CN103254315A

CN103254315A - 一种重组tat-manf融合蛋白及其应用

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Publication number: CN103254315A
Application number: CN2013101561136A
Authority: CN
Inventors: 房健民; 郭佳; 李晨
Original assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Current assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及一种重组TAT-MANF融合蛋白及其应用，其序列包括位于氨基末端的TAT序列和位于羧基末端的MANF序列。重组TAT-MANF融合蛋白用于神经系统疾病。融合蛋白能跨过细胞膜进入细胞中，可以通过血脑屏障,同时具有神经细胞保护作用，可以用于减缓帕金森症相关神经元病变。

Description

一种重组TAT-MANF融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于融合蛋白及其构建方法与应用领域，特别涉及一种重组TAT-MANF融合蛋白及其应用。

背景技术

帕金森病（Parkinson disease,PD）是一种常见于中老年的神经变性疾病，其主要病理改变为黑质致密部的多巴胺能神经元的进行性死亡导致纹状体内神经递质多巴胺的耗竭。正常人黑质致密部中大约有50万个特化的多巴胺能神经细胞，当多巴胺能神经支配被破坏75-80%时，会出现帕金森病的症状。临床表现为震颤、强直、姿势不稳和运动不能/徐缓。我国PD患者已高达300万人，目前PD的治疗仍以药物对症治疗为主，可暂时改善患者的生活质量，但并不能减慢或阻止疾病的进展。如何降低神经功能受损程度，促进多巴胺神经元存活或重建多巴胺能神经系统正常功能对患者及其家庭、社会有重要意义。

目前，在动物模型中显示出促进多巴胺神经元存活的主要有神经营养因子家族，主要包括脑源性神经营养因子（Brain derived neurophic factor,BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF）。其中GDNF已经进入临床研究阶段，但其Ⅱ期临床双盲试验的有效率并不明显，还出现血清反应和小脑损伤等一系列严重的副反应（Lang et al.,2006；Peterson and Nutt.,2008；Hovland et al.,2010）。更为重要的是GDNF是一种不能穿过血脑屏障的大分子，使其临床应用价值受到质疑。

中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(Mesencephalic astrocyte derived neurotrophicfactor,MANF）属于神经营养因子家族，于2003年首次在体外传代培养的大鼠中脑I型星形胶质细胞的培养基中分离的一种能促进体外多巴胺能神经元存活的神经营养因子，分子量为18KD（Petrova et al.,2003）。同GDNF一样，MANF也具有促进多巴胺神经元存活的作用，研究发现MANF基因缺失的果蝇会因多巴胺能神经元数量和多巴胺水平的减少而死亡，给予人源性MANF可发挥替代功能（Palgi et al.,2009）。在大鼠中风模型中，MANF可保护大脑皮层神经元（Airavaara et al.,2010）。在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的大鼠帕金森模型中，通过纹状体内注射MANF不但能保护中脑多巴胺神经元和纹状体多巴胺神经纤维，而且能加强存活神经元的功能、修复受损的黑质-纹状体多巴胺系统，减少帕金森大鼠的运动障碍，具有预防和治疗的双重潜在作用（Lindholm et al.,2007;Lindholm and Saarma.,2010）。同时，研究还证明与GDNF和BDNF相比，MANF对细胞外基质亲和力低，扩散范围较大；选择性作用于多巴胺神经元，对周围运动、感觉神经元和交感神经元无影响，副作用小；在低、中药物浓度时的选择性较GDNF和BDNF高。因此，MANF作为一种强效神经保护因子，被认为是治疗某些中枢神经系统疾病的潜在候选因子，有较大的应用前景。但尚未有分子生物学方法获得能通过血脑屏障的神经营养因子MANF，并将其用于帕金森病等中枢神经系统损伤和退化性疾病治疗的报道。

蛋白质由于分子量较大，无法透过血脑屏障。血脑屏障主要由血管内皮细胞和脑组织的星状胶质细胞的足突组成，内皮细胞间的紧密连接和缺乏内吞囊泡的特点，可限制血液和脑组织之间物质的自由交换（Bickel et al.,2001）。正常情况下血脑屏障只能透过6个氨基酸以下的多肽性物质。因此，有治疗作用的蛋白质、多肽和很多化学药物很难进入脑组织发挥作用。研究发现，某些富含精氨酸和赖氨酸的特殊多肽与靶蛋白相连后，靶蛋白会被多肽一起带进细胞中，发挥应有的生物学功能。这些能携带外源蛋白进入细胞的多肽称蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)。

人类免疫缺陷病毒的转录反式激活因子(trans-activator of transcription,TAT)的47-57位氨基酸(YGRKKRRQRRR)是功能较强蛋白转导结构域。研究表明，TAT-PTD能够将与之共价连接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)转导入细胞内部，此过程能在无脂质体、磷酸钙、病毒载体等条件下直接透过细胞膜甚至血脑屏障，被转运如细胞内的外源蛋白保留原有的生物活性与功能，且对宿主细胞几乎没有毒性。利用该方法已经高效地将EGFP、β-半乳糖苷酶、insulin等多种蛋白质带到细胞中，甚至穿过血脑屏障。目前最常用的蛋白转导结构域共价偶连方法是将目的基因与蛋白转导结构域基因相融合，最后产生赋予了新的转导能力的融合蛋白

融合蛋白是将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物。融合蛋白因其在目的蛋白的构建、表达具有双功能的目的蛋白等研究方面有具有不可替代的作用，在医药、农业、环境等的生产、研究中有着重要的用途。特别是融合蛋白药物的出现解决了单一蛋白的使用的缺点和问题，使得融合蛋白药物的研究不但深入。

重组DNA技术（recombinant DNA technique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。因此它不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组TAT-MANF融合蛋白及其应用，该重组TAT-MANF融合蛋白具有跨过细胞膜进入细胞中，并发挥很好的神经细胞保护作用，可以减缓帕金森症相关神经元病变，是一种成药性好的新型生物技术药物。

本发明的一种重组TAT-MANF融合蛋白，是由人类免疫缺陷病毒反式激活转导蛋白TAT的蛋白转导结构域修饰MANF形成的融合蛋白，其序列包括位于氨基末端的TAT序列和位于羧基末端的MANF序列。TAT序列如SEQ ID NO:1所示，或者是该序列的变体或截短的序列。所述MANF序列如SEQ ID NO:2所示，或者是该序列的变体或截短的序列。

本发明提供的这种融合蛋白由TAT蛋白转导结构域和MANF组成，本发明专利申请将该融合蛋白称为TAT-MANF融合蛋白。

重组TAT-MANF融合蛋白包含两个功能区，每个功能区的功能如下：TAT蛋白转导结构域是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，主要功能是引导重组TAT-MANF融合蛋白穿透细胞膜。MANF主要功能是促进多巴胺神经元存活或重建多巴胺能神经系统正常功能，由于帕金森综合症和多巴胺神经元损伤密切相关，本发明重组TAT-MANF融合蛋白可以用于帕金森综合症的治疗。

为了纯化方便，在TAT-MANF融合蛋白的羧基末端可以加上His标签或其他标签。

所述编码重组TAT-MANF融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述重组TAT-MANF融合蛋白一共有170个氨基酸，其中1-12位氨基酸是TAT蛋白转导结构域，13-170位氨基酸是MANF蛋白。

本发明的一种重组TAT-MANF融合蛋白的构建方法，包括以下步骤：

1.扩增人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（MANF）基因

根据GenBank上登陆的人MANF的基因序列设计并合成PCR引物P1和P2，并在上、下游引物上分别添加TAT序列和His标签及限制性酶切位点NdeI和BamHI。

P1:5’-GGAATTCCATATGTACGGCCGGAAGAAGCGGCGGCAGCGGCGCCGGCTGCGGCCGGGCGACT-3’；

P2:5’-CGGGATCCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCAAATCGGTCCGTGCACTG-3’。

扩增产物连接到克隆载体PCR-blunt中初步测序鉴定序列正确，用限制性内切酶NdeI和BamHI切割阳性克隆子及原核表达载体中（比如Novagen公司的pET系列载体），构建成pET22b-TAT-MANF，上含有重组TAT-MANF基因，经过测序验证，序列正确。

2.融合蛋白表达载体在大肠杆菌中的表达

用构建的载体pET22b-TAT-MANF重组质粒转化大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21（DE3），在诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的诱导下可以高水平的生产融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析证实，融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达。

3.融合蛋白纯化

上述诱导表达的菌液经过超声破碎后，4℃下12000rpm离心20min，表达产物存在于上清液中，经过组氨酸标签融合蛋白质纯化树脂Talon Metal Affinity Resin纯化，获得纯化后的融合蛋白，其纯度大于90%。用免疫细胞荧光激光共聚焦显微镜检测融合蛋白具有穿过脑血管内皮细胞B-Endo3细胞膜的活性。以上结果表明，本发明提供的质粒pET22b-TAT-MANF表达重组TAT-MANF的能力强，产生的TAT-MANF融合蛋白具有穿过脑血管内皮细胞B-Endo3细胞膜的特点。本发明的内容具有可重复性，普通技术人员按照本发明提供的步骤，可以构建该质粒。

本发明的一种TAT-MANF融合蛋白在制备治疗神经系统重大疾病药物中的应用。

所述的神经系统重大疾病为帕金森综合症、阿尔兹海默综合症、缺血性脑损伤、脑中风或血管性痴呆。

有益效果

本发明具有跨过细胞膜进入细胞中，并发挥很好的神经细胞保护作用，可以减缓帕金森症相关神经元病变，是一种成药性好的新型生物技术候选药物；构建方法简单，成本低，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳鉴定TAT-MANF基因PCR产物电泳图，其中泳道A为DL1000Marker；泳道B泳道为目的基因条带531bp；

图2为克隆产物blunt-TAT-MANF菌液PCR电泳图，其中M为DL1000Marker；泳道1-5为挑取的5个阳性克隆PCR产物；

图3为pET22b-TAT-MANF构建后对携带的TAT-MANF的测序结果；

图4为纯化后重组TAT-MANF融合蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝结果，其中M为蛋白相对分子质量标准；泳道1为40mM咪唑洗脱；泳道2为70mM咪唑洗脱；泳道3为100mM咪唑洗脱；泳道4为130mM咪唑洗脱；泳道5为150mM咪唑洗脱；泳道6为IPTG诱导后总蛋白；

图5A为脑血管内皮细胞B-Endo3，B为重组TAT-MANF融合蛋白穿过细胞膜进入脑血管内皮细胞B-Endo3中。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

重组TAT-MANF融合蛋白表达载体的构建

（1）人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子MANF的克隆：

含有人MANF基因的Blunt-MANF载体通过Invitrogen公司测序鉴定，测序结果与GenBank上登陆的人MANF基因一致，表明此质粒可用于扩增MANF基因。根据GenBank上登陆的人MANF的基因序列设计并合成PCR引物P1和P2（上海Invitrogen公司合成），并在上、下游引物上分别添加TAT序列和His标签及合适的限制性酶切位点。以Blunt-MANF为模板，用设计合成的P1和P2引物扩增得到约531bp的目的片段。

PCR反应体系

试剂名称	体积（μl）
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		10×buffer	10
d NTP(10mM)	1
		模板DNA	<50ng
NEB高保真酶	0.5
		dd H₂O	加水至50μl

PCR反应条件：预变性98℃，3min；变性98℃5-10s，退火56℃30s，延伸72℃1min，循环30次；延伸72℃10min，反应结束。

（2）分离纯化TAT-MANF基因片段

PCR反应结束后，将上述PCR产物通过核酸电泳鉴定，用割胶回收试剂盒回收特异性条带，获得纯化的TAT-MANF，通过Eppendorf核酸蛋白测定仪检测其浓度，-20保存备用。

（3）克隆质粒Blunt-TAT-MANF的构建

纯化后的TAT-MANF PCR产物与PCR-Blunt克隆载体平末端连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基上培养过夜，通过菌液PCR初步鉴定阳性克隆，阳性克隆命名为Blunt-TAT-MANF，将Blunt-TAT-MANF重组质粒进行测序鉴定。

（4）pET22b-TAT-MANF原核表达载体构建

将构建成功Blunt-TAT-MANF和pET22b分别用NdeI和BamHI双酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，并分别回收531bp的TAT-MANF片段和线性化的pET22b片段，两者在T4连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基上培养过夜，通过菌液PCR初步鉴定阳性克隆，阳性克隆命名为pET22b-TAT-MANF，将pET22b-TAT-MANF重组质粒进行测序鉴定，证实所构建的片段即为TAT-MANF的编码基因。

实施例2

重组TAT-MANF融合蛋白表达载体的表达、鉴定及纯化

（1）重组TAT-MANF融合蛋白基因在BL21(DE3)表达菌株中的整合及诱导表达

用构建的载体pET22b-TAT-MANF重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，涂布于含氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃培养箱中过夜培养(12-16h)。挑取单菌落至100mL含氨苄青霉素的液体LB培养基中，待OD值到达0.6-1.0时(约3-5h)，温度降至16℃预培养1h后，加入IPTG使终浓度为0.2-1.6mM，16℃诱导培养过夜（16-18h）。4℃8000rpm，离心5min收集菌体，0.2M PBS洗涤1-3次。

（2）重组TAT-MANF融合蛋白的纯化及鉴定

上述诱导表达的菌液中加入裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。经超声破碎后，4℃12000rpm离心20min，融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。将上清转入组氨酸标签融合蛋白质纯化树脂Talon Metal Affinity Resin中（Takara公司），按照Takara公司Talon Metal Affinity Resin说明书加Wash buffer洗去未结合的蛋白。分别用含有40mM、70mM咪唑的梯度wash buffer过柱，洗除结合在柱上的杂蛋白，最后用Elutionbuffer洗脱目的蛋白。纯化后液体经SDS-PAGE检验，分子量大小约为20.657KD，与计算值相符，获得融合蛋白纯度大于90%。纯化后的蛋白存放在-80℃冰箱中，经蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ.NO.1所示。

实施例3

免疫细胞荧光激光共聚焦显微镜检测重组TAT-MANF融合蛋白转导功能

脑血管内皮细胞是血脑屏障的组成成分之一，我们首先用脑血管内皮细胞B-Endo3来检测TAT-MANF是否能穿过细胞膜进入细胞中。将5×10⁵B-Endo3细胞接种到6孔培养板中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2，37℃培养。待细胞贴壁后，加入1μg/mL FITC荧光标记后的融合蛋白TAT-MANF，每隔2h，1×PBS洗3遍，激光共聚焦显微镜(Zeiss，S100 microscope)下观察并拍照。

本发明将FITC荧光标记后的融合蛋白TAT-MANF加入到培养的脑血管内皮细胞B-Endo3，孵育6h后，免疫荧光检测显示有明亮的绿色。融合蛋白TAT-MANF可穿越细胞膜。

Claims

1.一种重组TAT-MANF融合蛋白，其特征在于：其序列包括位于氨基末端的TAT序列紧接着MANF序列。

2.根据权利要求1所述的一种重组TAT-MANF融合蛋白，其特征在于：所述TAT序列如SEQ ID NO:1所示，或者是该序列的变体或截短的序列。

3.根据权利要求1所述的一种重组TAT-MANF融合蛋白，其特征在于：所述MANF序列如SEQ ID NO:2所示，或者是该序列的变体或截短的序列。

4.根据权利要求1所述的一种重组TAT-MANF融合蛋白，其特征在于：所述重组TAT-MANF融合蛋白一共有170个氨基酸，如SEQ ID NO:3所示，其中1-12位氨基酸是TAT蛋白转导结构域，13-170位氨基酸是MANF蛋白。

5.根据权利要求1所述的一种重组TAT-MANF融合蛋白，其特征在于：所述编码重组TAT-MANF融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.编码有权利要求1-5任一所述的重组TAT-MANF融合蛋白的DNA的质粒。

7.编码有权利要求1-5任一所述的重组TAT-MANF融合蛋白的表达，包括在原核和真核细胞的表达。

8.一种如权利要求1所述的重组TAT-MANF融合蛋白的应用，其特征在于：用于神经系统疾病。

9.根据权利要求8所述的一种重组TAT-MANF融合蛋白的应用，其特征在于：所述的神经系统重大疾病为帕金森综合症、阿尔兹海默综合症、缺血性脑损伤、脑中风或血管性痴呆。