　　；ヤナガワら：［ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー」、第２５９巻、第５
号、第２７０７２７１０頁、１９８４年［Ｙａｎａｇａ
ｖａ、　　ｒｌ　ｘｌ、、　　Ｉ、　　ＢｉｏｔＣｈｅ
ｍ、　２５９（５）、２７０７−２７１０　（１９８４
）コ、及び米国特許第４．４６５．６２４号明細書も参
照のこと。

更に、本発明の背景にあって重要なのは、天然蛋白質、
糖蛋白質及び核蛋白質中のアミノ酸配列と実質上同一で
ある合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告である。

更に具体的には、比較的低分子量のポリペプチドが、ウ
ィルス抗原、ポリペプチドホルモン等のような生理学上
重要な蛋白質の免疫反応に対し、時間及び程度の点で類
似した免疫反応に関与していることが示された。このよ
うなポリペプチドの免疫反応の中には、免疫活性な動物
において特異的抗体形成を刺激することが含まれる。例
えば、ラーナーら＝　「セル」、第２３巻、第３［１９
−３１０頁、１９８１年［Ｌｅｒｎｃ＋、ｒｌ　ａｌ、
、Ｃｅ２３、　３０９−３１０　（１９８１）］　　；
ロスら・　「ネーチャー」、第２９４巻、第６５４−６
５６頁、１９８１年［Ｒｏｉｓ、　ｅｌ　晟Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　２９４．６５４−６５６　Ｉ１９８１）］　　
；ウォルターら：ｒＰ、Ｎ、＾、Ｓ、Ｊ（米国）、第７
７巻、第５１９７−５２ＱＯ頁、１９８０年［Ｗａｌｔ
ｅ＋、　　ｅｔ　ｉｆ、、　　Ｐ、Ｎ、人、Ｓ、　（Ｕ
、Ｓ、Ａ）　、７７゜５１９７−５２００　（１９８０
）コ　；ラーナーら：　　ｒｌ’、、Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ（
米国）、第７８巻、第３４０３−３４０７頁、１９８１
年［Ｌｅ＋ｎｅｒ、　　ｅｌ　　ａｔ、、　　Ｐ、Ｎ、
Ａ、Ｓ、　（［１，Ｓ、Ａ）　　、７１１．３４０３３
４０７　（１９８１）　］　　；ウォルターら：　　ｒ
［’、Ｎ、Ａ、Ｓｌ　　（米国）、第７８巻、第４８８
２−４８８６頁、１９８１年［Ｗａｌｔｅ＋。

ｅｔ　　ｓｌ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（Ｕ、Ｓ、
Ａ　　）　　、７８．　４８８２−４８８６（１９８０
）］　　；ウォングら：　　ｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　　
（米国）、第７８巻、第７４１２−７４１．６頁、１９
８１年［Ｗｏｎｇ、ｅｌ　ａｌＰ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、
　　（Ｕ、　Ｓ、人　）　　、　７８．　７４１２−７
４１６　　（１９８１）コ　；グリーンら：　「セル」
、第２８巻、第４７７−４８７頁、１９８２年［Ｇ＋ｅ
ｅｎ、　　ｅｌ　１１．、　　Ｃｅ１１．　２８．　４
７７−４８７（１９Ｎ）］　　；ニニラら：　ｒｌ’、
Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　　（米国）、第７９巻、第５３２２−
５３２６頁、１９８２年［Ｎ１ｇｇ、　　ｅｔ　ａｌＰ
、１１．Ａ、Ｓ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ）、７９．５３２２−
５３２６　（１９８２）］　；バロンら、「セル」、第
２８巻、第３９５−４０４頁、１９８２年　［Ｂａ＋ｏ
ｎ、ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｃｅ１１．　２８．　３９５
−４０４　　（１９８２）コ　；ドリースマンら：　「
ネーチャー」、第２９５巻、第１５８−１６０頁、１９
８２年［Ｄ＋ａｅ＋ｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ
ｅ２９５　１５ｇ−１６０（１９８２）コ　：及びラー
ナー：　「サイエンティフィック・アメリカン」、第２
４８巻、第２号、第６６−７４頁、１９８３年［Ｌｅ＋
ｎｅｔ、　ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ　　
　２４ｇ、　ＮＯ，２，６６−７４（１９８３）］参照
。

更には、ペプチドホルモンの一次構造配列ではなく、そ
の二次構造をおおむね有している合成ペプチドの生物学
的及び免疫学的活性に関するカイザーら＝　「サイエン
ス」、第２２３巻、第２４９−２５８頁、１９８４年［
Ｋａｉｓｅｒ、ｅｌ　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　、　　
２２３．　　ｐｐ２４９２５５　（１９８４）］　も参
照のこと。上記研究は、勿論、エリスロポエチン（即ち
実質的なアミノ酸配列の情報がまだ知られていなかった
物質）以外の蛋白質アミノ酸配列に関するものである。

共同所有に係る継続中のエグリー（Ｊ、　　Ｅｇ目ｅ）
により１９８３年２月　４日に出願され、欧州特許第０
１１６４４６号として１９８４年８月２２日に公開され
た米国特許出願４６３７２４号明細書には、マウス−マ
ウス／％イブリドーマ細胞系（＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，第
ＨＢ８２Ｇ９号）が記載されており、この細胞系は、下
記のアミノ酸配列：ＮＨ２山−Ｐｒｏ−［’＋ｏ−Ａ＋
ｇ−Ｌｅａ−１１ａ−Ｃ７＋−Ａ＋ｐ−３ｅ【−＾ｒｇ
−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　［０−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−
Ｌｅ　ａ−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ａ−Ａ　Ｉ　！　−１７
ｉ−ＣＯＯ）ｌ。

からなるポリペプチドとも特異的に免疫応答する高度に
特異的なモノクローナル抗エリスロポエチン抗体を産生
ずる。このポリペプチド鎖は、ミャケら＝「ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、第２５２巻
、第５５５８−５５６４頁、１９７７年［Ｍｉｌａｋｅ
、ａｔ　ａｔ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　
２５２．５５５８−５５６４　（１９７７）］の方法に
より単離され、ヒユーイック・エムら＝　「ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、第２５６巻
、第７９９０−７９９７頁、１９８１年［Ｈｅｖｉｅｋ
、　　Ｍ、、ｅｌ　ａｌ、、　　］、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅ
ｍ２５６、　７９９０−７９９７　（１９８１）］の操
作によりアミノ酸分析が気相配列決定装置［アプライド
・バイオシステム社（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ＋Ｙａｔ
ｅｍｓ、　　Ｉｎｃ）］によって行なわれた成熟ヒトエ
リスロポエチンの最初の２０個のアミノ酸残基に対応す
るものである。別個のアミノ酸鎖に基づく、合成２６マ
ーに対するポリクローナル抗体の産生に関するスーら：
「プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ」　（米国）、第８０巻、第３６
５１−３６５５頁、１９８３年［Ｓａｅ、ｅｔ　ｉｔ、
、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　ＡｃａｄＳｃｉ、　
（Ｕ、　Ｓ、＾１．ｆｉｌ　　ｐｐＪ６５１−３６５５
　（１９８３）コ及びシトウスキーら：「ジャーナル・
オブ・イムノロジカル・メソッズ」、第６９巻、第１Ｈ
１ｌ！６頁、１９８４年［Ｓｙ！ｏｗｓｋｉ、　ｅｌ　
ａｌ、、　　］、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、　　６９゜ｐｐ１８１．−１８６　（１９８４）］
　も参照。

上記ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、エリス
ロポエチンの定性及び定量のためのイムノアッセイに使
用される高度に有用性のある物質を提供し、更にエリス
ロボエチンのアフィニティー精製においても有用性を有
するが、更に分析、臨床試験及び例えば疾患組織がエリ
スロポエチン産生をになうことができない慢性疾患の治
療のために、該物質の潜在的に広範な治療用途にとって
充分に大量のエリスロポエチンを哺乳類源から単離する
ことに前記抗体が有効に活用できるかということに関し
ては疑問が持たれている。したがって、哺乳類エリスロ
ポエチンを充分に特定化でき、しかも可能性のある診断
的及び臨床的用途のためにそれを大量に供給し得る上で
最良の見通しは、大規模な哺乳類エリスロポエチンの微
小生物による大規模な合成をもたらす組換え操作の実用
化を成功させることにあると、当業者間では考えられて
いる。

ヒト及び他の哺乳類のエリスロポエチンをコードしてい
るＤＮＡ配列を実験的に単離する実質的な努力がこれま
でなされてきたが、誰もまだ成功していない。これは主
に、エリスロボエチンをコードするＤＮＡ配列を従来の
技術により単離することのできる　ｃｌ）ＮＡライブラ
リーを構成し得るｍＲＮＡに富む組織源、特にヒト組織
源、の欠乏に起因するものである。更に、エリスロボエ
チンのアミノ酸残基連鎖についてはほとんど未知である
ため、例えばｃＤＮＡ特にゲノムＤＮＡライブラリーの
ＤＮＡ／ＤＮＡノ翫イブリダイゼーションスクリーニン
グにおいて安心して直ちに使用することができる長鎖ポ
リヌクレオチドプローブを調製することができない。実
際の例として、Ａ、　Ｔ、　ＣＣ，ｌ（［１８２０９で
産生された上記モノクローナル抗体を得るために用いら
れる２０個のアミノ酸配列は、上記アンダーソンらの方
法における、明確な６０塩基オリゴヌクレオチドプロー
ブの構築には使えないものである。エリスロボエチンの
ためのヒト遺伝子はヒトゲノム内で「単一の遺伝子」と
して存在しているらしく、いかなる場合も、ヒトエリス
ロポエチンをコードする遺伝子物質はゲノムライブラリ
ーに存在する総ヒトゲノムＤＮＡの０、０［１００５％
未満を構成するにしかすぎないと推定される。

現在までのところ、単離可能量の哺乳類エリスロポエチ
ンの微生物発現における使用に適したＤＮＡ配列を与え
る組換え関連方法において、最も成功した既知報告例で
も、目標にはほど遠いものであった。−例として、ファ
ーノく−ら：　「エクスベリメンタル・ヘマトロジー」
、第１１巻、第１４増刊号、抄録１０１．１９８３年［
Ｆｘｒｂｅｒ、　　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＩＬＨｅｍａｔ
ｏｔ、、　　１１．　５ｕｐｐ、　　１４．　　Ａｂｓ
ｔｒａｃ＋　　１０１（１９８３）］では、フェニルヒ
ドラジン処処理上の腎臓組織からｍＲＮＡを抽出し、こ
のｍＲＮ　Ａをアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　
１ａｅｖｉ＋）卵母細胞に注入したが、それらの中に含
まれエリスロポエチンの生物学的性質を示す「翻訳生成
物」の混合体がイン・ビトロで産生ずるのはむしろ一時
的な結果であったと報告している。更に最近において、
ファーバーら：「ブラッド」、第６２巻、第５号、第１
増刊号、抄録３９２、第１２２１頁、１９８３年［Ｆ！
＋ｂｅ＋、　　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｌｏｏｄ　、　６２．　Ｎｏ、５．５ｕｐｐ、　ＮＯ
，１，＾ｂ＋ｔ＋ａｃｔ　３９２！ｌ　ｐａｇｅ　１２
２８　ｆ１９８３）　］は、カエル卵母細胞によるヒト
腎臓ｍＲＮ　Ａのイン・ビトロ翻訳について報告した。

その得られた翻訳生成混合体には、注入されたｍＲＮＡ
１蒔当り、エリスロポエチン活性を有する翻訳生成物が
２２０　ｍＵ金含有れていると推定された。エリスロポ
エチンをコードしている外来性ｍＲＮＡのこのようなイ
ン・ビトロ翻訳量が（従来報告された、必要とする生成
物へのヒトｍＲＮ　Ａ翻訳量と比べて）著しく低いと認
められたが、この結果は、ヒト腎臓を、所望の遺伝子が
単離され得る豊富なヒト腎ｃＤＮＡライブラリーの構成
を可能にするエリスロポエチン発現部位としてみなさせ
るものであると考えられた［ファーバー：　「クリニカ
ル・リサーチ」、第３１巻、第４号、東７６９＾頁、１
９８３年［Ｆａｒｂｅｒ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｒｅｓ、
、　　３１（４）　、　７６９Ａ　（１９８３）　］も
参照］。

米国特許出願第５６１．０２４号及び第５８２．１８５
号の出願以後、大腸菌内で、ヒトエリスロポエチンｃＤ
ＮＡとみなされていた物質のクローニングと発現に関す
る一つの報告がなされた。簡単に言えば、多数のｃＤＮ
Ａクローンが大腸菌プラスミドに挿入され、β−ラクタ
マーゼ融合生成物がヒトエリスロポエチンの非特異的「
エピトープ」に対するモノクローナル抗体と免疫応答性
を有することに着目したのである。リーーファン：　「
プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシズ」　（米国）、第８１巻、第２７０
８２７１２頁、１９８４年［Ｌｅｅ−Ｈｕａｎｇ、　　
？ａｃ、　　ＮａｔＡｃａａＳｃｉ、　　（Ｕ、Ｓ、Ａ
）、　　８ｆ、　　ｐｐ２７０８−２７１２　（１９８
４）］参照。

発明の概要 本発明は、その対立遺伝子変異体をも含む天然エリスロ
ポエチンの一次構造形状（即ち、アミノ酸残基の連続配
列）の一部もしくは全部、及び−以上の生物学的性質（
例えば、免疫学的性質並びにイン・ビボ及びイン・ビト
ロでの生物学的活性）を有する新規な精製単離されたポ
リペプチド生成物をはじめて提供するものである。これ
らのポリペプチドは、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの
クローニング又は遺伝子の合成によって得られる外来性
ＤＮＡ鎖の原核もしくは真核宿主での発現生酸物（例え
ば、細菌、酵母、及び哺乳類の培養細胞による）である
ということによっても独特に特徴づけられる。を推動物
（例えば、哺乳類及び鳥類）細胞における微小生物発現
生成物は、自然の哺乳類細胞環境又は血漿もしくは尿の
ような細胞外液におけるエリスロボエチンと関連性があ
るであろうヒト蛋白質又は他の夾雑物とは全く関係がな
いということによって、更に特徴づけられるかもしれな
い。典型的な酵母［例えば、サツカロマイセス・セレビ
シェ（ＳａｃｃｘｒｏａＢｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉａｉｇ
ｅ）］又は原核生物（例えば、大腸菌）を宿主細胞とす
る生成物は、いかなる哺乳類の蛋白質とも関連性を有し
ていない。使用する宿主によっては、本発明のポリペプ
チドは哺乳類もしくは他の真核生物の炭水化物によって
グリコジル化され、あるいはグリコジル化されないかも
しれない。本発明のポリペプチドはまた、最初にメチオ
ニンアミノ酸残基（１番目の位置）を含んでいてもよい
。

本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その−以上の生物
学的性質が得られるのに充分な天然（例えばヒト）エリ
スロポエチンの複製である一次構造形状を有し、天然（
例えばヒト）エリスロポエチンのそれとは異なる平均的
炭水化物組成を有するものが含まれる。

本発明により得られるを推動物（例えば、ＣＯ５−１及
びＣＩ（Ｏ）細胞は、イン・ビトロで継続した増殖が可
能であって、培地で増殖させた場合、それらの培地中に
て、ラジオイムノアッセイにより４８時間で１０６個の
細胞当り　１００単位以上（好ましくは５００単位以上
、最も好ましくは１０００〜５０００単位以上）のエリ
スロボエチンを産生ずることができる、常に入手し得る
最初の細胞である。

更に、本発明によって、初めて解明されたエリスロボエ
チンアミノ酸残基の連続配列の全体的もしくは部分的複
製である合成ポリペプチドが提供される。これらの配列
は、天然エリスロボエチンの一次、二次又は三次構造形
状特性を有しているため、治療及び免疫過程でエリスロ
ポエチンの生物学的活性なもしくは免疫学的な代用物と
して用いられるような、天然産物に共通した生物学的活
性及び（又は）免疫学的性質を有しているであろう。こ
れに付随して、標準的手段によって得られ、このような
ポリペプチドと免疫応答し、好ましくは天然エリスロポ
エチンとも免疫応答するモノクローナル及びポリクロー
ナル抗体が提供される。

本発明では、サル及びヒト種起源のクローンＤＮＡ配列
並びにそれから適切に誘導されたポリペプチド配列につ
いても解明しており、それらはそれぞれサル及びヒト種
起源エリスロポエチンの一次構造形状を表わしている。

更に本発明により、本発明のＤＮＡ鎖を取り込んだ新規
な生物学的機能性のウィルス及び環状プラスミドＤＮＡ
のベクター、並びにそのようなベクターにより安定にト
ランスフォーメーション又はトランスフェクションがな
された微生物（例えば、細菌、酵母及び哺乳類の細胞）
宿主生物も提供される。これに対応し、外来性ベクター
担持ＤＮＡ配列の大規模な発現を促進する条件下におい
て、このようなトランスフォーメーション又はトランス
フェクションされた微生物宿主を培養増殖させ、増殖培
地、細胞ライセード又は細胞膜画分から所望のポリペプ
チドを単離することからなる有用なポリペプチドの新規
製造方法が、本発明によって提供される。

上記方法で得られる微生物発現ポリペプチドの単離精製
は、例えばプレパラティブ・クロマトグラフィー分離、
並びにモノクローナル及び（又は）ポリクローナル抗体
調製物を用いる免疫学的分離のような従来の手段によっ
て行なってもよい。

エリスロポエチンのアミノ酸残基配列が解明されたので
、本発明により、エリスロポエチンをコードするＤＮＡ
配列の全体的及び（又は）部分的製造がなされるが、そ
のＤＮＡ配列には、選ばれた非哺乳類宿主による発現に
「好適な」コードンの取り込み、制限エントヌクレアー
セ酵素による開裂部位の具備及び容易に発現するベクタ
ーの構築を容易にする別の開始、終末又は中間ＤＮＡ配
列の具備というような有利な特性が備えられている。こ
れに伴い、本発明は、−以上のアミノ酸残基の同−性又
は位置に関して天然型とは異なるが、天然型の一部もし
くは全部の性質を有しているエリスロポエチンポリペプ
チド類似体もしくは誘導体（即ち、エリスロポエチンの
特定の残基を全てではないが存する削除類似体、及び（
又は）−以上のアミノ酸残基がポリペプチドの終末又は
中間部位に付加された付加類似体）の微生物発現をコー
ドしているＤＮＡ配列の製造法（並びにｃＤＮＡ及びゲ
ノムＤＮＡの部位特定突然変異誘発による生成法）を提
供する。

本発明の新規なりＮＡ配列は、エリスロポエチンの少な
くとも一部の一次構造形状及び−以上の生物学的性質を
有するポリペプチド生成物の原核もしくは真核宿主細胞
における発現を確保するのに必要な全ての配列を含んで
おり、この配列としては　（ａ１表Ｖ及び■に示したＤ
ＮＡ配列又はそれらの相補鎖、（ｂ）　（ａ）で定義し
たＤＮＡ配列又はそのフラグメントと（本明細書で説明
したようなハイブリダイゼーション条件又はより厳格な
条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ配列、及び（Ｃ
）遺伝暗号の縮重は別にして、上記（ａ）及び（ｂ）で
定義されるＤＮＡ鎖とハイブリッド形成するＤＮＡ配列
が挙げられる。特に、（ｂ）においては、サル及びヒト
エリスロポエチンの対立遺伝子突然変異型をコードし及
び（又は）他の哺乳類種のエリスロポエチンをコードす
るゲノムＤＮＡ鎖が含まれる。また、特に、（Ｃ）では
、エリスロボエチン、エリスロポエチンフラグメント及
びエリスロボエチン類縁体をコードし、無を推動物宿主
においてメツセンジャーＲＮＡの翻訳を促進するコード
ンを育していてもよい合成りＮＡ配列が含まれる。

本発明には、表■の上流路ヒトゲノムＤＮＡ配列のＤＮ
Ａ相補体部分によりコードされたポリペプチド種、即ち
、トラモンターノら＝　「ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ」、第１２巻、第５０４９５０５９頁、１９８４
年［Ｔｒｘｍｏｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎｏｅｌ
ｅｉｃ＾ｃｉｄ＋　Ｒｅ＋ｅｘｒｃｂ、　　１２．　　
ｐｐ５０４９−５０５９　ｆ１９８４）コに記されたよ
うな「相補的な逆方向蛋白質」が含まれる。

本発明には、エリスロポエチン治療、具体的には貧血症
の状態及び最も具体的には慢性腎疾患を伴うような貧血
状態の治療に使用し得る、本発明のポリペプチド生成物
の治療上有効量と薬学上許容される希釈剤、及びアジュ
バント及び（又は）担体とからなる医薬組成物も含まれ
る。

本発明のポリペプチド生成物は、固体組織及び血液又尿
のようにな液体試料中のエリスロボエチンの定性及び定
量に有用な試薬とするために、検出可能なマーカー物質
と共有結合させて標識化しでもよい（例えば　　Ｉで放
射線標識化する。）。

本発明のＤＮＡ生成物もまた、（放射線標識及びビオチ
ンのような非同位元素標識のような）検出可能なマーカ
ーで標識化されていてもよく、ヒト、サル及び他の哺乳
類種の染色体地図におけるエリスロボエチン遺伝子座及
び（又は）それに関連したすべての遺伝子群の座を決定
するために、ＤＮＡハイブリダイゼーション過程で用い
られてもよい。それらはまた、ＤＮＡレベルにおけるエ
リスロボエチン遺伝子の欠陥を見出すために用いること
ができ、更には隣接する遺伝子及びそれらの欠陥を見出
すための遺伝子マーカーとして用いることもできる。

本明細書で詳細に記したように、本発明では更に、マル
チブルー重鎖ポリヌクレオチドを含む不均一な細胞もし
くはウィルス試料において、配列未知の特定の一本鎖ポ
リヌクレオチドを検出するための重要な改良方法も提供
するが、この方法は下記のとおりである。

ｆり一様に変異した塩基鎖を有する標識化−重鎖ポリヌ
クレオチドプローブの混合体が調製される。このプロー
ブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特である、と推
定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である。

ｆｂ）試料が固体基質に固定される。

（Ｃ）それに固定された試料を有する基質が、該試料の
ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによらな
いで、ポリヌクレオチドが更にそれと結合するのを抑制
するように処理される。

（ｄ）それに固定された試料を有する処理済みの基質が
、全体的に相補性のポリヌクレオチド間でのみハイブリ
ッド形成し易い条件下で、一時的に前記標識化プローブ
の混合体と接触させる。

次いで （ｅ）特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化プロ
ーブ混合物内の全体的に相補的なプローブとのハイブリ
ッド形成反応の存在を確認することによって検出される
。これは標識化プローブの基質との非特異的結合に起因
する標識化物質の背景密度と比較して特定のポリヌクレ
オチド位置における基質上の標識化物質の密度が高いと
いうことにより証明される。

この操作は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ／ＲＮＡハイブリッド形成において、１７〜２０塩基
を有する６４、１２８．２５６．５１２．１０２４又は
それ以上の混合ポリヌクレオチドプローブを使用するこ
とが指示された状況下で特に有効である。

以下に記すように、上記改良方法により、サル種起源の
エリスロポエチンをコードし、貧血サル腎細胞ｍＲＮＡ
から誘導されたライブラリー内のｅＤＮＡクローンを実
際に同定することができた。

より具体的には、ヒトエリスロポエチンのフラクション
を配列決定して導かれたアミノ酸配列情報に基づく、　
１２８種類の一様に変異した２Ｑ−ｍｅｒプローブ混合
体が、コロニーハイブリダイゼーション操作で用いられ
、合計２Ｈ，ｆｌｕのコロニーの中から７つの「＋（陽
性）」エリスロボエチンｃＤＮＡクローンが同定された
。更に特記すべきは、本発明の改良操作を実施すること
により、ヒトゲノムライブラリーを構成する　１．５０
０．０ＧＯノア７−ジプラークのスクリーニングの中か
ら３つの陽性クローンを迅速に単離することができたこ
とである。

これは、ヒトエリスロポエチンの別の連続配列のアミノ
酸分析による第二の　１２８種類の１７−ｍｅ＋プロー
ブと一緒に上記した　１２８種類の２０−ｍｅｔプロー
ブ混合体を用いて実現されたものである。

上記で説明した操作は、哺乳類ゲノムクローンを単離す
るためのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成過程において
、多数の混合オリゴヌクレオチドプローブを使用した最
初の公知例であり、しかもｃＤＮＡクローンの単離にお
いて３２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ混合体
を使用した最初の公知例である。

種類発明に多数の側面と利点があることは、種類発明の
実際に好ましい態様での実施を説明している以下の詳細
な説明を読むならば、当業者においては明らかとなるで
あろう。

発明の詳細な説明 本発明によれば、ヒト及びサル種エリスロポエチン（以
下、時々ｒＥＰＯＪと略する）のポリペプチド配列の一
部又は全部をコードしているＤＮＡ配列が単離され、特
定化された。更に、サル及びヒト起源ＤＮＡは、イン・
ビボ及びイン・ビトロのＥＰＯ生物学的活性のみならず
、天然ＥＰＯの生物学的（例えば免疫学的）特性も発揮
する単離可能な量のポリペプチドを与える真核及び原核
細胞発現の主体をなした。

サル種起源のＤＮＡは、化学的に誘導された貧血状態を
呈し、その血清が免疫学的測定によると正常なサル血清
と比べて高レベルのＥＰＯを含有するサルの腎組織から
得られたｍＲＮＡにより構成された　ｅＤＮＡライブラ
リーから単離された。

ＥＰＯをコードするＤＮＡを含む所望ｃＤＮＡクローン
の単離は、１２８種類が混合され、放射線標識化された
２０−　ｍｅｔのオリゴヌクレオチドプローブのプール
を用いて、ＤＮＡ／ＤＮＡコロニハイブコロイゼーショ
ンにより実現されたが、２００、０００コロニーの迅速
なスクリーニングが必要とされた。オリゴヌクレオチド
プローブの設計は、少量のヒトＥＰＯ試料の酵素的切断
とアミノ酸配列決定により得られたアミノ酸配列情報に
基づいた。

ヒト種起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡライブラリーか
ら単離された。ＥＰＯをコードするＤＮＡを含むクロー
ンの単離は、１２８種類が混合された２Ｏ−ｎｅｔのオ
リゴヌクレオチドプローブの上記プールと、別の酵素に
よるヒトＥＰＯフラグメントから得られたアミノ酸配列
情報に基づく１２８種類の放射線標識化１７１ｅ＋プロ
ーブの第二のプールとを用いて、ＤＮＡ、／ＤＮＡプラ
ークハイブリダイゼーションにより行なわれた。

陽性のコロニー及びプラークは、２０−ｍａｒプローブ
のプール内の１６塩基鎖サブセツトを用いたクローンＤ
ＮＡのジデオキシ配列法により確認され、選択されたク
ローンは、それによりコードされるＥＰＯポリペプチド
の一次構造形状を推定させるヌクレオチド配列分析に供
された。推定されたポリペプチド配列は互いに、またヒ
トＥＰＯフラグメントのアミノ酸分析により得られた部
分配列に対しても高度の相同性を示した。

選択された陽性のサルｃＤＮＡクローン及び選択された
陽性のヒトゲノムクローンは、それぞれ「シャトルＪ　
ＤＮＡベクターに挿入され、このベクターは大腸菌に導
入されて、培養哺乳類細胞をトランスフェクションする
ために用いられた。トランスフェクションされた宿主細
胞の培養増殖により、培養ｅ、１　ｍｌ当り３０θＯυ
のＥＰＯを含有していると推定される培地上澄標品が得
られた。

以下の諸例は本発明の説明のために掲げられており、特
にＥＰＯをコードするサルｃＤＮＡクローン及びヒトゲ
ノムクローンの同定に先立って実施される操作、この同
定のための操作、並びに配列決定、発現系の生成及びこ
の系におけるＥＰＯ発現の免疫学的確認に関するもので
ある。

更に具体的には、例１はヒトＥＰＯフラグメントのアミ
ノ酸配列及びこの配列に基づく放射線標識化プローブ混
合体の調製に関する。例２は一般に、陽性サルｃＤＮＡ
クローンの同定に必要な操作に関するものであり、この
ため動物の処置及び動物血清の予備的ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩ　Ａ）分析に関する情報が得られる。例３は
、ｃＤＮＡライブラリーの調製、陽性クローンのコロニ
ーハイブリダイゼーションスクリーニングおよび確認、
陽性ｅＤＮＡクローンのＤＮＡ配列並びにサルＥＰＯポ
リペプチドー次構造形状（アミノ酸配列）の情報に関す
る。例４は陽性ヒトゲノムクローンの同定に必要な操作
に関するものであり、このためゲノムライブラリー、プ
ラークハイブリダイゼーション操作及び陽性クローンの
確認に関する情報が得られる。例５は、陽性ゲノムクロ
ーンのＤＮＡ配列及びサルＥＰＯ鎖の情報との違いも含
めた、ヒトＥＰＯポリペプチドアミノ酸配列の情報に関
する。例６は、陽性サルｃＤＮＡクローンから得られた
ＥＰＯをコードするＤＮＡを取り込んだベクターの調製
方法、ＣＯ３−１細胞をトランスフェクションされた細
胞の培養増殖法に関する。

例７は、陽性ヒトゲノムクローンから得られたＥＰＯを
コードするＤＮＡを取り込んだベクターの調製方法、Ｃ
Ｏ３−４細胞をトランスフェクションするためのベクタ
ーの使用法及びトランスフェクションされた細胞の培養
増殖法に関する。例８は、例６及び７におけるトランス
フェクションされた細胞の培養増殖により得られた培地
上澄で実施されたイムノアッセイ法に関する。例９は、
例６及び７における微生物発現によるＥＰＯのイン・ビ
トロ及びイン・ビボ生物学的活性に関する。

例１Ｇは、チャイニーズハムスター卵巣（ｒＣＨＯｊ）
細胞をはじめとする、サル種ＥＰＯｃＤＮＡ及び及びヒ
ト種ゲノムＤＮＡについての哺乳類宿主発現系の調製並
びにこれらの発現系による生産物の免疫的および生物学
的活性、およびこれらの生産物の特徴づけに関する。例
１１は、ヒ１−ＥＰＯ及びＥＰＯ類縁体をコードする合
成遺伝子、それらは大腸菌及び酵母菌の宿主細胞での発
現のための多数の優先ニートンを含むものであるが、の
調製及びそれに基づく発現系に関する。例１２は、例１
１の系における発現生成物の免疫学的及び生物学的活性
面に関する。

表　　■ ヒトＥＰＯを尿から単離し、トリプシン切断させて、約
１００〜１５０ピコモル量の１７個に分断されたフラグ
メントとし、単離した。

フラグメントに任意に数字を付し、気相配列決定装置（
アプライド・バイオシステムス）を用いて微細配列順序
分析によりアミノ酸配列を分析し、以下の表Ｉに示した
配列情報を得た。表では、単一文字符号が用いられてお
り、ｒＸＪは明確に決定されなかった残基を表わす。

Ｔ４Ｚ！ ｌｂ ｒＸＪ Ｔ／、４ ｉｔ Ｔ　コ　／ Ｔ　２　よ Ｊｊｘ 　Ｊｊｂ 丁コ２ Ｔ２Ｊ’ ＴＪ′Ｏ ＴＪ／ ＪＪ Ｊｊ ＪＩｒ Ａ−ｐ−ｐ−ａ Ｇ−に−Ｌ−Ｋ Ａ−Ｌ−Ｇ−人−Ｑ−Ｋ Ｖ−Ｌ−Ｅ−Ｒ 人−Ｖ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｒ Ｌ　　−Ｆ　　−Ｒ Ｋ−Ｌ−Ｆ’−Ｒ Ｙ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｋ Ｌ　　−１−Ｃ−Ｄ　　−Ｓ　　−Ｆ’。

Ｌ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ａ−’Ｃ−Ｒ Ｔ−Ｉ−Ｔ−Ａ−Ｄ　　−Ｔ４−ｇ Ｅ　−＾　−ｌ−５−Ｐ−Ｐ−Ｄ　　？Ａ−Ａ−Ｍ−Ａ
−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｒ Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｘ−ｒ−Ｔ−Ｔ−Ｃ；− Ｘ−Ａ−Ｅ−Ｈ−Ｘ−５−Ｌ− Ｎ−Ｅ−Ｘ−４−Ｔ−ｖ−Ｐ Ｖ−Ｙ−８−Ｎ−Ｆ−Ｌ−Ｒ ３−Ｌ−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｒ Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｙ−Ａ−Ｗ−Ｋ Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｌ−、Ｌ−Ｖ　　−χ　−Ｓ　−５−Ｑ−
Ｐ−Ｗ−Ｅ−Ｐ−Ｌ− Ｑ−Ｌ−Ｈ−Ｖ−Ｄ−に Ｂ、オリゴヌクレオチドプローブ混合体の設計と調製 表工に示したアミノ酸配列に関し、混合プローブ操作が
ｃＤＮＡ及び（又は）ゲノムＤＮＡライブラリーでのＤ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に適用し得るかにつ
いて確認する目的で、遺伝暗号の縮重関係を精査した。

この分析では、フラグメントＮｕ　Ｔ３５の中に７つの
アミノ酸残基（Ｖｉｌ−＾ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔ７ｒ−Ａｌ
ｘ−Ｔｒｐ−Ｌ７ｇ　）が存在しテいたことが判明した
が、この鎖は２０塩基対について可能な１２８種類のＤ
ＮＡ鎖のうちの一つによりコードされているということ
により独特に特徴づけることができる。１２８種類の２
０塩基鎖オリゴヌクレオチドの第一の組は、したがって
下記表■に示した配列に従い、固体支持体上での標準ホ
スホアミデート法［例えば、ビューケージら；　［テト
ラヘドロン・レターズゴ、第２２巻、第１８５９−１１
１ｆｉ２頁、ＩｆｆＨ年（Ｂｅ＊ｕｃＢｅ、　ｃｔ　ａ
１ ２２、　　ｐｐ１８５９−１８６２ る。

（１９８１））参照］により合成され Ｔｅ＋ｒｔｈｅｄ＋ｏｎ　　Ｌｅｖｅｒｓ　　。

表　　　　■ 残基　Ｖｇｌ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　ＴＬＬ３’　Ｃ
ＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧＴＡＡ＾ ＾ｌＩ　　Ｔｒｐ　　　ＬＨ ＣＧＡ　　　ＡＣＣＨ−５’ 更に分析すると、フラグメントＮｉｌ　Ｔ３８の中に、
６つのアミノ酸残基（Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＧＩｕ
−Ｐｒｏ−Ｌｅａ）の存在が確認され、それに基づけば
、下記表■に示したように１２８種類の混合オリゴヌク
レオチドの１７−ａ＋ｅ＋プローブのプールを調製する
ことができる。

表　　　■ 残基　Ｇｌｎ Ｔａｐ　　　Ｇｌｕ Ｌｅａ ３′ ＴＴ ＡＣＣ ＴＴ Ｇ＾−５ ＾ オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ＮＥＮ）を用いて７５００〜８０００Ｃｉ／
　■ｏｌ　（Ｉ　ＣＮ　）の７　　　Ｐ−ＡＴＰにより
５′末端で標識化した。

例　　　　２ サルの処理操作 メスのカニクイザル（ＣＢｏｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅ
７）マカカ０ファシキュラリアス（Ｌｃｌｃａ　ｔｔｓ
ｃｉｃａｌａ＋ｉｇａ）（２５〜３ｋｇ、　　１．５〜
２年齢）に１．３及び５日月；１２５■／ｋｇの用量で
ｐＨ７，０の塩酸フェニルヒドラジン溶液を皮下注射し
て処理した。ヘマトクリット値をそれぞれ注射する前に
測定した。７日目に、あるいはへマドクリット値が初期
値の２５％低下した際、塩酸ケタミン２５■／ｋｇを投
与して、血清及び腎臓を採取した。採取物を直ちに液体
窒素で凍結し、−７０℃で保存した。

Ｂ　　ＥＰＯのＲＩＡ 試料中のＥＰＯ定量のためのラジオイムノアッセイ操作
を以下の操作に従い実施した。

エリスロポエチンの標準又は未知試料を３７℃で２時間
抗血清と一緒にインキュベートした後、試験管を氷冷し
、　　　Ｉ−標識化エリスロポエチンを加え、管を１５
時間以上０℃でインキュベートした。各試験管には、希
釈免疫血清５更、１２５■−エリスロポエチンＩＱ、０
００　Ｃｌ１ｌ１１．　　）ウシロール５成及びＥＰＯ
標準もしくは未知試料θ〜２５０　ｕｌからなり、残部
が０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳであるインキュベート混合
物５００ｍが入っていた。使用した抗血清は、ヒト尿エ
リスロポエチンの純粋の１％標品で免疫されたウサギの
第２回目採血液であった。

試験のための最終的抗血清希釈液は、抗体−結合”ｒ−
ＥＰＯが入力縁カウント数の１０〜２０％を超えないよ
うに調整された。一般に、これは１：５ｆｌ　０００〜
１　：　１Ｇ０．０００の最終的抗血清希釈液に相当し
た。

抗体−結合１２５　Ｉ−エリスロボエチンは、スタフＡ
（凰ｊｘｐｈ＾）　１５０１１１の添加により沈澱した
。４０分間インキュベートした後、試料を遠心分離し、
ベレットを０．１５Ｍ　ＮｌＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ及
び０．０５％トリトンＸ−１，００含有１１０１ｏトリ
ス−ＨＣ１０，７５ｍ１　（ｐ）１１２）で二回洗浄し
た。洗浄したペレットをガンマ−カウンターで計測し　
　１２５Ｉ−エリスロポエチン結合体の％を求めた。免
疫前の血清のカウント数を、非特異的沈澱について補正
するため、全ての最終値から差し引いた。未知試料のエ
リスロボエチン含量を標準曲線と比較して求めた。

上記操作を、未処理サル血清のみならず、前記Ａ部で得
られたサル血清にも適用した。正常血清値を分析すると
含有量は約３６ｍＵ／ｍｌであったが、処理サル血清で
は含有量は１０００〜１．７００ｍＵ／ｍｌであった。

例　　　　３ Ａ、サルｃＤ　Ｎ　Ａライブラリーの構築メツセンジャ
ーＲＮＡを、チャーブウィンら＝「バイオケミストリー
」、第１ｇ巻、第５２９４頁、１９７９年［ＣｈｉＢｖ
ｉｎ、　　ｅｌ　ａ！、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋ｔｒ
７　１８ｐ　５２９４　（１９７９）　Ｅのチオシアン
酸グアニジウム法によって正常と貧血サル腎臓から単離
し、ポリｆＡ）＋　ｍＲＮＡを、マニアナイスら：　「
モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニ
ュアルＪ　　（１９８２年、ニューヨーク州、ハーバ−
、コールトスプリンゲス所在、コールトスプリンゲスハ
ーバ−ラボラトリ−）　　［Ｍａｎｉａｌｉ＋、　　ｅ
ｔ　ｚ″Ｍｏ１ｅｅｏｌａ＋　　Ｃ１ｏｎｉＢ、　　Ａ
　　Ｌｔｂｏ＋ａｆｏＢ　　Ｍａｎｎａ（Ｃｏｌｄ　　
Ｓｐｒｉｎｇｓ　　ＨＩｒｂａｒ　　Ｌａｂｏ＋ｘｌｏ
＋７．Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐ＋ｉＢ＋Ｈｘｒｂｏｒ、　　Ｎ
、Ｙ、、　　１９８２）　Ｅ第１９７−１０頁に記載さ
れているように、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムク
ロマトグラフィーで二回精製した。ｃＤＮＡライブラリ
ーを、オカヤマら：　「モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー」、第２巻、第１６１１７０頁、１９
８２年［Ｏｋ！７１．ｅｔ　Ｉｌ、、　　Ｍｏ１．ａｎ
ｄ　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．、　２．　　ｐｐ１６１−１７
０　　（１９ｇ２）コの一般的方法の修正法により調整
した。本発明での好ましい操作のキーポイントは以下の
とおりであった：（１）ｐＵＣ８を唯一のベクターとし
て使用し、ＰｓｌＩで切断し、次いで６Ｇ〜８０塩基鎖
のオリゴｄＴの連部をつけた。（３ＨｉｎｃＩ［切断に
よりベクターの一端からオリゴ４７尾部を取り除いた、
（３）第一の鎖の合成とオリゴｄＧの連部づけを公表さ
れた方法により実施した、（４）　Ｂ　ａｍＨＩ切断に
よりベクターの一端からオリゴｄＧ連部を取り除いた、
及び（５）　Ｄ　Ｎ　ＡによるＲＮＡ鎖の置換には、オ
リゴｄＧ連部つきベクターよりも３倍モル過剰の２つの
リンカ−（ＧＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣおよびＡＣＧＧＴＣＴＴＴ＾）を用いた。

トランスフォーメーションを受けた大腸菌を、５０趨／
ｍｌのアンピシリン含有栄養平板上に、ＩＱＸ　Ｌｏａ
ｎプレート当り９０００コロニーの密度で分散させた。

ジーン・スクリーン・フィルター（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅ
ｎ　１ｉｔｔｅｒ）　にューイングランド・ヌクレア・
カタログ勲ＮＥＦ−９７２）をＢＨＩ−ＣＡＭプレート
（バクト（８ｇｃ＋ｏ）脳心臓浸出液３７ｇ１ＩＩカザ
ミノ酸２ｇ／ｌ及び寒天１５ｇ／ｊ！、クロラムフエニ
コール５００℃１ｇ／　ｍｌ含有）にて予め湿潤させ、
プレートからコロニーを採取するのに用いた。コロニー
を同一の培地で１２時間以上増殖させて、プラスミド複
製数を増やした。増殖したコロニー（コロニ・サイド・
アップ）を、以下の溶液でそれぞれ飽和された２枚のワ
ットマン　３ＭＭ紙上にフィルターを連続的におくこと
により処理した：（１）５分間は５［１ｍＭグルコース
−２５ｍＭトリスＨＣｌ１（ｐＨ８，０）−１０ｍＭ　
ＥＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）、（２１１０分間は０．５
ＭＮａＯＨ，及び（３）３分間は１．０ＭトリスＨＣβ
　（ｐＦ１７．５）フィルターを次いで、８０℃にて２
時間減圧乾燥させた。

フィルターを次に、プロテア−ゼにで消化に付し、緩衝
液Ｋ　［０，ＩＭ　トリスＨＣｆｌ（ｐＨ８，０）０、
１５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｒ２−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　　（ｐ
Ｈ８，２）　−０，２％５ＤＳＩ中に該プロテアーゼ酵
素５０１１９　／　ｍｉを含む溶液で処理した。具体的
には、該溶液５ｍｌを各フィルターに加え、５５℃で３
０分間消化処理し、しかる後溶液を除去した。

フィルターを次いで、プレハイブリダイゼーション緩衝
液（５ｘＳＳＰε−０，５％５ＤＳ−１００１１９／　
ｍｌ　ＳＳ大腸菌ＤＮＡ−５Ｘ　ＢＦＦ）　４ｍｌで処
理した。ブレハイブリダイゼーション処理を５５℃で、
おおむね４時間以上行ない、その後、プレハイブリダイ
ゼーション緩衝液を除去した。

ハイブリッド形成操作を以下の方法で行なった。

各フィルターに、表■の　１２８種類のプローブ配列（
ＥＰＶ混合体とされる全ての混合体）をそれぞれ００２
５　ピコモル含有するハイブリダイゼーション緩衝液（
５ｘ　５ＳＰＥ−Ｇ、　５％５ＤＳ−酵母菌ｔＲＮ　Ａ
　　１００１１９　／　ｍｌ　）　３　ｍｌを加え、フ
ィルターを４８℃で２０時間保持した。この温度は、全
てのプローブについて決定された計算解離温度（Ｔｄ）
の最低のものより２℃低かった。

ハイブリッド形成後、フィルターを振盪器にて１０分間
、室温で５ｘ　５ＳＣ−Ｑ、　！％ＳＤＳにより３回洗
浄し、ハイブリッド形成温度（４８℃）にて２〜３回５
　ｘ　５ＳＣ−１％ＳＤＳで洗浄した。

フィルターのオートラジオグラフィーにより、スクリー
ニングされた　２００．０００コロニーの中から７つの
陽性クローンが見出された。

推定されるサルｃＤＮＡクローンの一つ（クローン＃８
３）の最初の配列分析が、ウォレスら＝　「ジーン」、
第１６巻、第２１−２６頁、１９８１年［Ｗａｌｌａｃ
ｅｃｌ　！ｌ、、　Ｇｅｎｅ、　　１６．　ｐｐ２１−
２６（１９８１）］の方法を修正して確認のために行わ
れた。即ち、サルｃＤＮＡクローン＃８３からのプラス
ミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して直鎖状となし、沸騰
水浴上で加熱して変性させた。ヌクレオチド配列をサン
ガーら：ｒ　Ｐ、　Ｎ、人Ｓ、Ｊ（米国）、第７４巻、
第５４６３−５４５７頁、１９７７年［Ｓａａｇｅｒ、
　　ｅ）　ｓｌ、、　　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　　（Ｕ、Ｓ
、＾）、７４゜ｐｐ５４６３−５４６７　（１９７７）
］のジデオキシ法で調べた。

１６の配列からなるＥＰＶプローブ混合体の一部を塩基
配列決定のプライマーとして用いた。

Ｃ，サルＥＰＯｃＤＮＡ配列 クローン＃８３のヌクレオチド配列分析をメッシング＝
　「メソッド・イン・エンザイモロジー」、第　１０１
巻、第２０−７８頁、１９８３年［Ｍｅ＋ｓｉｎｇ、　
Ｍｅｔｈｏｄｓｎ　ＥｎＢｍｏｌｏｇ７．　１０１．　
ｐ１１２０−７８　（１９８３）］の方法に従って行な
った。表■に示したのは、クローン＃８３における約１
６００塩基対のＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ　ｍクローン化
フラグメントの予備的な制限酵素地図分析結果である。

制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位のおおよその位置
は、該フラグメントの５′末端のＥｃｏＲ１部位に対す
る３′側の塩基数によって表わされる。ヌクレオチドの
配列は、重複するフラグメントを重ね合せるように、個
々の制限フラグメントをつなげることにより行なわれた
。例えば、Ｃ１１３の制限フラグメント（ＩＩＩの８口
３＾／３２４のＳｌｌりにおけるヌクレオチド分析で得
られる配列情報と０７３のフラグメント（４２４のＡｌ
ｕＴ／２０３のＢｓｆＥ］Ｉ）の逆方向配列決定により
得られる配列情報との重複である。

約１３４２塩基対（ＥｅｏＲＩ部位の３′側の５ａａ３
Ａ部位からＨｉｎｄｌｌＩ部位までの範囲内で）の配列
を決め、全ての解読可能な構造を分析して、表Ｖに示し
たＤＮＡ及びアミノ酸鎖の情報を解明することができた
。表中、成熟ＥＰＯのアミノ末端と推定される最初のア
ミノ酸残基（前述した２０のアミノ末端残基配列分析と
対比させて確認されるような）は、数値の＋１で示され
ている。成熟蛋白質アミノ酸鎖において一番目の残基で
ある最初のアミノ末端アラニン残基の「上流」に位置し
ていてメチオニンを特定化するＡＴＧコドン（−２７で
示される）の存在は、成熟ＥＰＯが循環系に入る前に切
除される２７のアミノ酸「リーダー」領域を含む前駆体
型として、ＥＰＯが細胞質中でまず発現される可能性の
あることを示している。ポリペプチド中の潜在的グリコ
ジル化部位は車で示されている。翻訳領域の分子量は２
１１１７ダルトンであり、成熟サルＥＰＯを構成するポ
リペプチドの１６５基の分子量は　１１１２３６ダルト
ンであった。

〉ベコ −ａ ａｃニ ー〇 〉Ｃ コΦ Ｃ Ｊ　Ｃｊ− ＝ζ フ二ζ （：；ζ：ズ ロロー く１口 ｃ５ ０ロ ロＵ コロ コロ ロ０υ （７％ｌ＋ω 伍ロ コロ Ｃ ０口 二− ＬＩ− 表Ｖのポリペプチド鎖は、 例えばホップら： 」 （米国） 第７８巻、 第 ３８２８頁、 １９８１年 ［Ｈｏｐｐ Ｐ、　Ｎ、＾、　Ｓ、　（Ｕ、　Ｓ、＾、）、７８、ｐ
ｐ３ｇ２４−３８２８　（１９８１）コ、カイトら：　
［ジャーナルオブ・モレキュラー・バイオロジー」 第 巻、 １（１５−１３２頁、 ［Ｋ７ｆｅ。

ｔ １５７、 ｐｐｌＧ５−１３２ ］ 及び （又は） チューら： 「バイオロジー ト リー」 第１３巻、 第 頁、 １９７４年 ［Ｃｈｏｕ ｔ １１ｉｏｃｈｅｍ １３゜ ｐ２２２ （１９７４）］ 及び 「ア ドバンシズ・イン エンザイモロジー」 第４７巻、 第４５− ４７頁、 ９７Ｂ ［Ａｄｙｘｎｃｅｓ ＥｎｇｙｍｏｌｏＢ ｐｐ４５−４７　（１９７８）］ 一〇　（ｊａ　Ｕ　　υトくローＱ←口くの方法により
、 高度に親水性の領域及び （又は） 潜在的に高度な免疫原性領域を示す二次構造特性の存在
に関する分析に容易に付されるであろう。

ホップらの方法によるコンピューター補助分析は、リフ
オルニア州、 パロアルト、 ユニバーシティ ァベニュ　１２４のインテリジニネティックス社から入
手可能なＰＥＰレファレンスのセクション６．７に示す
プログラムにより実施可能である。

例　　　４ Ａ、ヒトゲノムライブラリー ローンら：前記「セル」、［Ｌｘｖｎ、　ｅｌ　１１．
前記Ｃｅ１ｌ］の方法により調整されたＣｈＪ人ファー
ジ担持ヒト胎児肝ゲノムライブラリーを得、プラークハ
イプリダイゼーシラン分析で使用するために保存した。

ファージ粒子を溶解し、ＤＮＡを、シーンスクリーン・
プラス・フィルタにューイングランド・ヌクレア・カタ
ログＮＱ　ＮＥＦ〜９７２）及びＩＩｚＹＡＭプレート
・　（１リツトルにつき、Ｎａα５ｇ５Ｍｇα２−６Ｈ
２０２ｇ　ＸＮＺ　−７ミノＡ１０ｇ１酵母エキス５ｇ
１カザミノ酸２ｇ１マルトース２ｇ１及び寒天）を使用
することを除いては、ウー：　「メソッズ・イン・エン
ザイモロジー」、第５８巻、第３８９−３９５頁、１９
７９年［ＷＯＯ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｘ１ｍｏ
ｌＢ７６Ｂ、　　ｐｐ３１１９−［５（１！１７９）］
の方法により、フィルター（フィルター当り５０．００
０プラーク）に固定した。

風乾したフィルターを８０℃で１時間焼付し、次いで例
３のＢに記したように、プロティナーゼにで消化した。

プレハイブリダイゼーションを５５℃で４時間以上ＩＭ
　ＮＩＣ［！〜ｆｊ４　Ｓ０５緩衝液で行ない、しかる
後緩衝液を除去した。ハイブリッド形成及びハイブリッ
ド後洗浄を例３のＢに記したように行なった。ＥＰＶで
示される　１２８種類の２０−ｍｅ＋プローブ混合体及
び（ＥＰＱ混合体で示される）表■の　１２８種類の１
７−ｍａｒプローブ混合体を用いた。

ハイブリッド形成は、ＥＰＶプローブ混合体を用い、４
８℃で行なわれた。ＥＰＱプローブ混合体ハイブリッド
形成は４６℃、即ち混合体中の最低の計算Ｔｄ値より　
４℃低い温度、で行なわれた。再ハイブリッド形成のた
めのハイブリッド形成プローブの除去を、ｌ　Ｘ　５Ｓ
Ｃ−０，１％ＳＯＳと一緒に２分間煮沸することにより
行なった。フィルターのオートラジオグラフィーにより
、調べられた１、５００　ＱＯＧのファージプラーク中
３つの陽性クローン（いずれのプローブ混合体とも反応
する）が見出された。

ＥＰＯをコードしているような陽性クローンの確認が、
ＤＮＡシークエンシングと、例３のサルＣＤＮＡとのへ
テロ二重鎖形成の電子顕微鏡写真による視覚化とによっ
てなされた。この操作によっても、ゲノムＤＮＡ鎖にお
ける多数のイントロンの存在が実証された。

例　　　５ （λｈＥ１で示される）陽性クローンの一つのヌクレオ
チド配列分析を行なったが、これまでに得られた結果は
表■に示されている。

表■中、最初のＤＮＡ配列は、ヒトＥＰＯ遺伝子の翻訳
部分の直前の非翻訳配列と思われる最前の６２０塩基を
示す。より具体的には、その配列は、リーダー配列（「
前配列」）における最初の４つのアミノ酸（−２７〜−
２４）をコードする翻訳ＤＮＡｆＪ域まで続＜５′末端
遺伝子からなっているようである。リーダーの始まりを
コードする遺伝子の前に位置する鎖中の４つの塩基対は
まだ明確には確認されなかっため、「Ｘ」で表わされて
いる。次いで、約６３９塩基対（そのうち４３９塩基対
が配列決定されたが、残りの２００塩基対はｒｌ、ｓ、
」で表わされている）からなるイントロンに続いており
、翻訳されるポリペプチドの残基−２３として示された
グルタミン酸のコードンの直前に位置している。

その直後に続（エキソン鎖は、（成熟ヒトＥＰＯのアミ
ノ酸鎖残基＋１として示される）アラニン残基から、＋
２６のスレオニンを特定化するコードンまでのアミノ酸
残基をコードしていることが判明し、しかる後具体的に
示した２５６塩基からなる第二のイントロンに続いてい
る。このイントロンの後、２７〜５５のアミノ酸残基の
エキソン配列が続き、その後６１２塩基対からなる第三
のイントロンが始まる。次のエキソンはヒトＥＰＯの５
６〜１１５の残基をコードしており、次いで特定化され
た１３４塩基からなる第四のイントロンが始まる。第四
のイントロンに続くのは、第１１６〜１６６の残基をコ
ードするエキソンと「停止」コードン（ＴＧＡ）である
。最後に、表■では、ヒトＥＰＯ遺伝子の非翻訳３′領
域と思われる　５６８塩基対鎖を明らかにしているが、
「Ｘ」で示される２つの塩基対はまだ明確には配列法め
されなかった。

表■はこのように、１６６個の特定のアミノ酸残基の成
熟ヒトＥＰＯ（推定分子量＝１．８．３９９）の−次槽
造形状（アミノ酸配列）を確認するのに役立つ。表で同
時に示されているのが、ヒト遺伝子オペロンのプロモー
ター／オペレーター機能にとって重要な５’　−３’　
Ｄ　Ｎ　Ａ鎖とともに、２７残基のリーダー配列をコー
ドするＤＮＡ配列である。成熟ヒトＥＰＯポリペプチド
の潜在的グリコジル化部位は、表中に掌で示されている
。表■の特定のアミノ酸配列がヒトエリスロポエチンの
自然発生的対立遺伝型のそれを構成している可能性があ
ることに注意すべきである。この立場に関する支持が、
残基１２６において表に示したセリンと対立するメチオ
ニンを有する多くのエリスロポエチン分子の発見に至っ
た、尿中ヒトエリスロポエチンの単離物を配列決定する
という長年の努力の結果の末に見出された。

以下の表■はヒトおよびサルのＥＰＯにおけるポリペプ
チド配列の相同性の程度を示している。

表中の上部の連続列において、−文字の符号は残基−２
７で始まるヒトＥＰＯについて推定翻訳されたポリペプ
チド配列を示すために用いられており、下部の連続列は
指定の残基−２７で始まるサルＥＰＯについて推定され
たポリペプチド配列を示している。傘は、配列相同性を
強調するために用いられている。推定されたヒトおよび
サルＥＰＯ配列は、（ヒト）における部位１１６に「付
加的」リジン（Ｋ、　）残基を示していることに注目す
べきである。表■と相互に参照することにより、この残
基が丁度ゲノム配列において推定されるｍＲＮ　Ａのス
プライス部位にあることが明らかとなる。ヒトポリペプ
チド配列におけるリジン残基の存在は、下記例７でヒト
ゲノムＤＮＡによりトランスフォーメーションされたＣ
０８−１細胞から単離されりｌｌｌＲＮＡより得られる
ヒト　ｃＤＮＡＤＮＡ−ンを配列することによっても更
に確認された。

例　　　　６ 例３の操作で得たサルｃＤＮＡによりコードされるＥＰ
Ｏポリペプチド物質を単離可能な量で微生物合成するた
めに最初の試みとして選択された発現系は、哺乳類宿主
細胞のうちの一種（即ち、Ｃ０８−１細胞、＾、　Ｔ、
　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＣＲＬ−１６５０）であった。

その細胞は、大腸菌宿主（ｐＢＲ３２２由来ＤＮＡの存
在下にて）および哺乳類宿主（ＳＶ４０ウィルス由来Ｄ
ＮＡの存在下にて）内で自律的に複製することが可能な
「シャトル」ベクターによりトランスフェクションされ
た。

更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製
された。例３のプラスミドクローン＃８３を大腸菌で増
殖させ、約１．４ｋｂのサルＥＰＯをコードするＤＮＡ
をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｎＩ切断により単離した。

分別して単離されたのは、約４．ＯｋｂのｐＢＲ３２２
由来Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｓｌｌ　　Ｉフラグメントであ
った。約３０ｂ９のＥｃｏＲＩ／Ｓ直ＩＩ　　ｒリンカ
−」フラグメントがＭＩ３ｍｐ　１ＯＲＦ　ＤＮＡ　（
ＰアンドＬラボラトリーズ）から得られた。このリンカ
−はＥｃｏＲＩ付着端を含んでおり、順にＳ　！ｌ　Ｉ
　ＮＳｍｘｌＳＢ２１ＱＩおよびＸ　ｂａ　Ｉ認識部位
さらには５ａｌｌ付着端が続いている。上記３つのフラ
グメントは約５．４ｋｂの中間プラスミド（ｒ　ｐＥＲ
ｓＪ　）の形成のために連結されたが、このプラスミド
において、ＥＰＯＤＮＡは有効な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位の「バンク」近傍の一端に位置していた。ｐ
ＥＲ３を次いでＨｉｏｄｌ［［および５ａｌｌで消化す
ると、ＥＰＯＤＮＡおよびＥｃｏＲＩからのＳ　ａｌ　
Ｉ　（Ｍ２３ｍｐ　ｌ１ｌ）までのリンカ−が得られた
。

１．４ｋｈのフラグメントを約４．　［ｌｋｂのｐＢＲ
３２２のＢａｍＨＩ／５ｘｌｌおよび約３θｈｐの他の
Ｍ１３＋ｐ　１１１・Ｈｉｎｄ　ｍ／ＢａｍＨｒ　　Ｒ
Ｆフラグメントリンカ−と結合させた。Ｍ１３リンカ−
フラグメントは、Ｂｉｎｄｌ［［付着端、それに続＜　
Ｐｓｔｌ　、　Ｓ！ＩＩ、Ｘｂｉｌに認識部位およびＢ
ａｍＨＩ付着端という特徴を有していた。結合生成物は
、再び、制限部位バンクをＥＰＯＤＮＡの近傍両端に有
する有用な中間プラスミド（ｒ　ｐＢＲ−ＥＰＯＪ　）
であった。

ＣＯ３−１細胞におけるＥＰＯＤＮＡ発現のために選択
されたベクター（ｒｐＤｓｖｌｌＪ　）は大腸菌にて選
別および自律的に複製させられるよう予め調製された。

これらの特徴は、ｐＢＲ３２２ヌクレオチド２４４８〜
４３６２の領域に存在する複製起点とアンピシリン耐性
遺伝子ＤＮＡ鎖により付与される。この配列は、ベクタ
ーに取込まれる前に、ヌクレオチド２４４８に直接隣接
するようにＨｉｎｄｕ認識部位を付与するリンカ−を付
加することにより構造的に変換された。選択されたベク
ターの他の有用な特性としては、ＣＯ５−１細胞におい
て自律的に複製しうる能力と哺乳動物細胞中で機能する
ウィルス性プロモーター配列の存在であった。

これらの特徴は、５ｖ４０ゲノムにおけるヌクレオチド
数５１７１〜２７０の３４２ｂｐ配列に存在する複製Ｄ
ＮＡ配列の起点および「後期遺伝子」ウィルス性プロモ
ーターＤＮＡ配列により示される。市販のリンカ−［コ
ラボレーティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌ！ｂｏｒｇｔｉｖ
ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）コを用いて唯一の制限部位（Ｂ
ｇｍＨＩ）をベクターにつけ、ウィルス性プロモーター
配列に直接接合させた。更にベクターには、「後期遺伝
子」ウィルスｍＲＮ　Ａポリアデニル化信号（通常、転
写ターミネターと称される）を有する　２３７塩基対配
列（ＳＶ４０のヌクレアーゼ２５５３〜２７７０に由来
する）が取込まれていた。このフラグメントは、ベクタ
ーにおいて、「後期遺伝子」ウィルス性プロモーターか
ら唯一のＢａｍＨＴ部位までに対応し、適切に配向して
いた。更に、ベクターには、ウィルス性プロモーターと
ターミネータ−との間の配列において、唯一のＢＩＩＩ
ＩＨ１部位に挿入された遺伝子の潜在的転写に関与しな
い部位に別の哺乳類遺伝子が存在していた［哺乳類遺伝
子は、ガッサーら：　ｒＰ、　Ｎ人、Ｓ、Ｊ（米国）、
第７９巻、第６５２２−６５２６頁、１９８２年（Ｇ＆
ｓｓｅ＋、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、　（Ｕ
、Ｓ、＾）、７９、ｐｐ６５２２−６５２６　（１９８
２）コのように、プラスミド　ｐＭＧ−１から単離され
た約２．５０Ｑ　ｂｐのマウスジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）小遺伝子からなっていた］。再び、
プラスミドｐＤｓＶＬ１の大きな機能的成分は、５Ｖ４
ＧＤＮＡのヌクレオチド５１７１〜２７０　（３４２ｂ
ｐ）および２５５３〜２７７０　（２３７ｂｐ）にとも
なう　ｐＢＲ３２２のヌクレオチド２４４８〜４３６２
からなる。

例えば、上記マニアナイスらの方法により、ＥＰＯをコ
ードするＤＮＡをＢｇｍＨＩフラグメントとしてプラス
ミド　ｐＢ　Ｒ−Ｅ　Ｐ　Ｏから単離し、ＢａｍＨＩで
切断されたプラスミドｐＤｓＶＬ１に結合させた。制限
酵素分析を行ない、２つの得られたクローンベクター（
複製ベクターＨおよびＬ）が正確に配向してＥＰＯ遺伝
子が挿入されたことを確認した。プラスミドｐＤｓＶＬ
−ＭＫＥを示した第２図参照。誤って配向したＥＰＯ遺
伝子を有するベクター（ベクターＦ、ＸおよびＧ）は、
正確に配向したＥＰＯＤＮＡを有するベクターでトラン
スフォーメーションされた宿主のＥＰＯ発現量を測定す
るためのトランスフェクション実験において、ネガティ
ブコントロールとして使用するために保存した。

キャリアＤＮＡ　（マウス肝および牌ＤＮＡ）と結合し
たベクターＨ，Ｌ、ＦＳＸおよびＧを用い、リン酸カル
シウム微細沈澱法により、二重６０Ｍプレートをトラン
スフェクションした。二重６０ｍｍブレートはまた、「
にせ」のトランスフォーメーションのネガティブコント
ロールであるキャリアＤＮＡによってもトランスフェク
ションされた。５日後、全ての培地について、天然ＥＰ
Ｏの免疫学的性質を有するポリペプチドの有無に関し試
験した。

例　　　７ Ａ、Ｃ０８−１細胞を含む第−ＥＰＯ発現系ヒトゲノム
のＤＮＡ　　ＥＰＯクローンによりコードされたヒトＥ
ＰＯポリペプチド物質を単離可能な量で微小生物合成す
る最初の試みのために選択された系は、また哺乳類宿主
細胞（即ち、ＣＯ３−１細胞、＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎ
ｏ、　ＣＲＬ−１６５０）での発現を包含した。ヒトＥ
ＰＯ遺伝子を、まず、大腸菌宿主（ｐＢＲ３２２由来Ｄ
ＮＡの存在下にて）および哺乳類細胞系ＣＯ５−１（Ｓ
Ｖ４Ｇ由来ＤＮＡ（７）存在下にて）内で自律的に複製
することが可能な「シャトル」ベクターにてまずサブク
ローン化した。ＥＰＯ遺伝子含有シャトルベクターを次
いでＣ０８−１にトランスフェクションした。ＥＰＯポ
リペプチド物質がトランスフェクションされた細胞から
産生され、細胞培地に分泌された。

更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製
された。ラムダクローンλｈＥ１から単離され、ヒトゲ
ノムＥＰＯ遺伝子を含むＤＮＡをＢｘｍＨＩおよび）ｌ
ｉｎｄｍ制限エンドヌクレアーゼで消化して、全ＥＰＯ
遺伝子を含む５．６ｋｂＤＮＡフラグメントを単離した
。このフラグメントを、同様に消化された細菌プラスミ
ドｐＵｃｇ　　Ｅベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
社（ＢｅｔｈｅｇｄａＲｅｓｅｇｒｃｈ　Ｌｇｂｏｒａ
ｊｏｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、）］と混合し、結合させて
、この制限フラグメントの簡便な供給源となる中間プラ
スミドｒ　ｐＵＣ８−１（ｎＥＪを得た。

Ｃ０８−１細胞におけるＥＰＯＤＮＡ発現のために選択
されるベクター（９ＳＶ４ＳＥｌ）を予め調製した。プ
ラスミドｐｓＶ４ｓＥ＋は、大腸菌における選択および
自律的な複製をなすＤＮＡ配列を含んでいた。これらの
特徴は、細菌プラスミドｐＢＲ３２２のヌクレオチド２
４４８〜４３６２領域に存在している複製起点およびア
ンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ配列により付与される。こ
の配列を、ヌクレオチド２４４８に直接連結したＨｉｎ
ｄＩ［認識部位を付与するリンカ−の付加により構造的
に変換した。プラスミドｐｓＶ４ｓＥｔ　ハ、Ｃ０８−
１細胞においても自律的に複製することができた。この
特徴は、５ｖ４０のウィルス複製起点を含む３＜２ｂｐ
のフラグメント（ヌクレオチド数５１７１〜２７０）に
あった。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ認識部位をヌ
クレオチド２７０に接合させるリンカ−１および５ａｌ
Ｉ認識部位をヌクレオチド５１７１に接合させるリンカ
−を付加することにより変換した。ＳＶ４０の１０６１
．ｂｐフラグメントも、このベクター（ヌクレオチド数
１７１１〜２７７２およびヌクレオチド数２７７２に続
＜５ａｌＩ認識部位を有するリンカ−）に存在していた
。このフラグメント中には、唯一のＢａｍＨＩ認識配列
も含まれていた。即ち、プラスミドｐｓＶ４３Ｅｌは、
ヒトＥＰＯ遺伝子が挿入される１３ａｍＨＩおよびＨｉ
ｎｄＩ［Ｉ認識部位、大腸菌内で複製および選択される
配列、並びにｃｏｓ−ｉ細胞内で複製される配列を含ん
でいた。

ＥＰＯ遺伝子をｐｓＶ４ｓＥ＋に挿入するため、プラス
ミドｐＵＣ８−ＨｕＥをＢａＩＩＩＨＩおよびＨｉｎｄ
ｌ［［制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＥＰＯをコー
ドする５、６ｋｂ　（ｌＤＤＮＡ７ラグメントを単離し
り。ｐｓＶ４ｓＥもＢａｍＨｒおよびＨｉｎｄｍで切断
し、２５１３ｂ９の大フラグメントを単離した（全ての
必要な機能を保有している）。これらのフラグメントを
混合連結サセテ、最終的ベク９−　ｒ　ｐｓＶｇｌ（ｌ
ｌＥＰＯＪ　ヲ得た（第３図参照）。このベクターを大
腸菌中で増殖させ、ベクターＤＮＡを単離した。制限酵
素分析を行ない、ＥＰＯ遺伝子の挿入を確認した。

プラスミドｐｓＶｇＨｕＥＰＯＤＮＡを用イＣＯＳ　−
１細胞においてヒトＥＰＯポリペプチド物質を発現させ
た。更に具体的には、ｐｓＶｇ）ＩｕＥＰＯＤＮＡをキ
ャリアＤＮＡとともに、Ｃ０９−１細胞の三重６０ｍｍ
プレートにトランスフェクションした。コントロールと
して、キャリアＤＮＡのみをＣ０８−１細胞にトランス
フェクションした。細胞培地を５日後および７日後に採
取し、天然ヒトＥＰｏの免疫学的性質を有するポリペプ
チドの有無について試験した。

Ｂ、ＣＯ５−１細胞を含む第二ＥＰＯ発現発現系別の系
が、Ｃ０８−１細胞（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎ。

ＣＩＩＬ−１６５０）において、ヒトゲノムＤＮＡ　　
ＥＰＯクローンによりコードされたヒトＥＰＯポリペプ
チド物質の改良生産法を得るために設計された。

直前のシステムにおいて、ＥＰＯが、５．ｌ１ｋｂのＢ
ａｍＨＩからＨｉｎｄｌ［までの制限フラグメント中に
存在するそれ自身のプロモーターを用いて、Ｃ０８−１
細胞にて発現された。下記調製例では、ＥＰＯ遺伝子を
、５Ｖ４（ｌ後期プロモーターにより発現しうるように
変換させる。

更に具体的には、クローン化された　５．６ＫｂのＢａ
ｍＨＩからＨｉｏｄｌｌＩまでのゲノムヒトＥＰＯ制限
フラグメントを以下の操作により変換した。前記プラス
ミドｐＵＣ８−ＨｕＥをＢａｍＨＩおよびＢ＋ｆＥＩＩ
制限エンドヌクレアーゼで切断した。ＢｓｔＥｎは、ペ
プチド前駆体をコードする開始ＡＴＧから５′方向に４
４塩基対であり、Ｈｉｎｄ　ｍ制限部位から３′方向に
約６８０塩基対である部位において、５．６ｋｂＥＰＯ
遺伝子を切断する。約４９００塩基対のフラグメントを
単離した。５ａｌＩおよびＢｓ＋ＥＩＩ付着端並びに内
在ＢａｍＨＩ認識部位を有する合成リンカ−ＤＮＡフラ
グメントを合成し、精製した。２つのフラグメントを５
ａｌＩおよびＢｇｍＨＩで切断されたプラスミドｐＢＲ
３２２と混合し、連結させて、中間プラスミドｐＢ　Ｒ
ｇ　ＨＥを得た。ゲノムヒトＥＰＯ遺伝子は、アミノ末
端をコードする領域に近接したＢａｍＨ１部位から３′
方向に５３塩基対の一つのＡＴＧを含む完全な構造の遺
伝子を保有する４９００塩基対のＢａｍＨＩ切断フラグ
メントとして、それらから単離することができる。

このフラグメントを単離し、ＢａｍＨＩフラグメントと
して、（例６で示した）ＢｇｍＨＩ切断発現ベクタープ
ラスミドｐＤｓＶＬ１に挿入した。得られるプラスミド
、即ち第４図に示すｐＤＳＶＬ−ｇＨｕＥＰｏを用い、
例６および７Ａに示したように、ＣＯ３−１細胞からＥ
ＰＯポリペプチド物質を発現させた。

例　　　　８ 例６における６つのトランスフェクションされたＣ０８
−１の増殖後の培地を、例２のＢに示した操作に従い、
ラジオイムノアッセイによって分析した。各試料を２５
０．　１２５．５０および２ＳＩｌｉ量で分析した。不
正確なＥＰＯ遺伝子配向を有するベクターでトランスフ
ェクションされたにせの細胞増殖物の上澄は、明らかに
ＥＰＯ免疫応答性に関し陰性であった。正確な配列のＥ
ＰＯＤＮＡを有するベクター（ＨおよびＬ）でトランス
フェクションされたＣＯ５−１細胞の増殖物から得た２
つの上澄のそれぞれの試料に関し、抗体に対する１２５
１−ＥＰＯ結合阻害率は７２〜８８％の範囲であり、全
ての値が標準曲線の上位に位置していた。

培地上澄の正確なＥＰＯ濃度は、このため、信頼すべき
程度までには調べることができなかった。

しかしながら、最大量（２５０ρ）の計算値から控えめ
に推定すると、３００　ｍｕ／ｍｌであった。

例６の代表的培養液、並びに例７Ａで得た５日目および
７日目の培養液を、組換えサルおよびヒトＥＰＯ物質お
よび天然ヒトＥＰＯ標準と比較するために、ＲＩＡで試
験し、結果を第１図のグラフで示した。即ち、結果は予
期されたように、組換えサルＥＰＯは抗ヒトＥＰＯ抗体
と著しく競合したが、試験条件下では完全には結合を阻
害できないことを示した。組換えヒトＥＰＯに関する最
大の％阻害率はしかしながら、ヒトＥＰＯ標準の値と極
めて近似していた。用量応答曲線が平行関係であること
は、一般に免疫学的な配列（エピトープ）の同一性を示
唆している。サルＥＰＯ培養液の先の評価をそれよりも
高い希釈レベルで再度実施すると、２．９１〜３．１２
　Ｕ／　ｍｌの範囲であった。

調べられたヒトＥＰＯ生産量は、５日間増殖試料が３９
２　ｍＵ／　ｍｌで、７日間増殖試料が５６７ｍＵ／ｍ
ｌであった。例７Ｂの発現系におけるＥＰＯ測定値は同
レベルかそれ以上であった。

例　　　　９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドヮッサーら
コ　「エンドクリノロジー」、第９７巻、第２号、ｐｐ
　３１５−３２３．１９７５年［Ｇｏｌｄｖａｉｓｅｒ
　　ｅｆ　ａＥｎｄｏｃｔｉｎｏｌｏＨ、９７，２，ｐ
Ｈ３１５−３２３（１９７５）コ　の方法によるＥＰＯ
活性イン・ビトロ分析に供した。

被検培養液のサルＥＰＯ測定値は３．２〜４．３０／ｍ
ｌの範囲であった。ヒトＥＰＯ培養液もこのイン・ビト
ロ分析では活性を示し、この活性は抗ＥＰＯ抗体で中和
することができた。例６の組換えサルＥＰＯ培養液も、
コーラら：「ネーチャー」、第１９１巻、第１０６５−
１０６７頁、１９６１年［Ｃｏ１ｅｓ、　　ｅｔａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ、　　１９１．　ｐｐ１０６５−１０６
７　（１９６１）］およびハモンドら：　「アナルス・
オブ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンス」
、第１４９巻、第５１６−５２７頁、１９６８年［Ｈｉ
ｍｍｏｎｄ、　　ｅｔ　１１．　　Ａｏｎ　　ＮＹ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　１４９．　　ｐｐ、５１６
−５２７　（１９６８）］の一般的方法によるイン・ビ
ボ生物学的活性分析に供したところ、活性値は０．９４
〜１．２４　Ｕ／　ｍｌであった。

例　　　　１０ 前述の諸例において、組換えサルまたはヒトＥＰＯ物質
を、ＣＣ０８−ＩＩ胞をトランスフェクションするのに
用いたベクターからつくった。これらのベクターは、細
胞内におけるＳＶ４０のＴ抗原とベクター上のＳＶ４０
の複製起点との存在によって、Ｃ０８−１細胞内で複製
する。これらのベクターはＣ０８−１細胞内で有効量の
ＥＰＯを産生ずるが、その発現はベクターが最終的に減
少していくため、まさしく一時的である（７〜１４日）
。

これに伴い、少量のＣ０８−１がベクターでトランスフ
ェクションされた。本例では、チャイニズハムスターの
卵巣（Ｃ）（０）ＤＨＦＲ細胞および選別可能なマーカ
ーＤＨＦＲを用いた発現系を述べている［関連する発現
系の議論については、いずれも米国特許第４．３９９．
２１６号並びに１９８４年８月２９日に公開された欧州
特許出願第１１７０５８号、第１１．７０５９号および
第１１７０５８号参照］。

ウルラウブら：　「プロシーデインゲス・オブφナショ
ナル・アカデミ−・オブーサイエンシズ」（米国）、第
７７巻、第４４６１頁、１９８０年［口ｒｌａｕｂｅｔ
　１１．、　　ｆ’ｒｏｃ、　Ｎｌｌ、＾ｃａｄ、　　
Ｓｃ１．　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　ＶｏＬ７７゜４４６１　
（１９８ｆｌｌ　］に示されたＣＨＯＤＨＦＲ−細胞（
ＤｕＸ−ａｌｌ）ＣＩＯに１細胞は、構造遺伝子の突然
変異によってジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（Ｄ）ＩＦ
Ｒ）を欠如しており、このため培地中にグリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジンの存在を要求する。プラスミ
ドｐＤｓＶＬ−ＭｋＥ　（例６　）　＊　７’ｌ：　ハ
ｐｏｓｖｔ−ｙＨｕＥＰｏ　（例７Ｂ）を、６０Ｂ培養
プレート中のヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン
含有培地で増殖するＣＨＯＤＩ（ＦＲ細胞内に、キャリ
アＤＮＡと一緒にトランスフェクションした。プラスミ
Ｆ　ｐｓＶｇＨｏＥＰｏ　　（例７Ａ）を、細菌プラス
ミドベクターρＢ　Ｒ３２２でクローン化されたマウス
ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子含有プラスミド、ＭＧ
２　　（前記ガッサーらによる）と混合した。

プラスミド混合体およびキャリアＤＮＡをＣＨＯＤＨＦ
Ｒ細胞にトランスフェクションした（一つのプラスミド
を獲得した細胞は一般に第二のプラスミドをも獲得する
）。３日後、細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン欠
如培地の数個の　ＩＯＱ鵬培養プレートに、トリプシン
処理して分散させた。ＤＨＦＲ遺伝子で安定的にトラン
スフォーメーションされその結果ＥＰＯ遺伝子によって
もトランスフォーメーションされたそれらの細胞のみが
この培地で生存する。７〜２１日後、生存する細胞のコ
ロニーが明確になった。これらのトランスフォーマント
コロニーは、トリプシン処理で分散された後、ヒポキサ
ンチンおよびチミジン欠如培地中で継続して増殖するこ
とができ、新種の細胞株（例えば、ＣＨＯｐＤｓＶＬ−
ＭｋＥＰＯ、ＣＩＯｐｓＶｇＨｕＥＰＯ。

ＣＨＯ−ｐＤｓＶＬ−ｇＨｕＥＰｏ）が得られた。

上記細胞株の培養液を、組換えサルまたはヒ）ＥＰＯの
有無についてＲＩＡで分析した。ＣＨＯｐＤｓＶＬ−Ｍ
ｋＥＰＯ株培地は、プラスミドｐＤｓＶＬ−１１ｋＥＰ
ＯでトランスフェクションされたＣＯ３−１細胞から得
たＥＰＯと同様の免疫学的性質を有するＥＰＯを含有し
ていた。代表的な５５時間培養液は０，６０Ｕ／ｍｌの
サルＥＰＯを含有していた。

ＣＩＯｐｓＹｇｌ（ｕＥＰｏおよびＣＨＯｐＤｓｌ’Ｌ
−ｇＨｕＥＰ（１（Ｄ培養液は、プラスミドｐｓ’１ｇ
ＨｕＥＰｏまたたｐＤｓＶＬ−ｇＨ＋＋ＥＰＯでトラン
スフェクションされたＣＯ５−１細胞から得たものと同
様の免疫学的性質を有する組換えヒトＥＰＯを含有して
いた。ＲＩＡにより測定スルト、代表的ｆ；　ＣＨＯｐ
ｓＹｇＨ＊ＥＰｏ　（７）　３　日間培養液は２．９９
　Ｕ／　ｍｌのヒトＥＰＯを含有し、ＣＦＩＯｐＤＳＹ
Ｌ−ｇＨｕＥＰＯの５．５日間試料は１８．２　Ｕ／　
ｍｌのヒトＥＰＯを有していた。

前記細胞株から得られるＥＰＯ量は、遺伝子を増幅させ
て産生能の高い新規細胞株をつくることによって増加さ
せることができる。ＤＨＦＲ遺伝子によりコードされた
産物たるジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ
）は、薬物メソトレキセ−４（ＭＴＸ）で阻害すること
ができる。更に具体的には、ヒポキサンチンおよびチミ
ジン欠如培地で増殖した細胞は、ＭＴＸにより阻害され
または殺される。適切な条件下（例えば最低のＭＴＸ濃
度）では、ＭＴＸに耐性でかつＭＴＸ下でも増殖可能な
細胞を得ることができる。これらの細胞は、ＤＨＦＲ遺
伝子数が増加し、その結果ＤＨＦＲ酵素量が増加するこ
とにより、ＭＴＸ耐性であることが判明する。残存した
細胞を次いで、徐々に濃度を高めてＭＴＸで処理しても
よく、これにより更に多量のＤＨＦＲ遺伝子を含む細胞
株が得られる。ＤＨＦＲ遺伝子と一緒に発現ベクター上
に載せられ、またはＤＨＦＲ遺伝子とともにトランスフ
ォーメーションされた「パラセンジャー遺伝子」　（例
えばＥＰＯ）は、それらの遺伝子コピー数の増加がしば
しば見出されている。

この増幅系の実施例として、細胞株Ｃｌｌ０　ｐＤＳＶ
Ｌ−ＭｋＥを徐々に増加させたＭＴＸ濃度（ＯｎＭ、　
３０ｎＭおよび１００　ｎＭ）に供した。各増加段階か
ら得た代表的な６５時間培地試料をＲＩＡ分析すると、
それぞれ０．６０．２．４５および６．１０　Ｕ／　ｍ
ｌ含有していた。

細胞株ＣＩＯｐＤｓＶＬ−ｇＨｕＥＰｏを、３０ｎＭ、
　５０ｎＭ、　１００　ｎＭ１２ＧＯｎＭ、　　１μＭ
及び５μＭにＭＴＸ濃度を増加させて試験に供した。Ｉ
ｏｏｎＭ　Ｍ　Ｔ　Ｘ段階から得た代表的な３日間培地
試料は、ＲＩＡで調べると、３０８９±１２９　Ｕ／ｍ
ｌのヒトＥＰＯを含有していた。

１０（ｌ　ｎＭおよびｌμＭＭＴＸ段階から得た代表的
な４８時間培地試料は、ＲＩＡで調べると（３回分板の
平均）、それぞれ４６６および１３５２　Ｕ／　ｍｌの
ヒトＥＰＯを含有していた。これらの操作では、１×１
０６個の細胞を６０ｍ培養皿中の培地５　ｍｌに接種し
た。２４時間後、培地を除去し、無血清培地（０，１ｍ
Ｍの非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添加された
高グルコースＤＭＥＭ）５ｍｌで置き換えた。

ＥＰＯを無血清培地で４８時間蓄積させた。培地をＲＩ
Ａ分析用に集め、細胞をトリプシン処理し、計数した。

１００　ｎＭおよびｌμＭＭＴＸで増殖した細胞に関す
る４６７　Ｕ／ｍｌおよび１３５２Ｕ／ｍｌの平均ＲＩ
Ａ値から、それぞれ実際の収量２３３５０／プレートお
よび６７５０　Ｕ／プレートが求められた。−プレート
当りの平均細胞数はそれぞれ１．９４Ｘ　１０６および
３．１２Ｘ　１０６であった。これらの培養条件下での
有効産生速度は、したがって、１２６４および２１６７
　Ｕ／１０６細胞／４８時間であった。

直ぐ上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均一な群であ
る。標準的スクリーニング操作が、最大産生能を有する
おおむね均一なりローンを単離するために用いられてい
る。米国食品薬局（Ｕ、５Ｆｏｏｄ　ｘｎｄ　Ｄｒｕｇ
　Ａｄｍｉｎｉ＋１ｒｌｌｉｏｎ）　、薬品および生物
学センター（Ｃｅｎｔｅｒ［ｏ＋　Ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ
　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、生物学研究調査庁（ＯＮｉｃ
ｅ　ｏｆ　ＢｉｏｌＢｉｃｓ　Ｒｅ５ｅｓｒｃｈ　Ｒｅ
ｖｉｅｗ）、１９８４年６月　１日、「生物の産生に用
いられる株化細胞の特徴において考慮すべき点（Ｐｏｉ
ｎｔｓ　　　ｔｏ　　Ｃｏｎ５ｉｄｅｒ　　　ｉｎ　　
　ｔｈｅ　　Ｃｈｘｒｚｃｔｅｒｉ＋５ｔｉｏｎｏｆ　
Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　Ｕｓｅｄ　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕｃ
ｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）コのセクションＡ１パート２
参照。

前記ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞系の生産性は、適切な細胞培
養技術により改善することができる。哺乳類培養細胞の
増殖には、成長培地に血清の存在を要する。血清を含有
しない培地でＣＨＯ細胞からエリスロボエチンを産生ず
る方法は、培地がらのエリスロボエチンの精製を著しく
容易化するものである。下記方法によれば、産生に充分
な多量の無血清培地において、経済的にエリスロポエチ
ンを産生させることができる。

標準的細胞培養条件下で増殖させたＣＨＯｐＤｓＶＬ〜
ＩＨｕＥＰＯ細胞株を用い、スピナー細胞培養フラスコ
に接種する。この細胞を、５％胎児牛血清、Ｌ−グルタ
ミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加され
た高グルコースＤＭＥＭおよＵ　Ｈ！Ｉｌｌ’　ＩＦ１
２の５ｔｌ−５０混合物、０．０５ｍＭ非必須アミノ酸
並びに適当な濃度のメントレキセートからなる培地が入
ったスピナー細胞培養フラスコ内で、懸濁液細胞系とし
て増殖させる。懸濁細胞培養では、ＥＰＯ産生ＣＨＯ細
胞を容易に多量に増殖させることができる。懸濁液中で
増殖したＣＨＯ細胞を用い、培地２００ｍ１が入った８
５０ノのローラー瓶に　１．５×１０７個の生育細胞の
初期接種密度で、ローラー瓶に接種する。細胞を３日間
にわたり、付着細胞系として一面に広がるまで増殖させ
る。この増殖相に使用される培地は、懸濁増殖に用いら
れたものと同様である。３日の増殖期間の最後に、血清
含有培地を除去し、Ｉ　ＯＱ　ｍｌの無血清培地、即ち
０．０５ｍＭ非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添
加された高グルー１−スＤＭＥＭおよびＨａｍ’＋ＦＩ
２の５ｏ−ｓｏ混合物で置き換える。ローラー瓶をロー
ラー瓶インキュベーターに１〜３時間戻し、培地を再び
除去し、新しい無血清培地１００ｍ１で置き換える。無
血清培地を１〜３時間インキュベートすると、汚染血清
蛋白質濃度が減少する。ローラー瓶を７日間インキュベ
ーターに戻し、その間にエリスロボエチンが無血清培地
中で蓄積する。７日間の産生期の最後に、培養済み培地
を除去し、第二の産生サイクルのために新しい無血清培
地で置き換える。この度生糸の実施例では、代表的な７
日間無血清培地試料は、ＲＩＡによると、３８９２±４
０９　［１／ｍｌのヒトエリスロポエチンを含有してい
た。

０．９〜１．８Ｘ１０５細＃Ｊ／ａｉｌの推定細胞密度
に基づけば、各８５０ｃｄのローラー瓶は０７５〜１．
５×１０８個の細胞を含有しており、したがって７日間
の１００ｍ１の培養についてのＥＰＯ産生速度は７５０
〜１４７０　Ｕ／１０６細胞／４８時間であった。

１０ｎＭ　ＭＴＸｔ’処理すした細胞株Ｃ）１０　ｐ［
ｌｓＶＬ−ＭｋＥＰＯの培養液をＲＩＡイン・ビトロお
よびイン・ビポＥＰＯ活性分析に供した。培養済み培地
試料は、ＲＩＡで測定すると４１．２±１．４１１／ｍ
ｌ、イン・ビトロ生物学的活性分析で測定すると４１．
２±０．０６４１１／ｍｌおよびイン・ビボ生物学的活
性分析で測定すると４２，５±５Ｕ／ｍｌ、のＭｋＥＰ
Ｏを含有していた。

ポリペプチド生成物のアミノ酸の配列を調べるとＥＰＯ
生成物の存在が示されており、基本的な種では推定アミ
ノ末端アラニンに隣接する「リーダー」配列のうち３残
基分を有していた。これは、ＣＨＯ細胞内でのポリペプ
チドの膜処理が不正確であることの結果なのか、あるい
はヒトＥＰＯと比較したサルＥＰＯアミノ末端構造の違
いを反映しているのかはまだわかっていない。

細胞株ＣｔｆＯｐＤｓＶＬ−ｇＨＩＩＥＰＯ）培養液を
３つの分析に供した。５．５日目の試料は、培地中に組
換えヒトＥＰＯを、ＲＩＡ分析テ１８．２　［１／　ｍ
ｌ、イン６ビトロ分析で１５８″＝４．６［＋／ｍｌお
よびイン・ビボ分析で１６．８±３．ＯＬＩ／＋ｎｌ含
有していた。

徐々にＩ（１０ｎＭのＭＴＸまで増加させて得たＣＦＩ
ＯｐＤｓＹＬ−ｇＨｕＥＰｏ細胞の培養液を３つの分析
に供した。

３日間の試料は、組換えヒトＥＰＯをＲＩＡで３０８９
土１２９　ＩＩ／ｍｌ、イン・ビトロ分析で２５８９±
７１５０／ｍｌおよびイン・ビボ分析で２０４０±１６
０　ＩＩ／ｍｌ含有していた。この生成物のアミノ酸配
列は表■に示したアミノ末端と一致している。

１０ｎＭのＭＴＸ中、プラスミドｐＤｓＶＬ−ＭｋＥで
トランスフェクションされたＣ１（Ｏ細胞培養済み培地
をプールし、数日間にわたりＭＴＸを透析除去すると、
２２１±５．１υ／ｍｌ　ｆＥＰＯ−ＣＣＭ）のＥＰＯ
活性ある培地が得られた。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスのへ
マドクリット値に及ぼすＥＰＯ−ＣＣＭのイン・ビボ効
果を調べるため、以下の実験を行なった。トランスフェ
クションしてないＣＨＯ細胞の細胞培養済み培地（ＣＣ
Ｍ）およびＥＰＯ−ＣＣＭをＰＢＳで調製した。

ＣＣＭをコントロール群（マウス３匹）に用い、２つの
用量のＥＰＯ−ＣＣＭ（４単位（Ｕ）の注射および４４
単位（Ｕ）の注射）を実験群（１群２匹）に用いた。５
週間の間、７匹のマウスを週３回腹腔内注射した。８回
目の注射後における、コントロール群の平均へマドクリ
ット値は５０．４％、４Ｕ群は５５、１％、および４４
Ｕ群は６７．９％であった。

従って、本発明によって得られる組換ＥＰＯは、イン・
ビボに於いて、赤血球の産生を増大させる機能を有する
ことが実証された。

哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾配をかけ、好
ましくはｐｉ（７でＨＰＬＣ（Ｃ４）に付すことにより
、培地から実質的に精製された形で容易に回収すること
ができる。

予備実験を行ない、Ｃ０８−１およびＣＨＯ細胞におけ
るヒトＥＰＯ遺伝子発現調整培地から得られる組換え糖
蛋白質生成物を、ウェスタン・プロット分析および５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥによってヒト尿ＥＰＯ単離物と比較して、
その特徴を調べた。

これらの研究では、ＣＨＯ由来ＥＰＯ物質はＣＯ５−１
発現生成物よりもやや高分子量であったが、この生成物
はプールされたヒト尿抽出物よりもわずかに大きいこと
が判明した。全ての生成物はやや不均一であった。シア
ル酸を除去するためのノイラミニダーゼ酵素処理により
、はぼ同じ分子量であるにもかかわらず、いずれも得ら
れたアシアロヒト尿抽出物よりも大であるＣ０８−１お
よびＣ８０組換え生成物が得られた。組換えＣＨＯ生成
物および尿抽出物生成物を（両者から炭水化物を全て除
去するため）エンドグリコンダーゼＦ酵素（ＥＣ３，２
，１）処理して、本質的に同一の分子量を有する実質的
均一生成物を得た。

精製されたヒト尿ＥＰＯおよび本発明にょる組換え型の
ＣＨＯ細胞産生ＥＰＯを、ネッサーら：「アナリチカル
・バイオケミストリーＪ１第１４２巻、第　５８−６７
頁、１９８４年［Ｎｅｓ＋ｅ＋、　　ｅｔ　ａｌ、、　
　＾ｎａｌ、１１１ｉｏｃｂｅｍ、、ユ旦、　５８−６
７　（１９８４）　］の加水分解方法を用いて修正した
レディーンら・　「メソッズ・イン・エンザイモロジー
」、第８３巻（Ｄ部）、第１３９−Ｅｎ＋ｙｍｏｌｏｇ
Ｆ、　　８３　（Ｐ＆目ＩＩ）、　　１３９−１９１　
（１９８２）　］の方法により炭水化物分析に供した。

尿単離物について実験的に求めた炭水化物組成値（生成
物中の炭水化物モル比で示される）は次のとおりであっ
た：ヘキソース１．７３、Ｎ−アセチルグルコサミン１
、Ｎ−アセチルニューラミン酸０９３、フコース　０１
およびＮ−アセチルガラクトサミン００組換え生成物（
１００ｎＭのＭＴＸを含むＣＩＯｐＤＳＹＬ−ｇＨｕＥ
ＰＯの３日間培地から得たもの）の値は次のとうりであ
った：ヘキソース１５．０９　、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンｌ。

Ｎ−アセチルニューラミン酸０．９９８、フコース０、
およびＮ−アセチルガラクトサミン　０゜これらの値は
、上記ウェスタンおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析ともに一
致している。

本発明で得られる糖蛋白質生成物は、このように、天然
エリスロポエチンの一以上の生物学的性質を保有するの
に充分なその複製である−次構造形状を有し、しかも天
然エリスロポエチンのものとは異なる平均的炭水化物組
成を有する生成物として理解される。

例　　　　１１ 本例は、表■に示したヒト種ＥＰＯ配列をコードし、大
腸菌および酵母菌［サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ
、　　ｃｅｒｅマｉ＋ｉｉり］細胞での発現におけるそ
れぞれの「優先」コードンで取込んでいる２つの構造遺
伝子ヌクレオチド塩基集合体の全体的製造に関する。ま
た、ヒトＥＰＯ類縁体をコードする遺伝子の構造につい
ても述べられている。

蘭単に言うと、用いられたプロトコールは、先に示した
アルドンらの開示（７０Ｈ／ｆ）４Ｈ３）に掲載されて
いるものとほぼ同じであった。遺伝子はまず成分オリゴ
ヌクレオチドを組み立ててマルチプル・ジュープレック
スとし、これを次いで３つの別個のセクションに組み立
てるように設計した。

これらのセクションは、容易に増幅するように設計して
あり、増幅系から除いてから順番に、あるいは多数フラ
グメントの結合より、適切な発現ベクターに構築された
。

下記表■〜ＸＩＶは、いかなるリーダーまたは前記配列
も欠如しているが、−１位に第一のメチオニン塩基を有
するヒトＥＰＯ翻訳生成物をコードする合成遺伝子の設
計と組立体を示している。更に遺伝子は実質的部分に大
腸菌の優先コードンを取込んでおり、このためその構築
はｒＥｃＥＰＯＪ遺伝子と呼ばれる。

表　ｖｒｘｒ Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＣＡ　
Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｓ　：　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ
　Ａ　Ｔ　ＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴ丁ＡＣＣＣｒＣ
ＡＴＧＣ丁ＴＴＣＴＡＣ；ＡＴＧＧごＴＣＣＧＣＣＧご
ＧＴＣＴＬ、ＡＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣにＡにＴＣにＡ
ＧＡＴＣＡＧ二ＣＧＣＩ、；こＧＧＡＧＴＣＣＡ（：Ａ
ＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＣＴ（：ＣＴＴ
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ＣＣＡＣＴＩ：１１；ＴＴＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＣ丁Ｇ
ＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡｆｌ；工ＧＴＴＣＡＧＣＡＣ
ＡＡＣＣＡｒｒｒｃ、：＋Ａ（ｊ：ＡＡＡＡＣＡＴｒＡ
ＣＣＣＴＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣにＴＡＡＴＧ
丁ＴＴＴＣにＴＴ表−ＩＸ 幻汀ＴＣ二Ｃ７Ａ　Ｃ’：　Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＡＣ’：　
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ＧニスＡＡＣＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＣＧＴＴＴＣＣＡ
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ＴＣＴＣｕロ、ＱＣＴＧｌ−ＴＣＡＧＣＧＧここＴＣＧ
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Ｇ［ＡＣＴＧＣＧＴＧａＣＣＡＧＧＣＡＧこＡＧＴＧＣ
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ＡＡＩ：ＣＡにＴＡＴＣＴＧＧＩ：ＣＴＧＡＣＡＴＣＴ
ＣＧＡＴＣＣ＾ＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡ７ＡＣＴ
表　ＸＥＩ工 ＧＴＣｒＡＧＡＧＡｃ 表　ｘエエ ＥＣＥＰＯセクション　３ ＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣ丁ＣＴＧＣＡ
ＣＧＣＭ；こＡＧＡＧＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴ
ＧＣ（ＪＧＣＴＣＴＧＧＧ丁ＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧ
ＧＧＡＴＡＧＣＣＴＣＴＴ丁ＣＴＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧ
ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＧＣ
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ＧＧＡＧＡ八ＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡへＧＧ丁八ＣＧＣＡ
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ＣＴＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＣ；ＣＣＡ
ＧＴＡＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＣＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧ
ＡＣＣＧＣＴＡＡＴＡＣＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣにＧ
ＴＣＡＣＣＡＧＴＭ表ＸＩＶ ＥＣＥＦＯ遺伝子 ＡＣＴＴ丁ＴＧｒＡＧ　　ＴにＧＴＧＡＣＣＡＡ　　Ｃ
ＡＣＧＡＣＴＴＧＴ　　ＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＣ
ＴＴ丁ＴＧｒＴＴＡＣＣ：ＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡ
ＡＣ、にＴＴＡＡＣｒＴＣ丁’ＡＣＧＣＴＴＧＧＡＡ　
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ＧＧ’、ＣＡＣＴＧＣＴＧＧ丁−ＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴ
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ＧＡＣ，ＧＣＡＣＣＧＧＴＣＣ−ＧＴＧＡＣＧＡＣＣＡ
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ＣハＦＡＴロＡＣＣＣ；ＣＴＴＣＧＴＡＣＣ；ＧＣＡＴ
ＧＡＣＣＡＣＴＧ　　ＧＣＧＡＴＴＡＴＣＡ　　ＧＣＴ
更に具体的には、表■は、ヒト種ポリペプチドのアミノ
末端残基をコードするセクション１のＥＣＥＰＯの遺伝
子を得るために用いられるオリゴヌクレオチドを示して
いる。オリゴヌクレオチドは二重鎖（１と２．３と４等
）として組立てられ、二重鎖は次いで結合され、表■の
ようなＥＣＥＰＯセクション１が得られた。組立てられ
たセクションは末端ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｒ付着端を
それぞれ含み、ＥｃｏＲＩ付着端の「下流」にはＸｂａ
Ｉ制限酵素認識部位が存在し、ＢｓｍＨＩ付着端の「上
流」にはＫＩＩＤＩ認識部位が存在していることに注目
されたい。セクション１は、このセクションの配列の確
認のために用いられるＭ１３ファージベクターを用いて
、容易に増幅させることができた。

いくつかの困難な点が、大腸菌由来ＲＦ　　ＤＮＡから
Ｘｂａｌ／ＫｐｎＩフラグメントとしてセクションを単
離する上で現われたが、それはおそらく宿主内でＫ　ｐ
ｎ　Ｉ認識部位塩基がメチル化されるためであろう。−
重鎖ファージＤＮＡがしたがって単離され、プライマー
・エクステンション法によりイン・ビトロで二重鏡型と
され、しかる後所望の二重鎖フラグメントが容易に単離
された。

ＥＣＥＰＯ遺伝子セクション２および３（表ＸＩおよび
ＸＩ）を、表ＸおよびＸｌのオリゴヌクレオチドからそ
れぞれ同様の方法で調製した。各セクションは配列の認
識に用いられるＭ１３ベクターで増幅され、ファージＤ
ＮＡから単離された。表ＸＩから明らかなように、ＥＣ
ＥＰ○セクション２はＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ付着
端から構成されており、ＫｐｎＩ／ＢｇｌｌＩフラグメ
ントとして単離することができた。同様に、ＥＣＥＰＯ
セクション３をＢａｍＨＩおよびＳ　ａｌ　Ｉ付着端か
ら調製し、Ｂｇｎ／５ａｌｌフラグメントとしてファー
ジＲＦ　　ＤＮＡから単離することができた。このよう
に調製された３つのセクションは、大腸菌翻訳開始のア
ミン末端メチオニンコドン（Ａ　Ｔ　Ｇ）を含み、完全
なヒトＥＰＯポリペプチドをコードするＤＮＡ連鎖（表
ＸｒＶ）として容易に組立てすることができる。開始Ａ
ＴＧの「上流」には、大腸菌の高度な発現ＯＭＰ−ｆ遺
伝子におけるリポソーム結合部位配列を実質的に複製す
る一連の塩基対が存在していることにも注目されたい。

適切な発現ベクターを用いてＥＣＥＰＯを運搬すること
ができる。特定のベクターとして、チャールズ・エフ・
モーリス（Ｃｈｘｒｌｃｓ　Ｆ、Ｍｏ＋＋ｉ＋１により
１９８４年８月　６日に出願され、同時に係属中の米国
特許出願第６３６．７２７号（公開されたＥＰ○出願Ｎ
α１３６．４９０）に記載された、プラスミドｐＣＦＭ
４１４（＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，４Ｎ７６）の誘導体であ
る「温度感受性」プラスミドｐＣＦＭ５３６をＥＣＥＰ
Ｏ遺伝子発現用に選択した。より具体的にはｐｃＦＭ５
３６をＸｂａＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、大フラ
グメントを単離して、ＥＣＥＰＯ遺伝子と２つの部分で
結合させるのに用いた。セクション１　（Ｘｂａｌ／Ｋ
ｐｎＴ）　、２（ＫｐｏＴ／ＢｇｌＩＩ）および３　（
Ｂ　ｇｌＩ［／　Ｓ　ａｌ　Ｔ　）をＭ１３内で正確な
順序で予め組立てておき、ＥＰＯ遺伝子をそれから一本
のＸｂａｌ／Ｈｉｎｄｍフラグメントとして単離した。

このフラグメントは、Ｍ１３ｍｐ　９フアージ由来のＳ
　ａｌ　ＩからＨｉｎｄｕまでの部位のポリリンカーの
部分を有していた。得られた発現プラスミドｐ５３６に
よる発現の制御はラムダＰＬプロモーターによりなされ
たが、このプロモーター自体、Ｃリプレッサー遺伝子（
例えば、大腸菌株に１２ΔＨＩＬｐから得られる）の支
配下にある。

上記合成ＥＣＥＰＯ遺伝子は、下記のような［Ａｓｎ　
　　ｄｅｓ−Ｐｒｏ　　〜ｌ１ｅ６コｈＥＰＯおよび［
Ｈロア］　ｈＥＰＱのようなエリスロポエチン類縁体を
コードするように様々に変更してもよい。

Ｘｂａｒ　〜ＨｉｎｄＩ［挿入体として、表ＸＩＶのＥ
ＣＥＰＯ合成遺伝子を担持するプラスミド５３６をＨｉ
ｎｄＩ［およびＸｈｏＩで消化した。後者のエンドヌク
レアーゼは、Ａｉｐ８をコードするコードンの最後の塩
基からＡｒｇ１０コードンの二番目の塩基までの唯一の
６塩基対認識部位においてＥＣＥＰＯ遺伝子を切断する
。Ｘｂａｌ／Ｘｈｏｌ　ｒリンカ−」配列を製造したが
、それは次の配列を有していた。

ＸｂａＴ’　　＋ｌ　　２　７　８　　９Ｍｅｔ　Ａｌ
ａ　Ａ＋ｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　　　　Ｘｈｏ１５〜ＣＴ
ＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＴＧＣＧＡＣ−３３’
−ＴＡＣＣＧＡ　　丁ＴＡ　　ＡＣＧ　　ＣＴＧ　　　
ＡＧＣＴ−５Ｘｂａｒ／Ｘｈｏｒリンカ−およびＸｈｏ
ｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ　ＥＣＥＰＯ遺伝子鎖フラグメント
を、チャールズ・エフ１モーリス（Ｃｂａ＋ｌｅ＋　Ｆ
、　Ｍｏ＋＋ｉ＋）により１９８４年８月　６日に出願
され、同時に係属中の米国特許出願第６３６．７２７号
明細書に記載された、プラスミドｐｃＦＭ４１４　　（
Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，４００７６）（７）Ｍ導体テアルプラ
スミドｐＣＦＭ５２６のＸ　ｂａ　ＩおよびＨｉｌＩｄ
Ｉ［Ｉ切断により得られる大フラグメントに挿入し、所
望の類似体のＭｅｔ　ｌ型の大腸菌発現をコードするプ
ラスミド担持ＤＮＡ配列を得た。

Ｂ、　　　［Ｈロア　コ　ｈＥＰ。

プラスミド５３６を、前記へのようにＨｉｎｄｌ［Ｉお
よびＸ　ｈｏ　Ｉで切断した。Ｘｔ＋ａＩ／Ｘｂｏｌリ
ンカ−を製造したが、それは次の配列を有していた。

Ｘｂａｌ　　　＋ｌ　　２　３　４ Ｍｅｔ＾ｌａ　ＰＩＯＰｒｏ　Ａｒｇ ５’−ＣＴＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　Ｃ
ＧＴ３′づ＾ＣＣＧＡ　ＧＧＣＧＧＴ　ＣＣＡＬｅｕ　
　ｌｉｅ　　Ｈｉ＋ ＣＴＧ　　ＡＴＣＣＡＴ ＧＡＣＴＡＧ　　ＧＴ＾ ８　　　９　　　Ｘｈｏｌ ｌｐ ＧＡＣ−３ ＣＴＧ　　ＡＧＣＴ−５ リンカ−およびＸ　ｈｏ　Ｔ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ　　Ｅ
ＣＥＰＯ配列フラグメントを次いてｐＣＦＭ５２６に挿
入し、所望の類縁体のＭｕ’型の大腸菌発現をコードす
るプラスミド担持ＤＮＡ配列を得た。

酵母菌の優先コードンを取込んだ合成遺伝子（ｒｓｃＥ
Ｐｏ　Ｊ　）の構造は、以下の表Ｘ　Ｖ　−Ｘ　ＸＩに
示したとおりである。εＣＥＰＱ遺伝子の場合と同様に
、完全な構築には３組のオリゴヌクレオチド（表ＸＶ、
Ｘ■およびＸＸ）形成が含まれており、これを二重鎖に
形成し、各セクション（表ＸＶＩ、Ｘ■およびＸＸ）に
組立てた。合成は、ＳＣＥ［’ＯおよびＥＣＥＰＯの構
造においていくらか適合性のある（　＋ｕｂ−ｏｐｔｉ
ｍａｌ）コードン（即ち、各遺伝子におけるセクション
２のオリゴヌクレオチド１〜６と同様に、各遺伝子のセ
クション１のオリゴヌクレオチド７〜１２が一致する）
を用いることにより、部分的に容易化されたことに注目
されたい。

表　　×■ ５ＣＥＦＯセクノヨン　１　オリゴヌクレオ　ドＡＡＴ
丁ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＡＡＡＡＧスＧＣＴＧＴＧＧ
ＡＣ：ＴＣＴ丁ＴＴＡｒＣＣＡＡＧＣ丁ＴＧＣＣＡＣＣ
ＡＡＧＡＴＴにＡＴＣＴＧ丁ＣスＣＴＣ丁ＣＴＣＧＡＧ
ＴＣＡＣＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＧＴＴＴＴ
Ｇｆ：ＡＡＡＣＡＴＡＣ丁ＴＣ，Ｔ７ｒ；ＣＴＴＣＣＡ
ＡＣＡＡＣＴＡＴＣ丁丁ＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＴ
ＡＡＡＣＡＡＩ：ＣＴＩ：、ＡＡＡＡＣＡ丁ＣＧＴＣＧ
ＴＧＡ丁Ｇ丁ＴＴ丁ＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＧＡＣＣＡ
ＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣｉＡＡＣＡＣＴＧ丁ＴＣＣＡ
ＡＡＣ，ＡＡＣＡＣ：ＴＧＴｒＣＡ［、ＣＡＣＡＡＣＣ
ＡＴＴＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＧＧ丁ＡＣＣ
Ｇ（：ＡＴＣＣＣＧｒＡＣＣＧＴＡＡＴＧｒ丁ＴＴＣＣ
丁Ｔ表　　χｖｒ ｓｃ：ｐａセクンヨン　１ 表　’　　ＸＶＩＩ ＳＣＥＦＯセクション　２　オリゴヌクレオチドＡＡＴ
ＴＣＧＧ丁ＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＡＡ
ＣＣＴ丁ＧにＴＧＴＣ丁ＣＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴ口
丁ＡＣＧＣ丁Ｔｌ：ＣＡＡＡＣＧＴＡ丁ＴＴＣＣＡ丁Ａ
ＣＧＴＴＴＣＣＡＡｆ：ＣＧ丁ＡＧＡＡＧｉｌＪＡＧＴ
ＴＧＧｒＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡ、
ＱμＣＴＴＣρｔ／１．ｃ’ＴＧｃ丁ＴＧＴＴＧＡＣＣ
ＡＡＣＴ丁ＧＧＣＡＡＣＧＴＴＴにＣＣＣＴＴＣｔＴ丁
ＡＴＣＴＧＣＣ丁丁ＣＡＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＣＣ−Ａ
ＡＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣ丁ＧＴ’ＴＴＴＧＡＧＡＣＧＴ
ＣＡＡＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＣ
只ＡＡＡＣＡＴＣＴＴ（、ＧＴＴＡＡＣＴＣＴＴＣ丁Ｃ
ＡＡＣＣＡＴＧＣＧＴ’ＧＧＴＴＣＣＣＡ丁ＧＧＴ丁Ｇ
ＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＴ
ＴＣＣＡＣＧ丁ＣＧＡＴＣ丁ＴＴＡ丁ＣＣＡｃにＴＧＣ
ＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣ；ＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＴ丁
丁にＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡ丁ＣＴＣＡＡＡＣ
ＣＡＧＡＧＡＣＧＧ表　　ＸｌＸ ５ＣＥＰＯセクシヨン　３　オリゴヌクレオチドＧ：Ｊ
ＣＣＡＧＭＣＴＨＧＡＣＴＡＣＴＨＧＨＴＣ丁ＣＡＡＣ
ＡＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡにＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＴ
ＴＴＧＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＩＩＩ；ＧＡＡＧＡＴＧ
ＧＣ丁ＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣ
ＡｒＴＴＣＣＣＣＡＣＣＡ’ＧＡＣＧＣ丁’ＧＣ’ＴＴ
’　−ＧＣＡＧＡＡＧＣＡにＣにＴＣｒＧＧｒｃＧＧＧ
ＡＡＣＡＣＴＧＡ丁ＧＣＴＴＣＴＣババＴＧｃａｃｃｃ
ＡＣＴ−ＧＣＴＧＡ丁ＡＣＣＴ丁ＣＡにＡＡＡＧ丁ＴＧ
ＡＡＴＡＡＣＴＴ丁ＣＴＧＡＡＩＩ；Ｃ；ＴＡＴＣＡＣ
ＡＴＴＣＡにｇＣＴＴｒＡＣＴＣＣＡ’ＡＣＴ：ＴＩＪ
−−ＣＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴ、ＧＧ菖ＧＴＡ’バｇＣＴ
Ｃ丁−−ＴＧバＧＡＧＧＴＡＡＡ丁ＴＧＡＡＧＴＴＧＴ
ＡＣＡＣＡＣＣＧＧ丁ＧＴＡＣＡＡＣ丁丁ＣＡＡＴＴＴ
ＡＣＣ丁ＣＧＧＴＧＡＡＣＣＣＴにＴＡＣＡＡＣＴ’Ｇ
にＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴ丁ＣＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣ
ＧＡＣＡＧＡＴＡＡＧＣＣＣＣ；ＡＣＴＧＡ丁、へＡＧ
ＴＴ、ＧＴＴＡＴＣＡ［ｌ；丁ＣＧＧＧＣ丁ＴＡ丁ＣＡ
ＡＣＡ−にＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＴＣＧＡ
ＣＴ丁ＴＣＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣ丁χＶＨＩ ５Ｃ三＝０セクシヨン２ 表χＸ ｅ、Ｃ′：り０セクシヨン　３ 表　　ＸＸＺ ＴＣＡＡＡＣＣＧＴＴ、ＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡ　　ＡＣ
ＡＡ丁Ａｌｌ；ＡＣ丁　ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＴＣ
ＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣ（１；ＡにＴＴ　　ＴＴＣＣＴ
ＴＣＧＧ丁　ＡＡＡＧＧＧＧ丁ＧＧ　　ＴＣＴＧＣＧＡ
ＣＧＡ　　ＡＧＡＣＧＧＣＣ；Ａ［；ＴＴにＡＣＣＡＣ
丁Ｇ　　ＴＣＴＡ丁丁ＣＧ（：Ｇ　　ＣＴＧＡＣＴＡ丁
丁に−ＴＴにＴＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧＴＴ丁　Ｃ
ＡＧＣｒ 組立てられた５ＣＥＰＯセクシヨンがＭＩ３にて配列決
定され、セクション１．２および３はＨｉｎｄ　ｎ［／
ＫｐｎＩ　、　Ｋｐｎｌ　／ＢｇｌＩＩおよびＢｇｌＩ
Ｉ／５ａｌｌフラグメントしてファージから単離可能で
あった。

５ＣＥＰＯ遺伝子生成物にとり現在好ましい発現系は、
グランド・ニー・ビッタ−により１９８３年４月２２日
に出願され、同時に欧州特許出願第０１２３２９４号と
して１９８４年１０月３１日に公開された、係属中の米
国特許出願第４８７．７５３号明細書に記載されている
ようなサツカロマイセスｅセレビシェのα−因子分泌に
基づく分泌系である。簡単に言えば、この系は、酵母α
−因子遺伝子生成物のリーダー配列をコードするＤＮＡ
が、発現すべき外来性遺伝子の暗号領域の５″側に直接
位置している構造からなる。その結果、翻訳された遺伝
子生成物は、余剰生成物の分泌時に、内在酵母酵素によ
って「切離される」リーダーまたはシグナル配列を含ん
でいる。この構築ではα−因子翻訳開始（ＡＴＧ）コー
ドンを利用しているため、５ＣＥＰ’　Ｏ遺伝子の一１
位にそのようなコードンを付与する必要がなかった。表
ＸＸＩから明らかになるであろうように、アラニン（ｅ
１）暗号配列は、α−因子プロモーターに続くα−因子
リーダーの最初の８０残基のＤＮＡを含むプラスミドに
直接挿入されるリンカ−配列の後にきている。５ＣＥＰ
Ｏ遺伝子発現のための特定の好ましい構築においては、
前記５ＣＥＰＯセクシヨンフラグメントおよびプラスミ
ドｐａ　Ｃ３のＨｉｎｄ　Ｉ［［／　Ｓ　ａｔ　Ｉ消化
による大フラグメントからなる４部分の結合が行なわれ
る。得られるプラスミドｐαＣ３／５ＣＥＰＯから、α
−因子プロモーター　リーダー配列および５ＣＥＰＯ遺
伝子をＢａｍＨＩ消化により単離し、ＢａｍＨＩ消化プ
ラスミド９ＹＥと連結させて、発現プラスミドｐＹＥ／
５ＣＥＰＯを形成した。

例　　　　１２ 本例は、例１１の発現系における、合成ＥＣＥＰＯおよ
び５ＣＥＰＯ遺伝子の組換え生成物の発現に関する。

大腸菌宿主細胞に用いられる発現系において、例１１の
プラスミドｐ５３６を、Ｃｌ８５７遺伝子を有する適切
なプラスミドｐＭＷｌで予めトランスフォーメーション
されたＡＭ７大腸菌細胞に移入させた。

ＬＢブロス（アンピシリン５０１Ｓ　／　ｍｌおよびカ
ナマイシン５１１９　／　ｍｌ　、好ましくは１０ｍＭ
　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４も添加）中の培養細胞を２８℃に
維持し、Ｏ，０，６００＝０．１となるまで培養細胞が
増殖してから、培養温度を４２℃に上げてＥＰＯ発現を
誘導した。約４００、Ｄ、まで増殖した細胞は、約５■
１０Ｄ、リットルのＥＰ○生成物（ゲルで評価）を産生
じた。

細胞を採取し、分離し、フレンチプレス（１００００ｐ
ｈｉ）で破壊し、リゾチームおよびＮＰ−４０界面活性
剤で処理した。２４０００　ｘｇ遠心分離で得たペレッ
トを塩酸グアニジンで溶解し、Ｃ４（バイダック、Ｖ　
７ｄａｃ）リバース・フェース（Ｒｅｖｅ＋＋ｅ　Ｐｈ
ａｓｅ　）ＨＰＬＣ（ＥｔｏＨＯ〜Ｈ％、５０ｍＭＮ　
Ｈ４Ａ　ｃ　−ｐＨ４，５）によリー工程で更に精製し
た。分離した蛋白質は９５％以上純粋な生成物であり、
得られた生成物は、約３：１の量比で、二つの異なるア
ミン末端式・Ｐ・Ｐ・Ｒ・・およびＰ・Ｐ・Ｒ・・を有
していた。

ｈＥＰｏおよび［ｄｅ＋Ａ　Ｉａ１コｈＥＰｏ生成物に
ついての後者の観察は、宿主細胞におけるアミノ末端「
プロセッシング」が、末端メチオニンおよびある場合に
は開始アラニンを除去するように作用することを示して
いる。単離物のラジオイムノアッセイ活性は１５ＨＮ　
−１ｆｉθ０００υ／■であり、イン・ビトロ分析活性
では３（Ｉｎθ〜６２Ｈ［ｌυ／■であり、更にイン・
ビボ分析活性では豹１２Ｇ〜７２０　Ｕ／■であった（
参考のために、各分析におけるヒト尿単離物標準は７０
０００　Ｕ／■である）。イン・ビボ分析における組換
え生成物の用量応答曲線は、ヒト尿ＥＰＯ標準のものと
は著しく異なっていた。

例１１のＡおよびＢで形成されたＥＰＯ類似プラスミド
を、ｐＭＷｌでトランスフォーメーションされたＡＭ７
大腸菌細胞にそれぞれ移入させ、細胞を上記のように培
養した。精製単離物をＲＩＡおよびイン・ビトロ分析で
試験した。［Ａ、＋ｎ２ｄｘ−Ｐ　ｔｏ　　〜Ｔ　ｌｅ
６コｈＥＰ○発現生成物のＲＩＡおよびイン・ビトロ分
析値はそれぞれ約１１０００Ｕ／■および６０００　Ｕ
／■蛋白質であったが、［Ｈｉ　ｓ　７コｈＥＰｏの分
析値はそれぞれ約４１０００　Ｕ／■および１４［１［
１０Ｕ／■蛋白質であって、類似生成物が分析によると
「親」発現生成物の１／４〜Ｉ／１０　ｒ活性」である
ことが示された。

サツカロマイセス−セレビシェ宿主細胞に用いられる発
現系において、プラスミドｐＹＥ／５ＣＥＰＯを二つの
異なる株、即ち、ＹＳＤＰ４　　（遺伝子型α　ｐｅｔ
４−３　ｔｒｐｌ）およびＲＫ８１（遺伝子型Ｕ　（１
ｐｅｐ４−３＋ｒｐｌ）に移入させた。トランスフォー
メーションされたＹＳＤＰ４宿主を、カザミノ酸が０６
５％添加されたｐＨ６，５のＳＤ培地ロニューヨーク州
、コールドスプリングハーバ−所在、コールドスプリン
グハーバ−ラボラトリ−「酵母遺伝学の方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄ＋　ｉｎ　Ｙｅｘｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第６
２頁、１９８３年］で３０℃にて増殖させた。細胞が３
６０．０　　まで増殖したときに採取した培地は、ＥＰ
Ｏ生成物を約２４４１１＃ｎｌ　（Ｒ，Ｉ　Ａで９７鱈
１０Ｄ・リットル）含有していた。６．５０．Ｄ、また
は６００．［］、　　まで増殖した形質転換ＲＫ８１細
胞は、約８０〜９０　Ｕ／　ｍｌのＥＰＯ濃度（ＲＩＡ
で３４／＃１０Ｄ・リットル）の培地を与えた。予備分
析では、発現系により得られる生成物は極めて不均一で
あったが、それはおそらく発現される蛋白質のグリコジ
ル化が様々であり、関連する炭水化物の中でマンノース
含量が比較的高かったためであろう。

ＨＢＩＯ１大腸菌細胞に含まれるプラスミドＰαＣ３お
よびｐｙＥを、１９８４年９月２７日に米国特許庁施行
規則に従い、それぞれ受託番号Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎ
ｏ。

３９８８１およびＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＮＯ，３９８Ｎ
として、メリーランド州、ロックビル、パークローン・
ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ、カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。ＡＭ７
細胞中のプラスミドｐＣＦＭ　５２６、ＪＭ１０３細胞
中のｐｃＦｉｌ　５３６およびＪＭ１０３細胞のｐＭＷ
ｌを同様に、それぞれＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　３
９９３２、Ｎ。

３９９３４およびＮｏ、　３９９３３　として、１９８
４年１１月２１日に寄託した。サツカロマイセス・セレ
ビシェ株ＹＳＰＤ４およびＲＫ８１をそれぞれＡ、　Ｔ
、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　２０７３４およびＮｏ、　２０７
３３として１９８４年１１月２１日に寄託した。

多数の極めて貴重な生成物および操作法が様々な面で本
発明により提供されることは、前記実施例を考慮すれば
容易に明らかとなるであろう。

本発明により提供されるポリペプチドは、それらが微生
物で発現された生成物であろうと、あるいは合成生成物
であろうと、それらの−次、二次または三次構造形状は
本発明で初めて公けになったものであるが、極めて有用
な物質である。

前述のように、本発明の組換え体由来および合成生成物
は、天然源からのＥＰＯ単離物のイン・ビトロ生物学的
活性を様々な程度で保有しており、したがって赤血球形
成細胞の増殖に用いられる培地において、ＥＰＯ単離物
に対する代替物としての利用性を有するものと考えられ
る。同様に、本発明のポリペプチド生成物が天然ＥＰＯ
単離物のイン・ビボ活性を有する範囲内において、それ
らはヒトをはじめとする哺乳動物におけるエリスロポエ
チン治療処置に用いるのに極めて好適であり、イン・ビ
ボでのＥＰＯに起因する効果、例えば、網状赤血球応答
の刺激、鉄動態効果の促進（例えばプラズマ鉄回転効果
および骨髄通過時間効果）、赤血球質量変化、ヘモグロ
ビンＣ合成促進（前記ニッシュバッハら参照）および例
１０に示しだ哺乳動物におけるヘマトクリット値の増加
などのあらゆる効果を促進させる。本発明の生成物で治
療可能なヒトの分類の中には、一般に輸血を要する患者
、外傷者などの外科患者、透析患者などの腎疾患患者並
びに血友病、線型赤血球病及び生理学的貧血などのよう
な各種血液組織に影響を及ぼす疾患の患者が含まれる。

ＥＰＯ治療の採用による輸血治療の必要性の最小化は感
染物質による感染の抑制につながると期待される。本発
明の生成物は、組換え法により生産されたものであるた
め、発熱物質、天然阻害物質等が混入しておらず、この
ため天然由来生成物と比べ、高い総合的な治療効果を発
揮すると予想される。本発明の生成物によるエリスロボ
エチン治療は、低酸素環境条件下にある固体において酸
素供給能を高め、更には可能性として有益な心臓脈管系
効果をもたらすと期待される。

本発明のポリペプチド生成物を投与するための好ましい
方法は、非経口投与（例えば、静注、筋注、皮下性また
は腹腔内性）であり、投与される組成物には、治療上有
効量の生成物が、薬学上許容される希釈剤、担体および
（または）アジユバントとともに通常含有されている。

予備的な薬物動力学的研究では、サルＥＰＯ生成物に関
し、静注よりも筋注投与の場合に、イン・ビボでより長
い半減期を示す。有効量は治療条件によって実質上変動
すると思われるが、治療量は実際には活性物質の７Ｕ〜
７０００　Ｕ／ｋｇ体重の範囲内であると予想される。

ヒト血清アルブミンのような標準的希釈剤が本発明の医
薬組成物用として考えられ、生理的食塩水のような標準
的担体が同様に考えられる。

本発明の組成物に使用するのに好適なアジュバント物質
には、テストステロン、前駆細胞刺激剤、インシュリン
様成長因子、プロスタグランジン類、セロトニン、サイ
クリックＡＭＰ、プロラクチンおよびトリョードチロニ
ンのように赤血球生成刺激効果に関して独立に注目され
る化合物、並びにメテルン、スタノゾロールおよびナン
ドロロンのように、再生不良性貧血の治療に一般に用い
られる薬物が含まれる。それぞれのエリスロポエチン刺
激効果について注目される化合物が挙げられる［例えば
、レセゴッチら：　「バンミナーバ・メゾイカ」、第２
３巻、第２４３−２４８頁、１９８１年［Ｒｅ＋ｅｇｏ
ｔｌｉ、ｅ＋　　ａｌ、、　　　Ｐａｎｍ１ｎｅｒｖａ
　　Ｍｅｄｉｃａ　　、　　　２３２４３−２４８　　
（１９８１）　］　、マツクゴニグルら：　１−キドニ
ー・インド」、第２５巻、第２号、第４３７−４４４頁
、１９ｇ４年［ＭｅＧｏｎｉｇｌｅ、ｅｌ　ａｔ、、　
　ＫｉｄｎＢ　ｌａｔ、、２５ｆ２！４３７−４４４　
（１９８４）］　、パブロビックーカンテラら：「エク
スベリメンタル・ヘマトロジー」、第８巻（増刊第８号
）、第２８３−２９１頁、１９８０年［ｐａｙｌｏｖｃ
−Ｋａｎｔｅｒａ　ｅｌ　ａｔ、、Ｅｘｐｔ、　Ｈｅｍ
ａｔｏｌ、、　　８（Ｓｕｐｐ、８）。

２８３−２９１　（１９８０）］　、およびクルツ：　
ｒｌ”ＥＢｓレターズ」、第１４１巻、第１号、第１［
１５−１０８頁、１９８２年［ＫＯＩ＋Ｉ、ＦＥＢＳ　
ＬｅＮｅｒ＋、　　ｆ４ａ（１）、　　１０５−１０８
（１９８２）］参照］。更にアジュバントとして考えら
れるものには、アドレナリン作動性物質、甲状腺ホルモ
ン、男性ホルモンおよびＢＰＡのように、エリスロポエ
チンまたはアシアロ−ＥＰＯの効果を高めること、ある
いは補強すること、が報告された物質［ダン：　［血球
増生の最近の概念Ｊ　　［Ｄｕｎｎ″Ｃｕ＋＋ｅｎｔ　
Ｃｏｎｃｅｐ！＋　ｉｎ　ＥＢｔｈｒｏｐｉｅｓｉ＋　
”　］　、ジョン・ワイリーおよびサンズ（イングラン
ド、チチェスター、１９８３年）　　［Ｊｏｂｎ　Ｗｉ
ｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ（Ｃｈｉｅｈｅｉｔｅ＋、　
Ｅｎｇｌａｎｄ、　　１９８３）］　、ウライ−ランら
：「ブルート」、第４４巻、第３号、第１７３−１７５
頁、１ｇ８２年［Ｗｅｉｌａｎｄ、ｅｊ　ａｌ、、　　
［１Ｉａｔ、　　４４（３）、１７３１．７５（１９８
２）］、カルマンチ＝　「キドニー・インド」、第２２
巻、第３８３−３９１頁、１９８２年［Ｋａｌｍａｎｔ
ｉ、　Ｋｉｄｎｅ７ｉｎ１．　２２．　３８３−３９１
　　（１９８２）］　、　　シャヒシ：［−ニー・イン
グランド・ジャーナル・オン・メデイスン」、第　２８
９巻、第　７２−８０頁、１９７３年［Ｓｎａｂｉｄｉ
Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ。、　　２８９．　７
２−８０　　（１９７３）コ、フィッシャーら：　「ス
テロイズ」、第３０巻、第６号、第８３３−８４５頁、
１９７７年［Ｆｉｓｈｅ＋、ｅｔ　ａｌ、、ｓｔｅ＋ｏ
ｉｄ＋３０　Ｔ６）、　８３３−８４５　（１９７７）
コ、ウラベら＝　「ジャーナル・オン・エクスペリメン
タル・メデイスン」、第１４９巻、第　１３１４−［２
５頁、１９７９年［Ｕ＋ｘｂｅ、　　ｅ＋！１．、Ｊ、
　ＥＩｐ、　Ｍｅｄ、、　　１．４９．　１３１４−１
３２５　（１９７９）］、および、ビラットら＝　「エ
クスペリメンタル・ヘマトロジーヨ、第１０巻、第１号
、第１３３−ｉｆ）頁、１９８２年［Ｂ１１１ａｔ、ｅ
ｔ　ｇｌ、、Ｅｒｐｆ、　　Ｌｍａｔｏｌ、、　　１０
（ｆ、）＋３３−１４０　（１９８２）］参照］、並び
に「肝造血因子」と目される化合物類［ツートンら：　
「アクタ・ヘマティカ」、第６９巻、第　１７１−１７
９頁、１９８３年［Ｎａｏｇｂｌｏｎ、　ｅｌ　ｉｔ、
、＾ｅｔａ、　ｌＩａｅｍａｔ、、６９．第１７１−１
７９頁（１９１１３）］参照］、「エリスロトロビン類
」（Ｅｒ７ｔｂｒｏ＋ｒｏｐｉｎｓ）　　［コンボート
（Ｃｏｎｇｏｔｅ）ら：第７回内分泌学国際会議（１９
８４年７月　１−７日、ケベック、ケベック市）の会誌
、抄録３６４、コンボート：「バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」、第１
１５巻、第２号、第４４７−４８３頁、１９８３年［Ｃ
ｏＢｏｔｅ、　ＢｉｏｃｈｅｍＢ　ｌｏｇｌ＋ｙｓ、　
　　Ｒｅｇ　　　　Ｃｏ１ｌ１ｍ、、　　　１１５　　
（２ン、　　　４４７−４８３　　　（２９８３ンｊお
よびコンボート：「アナリチカル・バイオケミストリー
」、第　１４０巻、第　４２８−４３３頁、１９８４年
に記載コおよび「エリスロジエニン類Ｊ　（ｅＢｔｈｒ
。

ｇｅｎｉＩｌ＋）　　［ロスマンら：ジャーナル・オン
・サージカル・オンコロジー」、第２０巻、第１０５−
１０８頁、１９８２年（Ｒｏ＋Ｉ＋ｍｘｎ、　　ｅｆ　
ａｌ、、　　Ｊ、Ｓｕｒｇ、０ｎｃｏ１．、　２０１０
５−ＩＮ　（１，９Ｎ）］に記載コが挙げられる。予備
スクリーニングでは、５−α−ジヒドロテストステロン
またはナンドロロンで前処理された超低酸素赤血球増加
マウスの造血応答性を調べたが、前記本発明のエリスロ
ポエチンについて明確な結果が得られなかった。

本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に広範であり、
Ｒ１，ＡおよびＥＬ　Ｉ　ＳＡ等の各種イムノアッセイ
技術、並びに各種のイン・ビトロおよびイン・ビボ活性
分析において標識および未標識型での使用が挙げられる
。例えば、ダンら＝　「エクスベリメンタル・ヘマトロ
ジー」、第１１巻、第７号、第５Ｎ−６ｆｌ［）頁、１
９８３年［’ｈ＋ｎ、　　ｅｔ　ａｔｌ、Ｅｘｐｔ。

Ｈｅｍａｔｏｔ、、　ＩＨ７）、　　５９０−６００ｆ
１９８３）］　、ギブソンら＝「バンクジー」、第１６
巻、第１５５−１５６頁、１９８４年［Ｇｉｂａｏｎ、
ｅｔ　　！ｌ、、Ｐａｔｂｏｌｏｇｙ、１６，１５５−
１５６（１９８４）コ　。

クリスタル：　「エクスペリメンタル・ヘマトロジー」
、第１１巻、第７号、第６４９−６６０頁、１９８３年
［Ｋｒｙｓ　ｔａ　１．　ＥｘｐＬ　Ｆｌｅｍａｌｏ　
１．　、１１　（７）、　６４Ｇ−６６０（１９８３）
ｌ。

サイト−ら＝「ジャパニーズ・ジャーナル・オン・メデ
ィスン」、第２３巻、第１号、第１６−２１頁、１ｇ８
４年［５ｘｉｔｏ、　　ｅｔ　ｘｌ、、Ｊｉｐ、Ｊ、Ｍ
ｅｄ、、　　２３（１）、　　１６−２１、（１９８４
）コ、ネーザンら＝　「ニューイングランド・ジャーナ
ル・オン・メディスン」、第３０８巻、第９号、第５２
０−５２２頁、１９８３年［Ｎ［ｈｇｎ、　ｅｔ　ａｌ
、。

ＮｃｖＥｎｇ、Ｊ、Ｍｅ＋、、　　３０８（９）、５２
０−５２２（１９８３）］、およびそれに関する分析に
ついての各種文献参照。ここに初めて開示されたＥＰＯ
残基配列からなる合成ペプチドをはじめとする本発明の
ポリペプチドは、また、ポリクローナル抗体、並びに各
種の連続的および非連続的ＥＰＯエピトープに対して特
異的なモノクローナル抗体の「バンク」を得るために極
めて有用な純粋物質を提供する。−例として、ホップら
：ｒＰ、Ｎ。人、Ｓ、Ｊ（米国）、第７８巻、第３８２
４−３８２８頁、１９８１年口Ｈｏｐｐ、　ｅｔ　ａｌ
、　、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ（Ｕ、Ｓ、Ａ）、７８．
　　ｐ９３８２４−３８２８　（１９８１）］による親
水性に関し、またチューら：　「アナルス・レヴイー・
バイオケミストリー」、第４７巻、第　２５１頁、１９
７８年　［Ｃｈｏｕ、ｒｌ　　ｇｌ、、Ａｎａ、　　　
Ｒｅｖ、　　　Ｂｉｏｃｈｃｍ、、　　　４７．　　　
ｐ２５１（１９７８）］による二次構造について、表■
のアミノ酸配列の予備分析では、４１−５７位、ｌｌＳ
−１２８位および１４４−１６６位を含む連続残基配列
の複製である合成ペプチドは高い抗原応答性を生み出す
であろうこと並びに合成ペプチドおよび完全蛋白質と免
疫応答する有用なモノクローナルおよびポリクローナル
抗体を与えるであろうことを示している。

このような抗体は、ＥＰｏおよびＥＰＯ関連生成物の検
出およびアフィニティ精製に有用であると予想される。

実際に、下記三種の合成ペプチドが製造された：（１）
　　ｂＥＰｏ　４１−５７．　　　Ｖ−Ｐ−Ｄ−Ｔ−に
−Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｙ−Ａ−Ｗ−に−Ｒ−Ｍ−Ｅ−ＬＧ （２）　　　ｈＥＰｏ　　１１６−１２８．　　Ｋ−Ｅ
−Ａ−１−３−Ｐ−Ｐ−Ｄ−＾−Ａ−Ｓ−＾−Ａ（３）
　　　ｈＥＰｏ　　１４４−１６６、　　Ｖ−Ｙ−Ｓ−
Ｎ−Ｆ−Ｌ−Ｒ−Ｇ−に−ｔ−に−Ｌ−ＹＴ−Ｇ−Ｅ−
Ａ−Ｃ−Ｒ−Ｔ−Ｇ−Ｄ−Ｒ上記ポリペプチドを用いた
予備免疫試験では、１２５Ｉ−標識化ヒト尿ＥＰＯ単離
物を免疫沈降させるウサギ血清抗体能を測定すると、ｈ
ＥＰ。

４１、−５７に対して比較的弱い陽性応答性を示し、ｈ
　Ｅ　Ｐ　０　１１６−１２８に対しては明確な応答を
示さず、ｈ　Ｅ　Ｐ　Ｏ１４４−１６６に対し強い陽性
応答性を示した。

三種のペプチドについての予備的なイン・ビボ活性試験
では、単独ででもまた組合せでも、さほど活性を示さな
かった。

前記諸例で得られた哺乳類ＥＰＯのアミノ酸残基の配列
を推定してみると、これは成熟ＥＰＯの一次構造形状を
本質的に示しているが、表■のサル種ＥＰＯの１６５ア
ミノ酸残基の特定配列および表■のヒト種ＥＰＯの　１
６６残基により、本発明で得られる有用なポリペプチド
の範囲が制限されるものではないことを理解されたい。

本発明には、ヒトγ−インターフェロンのような生物学
的活性哺乳類ポリペプチドの過去の研究により明らかに
されたところからおそらくは存在するであろうところの
ＥＰＯの各種天然対立遺伝子型が含まれる［例えば、Ｅ
ＰＯ出願第００７７６７０号として公開され、　１４０
位にアルギニン残基を有すると報告されたヒト免疫イン
ターフェロン種、およびグレーら：　「ネイチャー」、
第２９５巻、第５０３−５０８頁、１９８２年［Ｇ＋Ｂ
、ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２９５．　　
ｐｐ５０３−５０８（１９８２）］において、１４０位
にグルタミンを有するとして報告された種と比較された
い。］両種とも「成熟」ヒトγ−インターフェロン配列
を構成するものとされている。成熟ＥＰＯポリペプチド
の対立遺伝子型は、配列の長さに関しおよび（または）
配列内のアミノ酸の欠如、置換、挿入または付加に関し
て、相互に、又表Ｖおよび■の配列との開で異なってい
るであろう。その結果、グルコシル化能において潜在的
な多様性が生じる。前述したように、一つの推定される
ヒト種ＥＰＯの対立遺伝子型には、１２６位にメチオニ
ン残基を含むものが考えられる。予期したように、ＥＰ
ＯをコードするＤＮＡゲノムおよびｃＤＮＡ配列の天然
対立遺伝子型として、上記型の対立遺伝子ポリペプチド
をコードするか、あるいは特定の同様のポリペプチドを
示す別のコードンを単に有するものも発生しているよう
である。

成熟ＥＰ○の天然対立遺伝子型の他に、本発明ではＥＰ
Ｏのポリペプチド類縁体および「成熟」ＥＰＯフラグメ
ントのような他のｒＥＰｏ生成物」を包含するものであ
る。アルドンらによる前記公開出願（ｗｅ／　８３／　
０４０５３）の方法により、−以上の残基の同一性また
は存在位置（例えば、置換、末端および中間的付加並び
に削除）についてここに特定された成熟ＥＰＯとは異な
る一次構造を有するポリペプチドの微小生物発現をコー
ドしている遺伝子を容易に設計し、製造することができ
よう。

あるいは、ｃＤ　Ｎ　ＡおよびゲノムＥＰＯ遺伝子の改
変は、周知の特定部位突然変異誘発技術により容易に実
施でき、またＥＰＯ類縁体および誘導体を得るために利
用することができる。このようなＥＰＯ生成物は少なく
とも一つのＥＰＯの生物学的性質を有するが、他の点で
は異なっていてもよい。例えば、本発明で計画されるＥ
ＰＯの生成物には、例えば削除によって短縮された形の
もの［Ａｓｎ　　　　ｓ　　　ｄａｄ−Ｐｒｏ　２〜　
Ｉ　　ｌｅ　６　コ　　　ｈＥＰｏ　　、Ｃｄｅｓ−Ｔ
ｂｒ　　−Ａｔｅ１６６］　　ｈＥ　Ｐ　Ｏおよび「Δ
２７−５５ｈＥ　Ｐ　ＯＪがあって、特にこの後者は完
全なエキソンによってコードされた残基を欠いたもので
ある。また、本発明のＥＰ○生成物には、加水分解に対
しより安定なもの（したがって、天然ＥＰＯよりも著し
い、または長い持続性を有するであろう）、−以上のグ
リコジル化可能部位を削除して変換されたもの（酵母産
生生成物ではより高い活性を有するようになるかもしれ
ない）、−以上のシスティン残基が削除されまたは例え
ばヒスチジンもしくはセリン残基で置換され（例えば、
［Ｈロア］　　ｈＥＰｏ類縁体）、微小生物系から更に
容易に活性型で単離され得るもの、あるいは、−以上の
チロシン残基がフェニルアラニンで置換され（例えば、
類縁体の［Ｐｂｅ１５］　　ｂＥＰｏ。

こＰｈｅ　）ｈＥＰｏおよびＥ　Ｐ　ｈｅ””　）ｂＥ
　Ｐ　Ｏ）、多少なりとも標的細胞のＥＰＯレセプター
と容易に結合し得るもの、が含まれる。更には、成熟Ｅ
ＰＯ内の一部のアミノ酸配列または二次構造のみを複製
したものであって、フラグメントが一つのＥＰＯ活性（
例えばレセプター結合性）を有し、他の活性（例えば、
造血機能）を有していないポリペプチドフラグメントも
含まれる。この点４こ関しとくに重要であるのは、表■
のヒトゲノムＤＮＡ配列により解明されたこれらの可能
なＥＰＯフラグメントであり、即ちイントロン配列で示
されかつ生物学的機能のうえで独立の「ドメイン」を構
成する全体的ＥＰＯ配列の「フラグメント」である。本
発明のいかなる一以上のｒＥＰｏ生成物」におけるイン
・ビボ活性が欠如しても、治療上の有用性（前記ライ−
ランドら参照）またはＥＰＯ分析もしくはＥＰＯ拮抗作
用のような他の関連分野での有用性を全体的には阻害し
ないことが注目される。エリスロポエチン拮抗剤は、赤
血球増加症またはＥＰＯ過剰産生時の治療に極めて有用
であろう［例えば、アダムソン・　「ホスピタル・プラ
クティス」、第１８巻、第１２号、第４９−５７頁、１
９８３年［Ａｄｘｍ＋ｏｎ、Ｈｏ５ｐ、　　ＰｒａＣｔ
ｉｃｅ、　　１８（１２）、　　４９５７（ｉ９８３）
］およびヘルマンら：　「クリニカル・アンド・ラボラ
トリ−・ヘマトロジー」、第５巻、第３３５−３４２頁
、１９８３年［Ｈｅｌｌｍａｎｎ、ｅｆ　ｘｌ、、Ｃｌ
１ｎＬｓｈ、　Ｈａｅｍａ＋、、　　５．　３３５−３
４２　（１９ｇ３）ｌ参照コ。

本発明の他の面によれば、ここに記載された、ヒトおよ
びサルＥＰＯポリペプチドをコードするクローンＤＮＡ
配列は、天然生成物の単離物についての数ｌθ年間にわ
たる分析にもかかわらず今まで利用できなかった哺乳類
エリスロポエチンアミノ酸配列に関し、それらが与える
情報において極めて価値が高い。このＤＮＡ配列はまた
、各種組換え技術によって大量のエリスロポエチンを微
生物合成するのに役立つ生成物としても極めて価値があ
る。即ち、本発明で得られるＤＮＡ配列は、新規でかつ
有用なウィルス性および環状プラスミドＤＮＡベクター
、新規でかつ有用なトランスフォーメーションおよびト
ランスフェクションされた微小生物原核ならび真核宿主
細胞（培地で増殖される細菌、酵母細胞および哺乳類細
胞が含まれる）およびＥＰＯおよびＥＰＯ生成物の発現
が可能な微小生物宿主細胞の新規でかつ有用な培養増殖
方法を得る上で有益である。本発明のＤＮＡ配列は、こ
こに具体的に説明したヒトおよびサル種以外の哺乳動物
種におけるＥＰＯおよび関連蛋白質をコードする　ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を単離する上で、標識化プ
ローブとして使用するのに極めて適した物質でもある。

本発明のＤＮＡ配列が、各種の別の蛋白質合成方法にお
いて（例えば昆虫の細胞）、あるいはヒトおよび他の哺
乳動物の遺伝子治療において使用される範囲は計算でき
ない。本発明のＤＮＡ配列は、エリスロボエチンおよび
エリスロポエチン生成物を大量に産生ずる真核「宿主」
として機能する遺伝子変異哺乳動物種を得る上で有用で
あると予想される。一般的には、パーミターら：　「サ
イエンス」、第２２２巻、第４６２５号、第８０９−８
１４頁、１９８３年［Ｐａ１ｍ１ｔｅ＋ｅｌ　ａｌ、　
　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２２（４６２５）、　　８０
９−８１４　（１９８３）］参照。

この観点からすれば、したがって、特定の実施例の開示
は本発明の範囲を制限するものでないことは明白であり
、多数の改変および変更が当業者において考えられる。

−例として、実施例で得られるＤＮＡ配列は　ｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡ配列を含み、それは本出願がＤＮＡ
配列の製造に必要なアミノ酸配列情報を提供するための
ものだからであるが、本発明にはＥＰＯアミノ酸配列配
列報に基づいて調製されるような合成りＮＡ配列も含ま
れる。これらは、ＥＰＯをコードしく例１２のように）
、また−以上の天然ＥＰ○の生物学的性質を有するけれ
ども他の性質は有しない（または、程度の異なる他の性
質を有する）ＥＰＯフラグメントおよびＥＰＯポリペプ
チド類縁体（即ち、ｒＥＰ○ＥＰＯ」）をコードするも
のであろう。

本発明で得られるＤＮＡ配列には、このように、エリス
ロボエチンの少なくとも一部の一次構造配列と一以上の
その生物学的性質を有するポリペプチド生成物を原核ま
たは真核宿主細胞において発現させる上で使用するのに
適し、かつ（ａ）表■および■に示したＤＮＡ配列、（
ｂ）　（ａ）で定義したＤＮＡ配列またはそのフラグメ
ントと１１イブリツド形成するＤＮＡ配列、およびｆｃ
）遺伝暗号の縮重は別にして、（ａ）および（ｂ）で定
義されたＤＮＡ配列とハイブリッド形成するであろうＤ
ＮＡ配列の中から選択されるＤＮＡ配列が全て含まれる
。

この点に関し注目すべきは、例えば存在するサルおよび
ヒトＥＰＯ対立遺伝子配列並びに他の哺乳動物種遺伝子
配列が、表■および■の配列およびそのフラグメントと
ハイブリッド形成すると期待されることである。更に、
遺伝暗号の縮重は別にして５ＣＥＰＯおよびＥＣＥＰＯ
遺伝子並びに各種ＥＰＯフラグメントおよび類縁体をコ
ードする合成もしくは突然変異のｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡ配列は上記ＤＮＡ配列ともハイブリッド形成する
であろう。このようなハイブリダイゼーションは、サル
およびヒトのＥＰＯをコードするＤＮＡの最初の単離に
関してここに記載された条件またはより厳格な条件下で
、所望ならば背景のハイブリッド形成を抑制して容易に
実施することができるであろう。

同様の意味で、前記諸例は、細菌性プラスミドおよびウ
ィルス性ゲノム起源のハイブリッドベクターに挿入され
たＤＮＡの哺乳動物細胞発現に関し、ＥＰＯ生成物を微
小生物発現させる発明を説明するものであるが、広範な
発現系が本発明の概念の中に含まれる。特に、培養され
た各種細菌、酵母菌および鴫乳動物細胞に適用される均
−源からのベクターを含む発現系、並びにベクターを含
まない発現系（例えば、リン酸カルシウムでトランスフ
ェクションされた細胞）が含まれる。この点に関し、例
えば、サル宿主培養細胞およびヒト宿主培養細胞におい
てサル起源ＤＮＡが発現するのは現実には「外来性Ｊ　
ＤＮＡによる発現の場合であると理解されたいが、その
理由は高レベルの発現が求められるＥＰＯＤＮＡは宿主
ゲノムに起源を有さないからである。本発明の発現系は
、ＥＰＯ生成物が細胞質で形成されて宿主細胞の細胞質
または膜に（例えば、細菌ペリプラズム空隙に蓄積され
る）、または前記培地上澄に、または緑膿菌（Ｐ、　ａ
ｅｒｕｇｉｎｏ＋ａ）発現系〔グレイら二「バイオテク
ノロジー」、第２巻、第１６１−１６５頁、１９８４年
［Ｇｒａｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇ
７．　２．　　ｐｐ１６ｉ１６５　Ｆ＋９８４）］のよ
うにどちらかといえば、まれな系に、グリコジル化され
たＥＰＯ生成物およびグリコジル化されないＥＰＯ生成
物が蓄積されるという実施態様を意図するものである。

本発明のハイブリッド形成改良方法は、実際には上記Ｄ
　Ｎ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａスクリーニングに用いられたが、
これはＲＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮ　Ａ／Ｄ　ＮＡスクリ
ーニングにて同様に適用可能である。ここに説明したよ
うな混合プローブ技術は、一般に、より迅速にかつ信頼
をもってポリヌクレオチドを単離できるハイブリッド形
成過程において多くの改良点を有している。これらの多
数の個々の操作上の改良点としては、改良されたコロニ
ー移転および保存方法、および同様のフィルターで再プ
ローブ化でき、フィルターの繰返し使用が可能で、新規
なプロテアーゼ処理の適用を可能にするシーンスクリー
ン（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ）およびシーンスクリーン
畳プラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　ｐＨ１１１のよう
なナイロン基質フィルターの使用［例えば、タウブら：
「アナリテイカル・バイオケミストリー」、第１２６巻
、第　２２２−２３０頁、１９８２年［Ｔａｕｂ、　　
ｅｔ　ａＡｎａｌ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１２６
．ｐｐ　２２２−２３０　　（１９８２）］　と比較さ
れたい］、および多数の種類の混合プローブ（例えば３
２種類を超える数）のそれぞれの極めて低イ濃度（０，
０２５ピコモルのオーダー）での使用、および、用いら
れる全ての混合プローブの中の最低の計算解離温度に非
常に近い厳格なる温度下での（即ち、それより４℃以内
、好ましくは２℃以内での）ハイブリダイゼーションお
よびボストノ１イブリダイゼーシラン工程の実施、が挙
げられる。

これらの改良点を組合わせると、それらの実施によるも
のとは予想できない程の結果が得られる。

このことは、比較的低めの充分量なるメツセンジャーＲ
ＮＡ種に　ｃＤＮＡスクリーンを用いると好結果が得ら
れたと今までに報告されたプローブ数の４倍量を含む混
合プローブ操作を、　１．５［１０，０００のファージ
プラークのゲノムライブラリースクリニングにおいて唯
一の遺伝子配列を単離するのに適用して成功した、とい
う事実により詳細に説明される。この偉業は、前記アン
ダーソンらの、「混合プローブスクリーニング法は相当
するＲＮＡの遺伝子が利用できない限り、哺乳類蛋白質
遺伝子を単離するのは実際上不可能である」との論評の
公開と実質上同時に行なわれたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はラジオイムノアッセイによる組換ヒト及びサル
ＥＰＯの活性を示したものである。 第２図、第３図及び第４図は、夫々、ベクターｐＤＳＶ
Ｌ−ＭｋＥ、　　ｐｓＶｇＨｕＥＰｏ及びｐＤＳＶＬ−
ｇＨｕＥＰｏを示したもノテある。 代瑯人ブ■・１１１士 船 山 第３図 Ｒ１ 第４図 ゝ゛警〜−〜 手続補正書動式） 手続補正書 平成３年５月１７日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）マルチプル一本鎖ポリヌクレオチドを有する不均
   一な細胞もしくはウィルスの試料における未知配列の特
   定の一本鎖ポリヌクレオチドを検出するための改良方法
   であって、下記の（ａ）〜（ｅ）を含むものにおいて、
   この改良が３２を越える混合プローブを用いかつ下記の
   （１）〜（４）の一つまたはそれより多くを実施するこ
   とからなるものである、改良方法。 （ａ）一様に変異した塩基配列を有する標識化一本鎖ポ
   リヌクレオチドプローブの混合体が調製される。このプ
   ローブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特であると
   推定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である
   。 （ｂ）試料が固体基質に固定される。 （ｃ）試料を固定してある基質が、該試料のポリヌクレ
   オチドとのハイブリダイゼーションは別として、ポリヌ
   クレオチドが更にそれと結合するのを抑制するように処
   理される。（ｄ）試料を固定してある処理済みの基質が
   、全体的に相補性のポリヌクレオチド間でのみハイブリ
   ダイゼーションし易い条件下で、一時的に前記標識化プ
   ローブの混合体と接触せしめられる。 （ｅ）特定のポリヌクレオチドがそれと該標識化プロー
   ブ混合物内の全体的に相補的なプローブとのハイブリダ
   イゼーション反応の存在を監視することによって検出さ
   れる。これは、標識化プローブの基質との非特異的結合
   に起因する標識化物質の背景密度と比較して特定のポリ
   ヌクレオチド位置における基質上の標識化物質の密度が
   高い、ということにより証明される。 （１）前記固体基質としてナイロン基紙を用いる。
2. （２）工程（ｃ）でプロテアーゼにより処理する。
3. （３）それぞれが約０．０２５ピコモル濃度の標識化プ
   ローブを用いる。
4. （４）工程（ｄ）におけるハイブリダイゼーション条件
   の一つとして、使用される全てのプローブ中で最低のＴ
   ｄ計算値から４℃離れた温度付近の厳格な温度を適用す
   る。