CN110170044A - Tat-tdrg1在制备治疗弱精子症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于制备治疗弱精子症的重组蛋白，属于生物医学和分子诊断技术领域。该重组蛋白为TAT‑TDRG1。TDRG1在弱精子症的精子中表达水平显著下调，而TAT‑TDRG1重组蛋白可以显著提高弱精子症患者精子中的TDRG1含量，从而有效改善弱精子症精子的前向运动率，可作为一种治疗弱精子症的药物。

Description

TAT-TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学和分子诊断技术领域，具体涉及穿膜肽TAT-TDRG1融合蛋白的制备及成为治疗弱精子症药物中的应用。

背景技术

当今，不孕不育症已成为全世界范围内的健康和社会问题，其中男性因素约占50％，且呈上升趋势。弱精子症(asthenospermia)是男性不育的主要病因之一。根据世界卫生组织规定，精液参数中前向运动精子比率小于32％的病症为弱精子症。引起精子活力低下的原因很多，包括外部环境、自身缺陷和遗传等因素，但弱精子症具体发病机制不明，严重阻碍了弱精子症临床诊断和治疗的进展，且尚未有治疗弱精子症的特效药。研究表明睾丸特异性蛋白含量下降或功能异常与弱精子症有关，改善弱精子症精子中这些相关蛋白含量和功能可能是治疗弱精子症的可行之法。然而，成熟精子是基因表达沉默的特化细胞，很难通过传统的分子生物学方法来调控基因表达。因此，通过穿膜肽将重组蛋白直接导入患者精子可能为弱精子症治疗提供新思路。但目前还未有通过穿膜肽导入重组蛋白改善人精子运动的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TAT-TDRG1重组蛋白，该重组蛋白能够穿过精子细胞膜，提高弱精子症患者的精子前向运动率，可以作为一种治疗弱精子症药物。

在弱精子症导致的不育症患者的精子中，其TDRG1表达水平显著下调，因而，可以通过检测TDRG1表达水平，来诊断患者是否患有不育症。采用TAT-TDRG1重组蛋白，利用TAT的穿膜能力以及对细胞无毒性影响的特点，将原本无法在非通透性的人精子膜中的表达的TDRG1蛋白携带并导入进人精子中，可显著恢复弱精子症患者的精子中的TDRG1表达水平，改善弱精子症病人前向运动率。

用于将外源蛋白导入人精子的穿膜肽为1型人免疫缺陷病毒转录激活因子TAT，氨基酸序列为：YGRKKRRQRRR；导入精子外源重组蛋白为TDRG1(Testis development-relatedprotein 1)，Uniprot序列号为Q3Y452，含有100个氨基酸，预测分子量为11KDa，氨基酸序列为：

所述的TAT-TDRG1重组蛋白的制备，包括如下步骤：

(1)构建pET28a-TAT-EGFP重组质粒；

(2)TAT-EGFP在大肠杆菌中的表达和纯化；

(3)TAT穿膜效应验证；

(4)TAT融合蛋白对精子的影响；

(5)构建pET28a-TAT-TDRG1重组质粒；

(6)TAT-TDRG1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化；

上述制得的TAT-TDRG1融合蛋白导入人精子，对人精子前向运动率的有显著提高。

本发明的有益效果在于：通过实验表明，本发明提供的TAT-TDRG1重组蛋白能显著提高弱精子症患者精子中的TDRG1含量，从而有效改善弱精子症精子前向运动率，为弱精子症的治疗提供了一个新的药物选择。同时，该TAT-TDRG1重组蛋白制备成本低，对于辅助生殖和精子运动改善药物的应用具有良好前景。

附图说明

图1：PCR产物及回收产物电泳图(A)、表达载体及PCR产物双酶切回收产物电泳图(B)。

图A中Lane 1和2：TAT-EGFP PCR产物；Lane 3和4：TAT-EGFP PCR回收产物；LaneM：D2000DNA ladder。

图B中Lane 1和2：TAT-EGFP PCR产物双酶切回收产物；Lane M1：D2000 DNAladder；Lane 3：pET28a双酶切回收产物；Lane M2：1kb DNA ladder。

图2：PCR产物及回收产物电泳图(A)、表达载体及PCR产物双酶切回收产物电泳图(B)。

图A中Lane 1：TDRG1 PCR产物；Lane 2：TDRG1 PCR回收产物；Lane M：D2000 DNAladder。图B中Lane 1：TDRG1 PCR产物双酶切；Lane 2：pET28a-TAT-EGFP双酶切；Lane 3：TDRG1 PCR产物双酶切回收产物；Lane 4：pET28a-TAT-EGFP双酶切回收线性载体；Lane M1：D2000DNA ladder；Lane M2；1kb DNA ladder。

图3：菌检PCR电泳图(A)、部分测序后比对图(B)。图A中1、3、4、5、6、10、12、13、15为阳性克隆)；Lane M：D2000DNA ladder；图B为阳性克隆提取质粒测序后序列比对结果。

图4：菌检PCR电泳图(A)、测序比对图(B)。图A中Lane 1-7：TAT-TDRG1菌检；LaneM：D2000 DNA ladder；(2为阴性，余为阳性)。图B是阳性克隆质粒抽提送测序后部分比对结果。

图5：融合蛋白诱导表达后电泳图(A)、融合蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后电泳图(B)。

图A中Lane 1～6：转化pET-TAT-EGFP质粒，加0.5mMIPTG诱导，随机挑取的6个克隆(均出现大小正确的表达条带)；Lane 4和8：负对照，转化pET-TAT-EGFP质粒、未加IPTG诱导；Lane M：Fermentas Prestained Protein Molecular Weight Marker。图B中Lane1和2：纯化的EGFP-TAT；Lane 3-6：商业化BSA，浓度分别为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml和0.8mg/ml；Lane M：Fermentas Prestained Protein Molecular Weight Marker。

图6：不同浓度融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT与精子孵育不同时间的穿膜效果图。

图7：融合蛋白的表达纯化和穿膜验证。A：构建的TAT-TDRG1原核表达在体在细菌中的表达情况，1表示未诱导，2诱导后的总蛋白，3诱导后细菌裂解沉淀(包涵体)，4诱导后细菌裂解上清。结果表明，TAT-TDRG1在细菌中过量表达，造成其主要在包涵体中，因此，需要进行复性实验。5-7表明复性后的进一步纯化结果，7中纯化到了纯度大于90％以上的可溶的TAT-TDRG1。B：不同浓度的重组TAT-TDRG1与正常人精子孵育2小时后，wash，提蛋白，分别用flag tag抗体(检测外源导入的TDRG1)和TDRG1抗体(总TDRG1)进行Western blot，结果表明80ug/ml的TAT-FLAG-TDRG1具有最适的导入效果。

图8：导入外源重组蛋白TAT-TDRG1精子活力变化统计图。A是总的52例样本总体结果，B是27例正常精子样本结果，C是25例弱精症样本结果，结果表明TAT-TDRG1导入精子后不仅能增加正常人的PR值(增加约10％)，而且能显著增加弱精的PR(40％)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步地说明。

实施例1 TAT-EGFP及TAT-TDRG1融合蛋白的制备

1、重组质粒pET28a-TAT-EGFP及pET28a-TAT-TDRG1的构建

1.1 EGFP基因的钓取

1.1.1引物设计(引物设计序列详见表)

pET28a-TAT-EGFP重组质粒的构建：根据载体pET28的特性和EGFP基因序列情况，我们设计引物EGFPN上游5′端，依次分别加入了保护碱基GGG、NdeI酶切位点(CATATG)、TAT序列和BamHI酶切位点(GGATCC)。

表1：pET28a-TAT-EGFP重组质粒的引物设计序列

*：引物融合NdeI(CATATG)酶切位点、XhoI(CTCGAG)酶切位点、BamHI(GGATCC)酶切位点，酶切位点增加3个保护碱基。在引物上游融合TAT穿膜肽或下游引物融合TAT穿膜肽，形成TAT-EGFP和EGFP-TAT。

**：TAT穿膜肽(YGRKKRRQRRR)：TACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGC

pET28a-TAT-TDRG1重组质粒的构建：根据TDRG1基因序列和质粒pET28a-TAT-EGFP特性，设计上游引物融合酶切位点BamHI(GGATCC)，下游融合XhoI(CTCGAG)酶切位点，酶切位点增加3个保护碱基，克隆至pET28a-TAT-EGFP。

表2：pET28a-TAT-TDRG1重组质粒引物设计序列

*：TAT-TDRG1上游引物融合酶切位点BamHI(GGATCC)，下游融合XhoI(CTCGAG)酶切位点，酶切位点增加3个保护碱基，克隆至pET28a-TAT-EGFP。

**：TAT穿膜肽(YGRKKRRQRRR)：TACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGC来自于pET28a-TAT-EGFP载体。

1.1.2建立PCR反应体系

pET28a-TAT-EGFP及pET28a-TAT-TDRG1分别以pEGFP-N1、pYD5-TDRG1载体为模板，各自添加对应的上下游引物，特异性扩增出TAT-EGFP、TDRG1N片段。反应体系如下表3：

表3：PCR反应体系

反应条件：95℃5min预变性。95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，25循环；72℃7min延伸。

1.1.3点样检测、切胶回收扩增产物后再检测

上述扩增产物分别在1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，按照Axygen凝胶回收试剂盒说明书中的详细步骤切胶回收目的条带，回收的产物最后在1.2％的琼脂糖凝胶上样电泳检测。电泳结果如图1、2所示。

1.2酶切载体和PCR产物连接

(1)pET28a-TAT-EGFP为例：

回收扩增产物进行NdeI和XhoI双酶切后，通过跑胶检测，再切胶回收得到目的条带，同时将载体pET28a进行同样条件下的双酶切后，通过跑胶检测，再切胶回收。电泳结果如图1所示。

酶切反应体系如下：

反应条件：37℃60min，70℃10min热失活。

注：重组质粒pET28a-TAT-EGFP的具体酶切位点详见引物设计表。

pET28a-TAT-EGFP：将已酶切好的TAT-EGFP、线性载体pET28a在T4连接酶作用下进行连接，再把连接产物转化入感受态细胞TOP10，挑选阳性克隆培养，最后行菌落PCR检测(pET28a-TAT-EGFP菌检引物用载体为T7)并送测序，测序结果比对无误后，抽提质粒放入-80℃冰箱保存。结果见图3。

(2)pET28a-TAT-TDRG1酶切及连接：

以pET28a-TAT-EGFP和TDRG1克隆产物为模板，加入内切酶BamHI和XhoI按照酶切操作说明书建立20μL体系，反应结束后产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，再行凝胶切胶回收，回收产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图2所示。

将己酶切好的线性载体pET28a和PCR产物在T4连接酶作用下进行连接。

连接体系：

反应条件：22℃120min。反应结束后把连接产物放入4℃保存备用。

酶切后连接的产物转化入感受态细胞TOP10，挑选阳性克隆培养，最后行菌落PCR检测(pET28a-TAT-TDRG1菌检引物用载体为T7-F、T7-R)并送测序，测序结果比对无误后，抽提质粒放入-80℃冰箱保存。结果见图4。

菌检引物用载体通用引物

上述实验中，PCR扩增产物通过跑胶检查显示：其大小约为776bp，与预期结果相符。切胶回收PCR扩增产物(见图1A)。回收的扩增产物和pET28a载体行NdeI和XhoI双酶切跑胶检查后再切胶回收，回收产物跑胶结果证实切胶回收成功(见图1B)。双酶切后的线性化pET28a质粒和扩增产物在连接酶作用下连接后转化TOP10感受态细菌，挑取平板上阳性单菌落、摇菌后行菌液PCR(见图3A)。阳性克隆提取质粒测序证实所插入基因片段无突变，与GenBank中序列一致(见图3B)。结果证实重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT构建成功。

以pYD5-TDRG1载体为模板，我们按照需求合理设计引物，PCR特异性扩增出TDRG1N目的片段，片段大小约为344bp，与预期结果相符，跑胶、切胶回收备用(见图2A)。根据引物设计和质粒pET28a-TAT-EGFP特性，选择内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。图2B中可见1泳道为TDRG1N酶切产物，大小约为340bp。2泳道为pET28a-TAT-EGFP酶切产物，有两条条带，约为5.4kb和770bp，与实际相符。按照Axygen凝胶回收试剂盒的操作步骤对pET28a-TAT-EGFP酶切后的线性载体和酶切后的PCR产物TDRG1N进行切胶回收，回收产物在在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，其大小均和预期相符(详见图2B)，回收成功。

在连接酶作用下，将双酶切后的pET28a线性载体和PCR产物连接，并转化TOP10感受态细菌，挑取平板上阳性单菌落、摇菌后行菌液PCR(见图4A)。阳性克隆提取质粒测序证实所插入基因片段无突变，与GenBank中序列一致(见图4B)。结果证实重组质粒pET28a-TAT-TDRG1构建成功。

2、TAT-EGFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

重组质粒pET28a-TAT-EGFP转化到大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入含4mlLB试管中，37℃、220rpm振荡培养，并保存菌种(8％的甘油菌)。待细菌菌浓度至OD600＝0.6时，添加IPTG诱导，终浓度为0.5mM，继续培养4h后，6000rpm离心5min收集上述细菌，用400ul的PBS重悬菌体沉淀，6000rpm离心5min。

选取高表达的阳性克隆子大量表达融合蛋白TAT-EGFP，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，可见一条相对分子质量约为32kD的强表达带，与预期相符合(见图5A)。用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白TAT-EGFP，取样品跑SDS-PAGE胶(见图5B)，通过ImageJ图像分析软件分析，其纯度93.2％(±3.5％)。根据牛血清白蛋白制备标准曲线，求得标准曲线回归方程为Y＝0.0226X+0.0194，根据纯化蛋白溶液测得的平均吸光度值计算出纯化TAT-EGFP浓度为0.35±0.03mg/ml。

实施例2

TAT-EGFP融合蛋白的穿细胞膜作用

收集正常人成熟精子，离心，用PBS重悬，洗涤3次，最后用HTF液重悬沉淀。将融合蛋白TAT-EGFP纯化后无菌过滤，调整浓度为1μmol/L、5μmol/L，加入已处理好的正常人成熟精子中，设空白、EGFP对照，放入CO₂培养箱中孵育1h和2h，取出后PBS清洗3次，置于荧光显微镜下观察。结果如图6所示。不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP加入精子中，孵育1h和2h，在荧光显微镜下观察到精子呈现出清晰明亮的绿色荧光蛋白，而EGFP对照组和空白对照组精子中均未见荧光(见图4)。孵育不同时间组内和组间比较差异也无统计学意义，孵育不同浓度组内和组间比较差异无统计学意义(见表4)，即孵育时间越长并未增加穿膜效率；浓度越高，穿膜效率无明显增强。

表4：不同浓度的融合蛋白与正常精子孵育不同时间穿膜效率的比较(％)

TAT-EGFP融合蛋白对精子存活率及各项运动参数的影响

加入TAT-EGFP使终浓度分别为1μmol/L和5μmol/L，设置空白、EGFP对照，放入CO₂培养箱中孵育2h。利用CASA检测加入融合蛋白TAT-EGFP后精子运动参数的变化情况；同时按照伊红染色试剂盒说明书检测加入融合蛋白TAT-EGFP后对精子存活率的影响。结果见表5。不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP与正常人成熟精子作用2h后精子各项运动参数比较差异无统计学意义(见表5)。融合蛋白TAT-EGFP在一定范围浓度里对正常人成熟精子无明显影响。

表5：不同浓度融合蛋白与正常人成熟精子作用后各项运动参数检测结果

实施例3

TAT-TDRG1融合蛋白的表达纯化和穿膜效果的检测

重组质粒pET28a-TAT-TDRG1分别转化到大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入含4ml LB试管中，37℃、220rpm振荡培养，并保存菌种(8％的甘油菌)。待细菌菌浓度至OD600＝0.6时，添加IPTG诱导，终浓度为0.5mM，继续培养4h后，6000rpm离心5min收集上述细菌，用400ul的PBS重悬菌体沉淀，6000rpm离心5min。

选取高表达的阳性克隆子大量表达融合蛋白TAT-TDRG1，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，可见一条相对分子质量约为18kD的强表达带，与预期相符合(见图7A)。用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白TAT-TDRG1，取样品跑SDS-PAGE胶(见图7A)。

我们把制备好的不同浓度的重组TAT-TDRG1与正常人精子孵育2小时后通过Western blot检测，结果显示：穿膜肽TAT能顺利把外源的TDRG1导入精子内，且浓度为80μg/ml的TAT-TDRG1具有最适的导入效果(详见图7B)。

TAT-TDRG1融合蛋白明显提升弱精症精子的前向运动率

精子是一特化细胞，不能传代培养，TDRG1是灵长类睾丸特异蛋白，因此无法建立动物在体试验体系。我们只能采用直接添加外源重组蛋白模拟表达模式(例如恢复表达或者过表达模式)进行干预，上述实验中，我们证实利用穿膜肽TAT能将外源重组蛋白TDRG1导入精子中。正是基于这些因素，为了进一步验证TDRG1与精子运动之间的关系，在前述已收集的52例精子样本中我们拟通过以下实验方案进行进一步验证：25例弱精症样本中外源添加TAT-TDRG1融合蛋白，恢复TDRG1功能后，比较添加融合蛋白前后间精子活力(精子前向运动率，PR)的变化情况，正面来评价TDRG1蛋白在弱精症精子中的功能；在27例正常样本中外源添加TAT-TDRG1融合蛋白，模拟TDRG1过表达，比较添加融合蛋白前后精子活力(精子前向运动率)的变化情况来评价TDRG1蛋白在人成熟精子中的功能；两组实验中均设立添加TAT-flag作为阴性对照。结果如图8所示。

实验结果显示：52例样本中添加外源重组蛋白TAT-TDRG1后精子活力总体有升高趋势，但添加TAT-flag组精子活力无明显升高(见图8A)，把正常组和弱精组单独分析，结果表明TAT-TDRG1导入精子后不仅能增加正常人的PR值(增加约10％)(见图8B)；更重要的是，TAT-TDRG1融合蛋白能将弱精症精子的前向运动率提升40％(见图8C)。

序列表

<110> 江西省妇幼保健院

<120> TAT-TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Arg Arg Glu Ala Val Cys Ala His Arg His Phe Leu Gly Thr

1 5 10 15

Gly Lys Pro Pro His Pro Leu Gly Arg Ser Ile Pro Val Glu Pro Cys

20 25 30

Pro Gly Leu Pro Ala Phe Ala Glu Val Asp Leu Leu Ser Leu Leu Val

35 40 45

Pro Ile Lys Ile Ser Ser Thr Pro Pro Ser Gly Ser Arg Leu Asp Pro

50 55 60

Gln Ile Ala Ser Ser Ala Phe Pro Gly Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln

65 70 75 80

Asp Ser Ser Gly Ser Leu Val Gln Arg Ala Ser Cys Glu Leu Glu Ser

85 90 95

Pro Tyr Glu Leu

100

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

Claims (1)

1.TAT-TDRG1在制备治疗弱精子症药物中的应用，其特征在于：该TAT-TDRG1重组蛋白应用于治疗弱精子症药物中的应用。