CN1291229A - 重组的活性人透明带蛋白3 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产重组人透明带透明蛋白3(rhZP3)和能与人精子结合具生物活性的糖基化肽。人卵巢细胞系则被用来生产含有完整生物活性所必须的糖基化类型的rhZP3。讨论了用于鉴定有用的具有人精子结合活性的肽及其合成,以及讨论了如何将此类肽和蛋白质用治疗和诊断中。

Description

重组的活性人透明带蛋白3

发明领域

本发明涉及男性不育检测，以及重组人透明带蛋白在临床研究和实际应用中的用途。

现有技术的描述

源自于女性和男性的卵和精子在授精的过程中，结合成为合子，合子的基因组成和双亲不同。精卵的相互作用需要卵透明带蛋白3(ZP3)作为精卵结合的配体和精子顶体反应的引发者。

在诸多不明病因的男性不育病患中，可以经常看到不正常的精子-卵子透明带的相互作用。这种不正常常伴随着精子授精能力的减低并且在不育病例中占相当大的比例。今天男性不育是一个不容忽视的问题，不育病例当中，约有30～40％的问题在于男性生殖功能障碍。因此有必要更深一层地去探讨在透明带层次上的精卵相互作用。更多的了解将可提供不育病患改进的和更以生理-病理为导向的疗法。

许多不育的病例，其问题出在精子和卵子的结合形成合子时。精子和卵子透明带的结合是该过程中的一个重要的识别过程。对鼠受精系统的深入研究结果已分离出ZP3并证实其为精子的主要受体(Bleil和Wassarman，发育生物学(Dev．Biol．)76∶185-202(1980))。ZP3是在授精过程中起重要作用的一种糖基化多肽。就其生物作用的一部分而言，ZP3在暴露于精子的30分钟内会与精子结合应引发顶体反应。这种生物活性包括两部分。第一部分包括ZP3与精子的结合，第二部分为引发精子的顶体反应。这两种反应都可由本领域的技术人员用多种方法进行检测。

现有的证据表明，如在鼠模型中所证实的，ZP3参与了在授精过程中的两个必要事件。第一ZP3扮演主要的精子受体以使精子与透明带结合(Saling，Oxf．Rev．Reprod．Biol．11∶339-388(1989))。第二ZP3是引发顶体反应所必需的(Saling，Biol．Rep．44∶246-251(1991))。目前大部分有关此类的研究都使用来自于动物的天然ZP3。报告指出人ZP3糖基化多肽，其分子量大约为60～100kD，其中一半是糖。

对ZP3糖在受精中的作用有过猜测，但没有关于种间差异的确切描述。在一个最近的实验中，用mZP3转染小鼠胚胎癌细胞其中簇集在外显子7中的5个丝氨酸残基Ser-329，Ser-331，Ser-332，Ser-333和Ser-334通过定向突变被改变为小的、非羟基的氨基酸。转基因的ZP3以非活性形式合成和分泌，丧失了结合精子的能力(Chen等．，《美国国家科学院院报》。95∶6193-97(1998))。但是，这项工作没有充公说明各种ZP3之间可能的种间差异并且没有充分特征描述5个丝氨酸之间的差异。而且，现在也不知道在粘蛋白型糖基化多肽中负责将糖GalNAc连接到特定的丝氨酸和苏氨酸残基的侧链的UDP-GalNAc：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶家族。但是，据丹麦生物序列分析中心报道，可以用已知的哺乳动物肽序列预测给定的序列的糖基化可能性，可以得到高度可信的经验性数据。例如，该中心的站点(www．cbs．dtu．dk／services／NetOGly 2．0)查看(下文称为“NetOglyc站点)。另一个O-糖基化的蛋白质数据库也能在(Hansen等，核酸研究，25∶278-282(1997))的报告中查知，另外根据肽序列来预测糖基化位点的算法亦可在(Hansen等，Glyco．J．，15∶115-130(1998))的报告中查知。

分子生物学已揭示了有关ZP3蛋白和其有关基因的新的信息。全长的人ZP3 cDNA克隆已被分离，并且这个基因的所在位置和特征也已为Chamberlin和Dean在美国国家科学院院报。87∶6014-6018(1990)中完整地描述。也已经获得了小鼠的基因组序列，可用已知方法获得编码蛋白的羧基末端序列的外显子7(Kinloch等，美国国家科学院院报。85∶6409-13(1988))含有小鼠ZP3基因信息的克隆可以在例如小鼠组织培养系中表达有用量的重组ZP3(“rZP3”)。然而不幸的是，重组人ZP3(“rhZP3”)的生产遇到了困难，至少是rhZP3的表达经常不稳定。(Chapman和Barratt，Mole．HumanRepro．3∶646-648(1997))。而且，在此之前还没有纯化过合适的糖基化的hZP3，因此任何有关该材料的信息都是间接确定的。

根据其来源不同，ZP3的表观分子量有稍许的不同。举例说，Beebe等，发育生物学。151∶48-54(1992)确定来自转染的中国仓鼠卵巢细胞的重组鼠ZP3(“rmZP3”)的分子量大约是60-70kDa；其与平均大小在83kDa天然的ZP3不同。这些研究者认为这种不一致是由于糖基化类型的不同。

如Beebe等所说，尽管有推测的不同的糖基化，rmZP3仍然能够在同源的(小鼠)精子-卵透明带竞争性的测定中，展现其生物活性，并且rmZP3能在获能的小鼠血清中引发小鼠精子的胞吐作用。但在人中测试时，在半透明带测定条件下，rmZP3仅显示出部分的竞争作用，而且不能用为顶体反应激动剂。(Chamberlin and Dean，《美国国家科学院院报》。87∶6014-18(1998))。

另外的后续的公开表明CHO细胞生产的rhZP3有生物活性。(VanDuin等，Biol．Repro．51∶607-17(1994))。然而在Van Duin的报告上未能证明rhZP3具有精子结合能力。进一步地，rhZP3需要在高达10-20μg／ml的浓度下至少与精子接触3小时才可以有明显的顶体反应，该ZP3不能说是有真正的生物活性。该结论是根据如下的事实：生物活性是特异性的(即可以在低的浓度下发生)，即精子和ZP3蛋白结合并迅速发生顶体反应。特异性的结合和迅速的顶体反应是精子细胞进入透明带的必要前奏。在天然生物条件下，ZP3的浓度至少要比Van Duin所报道的低100倍，而且顶体反应是在30分钟内发生的而不是至少几个小时。

一种检测生物反应的方式是半透明带测定法(HZA)。HZA功能性的检测精子与透明带的紧密结合，该结合是引发导致受精和早期胚胎发育的生理顶体反应的关键步骤。

由于获得合适的用于此检测的rhZP3是困难的，大多数工作都使用了来自其他物种的基因。尽管有这些困难，现在已经知道人ZP3和小鼠一样包含大约50％的糖(即按重量计40％-60％的糖)并且424个氨基酸长的序列与小鼠的序列大约有1／3不同。而且，一般认为不同的宿主细胞对hZP3的糖基化也是不同的。但是，正如最近所总结的“是否此类差别改变了rhZP3的生物活性是不清楚的”(同上648页)。

在利用了精子结合透明带的关键事件的临床应用中需要大量的生物活性rhZP3用于诊断临床疾病。例如，如Burkman等，Fertil．Steril．49∶688-693(1998)和Oehninger等Andrologia24∶307-321(1992)所说的标准的和内部控制的“半透明测定”检测评价了人精子和透明带的结合能力。不幸的是，这种需求不能从动物来源得到满足或者从现在可以得到的rhZP3得到满足。因此，需要一种方法以便得到大量的可生产量的有一或多种rhZP3生物活性的物质，以用于研究和诊断检测和用于需要完整活性的蛋白质药物。

发明概述

本发明的一个目的是提供有一或多个hZP3生物特征的糖基化多肽。另一个目的在于提供分离的和有生物功能的rhZP3。再一个目的在于提供rhZP3糖基化多肽，该多肽结合人精子并有与人受精相关的的诊断和治疗用途。还有一个目的是提供检测男性不育的方法，该方法基于生物活性hZP3与临床样品结合所引起的对顶体反应的诱导。还有一个目的是提供满足临床和研究用量的高水平的生物活性hZP3。

为了实现这些目的和其他目的，本发明提供了大约65kd-100kd的重组糖基化多肽，该多肽包括按重量计50％的糖并且可以与人精子结合和引发顶体反应。本发明还提供了大约65kd-100kd的重组糖基化多肽，该多肽包括按重量计50％的糖并且可以与人精子结合和引发顶体反应，其中产生该糖基化多肽的细胞的糖基化机制与卵细胞相似。本发明还提供了产生有hZP3蛋白生物活性的糖基化多肽，包括步骤：用编码hZP3多肽的基因转染卵巢细胞系；培养该细胞以得到产生hZP3的细胞培养物；和分离该糖基化多肽。

本发明还包括用精液样品检测男性不育的方法，包括步骤：将重组糖基化多肽溶液与样品接触形成混合物，其中该重组糖基化多肽的分子量大约是65-100kd并且包括按重量计大约50％的糖并且能结合人精子和引发顶体反应；检测混合物中的顶体反应和顶体反应裂解物；将顶体反应裂解物的量与参考值进行比较。本发明还提供了来自包括rhZP3基因的转化的人卵巢细胞的细胞。

本发明的另一个实施方案是含有与人精子优先结合的活性部分(即糖基化氨基酸序列区)的转基因糖基化多肽，其中活性部分多肽小于25kDa，包括与SEQ ID NO：1有54％以上的同源性的氨基酸序列并在羧基末端的第5位点有预测的O-糖基化位点。再一个实施方案是用人精子检测男性不育的方法，包括步骤：(a)将含有优先与人精子结合的活性部分的转基因糖基化多肽与样品精子接触以形成混合物，其中活性部分多肽小于25kDa，包括与SEQ ID NO：1有54％以上的同源性的氨基酸序列并在羧基末端的第5位点有预测的O-糖基化位点；(b)检测混合物中的精子的生物活性；和(c)与参考值比较生物活性。还有一个实施方案是用于产生糖基化多肽的核酸载体，其中该糖基化多肽与人精子特异性结合，其中载体编码的氨基酸序列与SEQID NO：1有54％以上的同源性。还有一个实施方案是含有核酸载体的人细胞，该核酸载体可以用于产生小于200氨基酸的糖基化多肽，其中该糖基化多肽特异性地与人精子结合并且该载体编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1有75％以上的同源性。

附图描述

图1是人ZP3的308-348残基的氨基酸序列。

图2是人ZP3的308-348残基中的O-糖基化位点的代表性预测的概括。

图3是小鼠ZP3的309-349残基中的O-糖基化位点的代表性预测的概括。

发明详述

本发明人发现了hZP3蛋白糖基化类型的组织特异性和种特异性的差异，更具体地是残基308-349极大地影响该蛋白的生物活性。根据本发现，本发明人开发了应用卵巢糖基化机制的系统以适当的糖基化hZP3。本发明人还开发来了结合人精子的糖基化多肽。“适当的糖基化”在本文中的含义是产生类似于人卵细胞的糖基化类型(“人功能化的”)以便有与人精子结合的生物活性。使用该系统，本发明人首次分离了不同于以前的rhZP3，与已知的rhZP3相比它有完整的生物活性和更类似于人卵细胞蛋白的糖。本发明人还开发了用生物活性的重组糖基化多肽诊断男性不育的检测方法。进一步地，本发明人还发现了rhZP3和比rhZP3小的糖基化多肽的治疗用途，这是以前没有实现过的。

发明人根据他们对hZP3残基308到349对限定人卵母细胞糖基化作用的理解，本发明人发现了替代地可以模拟人卵母细胞和人精子结合的有生物功能的糖基化多肽。术语“有生物功能的糖基化多肽”在本文中的含义是指包括序列SEQ ID NO：1中至少部分氨基酸的多肽而且该多肽与人精子的结合好过与小鼠精子的结合。优选地，该多肽还包括在多肽生物合成中由人细胞加上的糖。更优选地，人细胞系来自卵巢或卵泡细胞系。在一个实施方案中，该细胞系是非卵巢哺乳动物(优选人)细胞系，该细胞系已被遗传变异以便诱导和／或刺激卵母细胞糖基化酶。在本文中，大规模的小的糖基化多肽其有了新的用途，例如，避孕中糖基化多肽干扰了正常的受精过程，其中小的糖基化多肽是小于200氨基酸的与SEQ ID NO：1有54％以上，优选有75％以上的氨基酸序列同源性。

本发明人发现了显著地来自于本节的hZP3的糖基部分的rhZP3的生物特异性。更具体地，本发明人由非人卵巢细胞系如CHO细胞系制备的人rZP3，尽管其具有人ZP3同样的氨基酸序列，但由于其糖成分使其没有人卵细胞作用的活性。例如，用糖苷酶从hZP3去掉糖基将失去hZP3的生物活性。可以通过首先制备完全的生物活性的hZP3来确定糖基化的细微差别。从而，糖基化多肽的糖部分被部分改变或去掉。改变后，检测该糖基化多肽是否还保留与人卵细胞作用的完全活性。

发明人的有关人和小鼠之间该蛋白的种间差异的细微的生物化学差别的知识提供了新的创制和使用糖基化的糖基化多肽诊断和治疗人受精的工具和技术。更具体地，与许多已知的看法不同，ZP3的一级序列决定了不同的糖基化，它和人卵细胞相关和独一无二的种特异性的和组织特异性的糖基化机制相结合，提供了独一无二的人卵母细胞糖基化类型。因此，本发明的一个方面是发现了当表达ZP3蛋白时，人卵细胞中的人特异的卵细胞糖基化确实有影响。本发明的另一方面是残基308-348的氨基酸序列是种特异性的而且指导人特异的卵母细胞糖基化。本发明的另一方面是本发明可以根据由特殊设计的算法所预测的特征来改变特定的序列，以便知道序列在序列中O-糖基化的可能性。

hZP3种特异性结合区的发现使改变模拟了hZP3的一或多种活性的糖基化多肽的效力成为可能。因此，本发明的另一方面是可以表达较小的糖基化多肽，该多肽包括小于400个氨基酸，而且由于有人功能化的糖基化类型的活性区而且具有人hZP3的结合能力(即带有适于与人精子作用的种特异性的类似于人的糖基)。本文特征描述和解释了可用的特定的类似人的糖基，例如。Clark等，《人类生殖》。11∶467-473(1996)；Clark等，《分子人类生殖》。2∶513-517(1996)；Patankar等，《分子人类生殖》。3∶501-505(1997)；和Ozgur等，《分子人类生殖》。4(4)∶318-324(1998)。

在有益的实施方案中，糖基化多肽为41-400个氨基酸长。当主要用于种特异性的结合反应时，该糖基化多肽应该更小，如41-300，50-200，50-150和甚至于是50-100个氨基酸长以便给给定量的物质提供更多的结合位点。更有利的结合反应是糖基化多肽与SEQ IDNO：1有54％，特别是大于75％，更特别是大于80％的序列一致性并且为41-65个氨基酸长。

有益地，糖基化通过在人细胞中(即表达人糖基化酶的细胞)特别是在人卵泡细胞系或卵巢细胞系如PA-1中表达而被实现。在其他的实施方案中，包含如SEQ ID NO：1的区域的糖基化多肽可小到41个氨基酸。但是，有益地，可通过SEQ ID NO：1所示的结合区的重复单位制备大到200，400或更多氨基酸的大的糖基化多肽。

在应用种特异区时，本发明人发现了3个参数。第一，含有种间信息的ZP3残基308-348和含有人ZP3残基308-348的核酸载体在制备有人特异性糖基化作用的多肽中特别有用。第二，SEQ ID NO：1的残基308-348与其他物种的ZP3不同，特别是在丝氨酸O-糖基化细胞机制的能力方面不同。第三，与N-糖基化不同，在该肽或包括该序列的肽中残基308-348羧基端丝氨酸的预测的O-糖基化类型极大地影响了多肽的实际糖基化。

本发明人在人ZP3序列中发现了极有可能被糖基化的丝氨酸344。相反地，来自其他物种的，例如小鼠的对应序列有明显不同的预测的O-糖基化可能性。例如，小鼠中类似的残基(丝氨酸345)预测的糖基化作用大大降低，而丝氨酸332则极有可能被糖基化。因此，所发现的技术可被用于区别和预测哪些序列和序列修饰可提供合适的将在人细胞特别是人卵巢细胞或卵泡细胞中被糖基化的人序列。图2和3示出了不同的预测的O-糖基化参数。从图中可以看到，相对于对应的阈值，有效值越高，氨基酸与N-乙酰半乳糖胺基转移酶反应的机会就越多。更具体地，“有效”值是对指定的残基是否O-糖基化的相对评价。“阈值”是与糖基化作用的机会反向相关的相对评价。

本发明人指出图2和3所示的结果是从其他非卵巢细胞系得到的蛋白的经验值和相对评价。该分析清楚的表明，根据其他系统中序列对糖基化作用的影响，人ZP3的残基308-348的糖基化主要指向位点344，而对应的小鼠序列的糖基化作用指向更靠近氨基端13个位点的丝氨酸残基。而且，改变人序列以使其去掉这种计算的O-糖基化偏差也将降低了糖基化多肽与人精子表明的亲和性。此处的分析对本发明中将涉及的其他序列也适用。特别是，可以在表1所列的位点进行氨基酸残基的替换，而替换保留了本发明的糖基化多肽的独特的人特异的糖基化作用。该表列出了代表性的根据该算法可以替代但又可以保持独特的人糖基化作用类型的氨基酸。

对大多数位点来说，例如位点326，可以进行保守的氨基酸替换。“保守的替换”是指用生物学上和／或化学上相似的一个氨基酸替换另一个氨基酸，例如用疏水的氨基酸替换疏水的氨基酸，用极性的氨基酸替换极性的氨基酸。替换包括例如：Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg和Phe，Tyr。优选地，该有意模拟SEQ ID NO：1肽的部分序列与SEQ ID NO：1的差别小于50％，除了可以在任一末端添加另外的氨基酸之外。

本领域的相当多的工作提供了用于此类改变的算法。例如，可以考虑亲水指数。如现有技术美国专利5703057，一般认为氨基酸疏水指数的重要性在于提供了蛋白质的相互作用生物功能。一般可以接受的是，氨基酸的相对疏水特征对得到的肽的二级结构起作用，结果是它可以限定肽和其他分子如受体，DNA，糖苷酶等的相互作用。根据其疏水特征和电荷特征每个氨基酸都有一个疏水指数，这些氨基酸的疏水指数是：异亮氨酸(+4．5)；缬氨酸(+4．2)；亮氨酸(+3．8)；苯丙氨酸(+2．8)；半胱氨酸／胱氨酸(+2．5)；甲硫氨酸(+1．9)；丙氨酸(+1．8)；甘氨酸(-0．4)；苏氨酸(-0．7)；丝氨酸(-0．8)；色氨酸(-0．9)；酪氨酸(-1．3)；脯氨酸(-1．6)；组氨酸(-3．2)；谷氨酸(-3．5)；谷氨酰胺(-3．5)；天冬氨酸(-3．5)；天冬酰胺(-3．5)；赖氨酸(-3．9)；精氨酸(-4．5)。

现有技术已知一些氨基酸可以被有相似疏水指数的氨基酸替换并且可以得到有相似生物活性的肽即仍可得到生物功能等价肽。在进行此类改变时，亲水指数在±2范围内的氨基酸替换是优选的；在±1范围内的氨基酸替换是更优选的；最优选的是在±0．5范围内的氨基酸替换。根据现有技术，应该理解可以根据亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。例如，美国专利4554101指出由邻近氨基酸的亲水性决定的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物特性相关。如美国专利4554101所详述的，氨基酸残基的亲水性值如下：精氨酸(+3．0)；赖氨酸(+3．0)；天冬氨酸(+3．0±1)；谷氨酸(+3．0±1)；丝氨酸(+0．3)；天冬酰胺(+0．2)；谷氨酰氨(+0．2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0．4)；脯氨酸(-0．5±1)；丙氨酸(-0．5)；组氨酸(-0．5)；半胱氨酸(-1．0)；甲硫氨酸(-1．3)；亮氨酸(-1．8)；异亮氨酸(-1．8)；酪氨酸(-2．3)；苯丙氨酸(-2．5)；色氨酸(-3．4)。

应该理解到氨基酸可以被有相似亲水指数的氨基酸替换并且可以得到生物功能等价肽。在进行此类改变时，亲水指数在±2范围内的氨基酸替换是优选的；在±1范围内的氨基酸替换是更优选的；最优选的是在±0．5范围内的氨基酸替换。如上所示，氨基酸替换通常是根据氨基酸侧链的相似性例如他们的疏水性，亲水性，电荷，大小等进行的。综合考虑了上述各种特征的典型替换是本领域熟知的，包括如下：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰氨和天冬酰氨；缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。在本案中，本发明人发现，作为表1的例外，SEQ ID NO：1中的丝氨酸由于参与了糖基化作用而不能被替换。

本发明上下文中所述的“生物功能”糖基化多肽或rhZP3指多肽(至少含308-348氨基酸和其功能衍生物)或ZP3(如果得到了完整的蛋白)在低于1μg／ml的浓度下结合精子并在结合约1小时内引发顶体反应。有益地，rhZP3在浓度低于0．1μg／ml时发生结合，更有益地，结合在0．01μg／ml-0．1μg／ml的浓度范围内发生结合。发生顶体反应的时间小于1小时或小于30分钟。这种ZP3蛋白与精子的结合是种特异的并可用于检测引起男性不育的精子缺陷。

本文所定义的“卵巢细胞系”指来自卵巢组织的人细胞系从而使该细胞系产生的糖基化多肽具有卵母细胞糖基化多肽特征的糖基。可用本领域技术人员熟知的多种技术中的任意已知比较卵母细胞样糖基化多肽糖基类型和非卵母细胞样糖基化多肽糖基类型。

上文中所用的比较糖基化多肽类型的方法包括例如Barbosa所述的检测HLA糖基化多肽糖基部分的变化的使用单克隆抗体的方法；使用寡核苷酸定向突变，基因转移技术(Barbosa等《实验医学杂志》。166∶1329-50(1987))和更新的生化方法直接测定糖基含量。

另一个可用于直接比较是否重组的糖基化多肽含有正确的糖基化类型的方法是确定该糖基化多肽可阻断精子在“半透明带测定”中与精子的结合。在正常的无糖基化多肽的条件下，精子可以和卵母细胞结合。但是，含有合适的卵母细胞糖基化作用的糖基化多肽与精子温育时，该糖基化多肽将首先和精子结合并阻断和精子的进一步的结合或与卵母细胞的反应。相反地，如果糖基化多肽缺少正确的糖基化类型，该糖基化多肽将不能阻断精子与卵母细胞的结合。

还有一个确定是否糖基化多肽具有正确的糖基化类型的方法是用肽N-糖基化酶F和O-糖基化酶去除糖基侧链然后与精子一起温育反应产物。如果糖基化多肽制品在消化前能而在消化后不能阻断精子和人卵母细胞的结合，那么未消化的制品具有正确的糖基化类型。

“重组的人透明带蛋白3”指包括至少部分hZP3基因并保留基本上所有的hZP3糖基化多肽活性的转基因蛋白(或在转基因控制元件控制之下的天然蛋白)。“基本上所有活性”指该当以低于约1μg／ml(例如1μg／ml)，更特别地是低于0．1μg／ml(例如0．1μg／ml)的浓度下于水溶液中共存小于1小时(例如1小时)，更特别地是小于30分钟(例如30分钟)的一段时间后，该蛋白表现出结合活性和刺激顶体反应的活性。

可用于完成hZP3转基因蛋白表达的DNA序列是本领域技术人员熟知的并衍生自424氨基酸序列的hZP3，参见Chamberlin and Dean，美国国家科学院院报。87∶6014-6018(1990)。可以用已知的方法以此序列转导卵巢细胞系细胞。通常，所用的DNA构建体在编码靶蛋白序列的结构基因的上游含有启动子序列。合适的启动子，例如美国专利5618698所述。根据该实施方案，rhZP3结构基因和控制该基因的调控元件都被转导进了宿主细胞。

根据本发明的另一实施方案，用包含启动子和同源DNA(不是完整的结构基因)转导卵巢细胞系细胞，其中的同源DNA可在细胞核与内源基因相连接和起作用(即表达或增加表达)。在该实施方案中，通过同源重组将包含调节序列，外显子和剪切供体序列的DNA导入到了细胞基因组的选定位点。该DNA的导入结果是产生了新的转录单位，其中调节序列，外显子和剪切供体位点有效地和内源基因相连接。

术语“有效地连接”指第一个序列被定位在足够靠近第二个序列的位点从而施加对第二个序列或受第二个序列控制的区域的影响。例如，调节序列可以有效地与启动子连接，从而该序列增强了启动子的转录力量。在这种情况下，调节序列一般在启动子的5’端。调节序列和启动子可以按顺序与基因有效地连接从而该基因将在通常位于基因的5’端的调节序列／启动子的联合控制进行表达。

在导入DNA后通常接着要对在目标位点接受了靶基因的细胞进行筛选。对可用的筛选方法的描述有，例如美国专利5641670和5272071。筛选技术的描述如Mansour等，《自然》。136∶348，349(1988)。筛选后，培养表达靶基因的细胞和收获表达的基因产物。

根据优选的实施方案，用于hZP3转基因表达的DNA序列编码较小的蛋白(多肽)(即小于25kDa的多肽，特别是小于10kDa的多肽，更特别是小于5kDa的多肽)。此类优选的蛋白质序列包含如SEQ IDNO：1所示的核心区。本发明人认识到SEQ ID NO：1是ZP3种间糖基化类型最重要的决定因素，一定量的含有该序列的小蛋白可特别有效地结合精子。SEQ ID NO：1与来自小鼠的对应序列有54％的同源性。“同源性”是指将两个序列进行比较时，54％的氨基酸是相同的。尽管有同源性，小鼠ZP3与人精子的结合能力很小，与人ZP3的亲和性相比，其亲和性小于1／10，更典型地小于1／100。术语“可以强烈地结合人精子”指结合是等摩尔量的小鼠的至少10倍(例如10倍)。在实践中，此类量的确定是通过在结合测定中温育不同浓度的物质和确定直接和间接的竞争结合而得到的。此类的结合测定的实例在本文的实施例中给出而且是本领域技术人员所熟知的。因此，与人ZP3有多达46％不同的肽序列所保留的残余的人精子结合活性仍大于等摩尔量的小鼠的ZP3的结合能力。因此，有一个实施方案的肽是与SEQ IDNO：1所示的人ZP3序列有大于46％的一致性。而且，优选地是任何来自该序列的衍生物被限定在位点3，8，13，16，17，19，21-23，25，27，28，30，32-35，38和39上可有变异(如图1所标定的)，而未标定的位点是保守的。

在另一实施方案中，该序列与图1所示的部分的羧基末端最后11个氨基酸一致。这是因为该序列中部的丝氨酸对人特异性的糖基化作用是特别重要的。

在另一个实施方案中，本发明是包括编码SEQ ID NO：1的DNA序列的核酸载体。有益地，此类载体是ZP3结合活性的基因序列的携带载体。在一个实施方案中，该载体包括残基308-348但缺少ZP3编码基因的其他部分。如本文的参考文献中所描述的，此类载体是本领域的技术人员已知的。根据最后一个实施方案，可以想到的是用于诊断的糖基化多肽和与影响精子结合和人受精的药物可以由包含残基308-348或编码SEQ ID NO：1的其他DNA的载体制备得到。

术语“rhZP3类似物”指具有上述所列的天然rhZP3的生化和生物学特征的突变体和化学变化衍生物。特别是，hZP3的序列的改变是本发明所能想到的。可通过改变编码该蛋白的DNA改变hZP3。优选地，如上所述，只用有相同或相似的特征的氨基酸进行保守氨基酸的改变，而糖基化识别位点没有被改变。

另外，其他的hZP3变异体和衍生物也可用于本发明。变异体包括了保留了精子结合能力及引发顶体反应的hZP3的类似物，同源物，衍生物，突变蛋白和模拟物。这些变异体及其片段可通过化学修饰，蛋白裂解酶消化或其组合方法直接从hZP3得到。另外，可通过基因工程改变非卵巢细胞系的蛋白糖基化作用机制使其模仿卵巢细胞的机制以便在非卵巢细胞中表达hZP3蛋白。

rhZP3的变异体及其片段(即类似物)也可由应用基因组或cDNA克隆技术的重组技术创制。可使用位点特异的和区域特异的突变技术。参见《现代分子生物学技术》。第1卷，第8章(Ausubel等编辑，J．Wiley&Sons 1989&Supp1．1990)；《蛋白质工程》(Oxender&FoxEds．A．Liss，Inc．1987)。另外，接头扫描和PCR介导的技术可以用于突变。参见，《PCR技术》(Erlich Ed．，Stochton Press 1989)；《当代分子生物学技术》，卷1§2，上文。在上述引文中《蛋白质工程》和《当代分子生物学技术》，卷1§2中公开了上述各种技术可以用于蛋白质测序，结构和模型构建。本文的一个优选的变异体是含有添加至氨基末端的6个组氨酸的424个氨基酸的hrZP3。添加的部分可以更方便地用Ni-NTA亲和树脂亲和纯化合成的蛋白质。

可用本领域技术人员已知的多种技术纯化由培养本发明的细胞所得到的重组hZP3蛋白。一个优选的方法是收集产生rhZP3蛋白的细胞培养基，然后通过亲和层析纯化该蛋白。优选用凝集素柱子，特别是麦胚凝集素柱子来作亲和层析。另外优选地，结合如上所示的含有多聚组氨酸部分的rhZP3类似物可以使用Ni-NTA亲和树脂以及在低pH下从该树脂洗脱该蛋白质。

本发明公开允许通过重组DNA方法大规模表达活性hZP3糖基化多肽。从而可用已知的重组方法获得分离形式的糖基化多肽。术语“分离的蛋白质”指纯化到一定程度使不含天然环境中发现的其他人蛋白质。优选分离的蛋白质是均一形式的，即是适于可以在例如AppliedBiosystems，Inc．的气相测序仪上测序的形式。在重组制备后获得此类均一形式的技术包括SDS-PAGE，等电聚焦，层析电泳，离子交换层析，凝胶排阻层析，亲和层析，免疫沉淀及其组合。

纯化指程度高于分离。“纯化的蛋白”指基本不含其他的物质，从而任何杂质都不会对蛋白质的生物特性有过度的影响或引起其他不利的后果。

本发明的纯化或部分纯化的蛋白可用于各种研究和临床目的。一个优选的用途是受精检测。在这种情况下，rhZP3与精子样品混合。重组的hZP3结合精子产生顶体反应以及检测该反应。可检测的与精子反应的比例的差异表明了男性不育和可育。来自可育男性的精子将比来自不育男性的精子以更高的速率成功地进行顶体反应。

在一优选的方法中，使来自患者供体的精液和已知有正常功能的精子在室温液化。选择各液体样品中的可以移动的精子，方法是将液体与缓冲蛋白溶液混合，离心，温育一段时间使精子泳动，然后去掉上部的液体。优选活性精子暴露于1-100ng／ml的rhZP3，更优选暴露于5-10ng／ml的rhZP3至少5分钟。过了这段时间后，用本领域技术人员已知的任何技术通过与对照精子对比确定患者精子的顶体反应状态。

对结合反应和顶体反应都进行检测以检测rhZP3的生物活性。对应结合检验，rhZP3被用于检测初始阶段精子和透明带的结合。在其他的实施方案中，可在溶液中或将rhZP3固定到固相支持物如Sephadex^TM或琼脂树脂上后对rhZP3和精子的结合直接进行检测。这些功能性检测评价了精子的结合能力，而且可以使用(a)rhZP3偶联珠(固相)或(b)使用作为ELISA类检测的一部分的不含rhZP3的溶液(液相)。在后一种情况，优选rhZP3被偶联到可以在测定中产生信号的其他部分上。来自男性不育个体的精子缺乏与ZP3结合能力不能结合到rhZP3上，从而可以被诊断和鉴定。

顶体反应检测典型地将男性不育原因和精子不能进行顶体反应联系起来，而顶体反应是精子穿入卵子的重要阶段。本文的一个优选实施方案是在用hrZP3处理后总细胞和顶体反应缺失细胞的不同的染色和视觉计数。如果患者的精子对用rhZP3处理有反应，则可确定患者的病因。例如，可以用本领域计数人员已知的免疫荧光计数进行检测。

在另一个实施方案中，本发明涉及转化的人卵巢细胞系，该细胞含有编码转染的ZP3的DNA。合适的细胞类型包括但不仅仅限于如下的细胞：EB2，(人卵巢细胞，ATCC)，CaoV-3，CaoV-4，OVCAR-3，SK-OV-3，SW 626(人卵巢癌，ATCC)。此类细胞的描述有如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)细胞系目录。将基因转入哺乳动物细胞产生“转染的”细胞系的方法在本领域中以有详细的描述。例如参见，Ausubel等的《现代分子生物学方法》9．5．1-9．5．6部分的“将DNA导入哺乳动物细胞”(John Wiley&Sons，Inc．1995)。

在更一个实施方案中，本发明提供了rhZP3在宫内受精疗法(“IUI”)中的“精子引发刺激剂”的治疗用途。在该方法中，应用泳动方法制备精子。本发明人还发现在泳动之前精子和rhZP3一起温育会刺激一些精子的顶体反应从而对精子样品表现出引发作用。该引发作用使处理过的精子可以与女性生殖道中的移动和顶体反应调节因子更有效地反应。

在该治疗实施方案中，将精子和以前剂量的rhZP3的温育可以产生中等程度的对顶体反应的刺激。本文中的中等刺激指反应刺激了给定样品中大约10-15％的精子。优选温育步骤为至少30分钟，以及后续有洗涤步骤和泳动步骤。

在另一个治疗用途中，rhZP3被用于在胞质内精子注射疗法(ICSI)之前刺激顶体反应。在该方法中应用rhZP3可通过例如，增加受精的成功率改善受精作用。优选地，在将精子导入卵子之前将rhZP3加入到精子液体中然后从悬浮液中洗去rhZP3。这种情况下，使用高浓度的rhZP3以确保最大比例的处理过的精子发生顶体反应。

本发明还以参考下面的实施例进一步进行了描述，但所示的实施例没有限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：hZP3 cDNA的反转录酶聚合酶链式反应

根据报道的hZP3序列设计了一对引物(引物A和B)。Chamberlinand Dean上文。引物A位于hZP3 cDNA 5’端的碱基8-29：5’-ACCATGGAGCTGAGCTATAGG-3’。引物B位于hZP3 cDNA 3’端的碱基1256-1282：5’-TTCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGATGATCGGAAGCAGACACAGGGTGGGAGGCAGT-3’。限制性位点XholⅠ处的序列(CTCGAG)和编码6个组氨酸的序列被添加到引物B的3’端以便将该cDNA亚克隆到表达载体中和从培养基中纯化hZP3。

从人卵巢细胞系分离了总RNA提取物。使用RT-PCR而且RT-PCR的使用是Perkin-Elmer Cetus(Foster City，CA)所描述的标准方法。通过PCR从卵巢mRNA扩增首链cDNA得到了包括带有6个组氨酸尾巴和XholⅠ限制性位点的全长的hZP3 cDNA的1315碱基对的DNA片段。

实施例2：将hZP3 cDNA亚克隆到pcDNA 3．1(+)表达载体中

用琼脂糖凝胶电泳分离实施例1的RT-PCR产物并在切下来1315碱基对的DNA产物后用Geneclean Ⅱ kit(BLO 101，Vista，CA)。纯化的RT-PCR DNA片段被插入哺乳动物表达载体pcDNA3．1(+)(Invitrogen，San Diego，CA)，其中该表达载体可以在哺乳动物细胞中表达高水平的重组蛋白而且含有可用于筛选的新霉素抗性基因。带有hZP3 cDNA的pcDNA 3．1(+)被转化进了大肠杆菌细胞中。通过限制性酶谱，Southern印迹分析和DNA测序对阳性克隆进行鉴定。

hZP3 cDNA的DNA序列分析揭示hZP3 cDNA序列与Chamberlinand Dean，美国国家科学院院报。87∶6014-6018(1990)中所公开的一致。为了确定是否hZP3 cDNA可被翻译成全长的重组hZP3，进行了体外翻译(Promega，Madison，WI)。体外翻译产物的SDS PAGE分析发现由hZP3 cDNA得到的产物仅仅是48kDa的蛋白质。该47kb被认为是代表了全长形式的重组hZP3。

实施例3：将rhZP3稳定导入PA-1细胞

通过磷酸钙方法将hZP3／pcDNA3．1(+)导入卵巢细胞系PA-1中。用200μM的新霉素(Sigma，St．Louis，MO)筛选稳定整合了外源基因的细胞。通过PCR和Sourthern印迹鉴定hZP3整合到了宿主细胞的基因组DNA中。在PCR分析中，用位于hZP3／pcDNA3．1(+)载体的特定引物(T7引物，Invitrogen)和位于hZP3 3’端的引物B鉴定hZP3／pcDNA3．1(+)构建体的整合。只在稳定转染的细胞得到了预期的产物而在未转染的PA-1细胞未得到预期的产物，这表明构建体被成功整合进了PA-1细胞的染色体。

通过RT-PCT和Western引迹分析检测重组hZP3的表达。用引物A和B对稳定转染的PA-1细胞和非转染的PA-1细胞的mRNA PCR分析发现只在稳定转染的细胞看到PCR扩增产物。收集这两组细胞的培养液，真空离心和SDS PAGE分析。将样品印迹到硝酸纤维素上并用可以识别hZP3保守区的兔多克隆抗体(Ab5a)进行杂交。只在转染的PA-1细胞和溶解的对照蛋白观察到杂交信号，这表明rhZP3表达自稳定转染的细胞。细胞被保存在液氮中。

实施例4：稳定转染的PA-1细胞的培养

从液氮中取出1ml保存的细胞样品，37℃溶解2分钟。将细胞悬浮在含10％FBS的MEM中1000×g离心5分钟。细胞沉淀重悬于10ml含10％FBS和200μM的新霉素的MEM中，然后在100mm培养板上培养。达到90％汇合后，用胰蛋白酶-EDTA〔Sigma，St．Louis，MO〕从培养板上取下细胞用不含血清的MEM洗涤。细胞沉淀重悬于60ml含10％FBS和200μM的新霉素的MEM中，然后在3个150mm培养板上培养。达到50％汇合后，将培养基由MEM／10％FBS换成不含蛋白的杂交瘤培养基。每24小时收集一次培养基并加入蛋白酶抑制剂(EDTA，亮抑蛋白酶肽，胃抑蛋白酶肽，PMSF)以防止蛋白降解。收集的培养基保存在-20℃备用。

实施例5：亲和层析纯化重组的hZP3

收集的培养基在37℃溶解并通过一个WGA亲和柱(2×4cm)纯化糖基化多肽。将培养基以每小时3个柱体积的速率通过2次后，用10mM PBS，0．15M NaCl，pH7．2-7．5洗WGA柱直到洗脱物在280nm的吸收值低于0．01。用含0．5M的N-乙酰-D-半乳糖胺的40mM的磷酸盐和0．15M NaCl在pH3．0-3．1进行洗脱。

在pH8．0，4℃将从WGA亲和柱部分纯化的蛋白对50mM磷酸钠，10mM咪唑和300mM NaCl透析过夜，然后以3-4个柱体积每小时上样到Ni-NTA柱(Qiagen，Valencia，CA)。用50mM的磷酸钠，300mM NaCl，10％甘油在pH7．8-8．0洗柱直到洗脱物在280nm的吸收值低于0．01。然后用200mM磷酸钠，300mM NaCl，pH6．6洗脱hZP3。洗脱的蛋白对10mM磷酸钠，pH7．5 4℃透析过夜。透析的蛋白以SDS PAGE和以hZP3抗体进行Western印迹分析。观察到了65-100kd的带，说明有hZP3同工型。

实施例6：纯化rhZP3至80％纯度

用琼脂糖麦胚凝集素(WGA)(Vectoe Laboratories，Inc．Burlingame，CA)层析作为第一步从细胞培养基分离糖基化多肽。用10倍树脂体积的WGA结合缓冲液(10mM PBS，pH7．4，0．15MNaCl)平衡琼脂糖麦胚凝集素。收集的上清在4℃冷室中以每小时3个树脂体积通过WGA树脂。用WGA结合缓冲液洗树脂直到280nm的吸收值小于0．01。以洗脱缓冲液A(10mM PBS，pH7．4，0．15MNaCl，500mM N-乙酰-D-半乳糖胺(Sigma))和缓冲液B(10mM PBS，pH7．4，0．15M NaCl，500mM N-乙酰-D-半乳糖胺)得到2个洗脱峰。从树脂洗脱糖基化多肽之后，用WGA结合缓冲液洗树脂直到流出液的280nm的吸收值小于0．01。洗脱的糖基化样品对Ni-NTA结合缓冲液(50mM PBS，pH8．0；300mM NaCl)透析以便进行Ni-NTA亲和层析。

用WGA亲和层析和Ni-NTA(亚硝基-三-乙酸)树脂(Qiagen)从细胞培养基中分离了，从糖基化级分中纯化了组氨酸标记的糖基化蛋白(rhZP3)。在蛋白的氨基或羧基端含1或多个6×组氨酸标记的蛋白和Ni-NTA树脂的亲和性(Kd=10¹³，pH8．0)远大于一般的抗体-抗原或酶-底物的亲和系数。2毫升的树脂被彻底悬浮然后用5个树脂体积的水洗。然后用10个树脂体积的Ni-NTA结合缓冲液平衡树脂。已对Ni-NTA结合缓冲液透析过的WGA分离的糖基化样品通过含1ml树脂的的平衡过的Ni-NTA柱。流速调整为3-4个树脂体积每小时。在将糖基化蛋白通过Ni-NTA柱后，用含Tween 20(Fisher)和2-巯基乙醇的10树脂体积的Ni-NTA结合缓冲液洗树脂柱，接着用Ni-NTA洗涤缓冲液(50mM PBS，pH6．6，300mM NaCl)洗涤直到流出液的280nm的吸收值小于0．01。用含40mM咪唑(Sigma)的Ni-NTA洗涤缓冲液从树脂中洗脱组氨酸标记糖基化蛋白。

Centricon 50滤液被用于从Ni-NTA纯化的糖基化蛋白样品去除共纯化的小于50kd的蛋白。通过对考马斯兰染色的蛋白电泳凝胶的密度扫描判断，rhZP3糖基化蛋白纯度为80％。

实施例7：精子生物活性的半透明带测定(HZA)

制备卵母细胞。人未成熟的卵母细胞(早前期Ⅰ)被保存在含有1．5M MgCl₂和加入了40mM Hepes缓冲液pH7．3和0．1％聚乙烯吡咯烷酮的高渗透压溶液中。卵母细胞可以在4℃下保存90天而不影响HZA测定。在切卵之前，用Ham’s F-10(Gibco Laboratories，GrandIsland，N．Y．)洗涤。将接到相差倒置显微镜(Nikon Diaphot，GardenCity，N．Y．)上的Narishige显微操作仪(Tokyo，Japan)将卵母细胞切为两半，成为半透明带。

制备精子并暴露于30ng／ml的rhZP3。用含5％人血清白蛋白(HSA)的2倍体积的Ham’s F-10洗涤精液的等分级分。人精子悬浮液在400×g离心8分钟。重复这种洗涤。最后的沉淀用500μl Ham’sF-10／5％HAS覆盖并在37℃ 5％ CO₂的条件下培养1小时。然后去掉HAS精子悬浮液并将其分为2份。一部分用作对照精子(4小时，5％CO₂，37℃)。第二部分在相同的条件下培养，但加入了30ng／ml的rhZP3。去掉含可移动的精子的上清并每一部分的100μl的小滴分别加入到浸入到矿物油中的培养皿中。

将精子和半透明带进行培养。一个半透明带被转入到对照滴中而其相对的半透明带被放入到rhZP3处理的滴中。将配子在5％ CO₂，37℃培养4小时。用培养基冲洗半透明带，用拉的很细的玻璃移液管将粘连而非结合的精子去掉。

结果。用相差显微镜在200倍放大倍数下，数出与每个半透明带的突出表面紧密结合的精子数。对每个样品，计算“半透明带指数”，即rhZP3处理的精子的结合数对未处理的对照精子的结合数的百分比。来自不育患者的缺陷精子的半透明度指数比正常精子的低从而可以通过这种方法在临床上检测到。

实施例8：顶体反应的免疫荧光测定

从正常供体得到精液并在室温液化30-60分钟。将精液分成0．5ml的等分级分并放到15ml的塑料管的底部。每个等分级分都用2个体积的补充有5％人血清白蛋白的Ham’s F-10洗涤。精子悬浮液在400×g离心8小时。重复一次该洗涤。最后的沉淀用500μl Ham’sF-10／5％HSA覆盖。试管松松地盖上，以30°的角度在37℃，5％ CO₂下放置1小时，使精子泳动到培养基中。

用异硫氰酸荧光素偶联的豌豆(Pisum Satvum)凝集素(PSA，Vector Lab，Burlingame，CA)标记的探针以评价点滴状载玻片上的精子顶体反应的状况。同一块载玻片用Hochest复染，该染料可以进入死的精子的核膜，产生复染的荧光。在400倍的放大倍数下用落射式荧光显微镜读取载玻片。每个测定作3张载玻片。在10个随机的区域的视野中至少数100个细胞。分配两个训练过的技术人员读取结果，进行平均。结果以顶体反应的精子数占总计数的百分比表示。用实施例4的含hZP3的细胞培养基处理的精子比用对照培养基(无hZP3)处理的精子更显著地发生顶体反应。

本文引用的所有公开(包括互联网站点)和授权专利被明确地全文引入作为参考。

      表1位点号    优选的    其它代表性氨基酸    氨基酸310       phe       tyr315       pro320       gln       asp323       asn       gln324       lys326       asp       asn，glu，gln，ile，pro，phe，cys328       gly       ala，ile329       thr       ser330       pro332       his       lys334       arg       lys335       arg       lys337       pro       met339       val       iso，met341       ser       thr342       gln       asn345       arg       lys

Claims (21)

1．约65kd-100kd的纯化的重组糖基化多肽，包括按重量计大约40％到60％的，并且能与人精子强烈结合并引发精子顶体反应。

2．权利要求1的糖蛋白，其中的糖蛋白由人卵巢细胞系产生。

3．生产具hZP3生物活性的糖基化多肽的方法，包括下列步骤：

(a)用编码包括SEQ ID NO：1多肽的多核苷酸来转导来自人卵巢细胞系的细胞；

(b)建立稳定转染的细胞培养物用于生产糖基化多肽；

(c)从细胞培养物中分离糖基化多肽。

4．权利要求3的方法，其中的卵巢细胞系是PA-1。

5．权利要求3的方法，其中的多核苷酸编码包含hZP3序列的多肽。

6．一种糖基化多肽，含有41个到400个氨基酸并有能优先与人精子结合的活性部分，其中活性部分包括与SEQ ID NO：1有54％以上的序列同源性的氨基酸序列，并在距离活性部分的羧基端的5个位点的丝氨酸上有预测的O-糖基化位点。

7．权利要求6的糖基化多肽，其活性部分的氨基酸序列与SEQ IDNO：175％以上一致。

8．权利要求6的糖基化多肽，含有41个到300个氨基酸。

9．权利要求6的糖基化多肽，含有41个到200个氨基酸。

10．权利要求6的糖基化多肽，含有41个到100个氨基酸。

11．权利要求6的糖基化多肽，含有41个到65个氨基酸。

12．根据人精子样品检测男性不育的方法，包括下列步骤：

(a)将约65kd到100kd的纯化的重组糖基化多肽与样品精子接触形成混合物，其中的糖基化多肽包含大约50％糖并且能与人精子强烈结合并引发顶体反应；

(b)在此混合物中检测精子的生物活性；

(c)与参考值比较得出生物活性。

13．权利要求12的方法，其中步骤b还包括加入豌豆凝集素到混合物中。

14．权利要求12的方法，其中重组糖基化多肽被固定于固相上。

15．权利要求12的方法，其中重组糖基化多肽是由人卵巢细胞系表达制备的。

16．权利要求12的方法，其中人卵巢细胞系是PA-1。

17．可用于产生小于300个氨基酸的糖基化多肽的核酸，其中该糖基化多肽特异性地与人精子结合，并且该载体所编码的活性氨基酸序列部分与SEQ ID NO：1有54％以上的一致性。

18．权利要求17的载体，其中的活性的氨基酸序列部位与SEQ IDNO：1有75％以上的一致性。

19．权利要求17的载体，其中的活性氨基酸序列部分与SEQ IDNO：1有100％的一致性。

20．人卵巢细胞，含有可用来产生一个少于300个氨基酸的糖基化多肽的核酸载体，其中的糖基化多肽能与人精子强烈结合，而且该载体所编码的氨基酸序列的一部分与SEQ ID NO：1有75％以上的一致性。

21．权利要求20的人细胞，其中的氨基酸序列部分与SEQ ID NO：1一致。

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