CN107530399A - 治疗分子在体外和体内的有效递送 - Google Patents

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Abstract

一种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的一种或多种蛋白或肽的嵌合分子。通过将这些分子包封到阳离子脂质或阳离子脂质体中可获得有效的体外和体内递送。处理方法包括这些分子向特定治疗靶点的细胞内递送。

Description

治疗分子在体外和体内的有效递送
发明领域
本发明涉及包括基因编辑的蛋白疗法。实施例涉及与阴离子分子融合的用于蛋白递送的阳离子脂质试剂。这些阴离子分子包括含有天然阴离子区域或与阴离子核酸天然结合的寡核苷酸、多聚核苷酸、超负电荷蛋白。
背景技术
包括肽类激素、细胞激素和单克隆抗体的治疗性蛋白作为研究工具已经获得广泛成功，并且是最快成长的几类药物之一。在过去的二十年中，已经发现或改造了许多强有力的和潜在的治疗性蛋白，包括能够代谢互补的酶(Hartung，S.D.等Gene.Mol.Ther.9，866-875(2004))、针对细胞内靶点的中和抗体(Wang，J.等，Nat.Biotechnol.26，901-908(2008))、改造的转录因子(Urnov，F.D.等，Nat.Rev.Genet.11，636-646(2010))，以及可编程的基因编辑酶(Sander，J.D.&Joung，J.K.Nat.Biotechnol.32，347-355(2014)；Gaj，T.等TrendsBiotechnol.31，397-405(2013))。尽管已经证明蛋白生物学对细胞外靶点有效，但是使用它们对付细胞内靶点是相对未开发的，这是由于大部分蛋白不能自发进入哺乳动物细胞。使得外源蛋白能够到达细胞内靶点最常通过通过化学转染(Midoux，P.等Br.J.Pharmacol.157，166-178(2009))、电穿孔(Bodles-Brakhop，A.M.等Mol.Ther.17，585-592(2009))、或病毒递送(Kay，M.A.等，Nat.Med.7，33-40(2001))递送它们的编码DNA序列来实现。但是，将外源DNA引入细胞内增加了永久性重组到基因组中、潜在的内源基因破坏、以及长期暴露于编码后的试剂的可能性。对于一些研究或治疗应用，包括试图实现基因组DNA的一次性永久修饰的基因组编辑应用。
最近开发的在体外递送转录的mRNA或mRNA类似物的方法为DNA递送提供了一个替代选择，不需要编码基因的核转运，并且会大大降低基因组插入外来核酸的可能性。尽管大有前景，但是mRNA递送仍然面临包括免疫抗原性和RNA稳定性在内的挑战。尽管包含化学修饰和碱基类似物可解决这些问题中的一部分，但是大规模生产高质量修饰的mRNA仍然是一个挑战(Zangi，L.等，Nat.Biotechnol.31，898-907(2013))。另外，含有重要的天然的或合成的转译后修饰物的蛋白可能不适合通过内源转译机械进行生产。因此，尽管DNA和mRNA两者的递送都已经成为具有治疗隐含意义的强有力的研究工具，但是开发有效和通用的蛋白递送方法对于分子生命科学仍然是一个重要挑战。
现有或常规蛋白递送技术基于会促进内吞作用的与阳离子分子的融合或共轭，例如未结构化的肽(Wadia，J.S.等，Nat.Med.10，310-315(2004)；Daniels，D.S.&Schepartz，A.J.Am.Chem.Soc.129，14578-14579(2007))或改造的超正电荷蛋白(Cronican，J.J.等ACSChem.Biol.5，747-752(2010)；Thompson，D.B.等Methods Enzymol.503，293-319(2012)；Thompson，D.B.等Chem.Biol.19，831-843(2012))。尽管此类递送在细胞培养中可以是有效的，并且甚至在体内已经显示一些成功，但是基于阳离子蛋白的递送方法尚未见到被广泛使用。未保护的蛋白可被细胞外和核内体蛋白酶迅速降解(Heitz，F.等Br.J.Pharmacol.157，195-206(2009))，或通过与血清蛋白、血液细胞、以及细胞外基质结合被中和(Caron，N.J.等Mol.Ther.J.Am.Soc.GeneTher.3，310-318(2001)；Chesnoy，S.&Huang，L.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29，27-47(2000))。另外，核内体逃逸的低效和溶酶体降解的避免是所有内吞蛋白递送策略的主要挑战，这可由对核内体改变(Thompson，D.B.等Chem.Biol.19，831-843(2012)；Al-Taei，S.等Bioconjug.Chem.17，90-100(2006))和失稳策略(Shete，H.K.，J.Nanosci.Nanotechnol.14，460-474(2014))的持续关注证明。已经证明在体内这些挑战尤其困难(Aguilera，T.A.等Integr.Biol.Quant.Biosci.Nano Macro1，371-381(2009))。
在过去的二十年间，核酸递送极大地受益于脂质体试剂的开发。阳离子脂质制剂使得DNA和RNA转染变成基础研究中的常规技术，并且甚至用于临床试验中(Coelho，T.等N.Engl.J.Med.369，819-829(2013))。The载体的脂质双层可保护包封的核酸不被降解，并且可防止被抗体中和(Judge，A.D.等Mol.Ther.J.Am.Soc.基因Ther。13，494-505(2006))。重要的是，在核内体的成熟过程中脂质体与核内体膜的融合使得阳离子脂质递送的物质从核内体的有效逃逸成为可能(Basha，G.等Mol.Ther.J.Am.Soc.基因Ther.19，2186-2200(2011))。更先进的可逆可离子化的脂质纳米颗粒使得核酸的有效包封和递送成为可能，同时避免非特定的静电作用和封存(Semple，S.C.等，Nat.Biotechnol.28，172-176(2010))。
由于与核酸相比蛋白是化学多样性的，没有占支配地位的静电特性，所以没有脂质制剂有可能驱使所有蛋白有效递送到哺乳动物细胞中。尽管蛋白可被非特异性包封并可通过再水合的脂质进行体外递送(Boeckle，S.等J.Control.ReleaseOff.J.Control.ReleaseSoc.112，240-248(2006)；Allen，T.M.&Cullis，P.R.Adv.DrugDeliv.Rev.65，36-48(2013))，但是包封功效取决于蛋白浓度，通常效率较低(Zelphati，O.等J.Biol.Chem.276，35103-35110(2001))，并且尚未看到广泛应用。为蛋白递送特别开发的专业商用试剂(Adrian，J.E.等J.Control.ReleaseOff.J.Control.ReleaseSoc.144，341-349(2010)；Morris，M.C，等，Nat.Biotechnol.19，1173-1176(2001))也未能获得普及，这可能是由于对于广泛的蛋白物质它们的低效和不可靠性(Colletier，J.-P.等BMCBiotechnol.2，9(2002))。
发明内容
本发明实施例涉及包含治疗有效的带阴离子电荷的分子的组合物以及用于它们有效和特定的体外和体内递送的组合物。
在一些实施例中，组合物包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质，所述嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的一种或多种蛋白或肽。在一些实施例中，组合物包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质，所述嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。这些一种或多种阴离子分子为嵌合分子赋予总体净负电荷，并且包含一个或多个阴离子区域，或者与阴离子核酸区域结合。在一些实施例中，阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、干涉RNA、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
在实施例中，一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。在一些实施例中，蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子或其组合。在一些实施例中，基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
在其它实施例中，治疗方法包含施用治疗有效量的包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质，所述嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的一种或多种蛋白或肽。
其它方面在以下进行描述。
附图说明
图1A、1B是通过与聚阴离子大分子融合或非共价复合以及与阳离子脂质复合将蛋白递送到哺乳动物细胞内的策略的实施例的图示。(图1A)重组酶、类转录激活物效应物(TALE)蛋白和Cas9核酸内切酶与核酸结合并且是天然阳离子(理论净电荷显示为黑色)并且未与阳离子脂质有效复合。但是，通过与像(-30)GFP这样的超负电荷蛋白融合或通过与聚阴离子核酸复合，这些蛋白可被赋予高度阴离子性。(图1B)可以预见，通常用来转染DNA和RNA的阳离子脂质会与所得高度阴离子性蛋白或蛋白:核酸复合物复合，介导它们向哺乳动物细胞中的递送。
图2A-2F显示Cre重组酶向培养的人细胞的递送。图2A是显示高度阳离子(+36)GFP或高度阴离子性(-30)GFP与Cre重组酶融合的图示。使用了HeLa报告细胞系，在Cre-介导的重组时表达DsRed，以评估Cre递送效率。图2B是显示经10nM(-30)GFP-Cre和阳离子脂质RNAiMAX处理的HeLadsRed细胞的扫描图片。在含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中温育48小时后使细胞可见。图2C是显示在10％FBS培养基或无血清培养基中递送(+36)GFP-Cre以及在具有或不具有阳离子脂质RNAiMAX(0.8μL)的情况下在全血清培养基中递送(-30)GFP-Cre的曲线图。图2D是显示48h后阳离子脂质剂量对功能性(-30)GFP-Cre递送功效的作用的曲线图。图2E是显示几种可商购的阳离子脂质和聚合物对于(-30)dGFP-Cre功能性递送功效的对比的曲线图。图2F是显示融合于Cre的多种阴离子肽或蛋白序列的RNAiMAX介导的递送的曲线图。VP64激活域和3xFLAG标签的理论净电荷分别是-22和-7。所有实验在48-孔板形式中使用具有10％FBS且无抗生素的275μL DMEM进行。误差条反映来自在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图3A、3B显示TALE转录激活物向培养的人细胞中的递送。图3A是显示18.5个重复的TALE激活物的设计的图示，所述TALE激活物的C-端融合于VP64激活域，N-端融合于(-30)GFP和NLS。融合物的总体理论净电荷是-43。图3B是显示NTF3转录的激活的曲线图，所述激活通过编码靶向NTF3基因中的位点的TALE-VP64激活物的质粒的常规转染或通过RNAiMAX阳离子脂质介导的相应N7F3-靶向性(-30)GFP-TALE-VP64蛋白的递送完成。针对蛋白递送实验，在收获之前25nM VEGFTALE、25n MNTF3TALE1、或25nM NTF3TALE1-5(每个5nM)与无抗生素的275μL DMEM-FBS中的1.5μL RNAiMAX一起递送4小时。对于质粒转染，总共700ng的1个或所有5个NTF3TALE表达质粒(每个140ng)用0.8μL脂质体2000转染，并且48小时后被收获。收获的细胞的基因表达水平通过qRT-PCR测量并相对于GAPDH表达水平标准化。TALE通过质粒转染和蛋白递送的激活物温育时间是可给出NTF3mRNA水平最大增加的那些。误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图4A-4E显示Cas9:sgRNA、Cas9D10A切口酶和dCas9-VP64转录激活物递送到培养的人细胞。图4A是显示使用分别具有250nM或100nMEGFP sgRNA的100nM的(-30)dGFP-Cas9或常规Cas9蛋白以及0.8μL RNAiMAX将与靶向EGFP的sgRNA或FEGF-靶向性sgRNA复合的Cas9蛋白变体向U2OS EGFP报告细胞的阳离子脂质介导的递送的曲线图。使用0.8μL脂质体2000将结果与Cas9和sgRNA表达质粒的标准转染结果比较。图4B是显示使用T7核酸内切酶I(T7EI)分析测量来自以下处理的EGFP修饰的结果的印迹：无处理(第1道)，仅用靶向EGFP的sgRNA处理(第2道)，仅Cas9蛋白(第3道)，Cas9蛋白+FEGF-靶向性sgRNA+RNAiMAX(第4道)，转染表达Cas9和靶向EGFP的sgRNA的质粒(第5道)，或Cas9蛋白+靶向EGFP的sgRNA+RNAiMAX(第6道)。图4C是显示在EGFP和3种内源基因处基因组修饰的Τ7ΕΙ分析的结果的印迹，每个处理之后，与4种sgRNA和RNAiMAX复合的Cas9的单递送进行48小时。通过密度测定法计算的插入缺失效率显示于凝胶图像的下方。图4D是显示在图4A中所述的条件下通过质粒转染或通过RNAiMAX-介导的蛋白:sgRNA复合物递送将Cas9D10A切口酶和sgRNA对递送的曲线图。预期破坏EGFP的sgRNAGFPg1+GFPg5或GFPg3+GFPg7会导致基因破坏，而GFPg5+GFPg7靶向同一链，因此预期是非功能性的。图4Ε是显示通过质粒转染或RNAiMAX-介导的蛋白递送将靶向NTF3的催化性死亡的(dCas9)-VP64转录激活物递送的曲线图。VEGFg3和VEGFg5sgRNA两者的递送充当NTF3基因激活的阴性对照。所有实验在48-孔形式中使用无抗生素的275μL DMEM-FBS进行。误差条反映在不同日进行的6个生物学复制品的标准偏差。
图5A-5D显示通过质粒转染或通过阳离子脂质介导的蛋白:sgRNA递送使用用于靶向每个目标基因的与100nM Cas9和100nM sgRNA复合的1.6μL RNAiMAX在培养的人细胞中进行Cas9-介导的内源基因切割的DNA序列特异性。图5A是T7EI分析的印迹，所述T7EI分析用于在HEK293T细胞中内源CLTA、EMX和VEGF基因的在靶修饰。图5B、5C和5D是显示对于质粒转染或阳离子脂质介导的蛋白:sgRNA递送，来自Cas9:sgRNA的在靶:脱靶DNA修饰比例的曲线图。调整每次处理的条件以产生～10％的在靶切割，从而实现在在靶基因修饰效率可比的条件下两种递送方法之间的DNA切割特异性的对比。单一生物学复制品的P值列于表2中。每个在靶和脱靶样品测序一次，每个在靶样品有>10,000个分析的序列，每个脱靶样品有>111,000个分析的序列(表2)。所有蛋白:sgRNA递送和质粒转染在24-孔形式中使用无抗生素的550μL DMEM-FBS中的1.6μL RNAiMAX进行。误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图6A-6D显示Cre重组酶和Cas9:sgRNA复合物向在小鼠内耳中毛细胞的体内递送。图6A：将P0floxP-tdTomato小鼠(n＝4)的中阶(蜗管)用0.3μL50％RNAiMAX中的23μΜ(-30)GFP-Cre或仅用RNAiMAX(对照)注射。5天后，使用免疫组织学使得指示Cre-介导的重组的tdTomato表达可视化。红色＝tdTomato，绿色＝Myo7a；白色＝Sox2；蓝色＝DAPI。黄色括弧表示外毛细胞(OHC)区域。图6B：(-30)GFP-Cre递送10天后，存在tdTomato阳性外毛细胞的完整的表达espin(Esp)的纤毛(箭头)，类似于对照耳蜗中的纤毛。红色＝tdTomato，绿色＝Esp；白色＝Sox2；蓝色＝DAPI。图6C：与图6A等同，除了使用脂质体2000而不是RNAiMAX。(n＝4)。上小图和下小图分别是小鼠耳蜗在低放大倍数和高放大倍数下的图像，详细显示了递送效率，以及对耳蜗结构和毛细胞损失的影响。图6D：P2Atohl-GFP小鼠(n＝3)的中阶(蜗管)用0.3μL 50％RNAiMAX中的33μΜCas9、33μΜEGFP sgRNA或脂质体2000未稀释的商用溶液注射。当10天后被可视化后，Cas9-介导的基因破坏会导致GFP表达的损失。上小图仅显示GFP信号，而下小图则包括另外的免疫组织学标记。下小图中的黄框强调损失GFP表达的毛细胞。与图6C相比，在Cas9+RNAiMax或Cas9+脂质体2000递送组中未观察到明显的OHC损失。红色＝tdTomato，绿色＝Myo7a；白色/浅蓝色＝Sox2；蓝色＝DAPI。所有显示为白色的标度条都是10μm。
图7A-7D显示阳离子脂质介导的Cre递送的优化和与使用(+36)GFP-Cre和质粒转染的递送的对比。图7A是显示(-30)GFP-Cre在BSR-TdTomato细胞中的递送的优化的曲线图，所述BSR-TdTomato细胞是用于测量Cre重组效率的第二个报告细胞系。图7B是显示通过改变质粒剂量和脂质体2000剂量并测量被FACS转染48小时后DsRed萤光细胞的存在对在HeLaDsRed报告细胞中Cre表达质粒转染进行优化的曲线图。基于这些结果，选择500ng的Cre表达质粒用于使用275μL无抗生素的DMEM-FBS的48-孔形式实验。图7C是显示RNAiMAX剂量对在HeLadsRed报告细胞中(-30)GFP-Cre重组效率的影响和通过FACS使用TO-PRO-3存活/死亡染料(生命技术技术(Life Technologies))测量的相应毒性的曲线图。图7D是显示脂质体2000剂量对转染的Cre质粒DsRed重组效率的影响以及通过FACS使用TO-PRO-3存活/死亡染料测量的相应毒性的曲线图。对于图7A-7D，误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图8A-8D是显示与超正电荷阳离子蛋白递送相比通过阳离子脂质介导的递送的蛋白摄取的曲线图。图8A：来自用PBS+肝素(20U/mL)洗涤细胞除去未结合的蛋白后用(-30)GFP-Cre和RNAiMAX或(+36)GFP-Cre处理的细胞的GFP荧光的定量。图8B：相对于由与(+36)GFP融合产生的Cre重组酶递送效率，(-30)GFP-Cre+1.5μL RNAiMAX的功能性Cre重组酶递送效率。图8C：通过用PBS+肝素处理和洗涤细胞48小时后测量总细胞群体的平均mCherry荧光对比通过(-30)GFP-融合+1.5μΜRNAiMAX的处理的mCherry摄取与(+36)GFP融合的mCherry摄取。图8D：在存在或不存在RNAiMAX的情况下(-30)GFP-Cre或(+36)GFP-Cre的总细胞GFP荧光。所示数据反映单一生物学复制品。
图9A、9B是显示设计成靶向NTF3基因的TALE激活物的递送优化以及观察到的基因激活的时间进程的曲线图。图9A：将HEK293T细胞通过转染用NTF3TALE质粒处理，或者通过NTF3TALE蛋白的脂质体递送处理。细胞在对两种处理经验上确定的最佳温育时间后被收获，并通过qRT-PCR分析NTF3的mRNA水平。图9B：对于蛋白递送和质粒转染，TALE激活的时间进程，通过测量NTF3的mRNA水平然后将每个方法相对于各方法在任何时间点获得的最高激活值标准化。选取最佳蛋白(25-50nM)和脂质剂量(1.5μL RNAiMAX)来对比图3B中的两种递送技术。所有蛋白递送和转染实验均在具有275μL无抗生素的DMEM-FBS的48-孔板中改进行。误差条反映在不同日进行的6个生物学复制品的标准偏差。
图10A-10D显示通过递送Cas9:sgRNA并通过流式细胞仪分析得到的EGFP报告基因的基因破坏频率。图10A是U2OS细胞中EGFP被NHEJ破坏的简图，所述破坏由Cas9双链断裂引起。图10B：使用RNAiMAX与质粒转染阳性对照(桔色)一起对与(-30)dGFP-Cas9复合的靶向EGFP的sgRNA或脱靶sgRNA的递送。图10C：通过用TO-PRO-3存活/死亡染料(LifeTechnologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德)处理样品并通过流式细胞仪分析所得细胞确认EGFP荧光的破坏不是细胞毒性的结果。图10D：通过添加细胞渗透性但非完全膜裂解性的去污剂(0.5％Tween)测试TO-PRO-3染色。
图11A、11B显示Cas9质粒转染条件的优化和在不同剂量的脂质体2000下细胞毒性的测量。图11A是显示在U2OS EGFP报告细胞系中优化Cas9表达质粒的转染效率的曲线图，所述优化通过改变Cas9质粒的量和脂质体2000的剂量进行。对于所有处理，输入的sgRNA表达质粒保持恒定在250ng输入的DNA。所有处理在具有275μL无抗生素的DMEM-FBS的48-孔板中进行。48小时后，通过FACS对细胞分析eGFP损失。图11B是使用TO-PRO-3存活/死亡染料测量48小时后各种Cas9质粒/脂质体2000转染条件的毒性并通过FACS对细胞毒性进行定量的曲线图。从图11A和11B，750ng的Cas9质粒剂量和0.8μL的脂质体2000剂量被选为质粒转染条件，在本工作的剩余研究中该条件引起了最大的基因破坏。对于图11A和11B，误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图12A-12D是显示优化Cas9:sgRNA功能性递送的曲线图。图12A：两种测试的结构体阳离子脂质介导的递送效率，其显示，在低的蛋白和sgRNA浓度下，与天然Cas9相比更多的阴离子(-30)dGFP-NLS-Cas9会促进更有效的递送。图12B：(-30)dGFP-NLS-Cas9的递送优化作为蛋白和sgRNA浓度的函数。图12C：没有任何融合或标签的Cas9蛋白的递送作为蛋白和sgRNA浓度的函数。图12D：对于RNAiMAX-介导的(-30)dGFP-NLS-Cas9和天然Cas9的递送，sgRNA与蛋白的最佳比例。所有实验在48-孔板中使用体积为275μL的无抗生素的DMEM-FBS进行，并且通过FACS测量EGFP基因破坏。对于图12A-12C，误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图13A-13C是显示NLS和/或(-30)dGFP对功能性Cas9递送的影响作为sgRNA和Cas9两者浓度的函数的曲线图。在3个固定的sgRNA浓度下测量U2OS EGFP报告细胞系中的EGFP基因破坏：图13A：10nM，图13B：25nM，图13C：50nM，以及曲线图中所示的不同蛋白浓度。递送使用0.8μL RNAiMAX在48-孔形式中使用275μL无抗生素的DMEM-FBS进行，并在48小时后通过FACS分析eGFP荧光信号的丢失。对于图13A-13C，误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图14A-14D是显示RNAiMAX和脂质体2000对Cas9:sgRNA递送效率和细胞毒性的影响的曲线图。图14A：在经0.8μL RNAiMAX或0.8μL脂质体2000处理的U2OS EGFP报告细胞中在不同的Cas9蛋白浓度和100nM恒定剂量的EGFP sgRNA下的EGFP基因破坏。16小时后，除去培养基并向细胞添加新鲜的培养基，直到蛋白递送处理48小时后的分析终点。通过FACS使用TO-PRO-3存活/死亡染料测定活细胞群体。图14B：Cas9:sgRNA递送到U2OS细胞的毒性概况作为脂质体2000剂量的函数。图14C：U2OS细胞的毒性概况作为RNAiMAX剂量的函数。图14D：使用1:1蛋白:sgRNA的递送条件在RNAiMAX或脂质体2000的最佳剂量下通过TO-PRO-3存活/死亡染料和FACS进行宽范围的Cas9:sgRNA处理的细胞毒性。RNAiMAX和脂质体2000的剂量在48-孔板形式中在275μL的体积中都是0.8μL。对于图14A-14D，误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图15A、15B是显示在蛋白和sgRNA的不同浓度下靶向NTF3基因的dCas9-VP64递送的优化的曲线图。图15A：使用在48-孔板形式中的275μL无抗生素的DMEM-FBS中的0.8μLRNAiMAX将HEK293T细胞用不同蛋白浓度下的dCas9-VP64激活物和所有6种MF3靶向性的sgRNA的混合物处理12小时。NTF3mRNA水平通过qRT-PCR测定，并相对于GAPDH的那些标准化。列出了总sgRNA浓度(每种sgRNA以所列总浓度的六分之一存在)。图15B：通过蛋白:sgRNA递送和质粒转染的NTF3基因激活的时间进程。NTF3mRNA水平在几个时间点使用所有6种来自表达质粒(在dCas9-VP64激活物质粒转染处理的情况下)的或者作为与100nMdCas9-VP64激活物和阳离子脂质复合的体外转录的sgRNA(在蛋白:sgRNA递送的情况下)的sgRNA测量。对于图15A和15B，误差条反映在不同日进行的6个生物学复制品的标准偏差。
图16A-16C是显示通过高通量测序测量的通过模拟处理、通过Cas9质粒和sgRNA线性DNAPCR产物的转染、或通过阳离子脂质介导的蛋白:sgRNA递送处理的几种人类基因的插入缺失频率的曲线图。模拟处理涉及EGFP靶向性sgRNA(而不是三种人类基因靶向性sgRNA中的一种)的阳离子脂质介导的蛋白:sgRNA递送。图16A：CLTA基因的在靶和脱靶插入缺失频率。图16B：EMZ基因的在靶和脱靶插入缺失频率。图16C：VEGF基因的在靶和脱靶插入缺失频率。每个在靶和脱靶样品测序一次，每个在靶样品分析>10,000个序列，每个脱靶样品分析平均>111,000个序列(表2)。对于图16A-16C，误差条反映在不同日进行的3个生物学复制品的标准偏差。
图17A-17F是显示Cas9质粒转染或脂质介导的蛋白:sgRNA递送的在靶和脱靶插入缺失修饰频率的浓度依赖性的曲线图。图17A：在不同剂量的Cas9:sgRNA下通过高通量测序测量的VEGF在靶和脱靶位点的插入缺失修饰频率。图17B：在不同的Cas9:sgRNA浓度下的在靶:脱靶特异性比例。图17C：在两种处理的一系列修饰频率下(～1％到～40％的插入缺失修饰频率)作为在靶插入缺失修饰频率的函数的在1号VEGF脱靶位点的蛋白递送和质粒转染的在靶:脱靶特异性比例的对比。图17D、17E、17F：对于2号、3号和4号VEGF脱靶位点与图17C相同。每个在靶和脱靶样品测序一次，每个在靶样品分析>10,000个序列，每个脱靶样品分析平均>111,000个序列。所有所示数据都来自单一生物学复制品。
图18是显示来自蛋白:sgRNA递送和质粒转染的Cas9核酸酶活性的时间进程的曲线图。U2OS EGFP报告细胞用50nM Cas9蛋白和100nM sgRNA和在275μL无抗生素的DMEM-FBS中的0.8μL脂质体2000中的任一个处理，或者用750ng Cas9表达质粒和250ng EGFP sgRNA表达质粒转染，持续2小时。除去培养基，并且在另外2小时之后或者在所示的更晚时间点收集样品。在EGFP基因中使用Surveyor T7E1切割试验对样品分析插入缺失。条带通过ImageJ软件定量。此处给出的数据代表两个独立的生物学复制品的平均值。
图19A、19B显示摄取到U2OS EGFP报告细胞中的Cas9蛋白的定量。图19A：显示经50nM与Alexa647共轭的Cas9和100nM EGFP sgRNA处理的细胞的Alexa647荧光、或未处理细胞的Alexa647荧光的FACS。图19B：U2OS EGFP报告细胞用50nM与Alexa647共轭的Cas9蛋白、100nM sgRNA EGFP1、以及0.8μL脂质体2000处理。在37℃下温育4小时后，将细胞用含有20U/mL肝素的PBS充分洗涤，以除去静电结合的阳离子脂质复合物，然后胰蛋白酶化。在在650nM会进行荧光激发、在665nM会进行荧光发射的平板读取器(Teca nM1000Pro)中，对每个含有10,000个经Cas9-Alexa647处理的细胞的孔测量整个群体荧光。标准曲线通过测量在含有10％FBS的DMEM中或者在胰蛋白酶化的U2-OS细胞的悬浮液中的已知量的Cas9-Alexa647的荧光创建，每孔10,000个细胞，蛋白直接被稀释或者先被与0.8μL脂质体2000预复合然后稀释。从50pmol开始到0.048pmol进行两倍的连续稀释以产生标准曲线样品。显示了0.048pmol到3.125pmol的各个值。黑色虚线的交叉显示所测量的经50nM与Alexa647共轭的Cas9和100nM EGFP sgRNA处理并如上所述进行洗涤的10,000个细胞的总Alexa647荧光。50nM经Cas9-Alexa647处理的细胞显示了每孔0.5pmol的总的细胞关联性的Alexa647标记的蛋白信号。这一数量代表Cas9-Alexa647:sgRNA处理中输入的蛋白的4％，相当于(6.02x1023)*5.0x10-13摩尔Cas9-Alexa647/10,000个细胞每孔＝3x107个Cas9-Alexa647分子每孔。假设每个细胞的总蛋白含量大约是7.9x109个分子(第4版《分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)》1.2部分的估值)，那么内化的Cas9-Alexa647代表总细胞蛋白的0.4％。所有示数都是3次技术重复的平均值。
图20A-20C显示Cas9核酸酶向小鼠胚胎干细胞的递送。Cas9核酸内切酶向小鼠胚胎干细胞的递送。图20A：用100nM Cas9蛋白以及无sgRNA的0.8μL·脂质体2000(对照)处理的浮球(Floating sphere)保持强烈的GFP荧光(右侧)，而在相同的成像条件下用100nMCas9:sgRNA和0.8μL脂质体2000处理的那些则显示减弱的GFP荧光(左侧)。标度条是100μm。图20B：细胞附着后，几乎所有对照祖细胞都是GFP阳性的(右小图)。细胞附着后，Cas9:sgRNA处理引起了GFP表达的显著降低(左小图)，并且许多祖细胞显示了完全的GFP坠落(箭头)。标度条是20μm。图20C：在成像后收获的干细胞上的T7EI分析可确认GFP报告物的切割。从阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA递送(24％)并且从Cas9和EGFP sgRNA质粒的共转染(20％)均观察到了类似的基因靶点修饰效率。
图21A、21B显示在体内内源基因位点由阳离子脂质介导的Cas9核酸酶和sgRNA的蛋白递送引起的基因组修饰。在图6D中所述的相同条件下将Cas9:sgRNA蛋白注射进Atoh1-GFP小鼠大约10天后，切了～15mg小鼠毛细胞组织。制备了150ng分离的基因组DNA用于高通量测序。图21A：在Atohl-GFP小鼠毛细胞中阳离子脂质介导的Cas9和EGFP sgRNA的递送之后在EGFP在靶遗传位点的基因组DNA序列的代表性实例。对于每个所示实例，未修饰的基因组位点是第一序列，接着是最大量的含有缺失的8个序列以及含有插入的3个序列。每个序列前的数字表示序列计数。sgRNA靶位点是黑体并下划绿色线。插入和缺失以红色显示。PAM位点以蓝色显示。图21B：在Atohl-GFP小鼠毛细胞中对于EMY在靶位点与图21相同的分析。此处所示的EGFP和EMX基因组基因位点的插入缺失来自选自代表性的一组的已测序的样品的单一生物学复制品，所有样品都显示类似的插入缺失概况。
图22显示在Pmca2小鼠突变型中Cas9/gRNA蛋白递送可恢复听觉。左小图：ABR研究显示，注射Cas9/gRNA-Pmca2-2.4在3星期和4星期后，被注射的内耳在不同的频率显示听觉的显著修复。在未被注射的内耳中，深度耳聋定义为ABR在所有频率大于100dB，在45.24kHz大于95dB。经过将4星期与3星期相比，听觉修复是稳定的。右小图：DPAOE研究显示注射Cas9/gRNA-Pmca2-2.4的内耳中类似的修复相对于未注射的内耳中严重增加的阈值。*P<0.05；***P<0.001；****P<0.0001。双因素ANOVA测试，平均值(±SEM)。对于每组都是n＝4。
图23是显示与未注射的对照耳朵相比多次注射4星期后在16、22.64、32和45.24kHz下在注射Cas9/gRNA-Pmca2-2.4的内耳中的ABR显示显著的听觉修复的曲线图。在16、22.64和32kHz的听觉修复提高了40dB。
具体实施方式
本发明实施例涉及用来将蛋白有效细胞内递送到细胞核或细胞质的组合物。蛋白递送的常规方法通常依赖于阳离子肽或蛋白来促进内吞作用，但具有血清蛋白的低耐受性、差的核内体逃逸，以及受限的体内功效的缺点。本文中，据报道阳离子脂质试剂可有效地递送融合于多聚核苷酸、寡核苷酸、超负电荷蛋白、含有天然阴离子区域、或天然结合于阴离子核酸的蛋白。
以下优选实施例的描述在本质上仅仅是示范性的，并且绝不旨在限制本发明、其应用或用途。本发明的实施例可在没有所提出的理论方面的情况下实施。另外，所述理论方面在理解申请人并不寻求被所提出的理论所束缚的前提下提出。
应理解，阐明的许多特定的细节、关系和方法是为了提供对本发明的充分理解。但是，相关领域的普通技术人员会容易地认识到本发明可在没有一个或多个特定细节的情况下或使用其它方法实施。本发明并不受动作或事件的所示顺序所限制，一些动作可以不同的顺序发生和/或与其它动作或事件同时发生。此外，不是所有所示的动作或事件对于实施根据本发明的方法都是需要的。
除非另外定义，本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)与本发明所属的本领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。还应理解，像在通常使用的字典中定义的那些这样的术语应被解释为具有与相关领域的上下文中其含义一致的含义，并且不会以理想化的或过度正式的意识加以解释，除非本文清楚的如此定义。
定义
本文所用的术语仅用于描述特定的实施例的目的，并不旨在限制本发明。如本文所使用，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指出。此外，术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体在详细说明书和/或权利要求书中使用的程度，此类术语是包括一切的，与术语“包含(comprising)”的方式类似。
如本文所使用，与所定义的或描述的物件、组合物、装置、方法、过程、系统等元素相关的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”或“包含(comprised)”及其变体意思是包括一切的或开放式的，允许另外的元素，从而表示所定义的或描述的物件、组合物、装置、方法、过程、系统等包括那些指定的元素--或者，适当时，其等价物--并且其它元素可被包括并仍落入所定义的物件、组合物、装置、方法、过程、系统等的范围/定义内。
术语“约”或“大约”意思是本领域普通技术人员测定的特定值在可接受的误差范围内，这会部分取决于该值是如何测量或测定的，即测量系统的限度。例如，根据本领域的实际，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。或者，“约”可以表示给定值或范围的至多20％、至多10％、至多5％、或至多1％的范围。或者，特别与生物系统或过程相关的术语可以表示在一值的5倍之内，并且还在2倍之内的数量级。当特定值在申请和权利要求书中描述时，除非另外指明，应该采用意思是特定值在可接受的误差范围内的术语“约”。
“任选的”或“任选地”意思是随后所述的事件或情况可发生或可不发生，并且说明书包括事件或情况发生以及其不发生的情形。
如本文所使用，“嵌合”分子是包含一种或多种不相关类型的成分或含有两个或更多个化学上不同的区域的分子，其可互相共轭、被融合、连接、翻译、通过连接基团接合、化学合成、从核酸序列表达等。例如，肽和核酸序列、肽和可检测标记物、无关的肽序列等。术语“嵌合”分子是“阴离子”分子，其中存在一个或多个“阴离子”区域并为分子赋予总体净阴离子电荷。例如，嵌合分子可具有一个或多个阴离子区域、阳离子区域、电中性区域，但是整个分子的电荷是阴离子。
如本文所使用，除非另外指出，术语“肽”、“多肽”或“蛋白”在本文中可互换使用，并且是指不同大小的氨基酸的聚合物。这些术语不表示特定长度的氨基酸的聚合物。因此，例如，术语寡肽、蛋白和酶包括在多肽或肽的定义内，不管使用重组技术、化学或酶合成产生还是天然发生。该术语还包括已经例如通过醣基化、乙酰化、磷酸化等修饰或衍生化的多肽。
如本文所使用，“核酸”或“核酸序列”或“cDNA”是指已经从序列分离的核酸区段或片段，所述序列在天然存在的状态下在其侧翼，例如已经从通常与片段相邻的序列(例如与其中它天然产生的基因组中的片段相邻的序列)被去除的DNA片段，并且是指其中一个或多个间隙子已经被去除的核酸序列。所述术语还适用于基本上已经从天然伴随核酸的其它成分(例如RNA或DNA或蛋白，其在细胞中天然伴随于它)纯化的核酸。所以所述术语包括例如重组DNA，其被引入载体中、自主复制质粒或病毒中、或原核生物或真核细胞的基因组DNA中，或者其作为独立于其它序列的单独分子(例如作为通过PCR或限制性酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在。它还包括重组DNA，例如其为编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分的DNA。
“多聚核苷酸”意思是核酸的单链或平行和反平行链。因此，多聚核苷酸可以是单链或双链核酸。
当在多聚核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可包含与野生型基因相关的多聚核苷酸序列。该定义还可包括例如“等位基因”、“剪接”、“异种”或“多晶型”变体。剪接变体可具有与参考分子的显著同一性，但通常会具有较多或是较少数目的多聚核苷酸，这是由于在mRNA加工过程中外显子的交替剪接。相应的多肽可具有另外的功能性区域或缺失各区域。异种变体是随着种类的不同而变化的多聚核苷酸序列。野生型基因产物的变体在本发明中更具有特定用途。变体可由核酸序列中的至少一种突变产生，并且可导致变异的mRNA，或者由其结构或功能可被改变或可不被改变的多肽中的至少一种突变产生。任何给定的天然或重组基因可具有零、一种、或许多种等位基因形式。会导致变体的常规突变变化通常归因于核苷酸的天然缺失、添加、或取代。这些类型的变化的每一种可单独发生，或与其它变化组合发生，在给定序列中发生一次或多次。
如本文所使用，术语“核酸序列”、“多聚核苷酸”和“基因”在整个说明书中互换使用，并且包括互补DNA(cDNA)、线性或环状低聚物或天然和/或修饰的单体或链接结构的聚合物，包括脱氧核糖核甙酸、核糖核甙酸、其取代形式和α-端基异构形式、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、磷酸甲酯等。
核酸序列可以是“嵌合”的，也就是由不同区域构成。在本发明的上下文中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其含有两种或更多种化学区域，例如DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每种化学区域由至少一个单体单元(即核苷酸)组成。这些序列通常包含至少一个其中序列被修饰以展示一种或多种期望的特性的区域。
术语“靶核酸”是指寡核苷酸被设计成与其特别杂交的核酸(通常衍生自生物样品)。要探测的是存在或不存在靶核酸，或者要定量的是靶核酸的量。靶核酸具有与指向靶的相应寡核苷酸的核酸序列互补的序列。术语靶核酸可以指寡核苷酸指向的较大核酸的特定子序列，或者指期望探测其表达水平的总体序列(例如基因或mRNA)。用途的不同从上下文来看是显而易见的。
在本发明的上下文中，术语“核碱基”包括天然存在的核碱基以及非天然存在的核碱基。本领域技术人员应清楚，之前被看做是“非天然存在的”很多种核碱基随后已经被发现是天然的。因此，“核碱基”不但包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括杂环类似物及其互变异构体。核碱基的示例性的实例是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞苷、N6,N6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、拟异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷以及Benner等在美国专利号5,432,272中所述的“非天然存在的”核碱基。术语“核碱基”旨在包括这些实例的每个和全部以及类似物及其互变异构体。特别有意义的核碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、以及尿嘧啶，其被看作涉及人类中治疗和诊断应用的天然存在的核碱基。
如本文所使用，“核苷”包括包括2'-脱氧和2'-羟基形式的天然核苷，例如，如Kornberg和Baker在第二版的《DNA复制(DNA Replication)》(Freeman，旧金山，1992)中所述的。
关于核苷的“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷，例如被Scheit，Nucleotide Analogs，JohnWiley，纽约，1980；Freier&Altmann，Nucl.Acid.Res.，1997，25(22)，4429-4443，Toulme，J.J.，Nature Biotechnology 19：17-18(2001)；Manohara nM.，Biochemica et Biophysica Acta1489:117-139(1999)；FreierS.M.，Nucleic Acid Research，25:4429-4443(1997)，Uhlman，E.，Drug Discovery&Development，3：203-213(2000)，Herdewin P.，Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10:297-310(2000)，)；2'-O，3'-C-linked[3.2.0]bicycloarabinonucleosides(参见例如N.KChristiensen.等，J.Am.Chem.Soc，120：5458-5463(1998)一般描述的那些。此类类似物包括被设计成增强结合特性(例如双螺旋或三螺旋的稳定性、特异性等)的合成核苷。
当在多聚核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可包含与野生型基因相关的多聚核苷酸序列。该定义还可包括例如“等位基因”、“剪接”、“异种”或“多晶型”变体。剪接变体可具有与参考分子的显著同一性，但是通常会具有更多或是更少数目的多聚核苷酸，这是由于在mRNA加工过程中外显子的交替剪接。相应的多肽可具有另外的功能性区域或缺失各区域。异种变体是随着种类的不同而变化的多聚核苷酸序列。野生型靶基因产物的变体在本发明中具有特定用途。变体可由核酸序列中的至少一种突变产生，并且可导致变异的mRNA，或者由其结构或功能可被改变或可不被改变的多肽中的至少一种突变产生。任何给定的天然或重组基因可具有零、一种、或许多种等位基因形式。会导致变体的常规突变变化通常归因于核苷酸的天然缺失、添加、或取代。这些类型的变化的每一种可单独发生，或与其它变化组合发生，在给定序列中发生一次或多次。
所得多肽通常会具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多晶型变体是在给定物质的个体之间特定基因的多聚核苷酸序列的变异。多晶型变体还可包含“单核苷酸多态性”(SNP)或其中多聚核苷酸序列变动一个碱基的单碱基突变。SNP的存在可表示例如具有疾病状态的倾向性的某一群体，所述倾向性相对于耐受性为易感性。
如本文所使用，多肽的“变体”是指通过一种或多种氨基酸残基改变的氨基酸序列。变体可具有“保守的”变化，其中取代的氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如将亮氨酸用异亮氨酸替代)。更罕见地，变体可具有“非保守的”变化(例如将甘氨酸用色胺酸替代)。类似的较小变异还可包括氨基酸缺失或插入，或者两者都包括。用来确定哪个氨基酸残基可被取代、插入、或缺失而不消除生物活性的指导可使用本领域熟知的计算机程序(例如LASERGENE软件(DNASTAR))找到。
“治疗”是所进行的干预，旨在阻止疾病的发展或者改变疾病的病理学或症状。相应地，“治疗”是指治疗处理和预防或预防措施。“治疗”还可指定为缓和疗护。需要治疗的那些包括已经具有疾病的那些，以及其中疾病会被预防的那些。相应地，状态、疾病或状况的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括：(1)防止或延迟在人类或其它哺乳动物中发展的状态、疾病或状况的临床症状的表现，所述人类或其它哺乳动物可能患有状态、疾病或状况，或者受到状态、疾病或状况但尚未经历或显示状态、疾病或状况的临床或亚临床症状；(2)抑制状态、疾病或状况，即中止、减弱或延迟疾病的发展或其反复(在保养治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状；或者(3)缓解疾病，即导致状态、疾病或状况或者至少一种它的临床或亚临床症状的退化。对待治疗个体的益处是统计学上显著的或者至少对于患者或医师是可感知的。
术语“患者”或“个体”或“主体”在本文中互换使用，并且是指待治疗的哺乳动物主体，人类患者是优选的。在一些情况下，本发明的方法在实验动物中、在兽医应用中、并且在疾病的动物模型的开发中找到应用；包括/但不限于啮齿动物(包括小鼠、大鼠和仓鼠)和灵长类动物。
如本文中所定义，“治疗有效”量的化合物或试剂(即有效剂量)意思是足以产生治疗上(例如临床上)期望的结果的量。组合物的施用可以从每天一次或多次到每周一次或多次；包括每两天一次。技术人员应认识到，某些因素可影响剂量和有效治疗主体需要的时序，包括但不限于疾病或疾病的严重性、之前的治疗、综合健康和/或主体年龄，以及存在的其它疾病。另外，使用本发明的治疗有效量的化合物治疗主体可包括单独治疗或系列治疗。
如本文中所定义，“有效”量的化合物或试剂(即有效剂量)意思是足以产生(例如临床上)期望的结果的量。
如本文所使用，“药学上可接受的”成分/载体等是适合用于人类和/或动物而不会有与合理的收益/风险比相称的不适当的不良副作用(例如毒性、刺激和过敏反应)的成分/载体。
术语“测定”、“测量”、“评估”、“探测”、“评价”和“分析”在本文中互换使用，来指任何形式的测量，并且包括确定所述元素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定。评价可以是相对的或绝对的。“评价……的存在”包括测定存在的某物的量，以及确定它是否存在。
如本文所使用，术语“试剂”意味着包含能够防止、改善、或治疗疾病或其它医疗状况的任何分子、化学实体、组合物、药物、治疗剂、化疗剂、或生物试剂。术语包括小分子化合物、反义试剂、siRNA试剂、抗体、酶、有机或无机肽分子、天然或合成化合物等。试剂可在临床试验、预实验测试、或FDA-批准后的任何阶段根据本发明的方法分析。
通过术语“调节”，意味着任何所提到的活性被例如提高、增强、提高、激动(用作激动剂)、促进、降低、减少、压制阻断、或拮抗(用作激动剂)。调节可将活性比基线值增加大于1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调节还可将它的活性降低至低于基线值。调节还可将活性相对于基线值标准化。
如本文所使用，术语“试剂盒”是指用于递送物质的任何递送系统。包含性的术语“试剂盒”是用于研究和临床应用的试剂盒。在反应分析的上下文中，此类递送系统包括容许从一个位置到另一位置反应试剂(例如适当的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持物质(例如缓冲剂、用于进行分析的书面说明书等)的储存、转运、或递送的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持物质的一个或多个壳体(例如盒子)。如本文所使用，术语“分区的试剂盒”是指包含两个或更多个分离的容器(每个含有总试剂盒成分的子部分)的递送系统。所述容器可一起或分别递送到期望的接收者。例如，第一容器可含有用于分析用途的酶，而第二容器则含有寡核苷酸或脂质体。术语“分区的试剂盒”旨在包含含有在《联邦食品、药物和化妆品法案(Federal Food，Drug，and CosmeticAct)》的520(e)部分管理的分析物特异性试剂(ASR)但不限于其的试剂盒。确实，包含两个或更多个分离的容器(每个含有总试剂盒成分的子部分)的任何递送系统都包括在术语“分区的试剂盒”中。相反，“组合的试剂盒”是指含有在单容器中(例如在装有每个期望的成分的单盒中)的所有反应分析成分的递送系统。术语“试剂盒”包括分区的和组合的试剂盒。
通用技术
为了进一步阐述用于实施本发明的通用技术，专业人员可参考标准教科书并回顾细胞生物学、组织培养、胚胎学和生理学。
分子和细胞生化学的通用方法可以在像《分子克隆：实验手册(MolecularCloning:A laboratory Manual)》，第三版(Sambrook等，哈勃实验出版社(HarborLaboratory Press)，2001)；《分子生物学中的短方案(Short Protocols in MolecularBiology)》，第四版(Ausubel等编辑，约翰威立国际出版公司(JohnWiley&Sons)，1999)；《蛋白方法(Protein Methods)》(Bollag等，约翰威立国际出版公司，1996)；《基因疗法的非病毒载体(Nonviral Vectors for Gene Therapy)》(Wagner等编辑，学术出版社(AcademicPress)，1999)；《病毒载体(Viral Vectors)》(Kaplift&Loewy编辑，学术出版社，1995)；《免疫学方法手册(Immunology Methods Manual)》(I.Lefkovits编辑，学术出版社，1997)以及《细胞和组织培养：生物技术中的实验步骤(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology)》(Doyle&Griffiths，约翰威立国际出版公司，1998)这样的标准教科书中找到。本公开提到的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从像BioRad、Stratagene、Invitrogen、西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)和ClonTech这样的商业供应商获得。
组合物
本文所述的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于来自任何本文公开的组合物和方法可应用于其的物质的同系物。因此，所述术语包括但不限于来自人类和小鼠的基因和基因产物。应理解，当来自特定物质的基因或基因产物被公开时，本公开旨在仅是示范性的，不可以理解为一个限制，除非它出现于其中的上下文明确表明。因此，例如，对于本文公开的基因或基因产物(其在一些实施例中涉及哺乳动物的核酸和氨基酸序列)旨在包含来自其它动物(包括但不限于其它哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类)的同源和/或直系同源基因和基因产物。在优选实施例中，基因、核酸序列、氨基酸序列、肽、多肽和蛋白是人类的。
在一些实施例中，组合物包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质。这些嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的一种或多种蛋白或肽。在其它实施例中，嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。阴离子分子可以改变，只要它们包含一个或多个阴离子区域或者与阴离子核酸区域结合。阴离子分子为嵌合分子赋予总体净负电荷是优选的。不希望受到理论的限制，可以假设，被改造成高度负电荷的或天然高度阴离子性的蛋白可能能够利用同样的被阳离子脂质体试剂用来递送核酸的静电驱动的复合和包封。尽管很少蛋白天然具有可在核酸的磷酸酯骨架中找到的负电荷密度，但是可以推测，与聚阴离子分子的转译融合或非共价复合可为所得蛋白或蛋白复合物赋予充分的阴离子性，从而被常规阳离子脂质试剂有效地复合。之后的实例部分所述的工作的结果显示，递送效率取决于融合蛋白的净电荷，并且像3xFLAG和VP64这样的天然阴离子肽标签也可以使脂质-介导的蛋白递送成为可能。
相应地，在一些实施例中，阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、短干扰RNA(siRNA)、微干扰RNA(miRNA)、小时序RNA(stRNA)、短发夹RNA(shRNA)、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的一种或多种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合可具有任意电荷，只要嵌合分子的总净电荷是阴离子性的。相应地，在一些实施例中，蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。可与聚阴离子分子或区域复合或链接的嵌合分子的蛋白或肽的实例包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子或其组合。
在一些实施例中，蛋白或肽是用来向特定靶点递送的治疗剂。所述靶点可以是任何期望的细胞内靶点。在一些实施例中，所述靶点是核酸序列或基因。在期望其中操作、调节或编辑基因的实施例中，蛋白或肽是基因或基因组编辑剂。在一些实施例中，基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。在一些实施例中，靶点是蛋白或肽。相应地，在一些实施例中，嵌合或阴离子分子包含一种或多种基因编辑剂、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
在一个实施例中，嵌合分子包含一种或多种可检测标记物、阴离子、放射性标记物、标签、靶向剂、带负电荷的蛋白或肽、或其组合。这些分子根据使用者期望的目的进行选择，例如用于诊断或研究目的，或者用来增加阴离子电荷、靶向信号等。相应地，用于内耳细胞类型的体内递送的用来复合蛋白和核酸(例如其靶结合区为寡核苷酸的转录因子)的脂质体制剂被用来治疗耳聋或其相关疾病，这是由于嵌合分子可被调整以进行再生(例如毛细胞和听觉神经元的再生)、修复(例如为了听觉恢复毛细胞和神经元之间连接的重建)和预防(例如通过在老化和曝露于噪音过程中可阻止毛细胞死亡从而保持听觉的isll的蛋白功能)。
在其它实施例中，嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。优选地，所述一种或多种阴离子分子包含一个或多个阴离子区域或者与阴离子核酸区域结合。在实施例中，所述嵌合分子包含总体净负电荷。在一些实施例中，阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。在一些实施例中，寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、短干扰RNA(siRNA)、微干扰RNA(miRNA)、小时序RNA(stRNA)、短发夹RNA(shRNA)、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。所述嵌合分子还包含一种或多种阳离子性的、阴离子性的、或电中性的蛋白或肽。蛋白的实例非限制性地包括：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因组或基因编辑剂、合成分子或其组合。基因或基因组编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、重组酶、核酸酶、结合DNA的蛋白或核酸或其组合。在其它实施例中，嵌合分子任选地包含一种或多种可检测标记物、放射性标记物、标签、阴离子、靶向剂或其组合。
在其它实施例中，阳离子脂质体包封包含与带负电荷的分子复合、融合或链接的蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合的阴离子分子。在一些实施例中，带负电荷的分子包含寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。在其它实施例中，多聚核苷酸或寡核苷酸是向导RNA。在一些实施例中，蛋白或肽是带负电荷的萤光蛋白。在又一个实施例中，一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。在又一个实施例中，带负电荷的萤光蛋白与一种或多种蛋白或肽融合或链接。在一些实施例中，蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子或其组合。在一些实施例中，基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。这些基因编辑剂的实例包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。阴离子分子任选地包含一种或多种可检测标记物、放射性标记物、标签、带负电荷的蛋白或肽、阴离子、靶向剂或其组合。
在一些实施例中，分子包含任意一个或多个如SEQ ID NOS:1到19所列的序列。
在一些实施例中，分子包含任意一个或多个如SEQ ID NOS:1到123所列的序列。
在其它实施例中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、修饰的脂质或其组合。
在一些实施例中，用于包封本文体现的一种或多种分子的脂质体包含脂质体、纳米脂质体、非离子表面活性剂囊泡、微球体、纳米球体、纳米颗粒、胶束、或古细菌体。在一些实施例中，阳离子脂质体包封一种或多种阴离子分子。这些分子可以是例如单个实体(例如蛋白、肽、核酸等)、嵌合实体(例如不同分子或各类型分子的组合)、分子复合物、复合分子等。
在一个实施例中，包封阴离子分子的阳离子脂质体包含与带负电荷的分子复合、融合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。在一些实施例中，带负电荷的分子包含寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。在一些实施例中，多聚核苷酸或寡核苷酸是向导RNA、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、功能、活性或其组合的调节剂。在一个实施例中，蛋白或肽是带负电荷的萤光蛋白。在另一个实施例中，一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。非限制性的实例包括：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、功能、活性或其组合的调节剂。
在另一个实施例中，基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、调节增强剂的分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。在一个实施例中，基因编辑剂包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。
在另一个实施例中，阴离子分子任选地包含一种或多种可检测标记物、放射性标记物、标签、阴离子、靶向剂或其组合。
修饰的蛋白或肽：包含多肽或其片段的杂合蛋白可被链接到其它类型的多肽，例如，除报告多肽之外的或代替报告多肽的超负电荷绿色萤光蛋白。这些另外的多肽可以是用于蛋白或肽的纯化、确认、总体电荷和/或肽的治疗或预防应用的任何氨基酸序列。此外，另外的多肽可以是信号肽或靶向肽等。
在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的稳定性(包括但不限于溶解蛋白降解抗性)或增加多肽与其适当的受体、配体和/或结合蛋白的亲和性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的溶解性。在一些实施例中，为了在重组宿主细胞中表达后增加多肽溶解性的目的，除了用于非天然氨基酸的结合的另一个位点之外，选择一位点来用天然编码的或非天然的氨基酸进行取代。在一些实施例中，多肽包含可调节与相关配体、结合蛋白和/或受体的亲和性、调节(包括但不限于增加或降低)受体的二聚作用、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节释放或生物利用度、促进纯化、或者改进或改变特定的给药途径的另一个添加、取代、或缺失。类似地，非天然氨基酸多肽可包含化学或酶切割序列、蛋白酶切割序列、反应性基团、抗体结合区域(包括但不限于，FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或可改进检测(包括但不限于GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药的释放或激活、尺寸减小、或多肽的其它特征的链接的分子(包括但不限于生物素)。
本文所述的方法和组合物包括将一种或多种非天然氨基酸结合到多肽中。一种或多种非天然氨基酸可在不会破坏多肽活性的一个或多个特定位置被结合。这可通过进行“保守的”取代(包括但不限于，用非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，用非天然或天然大氨基酸取代大氨基酸，用非天然或天然亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸)和/或在对于活性不需要的位置插入非天然氨基酸实现。
可使用各种生化和结构方法来选择在多肽内用非天然氨基酸取代的期望的位点。多肽链的任何位置均适于被选择来结合非天然氨基酸，并且选择可基于合理设计或对于任何目的或无特定期望的目的通过随机选择。期望位点的选择可基于产生具有任何期望的特性或活性的非天然氨基酸多肽(其可被进一步修饰或保持未修饰)，所述期望的特性或活性包括但不限于激动剂、超激动剂、部分激动剂、反向促效剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合伙伴结合的调节剂、结合伙伴活性调节剂、结合伙伴构型调节剂、二聚体或多聚体的形成、与天然分子相比无活性或特性的改变、或者像溶解性、聚集性、或稳定性这样的控制多肽的任何物理或化学特性。例如，多肽生物活性需要的多肽中的位置可使用包括但不限于点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描方法的方法确认。通过包括但不限于丙氨酸或同系物扫描突变的方法确认对生物活性关键的残基之外的残基可以是用非天然氨基酸取代的良好候选物，这要取决于为多肽寻求的期待活性。或者，确认对生物活性关键的位点也可以是用非天然氨基酸取代的良好候选物，再一次，这要取决于为多肽寻求的期待活性。另一个替代是，用非天然氨基酸在多肽链上的每个位置进行序列取代，并观察对多肽活性的影响。用来选择用非天然氨基酸取代到任何多肽中的位置的任何途径、技术、或方法均适合用于本文所述的方法、技术和组合物。
修饰的寡核苷酸：本发明预想的一些寡核苷酸的实例包括包含修饰骨架的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三脂、膦酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间链接或短链杂原子或杂环糖间链接。在一些实施例中，修饰的寡核苷酸包含具有硫代磷酸酯骨架的和具有杂原子骨架的那些，CH2--NH--O--CH2、CH,--N(CH3)--O--CH2[称为亚甲基(甲亚胺)或MMI骨架]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2和O--N(CH3)--CH2--CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示为O--P--O--CH,)。DeMesmaeker等在Acc.Chem.Res.1995，28:366-374中公开的酰胺骨架也在本文中体现。在一些实施例中，寡核苷酸(Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)具有吗啉基骨架结构,在肽核酸(PNA)骨架中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架替代，核碱基直接或间接结合aza聚酰胺骨架的氮杂氮原子(Nielsen等Science1991，254，1497)。寡核苷酸还可包含一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸还可具有糖模拟物，例如替代戊呋喃基团的环丁基。
另外地或者替代性地，寡核苷酸还可包括，核碱基(本领域经常简单称作“碱基”)修饰或取代。如本文所使用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅罕见地或短暂地在天然核酸中发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶、特别地5-甲基胞嘧啶(也称作5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，并且本领域经常称作5-Me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg，A.，《DNA复制(DNAReplication)》，W.H.Freeman&Co.，旧金山，1980，75-77页；Gebeyehu，G.等Nucl.AcidsRes.1987，15:4513。可包括本领域已知的“通用”碱基，例如次黄嘌呤核苷。已经显示5-Me-C取代可通过0.6-1.2℃增加核酸双螺旋稳定性(Sanghvi，Y.S.，在Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑，《反义研究和应用(AntisenseResearch and Applications)》，CRC出版社(CRC Press)，波卡雷顿，1993，276-278页)，并且目前是优选的碱基取代。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及与寡核苷酸的一个或多个部分化学链接或会增强寡核苷酸的活性或细胞摄取的共轭。此类部分包括但不限于脂质部分(例如胆固醇部分、胆固醇基部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1989，86，6553))、胆酸(Manoharan等Bioorg.Med.Chem.Let.1994，4，1053)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等Ann.NY.Acad.Sci.1992，660，306；Manoharan等Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3，2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.1992，20，533))、脂肪族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等EMBOJ.1991，10，111；Kabanov等FEBSLett.1990，259，327；Svinarchuk等Biochimie1993，75，49))、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵l,2-二-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等TetrahedronLett.1995，36，3651；Shea等Nucl.AcidsRes.1990，18，3777))、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等《核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》1995，14，969)、或金刚烷乙酸(Manoharan等TetrahedronLett.1995，36，3651)。包含亲脂部分的寡核苷酸和用来制备此类寡核苷酸的方法在本领域是已知的，例如美国专利号5,138,045、5,218,105和5,459,255。
对给定寡核苷酸的所有位置进行同样的修饰是不必要的，实际上多于一个前面提到的修饰可被结合到单个寡核苷酸中或者甚至寡核苷酸内的单个核苷中。本发明还包括寡核苷酸，其为本文前面所定义的嵌合寡核苷酸。
标记分子：在另一个优选实施例中，嵌合分子可被标记。用途包括治疗和用于诊断和预后目的的成像。标记物可以是放射性原子、酶、或生色团基团。标记抗体的方法已经在例如Hunter和Greenwood，Nature，144:945(1962)和David等生化学(Biochemistry)13：1014-1021(1974)中进行了描述。标记抗体的另外的方法已经在美国专利号3,940,475和3,645,090中进行了描述。用来标记寡核苷酸探针的方法已经在例如Leary等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:4045、Renz和Kurz，Nucl.AcidsRes.(1984)12:3435、Richardson和Gumport，Nucl.AcidsRes.(1983)11:6167、Smith等Nucl.AcidsRes.(1985)13:2399、以及Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.(1984)138:267中进行了描述。
标记物可以是放射性的。有用的放射性标记物的一些实例包括32p、125I、131I和3H。放射性标记物的用途已经在U.K.2,034,323、美国专利号4,358,535和美国专利号4,302,204中进行了描述。
非放射性标记物的一些实例包括可通过电子显微技术检测的酶、生色团、原子和分子以及可通过它们的磁特性检测的金属离子。
一些有用的酶标记物包括会在底物中导致可检测改变的酶。一些有用的酶和它们的底物包括例如辣根过氧化酶(邻苯三酚和o-间苯二胺)、β-半乳糖苷酶(荧光素β-D-半乳糖吡喃糖苷)和碱性磷酸酶(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑)。酶标记的使用已经在U.K.2,019,404、EP63,879中、以及Rotman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，47，1981-1991(1961)中进行了描述。
有用的生色团包括例如萤光、化学发光和生物发光分子，以及燃料。可用于本发明的一些特定生色团包括例如荧光素、若丹明、德克萨斯红、藻红朊、伞形酮、鲁米诺。
标记物可以通过本领域熟知的方法与嵌合分子共轭。标记物可以通过探针上的功能性基团直接附着。探针含有或可被导致含有此类功能性基团。合适的功能性基团的一些实例包括例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯。或者，像酶和生色团这样的标记物可借助于像二醛、碳二亚胺、双马来酰亚胺等这样的耦合试剂与抗体或核苷酸共轭。
在另一个优选实施例中，本发明的嵌合融合分子可用于成像。在成像用途中，复合物被标记，从而它们可在体外被检测到。典型的标记物是放射性同位素，通常是具有短半衰期的同位素。可使用常见的成像放射性同位素，例如123I、124I、125I、131I、99mTC、186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、67Ga、90Y、111In、18F、3H、14C、35S或32p。像钆-153这样的核磁共振(NMR)成像增强剂也可用来标记复合物，以通过NMR进行检测。在多聚核苷酸部分中或在蛋白部分中进行标记的方法和试剂在本领域看作是已知的。
可用于本发明的报告基因包括乙酰羟酸合成酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色萤光蛋白(GFP)、红色萤光蛋白(RFP)、黄色萤光蛋白(YFP)、青色萤光蛋白(CFP)、辣根过氧化酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合成酶(NOS)、章鱼碱合成酶(OCS)、及其衍生物。多个可选择的标记物是可获得的，其为氨苄青霉素、博莱霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲胺喋呤、膦丝菌素、嘌呤霉素以及四环素赋予抗性。确定报告基因的调节的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于萤光标定法(例如荧光光谱法、荧光激活细胞分类术(FACS)、荧光显微法)、抗生素抗性的确定。
治疗方法
在此体现的组合物和分子可用于那些会受益于蛋白疗法的疾病和状况。在一些实施例中，治疗方法包含给患者施用有效量的包封在此体现的嵌合分子的阳离子脂质体。在其它实施例中，分子包含一个或多个如SEQ ID NOS:1到19所列的序列。在其它实施例中，分子包含一个或多个如SEQ ID NOS:1到123所列的序列。
在其它实施例中，使用用于内耳细胞类型的体内递送的用来复合在此体现的蛋白和核酸(例如其靶结合区为寡核苷酸的转录因子)的脂质体制剂治疗听觉损失或耳聋的方法包含再生(例如毛细胞和听觉神经元再生)、修复(例如为了听觉恢复毛细胞和神经元之间连接的重建)和防止(例如通过可在老化和曝露于噪音过程中阻止毛细胞死亡从而保持听觉的isll的蛋白功能)。
听觉损失或耳聋以及相关联的疾病：每1000个新生儿中有一个会受到遗传性耳聋的困扰。超过80个耳聋基因已经被确认，并且另外200-300个耳聋基因尚待发现。尽管重大的进步，任何遗传性耳聋都没有治疗方法。因此迫切需要开发针对不同类型的遗传性耳聋的治疗方法。
存在两种主要类别的遗传性耳聋：通常是先天性的隐性耳聋；以及主要是进行性的显性耳聋。对于隐性耳聋，正常复制的突变基因的递送和连续表达可为听觉恢复补偿损失的功能。由于其长期表达模式和良好安全记录，基于腺伴随病毒(AAV)的基因疗法已经成为可被开发的疗法以作为隐性耳聋的治疗方法。但是，AAV载体仅适应少于4.5kb的插入，而许多耳聋基因的尺寸要大得多，从而严重地限制AAV的有用性。对于显性耳聋基因，递送不大可能会起作用。
像内耳发育不全性畸形这样的非遗传的内耳异常占先天性感音神经性耳聋的大约20％。剩余的(遗传的)耳聋的大部分是非综合征，意味着它不具有任何明显的区别特征。
大部分非综合征性听觉损失由联接蛋白基因突变引起。在哺乳动物中，至少20种联接蛋白子类型已经在小鼠和人类基因组中确认。联接蛋白基因编码间隙连接通道，其连接两个相邻细胞，从而容许至多1.2kDa的细胞质离子和小分子通过。在哺乳动物内耳中，联接蛋白26(Cx26)和Cx30是主要的异构体。Cx26突变可引起听觉损失的高发病率，是造成儿童中70到80百分比的非综合征性听觉损失的原因。
非综合征性耳聋：非综合征性意思是耳聋孤立地发生，没有其它相关疾病。约80％的遗传性听觉损失是非综合征性。在1992年和2001年之间，常染色体的显性的非综合征性耳聋的38个基因位点已经被定位，并且11个基因已经被确认。常染色体的显性基因位点称作DFNA，常染色体的隐性基因位点称作DFNB，并且X连锁基因位点称作DFN。
非综合征性耳聋是高度异质性的，但是联接蛋白-26分子(间隙连接蛋白，基因GJB2)的突变占具有非综合征性耳聋的患者的约49％和零星情况的约37％。每31个欧洲抽出的个体中约有1个可能是携带者。
常染色体的显性(DFNA)：常染色体的显性耳聋被直接传接数代。通过家谱的简单检查确认常染色体的显性模式经常是可能的。常染色体的显性耳聋的实例是COL11A2(DFNA13)和TMCl基因的误义突变。COL11A2编码XI型胶原蛋白的链，而TMCl则编码毛细胞通道蛋白。
常染色体的隐性(DFNB)：常染色体的隐性疾病需要来自母亲和父亲两者的基因。
综合征性耳聋：综合征性耳聋，其占剩余的20％的先天性的耳聋，包含极其复杂的互连的一阻疾病。此处的描述仅给出疾病的总体概况，并不旨在包括疾病的所有特征。在一些情况下，提供了与主要类型的遗传性疾病相关的在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库。该数据库是人类基因和遗传性疾病的目录册。
奥尔波特综合征：奥尔波特综合征由COL4A3、COL4A4或COL4A5的突变引起。典型表现型是肾衰竭和进行性感音神经性耳聋。
腮-耳-肾综合症：腮-耳-肾综合症由EYA1(一个156kB的基因组间隔内的16个外显子的基因)的突变引起。该综合征的特征为听觉障碍和白内障、鳃裂瘘和耳前深坑。内耳发育不全性畸形和相关的发育不良症可能会发生。
X连锁腓骨肌萎缩症(CMT)：主要形式的X连锁CMT由定位到Xql3遗传位点的联接蛋白32基因的突变引起。通常的临床征象由周边神经病变加上脚部问题和“香槟酒瓶”小腿肚组成。
如上所指出的，联接蛋白基因还与大百分比的非综合征性耳聋的情况相关。存在几种其它的相关神经系统病变和耳聋综合征。具有智力迟钝的常染色体的隐性脱髓鞘性神经系统病变、I型和II型常染色体的显性遗传性神经系统病变和X连锁遗传性轴索型神经系统病变都与所有耳聋相关。
戈尔登哈尔综合征：眼-耳-脊椎发育异常(OAVD)或戈尔登哈尔综合征最初描述于1881年。它包括复杂的特征，包括半面小耳畸形、耳下骨骼发育不全、眼球上的结膜脂肪皮样囊肿、先天性虹膜缺损和由发育性血管和遗传性场偏差引起的脊椎骨异常。它具有多种多样的病因，并且不归因于单个遗传位点。发病率大约是1/45,000。
Jervell和Lange-Nielsen综合征：Jervell和Lange-Nielsen综合征与心律失常相关。通过延长QT间隔，存在尖端扭转性室速心律失常(转折点，关于显然交替阳性和阴性QRS复合物)、突然晕厥发作，以及严重的到深度的感音神经性听觉损失。
Mohr-Tranebjaerg综合征(DFN-1)：Mohr-Tranebjaerg综合征(DFN-1)是X连锁隐性综合征性听觉损失，其特征是在儿童时后舌感音神经性耳聋，接着是进行性肌张力异常、肌肉痉挛、吞咽障碍和视神经萎缩。所述综合征由被认为会导致线粒体功能障碍的突变引起。它类似称为佛莱德立希共济失调的脊髓小脑退化，其也可能会展示感音神经性听觉损失、共济失调和视神经萎缩。佛莱德立希共济失调的心肌病特征在Mohr-Tranebjaergt综合征中未看到。
诺里病：诺里病的典型特征包括特定的眼睛症状(视网膜假瘤、视网膜增生、视网膜内层的发育不全和坏死、白内障、眼球痨)、进行性感音神经性听觉损失，以及精神纷乱，尽管少于一半的患者是听觉受损的或智力迟钝的。
Pendred综合征：Pendred综合征是与甲状腺疾病(甲状腺肿大)相关的耳聋。
Stickler综合征：Stickler综合征由COL11突变引起。它的特征是听觉受损、中脸发育不全、生命第一年中进行性近视，以及关节病。
Treacher Collins综合征：Treacher Collins综合征(OMIMentryTCOF1)的特征是下眼睑(上眼睑涉及Goldenhar综合征)的先天性虹膜缺损、小颌畸形、小耳畸形、颧弧发育不全、巨口畸形，以及跟中间眼角相比侧面眼角的劣等移位。
Waardenburg综合征：I型和II型Waardenburg综合征(WS)的临床症状包括每个眼睛内眦的侧面移位、头发、虹膜和皮肤的色素异常(经常是白色额发和虹膜异色)，以及感音神经性耳聋。I型WS的特征与上肢畸形的结合已经被称为Klein-Waardenburg综合征或III型WS。隐性遗传的II型WS特征与Hirschsprung疾病的结合已经被称为Waardenburg-Shah综合征或IV型WS。
Usher综合征：Usher综合征的特征是听觉损害和色素性视网膜炎。Usher综合征可基于临床发现分类为三种不同的类型。在I型中，存在听觉损害和前庭觉损害。在II型中，存在听觉损害而没有前庭觉损害。在III型中，存在不同数量的前庭觉损害。
线粒体疾病：听觉损失在包括MELAS的线粒体疾病(线粒体脑肌病、乳酸中毒和类中风发作)、Kearns-Sayre综合征和MERRF(具有粗糙红色纤维的肌阵挛性癫痫)中是常见的。这些疾病由线粒体DNA突变引起，特征是肌肉虚弱、具有“粗糙红”纤维的异常肌肉活检，以及定义特定临床表现型的各种其它发现。在MELAS中，听觉损失由耳蜗损害引起。它类似老年性耳聋，类似处在于它通常是对称的、渐进的，并且会先影响较高频率。其他人也报告了与线粒体突变相关的听觉损失。线粒体DNA突变在生命过程中会自然积累，并且目前被表明是正常老化的重要原因。已经报道线粒体缺陷会导致氨基糖苷类的不正常敏感性以及非综合征性感音神经性耳聋。
Mohr-Tranebjaerg综合征(DFN-1)也被认为会通过线粒体紊乱导致耳聋。
非遗传性先天性耳聋：这些类型的畸形大约占先天性耳聋的20％，其余的在起源上是遗传性的。
内耳发育不全性发育异常：正常的耳蜗具有两个半转弯。耳蜗畸形由膜畸形、骨质畸形、或者这两者的组合组成。如果耳蜗发育在胚胎时被抑制，会出现普通的洞，而不是蜗牛状耳蜗。这称作内耳发育不全性发育异常或畸形。
内耳的内淋巴和淋巴管周围性空间和蛛网膜下空间之间的异常沟通经常伴随内耳发育不全性发育异常。它通常由内听管侧端的筛状区域的缺陷引起，大概是因为该异常通道，淋巴管周围性瘘在这一疾病中更常见。
作为一种相关的异常现象和更严重的综合征，CHARGE联合体由先天性虹膜缺损、心脏病、鼻后孔鼻锁、迟延发育、生殖器发育不全、包括外耳发育不全和听觉损失的耳部异常现象组成。这些个体具有内耳发育不全性类型的畸形和半规管的缺少。
大前庭导水管综合征：大前庭导水管综合征被定义为在CT扫描中在岛盖和总脚中间测量的直径大于或等于1.5mm。
最近已经开发了具有革命性基因疗法可能性的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)核酸内切酶基因编辑。CRISPR使用Cas9和向导RNA来针对特定切割靶向任何基因组序列，导致任何基因的破坏或修复。所述过程可应用于突变基因(不管突变的特征如何(隐性或显性))，实现永久性矫正并恢复正常的基因功能。
针对CRISPR的常规方法涉及使用病毒载体来将Cas9和向导RNA(sgRNA，一种与靶向基因组区域20-29bp同源的模板)递送到细胞以进行基因编辑。但是，病毒基因组永久性保持在细胞内(对于内耳它意味着整个生命过程中)，具有不确定的后果(例如免疫原性反应、潜在重组)。此外，CRISPR介导的体内靶向切割的效率相对较低(低于5％)。
相对于以前方法的一个主要改进是将蛋白和核酸复合物直接递送到细胞中以进行CRISPR介导的基因编辑。该方法会容许蛋白和核酸的短暂递送，在它们起作用后会被降解，从而限制可能的由于两者长期存在于细胞中会引起的副作用。蛋白与核酸的组合的递送在体内或体外尚未实现。
基于阳离子脂质制剂的核酸递送已经被高效地广泛使用，效率较高。脂质体的脂质双层保护包封的核酸免受降解，并且可防止被抗体中和。重要的是，在核内体成熟过程中脂质体与核内体膜的融合可使得阳离子脂质递送的物质能够进行有效的核内体逃逸。由于一些天然蛋白或具有修饰的蛋白可以是高度阴性的(阴离子)，使用基于脂质体的载体来将蛋白高效地直接递送到细胞中是可能的。进一步还可能将阴离子蛋白和核酸(其为阴离子)的递送与脂质体递送一起结合。
相应地，在一些实施例中，体外或体内基因编辑的方法包含在体外接触细胞或者给需要治疗的患者施用治疗有效量的在此体现的组合物或分子。在另一个实施例中，在体外或体内靶向特定的蛋白、肽、核酸的方法，包含：在体外接触细胞或者给需要治疗的患者施用治疗有效量的在此体现的组合物或分子。
在另一个实施例中，在体外或体内递送治疗剂的方法包含在体外接触细胞或者给需要治疗的患者施用治疗有效量的在此体现的组合物或分子。
在另一个实施例中，治疗与需要的患者中遗传性突变相关的耳聋的方法包含给患者施用治疗有效量的包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白或肽的嵌合分子。嵌合分子靶向患者中一个或多个与耳聋相关的遗传位点并调节遗传位点的复制、表达、运转或活动。可赋予异常表现型(例如耳聋)的基因型变异包含：其中异常基因被表达的突变、插入、缺失、取代或其组合。在实施例中，嵌合分子包含一种或多种基因编辑剂，用来抑制与患者耳聋相关的遗传位点。这些基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、重组酶、核酸酶、结合DNA的蛋白或核酸或其组合。
在一些实施例中，治疗与需要的患者中遗传性突变相关的耳聋的方法包含给患者施用治疗有效量的包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合的嵌合分子。
在实施例中，阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。寡核苷酸或多聚核苷酸的实例包括：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、干涉RNA、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
在实施例中，嵌合分子被包封在阳离子脂质体中并被施用到患者内耳。
在另一个实施例中，治疗受由遗传性突变引起的耳聋困扰的患者的方法包含：给患者内耳施用包封治疗有效量的阴离子分子的阳离子脂质体，所述阴离子分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。在这些实施例中，嵌合分子靶向患者中一个或多个与耳聋相关的遗传位点并调节遗传位点的复制、表达、运转或活动。这些与耳聋相关的遗传位点包含：突变、插入、缺失、取代或其组合。阴离子分子包含一种或多种基因编辑剂，用来抑制与患者耳聋相关的遗传位点。这些基因编辑剂的实例包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
会导致例如非综合征性耳聋的基因突变的非穷举实例非限制性地包括ACTG1、CDH23、CLDN14、COCH、COL11A2、DFNA5、ESPN、EYA4、GJB2、GJB6、GRXCRl、KCNQ4、MY03A、MY015A、MY06、MY07A、OTOF、OTOA、PCDH15、POU3F4、RDX、SLC26A4、STRC、TECTA、TMC1、TMIE、TMPRSS3、USH1C、WFS1和WHRN基因的突变会导致非综合征性耳聋，目前有较弱证据表明也包括基因CCDC50、DIAPH1、DSPP、ESRRB、GJB3、GRHL2、GRXCRl、HGF、LHFPL5、LOXHDl、LRTOMT、MARVELD2、MIR96、MYH14、MYH9、MYOIA、MY03A、OTOA、PJVK、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、SERPINB6、S1X1、SLC17A8、TPRN、TRIOBP和WHRN。
相应地，可靶向任意一种或多种基因或者与耳聋相关的遗传位点。在其它实施例中，施用在此体现的分子来治疗受与耳聋相关的疾病或疾病困扰的患者。这些疾病或疾病的实例包括：耳鸣、听觉过敏、ADHD。
在一些实施例中，基因编辑剂包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。
在其它实施例中，阴离子分子包含任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到如SEQ ID NOS:1到123所列的序列。在另一个实施例中，一个或多个序列包含SEQID NOS:1到123。
在另一个实施例中，一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到19。
在其它实施例中，嵌合分子或者包封的嵌合分子或阴离子分子以药物组合物施用。
在另一个实施例中，治疗受耳聋或相关疾病困扰的患者的听觉损失的方法包含给患者内耳施用包封治疗有效量的阴离子分子的阳离子脂质体，所述阴离子分子包含与带负电荷的分子复合、融合或链接的蛋白或肽。嵌合分子靶向患者中一个或多个与耳聋或其相关疾病相关的遗传位点并调节遗传位点的复制、表达、运转或活动。阴离子分子可再生和/或修复细胞、组织、神经元、细胞间的连接、神经元和组织和/或防止对细胞、神经元和组织的损害。一种或多种与耳聋及其相关疾病相关的遗传位点包含：突变、插入、缺失、取代或其组合。基因编辑剂的实例包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。在一个实施例中，阴离子分子包含任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到如SEQ ID NOS:1到19所列的序列。在另一个实施例中，一个或多个序列被陈述为SEQ ID NOS:1到19。
药物组合物：用作治疗化合物的嵌合分子的类型和量可根据技术人员可获得的任何信息被认为具有治疗活性。例如，原型化合物可根据医师桌面参考手册(Physician'sDesk Reference)中包含的信息被认为具有治疗活性。另外，通过非限制性实例的方式，治疗化合物可根据临床医师的经验、化合物结构、结构活性关系数据、EC50、试验数据、IC50试验数据、动物或临床研究、或任何其它根据、或者此类根据的组合被认为具有治疗活性。
治疗活性的化合物是具有治疗活性(包括例如当给主体施用时或进行体外测试时化合物可引起特定反应的能力)的化合物。治疗活动包括疾病或状况的治疗，包括预防性治疗和改善性治疗。疾病或状况的治疗可包括任何程度的疾病或状况的改善，包括疾病或状况的防止、改善和去除。可针对任何疾病或状况进行治疗活动，在优选实施例中包括针对会受益于组织或细胞质解离的任何疾病或疾病，例如。为了确定治疗活性，可使用通过其化合物的治疗活性可被评估的任何方法。例如，体内和体外方法均可使用，包括例如临床评估、EC50和IC50分析，以及剂量反应曲线。
在一些实施例中，药物组合物包含包封在此体现的嵌合分子的阳离子脂质。在其它实施例中，分子包含一个或多个如SEQ ID NOS:1到19所列的序列。在另一个实施例中，一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到123。
在另一个实施例中，药物组合物包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质，所述嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。
在另一个实施例中，药物组合物包含包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合的嵌合分子。
在另一个实施例中，组合物包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质，所述嵌合分子包含与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的一种或多种蛋白或肽。在实施例中，一种或多种阴离子分子包含一个或多个阴离子区域或者与阴离子核酸区域结合。优选地，一种或多种阴离子分子为嵌合分子赋予总体净负电荷。在一个实施例中，阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。在其它实施例中，寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、干涉RNA、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
在另一个实施例中，一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。在实施例中，蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。在实施例中，基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
在另一个实施例中，嵌合分子包含一种或多种可检测标记物、阴离子、放射性标记物、标签、靶向剂或其组合。
制剂、施用：本文体现的组合物被配制成可通过任何合适的方法施用，例如，如在《雷明顿：药学科学和实践(Remington:The Science And Practice Of Pharmacy)》(第21次编辑，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins))中所述。示范性的给药途径包括但不限于肠胃外给药、口服、皮下注射、局部给药、肌肉注射、经皮给药、经粘膜给药、舌下给药、鼻腔给药、经血管给药、皮下注射、眼窝给药、或其组合。
试剂盒：在又一个方面，本发明提供了试剂盒，用来靶向细胞核酸序列和与靶分子调节相关的分子。例如，试剂盒可用来靶向任何期望的核酸序列，并且据此可具有许多应用。
在一个实施例中，试剂盒包含：(a)阳离子脂质、和嵌合分子或包封的嵌合分子、或蛋白和单独的聚阴离子分子、或其任意组合，以及(b)为细胞或个体施用治疗有效量的组合物的使用说明书。在一些实施例中，试剂盒可包含用来施用组合物的药学上可接受的盐或溶液。任选地，试剂盒可进一步以标签或单独插件的形式包含合适的操作参数的使用说明书。例如，试剂盒可具有标准使用说明书，来指导医师或实验室技术人员制备某一剂量的嵌合分子。
任选地，试剂盒可进一步包含标准或对照信息，从而患者样品可与对照信息标准对比，以确定嵌合分子的测试量是否为与例如治疗患者耳聋相符合的治疗量。
尽管本发明的各个实施例已经在以上进行了描述，但应理解，它们仅以举例方式而非限制方式呈现。在不脱离本发明的精神或范围的情况下可根据本文公开对所公开的实施例进行许多改变。因此，本发明的广度和范围不应被任何以上所述实施例限制。
本文提到的所有文件通过引用并入本文。本申请引用的所有公开物和专利文件，对所有目的皆相同，通过引用并入本文，如同独自地代表每一个独自的公开物或专利文件一样。通过它们在本文件中引用各种参考资料，申请人不承认任何特定的参考资料是他们发明的“现有文献”。本发明组合物和方法的实施例在以下实例中进行了说明。
实例
以下非限制性实例用来说明所选择的本发明实施例。应认识到，所示组分的比例变化和元素选择对于本领域技术人员是显而易见的并且在本发明实施例的范围内。
实例1：基因组编辑蛋白的体外和体内有效递送。
可以假设，被改造为高度负电荷的或其为天然高度阴离子性的蛋白可能能够充分利用被阳离子脂质体试剂用来递送核酸的相同的静电驱动的复合和包封。尽管很少蛋白天然具有在核酸磷酸酯骨架中发现的负电荷的密度，据推测与聚阴离子分子的转译融合或非共价复合可赋予所得蛋白或蛋白复合物足够的阴离子性，以被常规阳离子脂质试剂有效复合。
在该研究中，证明蛋白与改造的超负电荷GFP的融合(Lawrence，M.S.等J.Am.Chem.Soc.129，10110-10112(2007))使得能够进行有效的复合并通过通常用来转染核酸的阳离子脂质将蛋白递送到培养的哺乳动物细胞中。该方法甚至在低纳摩尔的蛋白浓度下和在存在血清的情况下也是有效的，导致与使用与阳离子肽或蛋白融合的方法相比效力高>1,000倍的功能性蛋白递送。递送效率取决于融合蛋白的净电荷，并且像3xFLAG和VP64这样的天然阴离子肽标签也可使得能够进行脂质介导的蛋白递送。进一步显示，与聚阴离子单向导RNA(sgRNA)复合的Cas9核酸酶蛋白可使用阳离子脂质制剂以功能型有效递送到哺乳动物细胞中。Cas9:gRNA复合物的递送是高度有效的(单独治疗可获得培养的人细胞高达80％的修饰)，并且还会引起与质粒转染相比更高的基因组修饰特异性，在人细胞中通常导致高>10倍的在靶脱靶DNA修饰比例。最后，证明该蛋白递送方法通过将功能性Cre重组酶和功能性Cas9:sgRNA复合物递送到活的小鼠内耳中的毛细胞在体内可以是有效的。
本文获得的结果，通过阳离子脂质细胞内递送聚阴离子蛋白和蛋白:核酸复合物，会显著扩大研究和包括基因编辑剂在内的蛋白治疗应用的范围。
方法
本研究使用的寡核苷酸：所有寡核苷酸从集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies)购得。
用来产生PCR产物的引物用作用于sgRNA的T7转录的底物。在所有情况下都使用T7_gRNA-Rev。所用的DNA模板是EGFP sgRNA质粒。用于dCas9-VP64激活物实验的NTF3和VEGFsgRNA已经在之前进行了报道(Maeder，M.L.等人，Nat.Methods10，977-979(2013))。
用于产生线性DNAPCR产物用于转染的的引物。在作为模板的含有U6启动子的质粒上使用下文列出的PCR_sgRNA-fwdl、PCR_sgRNA-rev2和适当的PCR_sgRNA引物的PCR延伸(72℃，3分钟)。
PCR_gRNA-fwdl CTGTACAAAAAAGCAGGCTfTA(SEQ ID NO:29)；
PCR_gRNA-rev2
AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC(SEQ ID NO:30)；
PCR-G-GFPl
GAAAGGACGAAACACCGGCCTCGAACTTCACCTCGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:31)；
PCR-G-GFP3
GAAAGGACGAAACACCGGCAGCTCGATGCGGTTCACCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:32)；
PCR-G-GFP5
GAAAGGACGAAACACCGGCTGAAGGGCATCGACTTCAGTTfTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:33)；
PCR-G-GFP7
GAAAGGACGAAACACCGGCAAGGAGGACGGCAACATCCGTTfTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:34)；
PCR-G-CLT2
GAAAGGACGAAACACCGGCAGATGTAGTGTfTCCACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:35)；
PCR-G-EMX
GAAAGGACGAAACACCGGAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGTTITAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:36)；
PCR-G-VEG
GAAAGGACGAAACACCGGGGTGGGGGGAGTTTGCTCCGTTITAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ IDNO:37).
进行T7核酸内切酶1DNA切割试验的引物。
人类基因组中在靶和脱靶位点的高通量测序的引物。
Cas9、Cre和TALE融合物和sgRNA表达质粒的构建。所使用的所有构建体的序列在以下列出。所有蛋白构建体均从之前报道的用于克隆到pET29a表达质粒中的目标蛋白的质粒产生。
酿脓链球菌Cas9和其它蛋白的表达和纯化。将大肠杆菌BL21STAR(DE3)感受态细胞(生命技术公司(Life Technologies))用编码融合于N端10xHis标签/麦芽糖结合蛋白的酿脓链球菌Cas9的pMJ806转化(Pattanayak，V.等，Nat.Biotechnol.31，839-843(2013))。在37℃下将所得表达菌株过夜接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养液中。将细胞以1:100稀释到相同的生长培养基中，并在37℃下生长至OD600＝-0.6。将培养物在20℃下温育30分钟，并以0.5mM添加异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)，以引发Cas9表达。在～16h后，通过离心在8,000g下收集细胞，并重悬于溶解缓冲液(50mM三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)-HCl，pH8.0，1MNaCl，20％甘油，10mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP))中。细胞通过超声溶解(1秒脉冲开，1秒脉冲关，在6W输出下总计15分钟)，并且可溶溶解物通过在20,000g下离心30分钟获得。
将细胞溶解物与His-Pur镍-氮川乙酸(镍-NTA)树脂(赛默科技(ThermoScientific))在4℃下温育30分钟以捕捉His标签的Cas9。将树脂转移到20-mL柱并用20柱体积的溶解缓冲液洗涤。Cas9在50mM Tris-HCl(pH8)、0.1MNaCl、20％甘油、10mM TCEP和300mM咪唑中洗脱，并通过Amicon超离心过滤器(Millipore，100-kDa分子量截留)浓缩至-50mg/mL。6xHis标签和麦芽糖-结合蛋白通过TEV蛋白酶在4℃下处理20小时除去并通过第二个Ni-亲和性纯化步骤捕捉。将含有Cas9的洗脱液在含有50mM Tris-HCl(pH8)、0.1MNaCl、20％甘油和10mM TCEP的纯化缓冲液中注射到HiTrapSPHP柱(通用医疗(GEHealthcare))中。将Cas9用含有从0.1M到1M的线性NaCl梯度的纯化缓冲液洗脱5个柱体积。将含有Cas9的洗脱级分浓缩至如通过二辛可宁酸分析(BCA)(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology))定量的200μΜ的浓度，在液氮中速冻，并在-80℃下以等分试样储存。所有其它蛋白均通过该方法纯化，但是没有TEV切割步骤并且含有(-30)GFP的蛋白使用相同的纯化方案使用Hi-TrapQHP阴离子交换柱(通用医疗)通过阴离子交换纯化。
sgRNA的体外转录。根据厂商使用说明书，使用T7高产率RNA合成试剂盒(NEB)对含有T7启动子结合位点的线性DNA片段接着是20-bpsgRNA靶序列进行体外转录。体外转录的RNA用乙醇沉淀，并通过凝胶电泳在Criterion10％聚丙烯酰胺TBE-Urea凝胶(Bio-Rad)上纯化。在4℃下在摇动表面上将切取的凝胶片段过夜提取到420μL的300mM NaCl中。凝胶纯化的sgRNA用乙醇沉淀并重新溶解于水中，并且sgRNA浓度最终通过UV吸光度定量并在-80℃下速冻。
质粒转染。质粒DNA使用脂质体2000(生命科技(Life Technologies))根据厂商方案转染。对于TALE激活物质粒，300ng的DNA被转染，对于激活物协同实验，60ng的5种质粒的每种被聚集并和转染。对于Cas9核酸酶递送实验，表达sgRNA的线性DNAPCR产物被用于转染实验，其靶向CLTA、EMX、VEGF和GFP(sgRNAGFPgl、GFPg3、GFPg5和GFPg7用于切口酶研究)中的基因组位点。线性DNAPCR产物使用含有U6启动子的质粒作为模板和携带U6启动子上游序列的正向引物和含有U6下游序列继之以sgRNA序列(对每个靶点独特的20-bp序列加上恒定的sgRNA骨架结构序列)的逆向引物产生。从线性DNA模板表达的sgRNA含有至少两个5'鸟苷以匹配需要这些碱基用于T7转录的体外转录的sgRNA。引物序列和PCR条件在下文列出。对于dCas9激活物实验，700ng的Cas9或dCas9-VP64质粒DNA被与250ng的适当的sgRNA表达质粒共转染。对于激活物协同实验，来自6种sgRNA的每种的50ngDNA被聚集并与700ng的dCas9-VP64质粒共转染。
在细胞培养物中与阳离子脂质复合的转录因子蛋白的递送：简而言之，将培养的细胞以次日达到-70％汇合所需的细胞密度以48-孔形式(250μL体积)铺板于在具有10％FBS(“完全血清培养基”)和抗生素的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Media)加GlutaMAX(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技)中。在递送至少1小时之前，将完全血清培养基用不含有抗生素的相同培养基替换。Cre和TALE蛋白的递送通过将1nM到1μΜ的蛋白(in275final体积)与0.5-1.5μL的可商购阳离子脂质结合在25μL的OPTIMEM培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技)中根据常规质粒转染的厂商方案(包括温育时间)进行。对于体外Cas9递送，转录的sgRNA在与阳离子脂质试剂复合之前与Cas9蛋白温育5分钟。将OPTIMEM培养基中的25μL脂质复合物添加到细胞，并且培养基在12-16小时后用新鲜的培养基替换，除非另外指出。递送48小时后对细胞分析重组，对于基因激活是递送后4小时或16小时，而对于基因修饰则是递送后48小时。
检测基因组修饰的T7核酸内切酶1分析。U2OS-EGFP细胞或HEK293T细胞用如上所述的Cas9表达和sgRNA表达质粒或线性DNAPCR产物转染，或者仅用Cas9蛋白、仅用体外转录的sgRNA、或仅用RNAiMAX处理。转染2天后使用DNAdvance试剂盒(Agencourt)按照厂商使用说明书将基因组DNA从细胞分离。200ng的基因组DNA在PCR反应中被用作模板，以使用本文指定的侧翼侦测引物对扩增靶向基因组的基因位点。PCR产物用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并用QUANT-ITTMPICO绿色dsDNA试剂盒(生命科技)定量。250ng纯化的PCRDNA与2μLNE缓冲液2(NEB)在19μL的总体积中结合并变性，然后用以下热循环重退火：95℃5分钟，以2℃/s从95℃到85℃；以0.2℃/s从85到20℃。重退火的DNA与1μl T7核酸内切酶I(10U/μΙ，NEB)在37℃下温育15分钟。将10μL50％甘油加入T7核酸内切酶反应中，并在在200V下电泳30分钟的5％TBE18孔CriterionPAGE凝胶(Bio-Rad)上分析12μL，然后用lxSYBRGold(生命科技公司)染色30分钟。Cas9引发的切割条带和未切割的条带在AlphaImager HP(Alpha Innotech)上可视化，并使用ImageJ软件(Schneider，C.A.等，Nat.Methods9，671-675(2012))定量。将切割条带的峰值强度除以所有条带的总强度(未切割的条带+切割的条带)以确定切割的分数，其如前所述用来估计基因修饰水平(Guilinger，J.P.等，Nat.Biotechnol.32，577-582(2014))。对于每个样品，在不同日分为三等份进行转染和随后的修饰测量。
干细胞培养和递送。含有永久性GFP基因插入的小鼠胚胎干细胞(ES)系Tau-GFP(A.Edge博士的好意，马萨诸塞眼科耳科诊所(马萨诸塞Eye&EarInfirmary)，波士顿)在具有10％FBS(Gibco)、100mM MEM非必须氨基酸(Gibco)、0.55mM 2-mercapto乙醇和白血病抑制因子(1,000unit/ml；Chemicon)的DMEM中培养。3天后形成呈现出GFP荧光的浮球。将Cas9:sgRNA与脂质体2000的复合物向含有浮球的培养物添加16小时。在处理Cas9:sgRNA后，将细胞在以上培养基中培养3天。将浮球用胰朊酶处理5分钟，然后通过70μm过滤器以收集单细胞。在标记之前，将细胞在涂有层粘蛋白的载玻片上在补充由1xΝ2、lxB27、青霉素-链霉素(100μg/mL)和10％FBS的DMEM/F12(1:1)中培养2天。免疫组织化学使用抗-GFP抗体(#abl3970，Abeam)进行以评估GFP表达。为了量化GFP阴性细胞的数目，对来自20X放大倍数下的三个代表性视场的GFP阳性细胞和GFP阴性细胞的总数目进行了记数，并计算了平均效率。对于每个条件进行三次了独立实验。
将蛋白微注射到小鼠内耳。将POfloxP-tdTomato小鼠(杰克逊实验室(TheJackson Laboratory))用于(-30)GFP-Cre注射并将P2Atohl-GFP小鼠(JJohnson博士，心德克萨斯大学西南医学中)用于Cas9:sgRNA注射。动物以由马萨诸塞眼科耳科诊所ALCUC委员会批准的方案使用。小鼠通过在冰上降低它们的温度进行麻醉。通过在耳朵后面制造切口进行耳蜗造口术以暴露耳蜗。使用微量操作器持握的玻璃微量移液管来将复合物递送到耳蜗管中，其容许到达内耳毛细胞。对于(-30)GFP-Cre的递送，将3μL的45μΜ蛋白与3μL的RNAiMAX或脂质体2000混合并在注射前在室温下温育30分钟。每个处理组注射4只小鼠。对于Cas9:sgRNA复合物的递送，在与3μL的RNAiMAX或脂质体2000混合并在注射前温育另外的30分钟之前，将1μL的200μΜCas9蛋白与2μL的100μΜsgRNA混合并在室温下温育5分钟。每个处理小组注射3只小鼠。每次注射的总递送体积是每个耳蜗0.3μL，并且释放通过微量操作器控制在32nL/sec的速度。
免疫组织化学和定量。注射5-10天后，杀死小鼠并通过标准方案收获耳蜗。对于免疫组织化学，遵循之前所述方案使用了针对毛细胞标记物(Myo7a和Esp)和支持细胞(Sox2)的抗体(Sage，C.等Science307，1114-1118(2005))。为了定量Cas9:sgRNA递送后(-30)GFP-Cre或GFP阴性细胞后TdTomato阳性细胞的数目，在跨越200μm的区域中在注射部位周围在耳蜗的底部转角(baseturn)对外毛细胞的总数目进行记数。将(-30)GFP-Cre-引发的重组或Cas9:sgRNA-引发的基因组修饰的效率计算为表达tdTomato或损失GFP表达的外毛细胞的百分比。
基因组修饰的高通量DNA测序。将HEK293T细胞用Cas9和sgRNA表达质粒或线性DNAPCR产物转染，或者用如之前为U2OS-EGFP报告细胞的Cas9蛋白递送所述的50nM Cas9蛋白、250nM纯化的sgRNA和阳离子脂质处理。对于基于质粒的转染实验，将700ng的Cas9表达质粒加上250ng的sgRNA质粒或表达sgRNA来靶向EMX1、CLTA2、或VEGF遗传位点的50ng线性DNAPCR产物用脂质体2000(生命科技)转染，并且2天后将细胞分离。对于体内蛋白递送实验，将～30mg的小鼠组织如之前所述从麻醉小鼠分离，并且将基因组DNA使用AgencourtDNA进步基因组DNA分离试剂盒(Agencourt DNA A dvance Genomic DNA Isolation Kit)(贝克曼库尔特(BeckmanCoulter))进行提取。对于细胞培养实验，将基因组DNA如上所述进行分离。将150ng的基因组DNA用作模板来用本文指定的侧翼HTS引物对通过PCR扩增在靶和脱靶基因组位点。粗PCR产物的相对量通过凝胶电泳定量，并且在用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化前将用不同sgRNA对处理的样品或Cas9核酸酶类型以等摩尔浓度单独聚集。使用5％TBE18孔CriterionPAGE凝胶(BioRad)将～150ng聚集的DNA在200V下电泳30分钟，并且将长度为-125bp到-300bp的DNA通过QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)分离并纯化。纯化的DNA用含有测序接头的引物通过PCR扩增，纯化，并如前所述在MiSeq高通量DNA测序仪(Illumina)上进行测序(Pattanayak，V.等，Nat.Biotechnol.31，839-843(2013))。
Cas9蛋白摄取的定量。Alexa Fluor 647C2马来酰亚胺(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技)被用来萤光标记表面半胱胺酸上的Cas9蛋白。在干燥DMSO中制备了10mM的Alexa647储备溶液。在0.4mL的反应中，10nMol的纯化的Cas9蛋白和200nMol的Alexa647马来酰亚胺在用于Cas9蛋白储存的缓冲液条件下合并。标记反应在4℃下温育16小时。在反应结束时，通过通过如上所述的阳离子交换色谱重新纯化标记的Cas9蛋白除去过量未共轭的Alexa647。为了测量递送到经处理的细胞中的蛋白的量，将20,000个细胞在处理1天前铺板于48-孔板的各孔中。在处理的当日，制备了50nM经Alexa647标记的Cas9(Cas9-Alexa647)和100nM EGFP1sgRNA用于如上所述的使用0.8μL脂质体2000的递送，并应用到细胞中。4小时后，除去Cas9-Alexa647:sgRNA含有脂质体的培养基，将细胞用含有20U/mL肝素的500μL的PBS洗涤3次。
将细胞胰蛋白酶化，并为如上所述的计数和流式细胞仪做准备。Cas9-Alexa647摄取通过流式细胞仪测量，而经处理的群体的10,000个细胞被转移到黑色、平底、不透明96-孔板。恰如针对Cas9-Alexa647递送所述通过将50pmol的Cas9-Alexa647蛋白与脂质体2000复合制作了Cas9-Alexa647的标准曲线，接着用96-孔板中每孔含有10,000个U2OS细胞的10％FBS在DMEM中进行2倍序列稀释。U2OS细胞的效果或者与脂质体2000在Alexa647荧光上的复合通过制作3个另外的Cas9-Alexa647标准曲线确定：(i)具有在缺少U2OS细胞的培养基中的脂质体2000，(ii)没有在含有U2OS细胞的培养基中的脂质体2000，以及(iii)没有在缺少U2OS细胞的培养基中的脂质体2000。
数据分析。用Unix Bash中编写的脚本对Illumina测序读数进行筛选和分析。DNA序列会被存储在NCBF测序读数文档(Sequencing Reads Archive，SRA)中，并且源代码可在配套软件(SupplementarySoftware)中找到。将测序实验的样品大小最大化(在实际的实验考虑内)，以确保最大能量来检测效果。对经Cas9修饰的基因组位点(表2)的统计分析如之前所述进行(Sander，J.D.等细胞核cAcidsRes.41，el81(2013))。
结果
与阴离子蛋白融合的Cre重组酶的高效递送：据推测，为基因组编辑蛋白赋予核酸的高度阴离子性静电特性可使得能够使用阳离子脂质将它们有效递送到哺乳动物细胞中(图1A)。对于非天然高度负电荷的目标蛋白，预想与天然的或改造的超负电荷蛋白的融合(Thompson，D.B.等MethodsEnzymol.503，293-319(2012))会赋予聚阴离子特性。对于核酸结合蛋白，据推测与天然DNA或RNA底物的简单复合可能会提供足够的阴离子特性，以支持基于阳离子脂质的递送(图1A)。
首先它被测试，以确定改造的超负电荷GFP变体(Lawrence，M.S.等J.Am.Chem.Soc.129，10110-10112(2007))、(-30)GFP是否能够调节复合和融合的蛋白物质的递送(图IB)。(-30)GFP与Cre重组酶转译融合以产生(-30)GFP-Cre；注意(-30)是指GFP部分的理论净电荷，不是融合物的净电荷。对各种可商购的阳离子脂质分析它们将(-30)GFP-Cre功能性递送到在Cre-介导的重组时仅表达DsRed的HeLa细胞的能力(图2A)。脂质体RNAiMAX(下面称作“RNAiMAX”，加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技)是设计用来递送siRNA的商用试剂。与含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中的1.5μL RNAiMAX复合的10nM(-30)GFP-Cre的递送在经处理的细胞中引起强烈的DsRed荧光信号。荧光激活细胞分类(FACS)显示，处理48小时后，52％的细胞表达了DsRed，与Cre重组一致(图2B)。
使用与含有10％FBS的250μL培养基中的1.5μL的RNAiMAX复合的25nM(-30)GFP-Cre，优化导致65％的重组效率(图2C)。当与阳离子蛋白介导的递送的效力对比时，脂质介导的(-30)GFP-Cre递送的效力是卓越的。仅需要具有阳离子脂质的1nM的(-30)GFP-Cre以产生15-20％的重组细胞，而需要1μΜ的(+36)GFP-Cre以获得这种程度的重组，相当于递送效力1,000倍的区别(图2C)。在第二个Cre报告细胞系(BSRTdTomato)中观察到几乎相同的结果(图7A)。在用来有效递送(-30)GFP-Cre的相同条件下，阳离子脂质没有增加中性或阳离子性Cre重组酶融合物的递送效力(图1C)，表明需要(-30)GFP-Cre的高度负电荷以参与阳离子脂质介导的递送。还观察到，增加阳离子脂质的量增加了最大重组需要的蛋白的浓度，与其中可递送蛋白与特定化学计量的阳离子脂质重新复合的模型一致(图2D)。这些观察共同表明，阳离子脂质可调节聚阴离子蛋白向哺乳动物细胞中的有力递送，甚至在存在血清的情况下。
为了对比，在HeLa报告细胞上质粒DNA转染的优化在一系列的质粒和脂质体2000剂量进行，并且发现该细胞系中的转染效率产生了最大33％的DsRed萤光细胞(图7B)。这些发现表明基于阳离子脂质的(-30)GFP-Cre蛋白递送可导致比公认的高效质粒DNA转染方法更高的功能性Cre重组酶活性。因为已知通过阳离子脂质的核酸转染会导致细胞毒性(Lv，H.等J.ControlledRelease114，100-109(2006))，特别因为核酸和脂质的量会增加，阳离子脂质介导的(-30)GFP-Cre蛋白递送的毒性被表征，并且结果被与质粒转染方法的那些进行对比。通过流式细胞仪使用TO-PRO-3活/死细胞染色(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技)对经过蛋白递送或质粒转染的细胞分析细胞存活率。尽管增加RNAiMAX的量可预见地增加了毒性(图7B)，但是使用1.5μL的RNAiMAX每275μL样品体积的具有10％FBS的DMEM最大化了蛋白递送的重组效率(>50％DsRed阳性的活细胞)，同时引起最小的细胞毒性(>80％活细胞，图7C)。相反，所有所测试的有效的质粒DNA递送条件呈现了高得多的毒性(图7D)，少于40％的细胞在导致>5％DsRed阳性活细胞的任何条件下的质粒转染后存活。这些结果表明，优化的阴离子Cre重组酶的阳离子脂质介导的递送会获得显著更高的递送的Cre的活性，毒性比优化的质粒DNA递送低得多。
为了确定与阳离子蛋白-介导的递送相比阳离子脂质介导的(-30)GFP-Cre递送的更高效力是来自细胞更多的总蛋白摄取，还是来自会进入细胞的功能性、非核内体蛋白分子的更高分数，流式细胞仪被用来测量在它们分别的最佳Cre递送条件下经(+36)GFP-Cre或脂质体(-30)GFP-Cre处理的细胞的GFP荧光。细胞荧光和重组效率的对比显示，(-30)GFP-Cre的脂质介导的功能性递送的效力在每一单位量的内吞蛋白比(+36)GFP-Cre的递送强9,800倍(图2A-2D)。总之，这些结果表明阴离子蛋白的脂质介导的递送的异常高的效力不是来自每个细胞中异常高的蛋白摄取，而是来自可能包括向细胞质的核内体逃逸和避免溶酶体蛋白降解的内吞作用后过程。
为了测试递送聚阴离子蛋白的能力是否取决于RNAiMAX中的专有成分或者其它阳离子脂质是否能够调节类似的有力递送，测试了设计成递送核酸的几种其它转染试剂(图2E)。尽管针对(-30)GFP-Cre，RNAiMAX仍然是最有效的功能性递送试剂，其它阳离子脂质制剂也导致有力递送。脂质体2000和脂质体LTX(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技)(两种基于阳离子脂质制剂的质粒转染试剂(Chesnoy，S.&Huang，L.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29，27-47(2000)))和SAINT-Red(荷兰格罗宁根的SynvoluxTherapeutics)(一种含有基于吡啶盐的合成阳离子脂质的siRNA递送制剂)在一系列浓度都导了致强劲的功能性(-30)GFP-Cre递送(图2E)。相反，阳离子脂质DOTAP(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏诊断(RocheDiagnostics))或基于肽的核酸递送试剂EZ-PLEX(佛罗里达州坦帕的AscensionBio)未观察到强劲的递送(图2E)。这些观察共同表明，几种但不是所有阳离子脂质能够与带负电荷的蛋白复合并将其递送到人细胞中。
据推测，应该可能使用阳离子脂质来递送(-30)GFP以外的聚阴离子蛋白。通常用于生物医学研究的改造的聚阴离子蛋白域包括广泛用于与改造的锌指阵列、TALE重复阵列、或用于转录激活的dCas9的融合中的VP64激活域(-22理论净电荷)，以及3xFLAG(-7理论净电荷)，一种用于蛋白纯化和可视化的表位标签(图2F)。观察到，VP64和3xFLAG两者均会增强使用阳离子脂质的Cre重组酶的功能性递送，尽管没有(-30)GFP那么有效，这很可能是由于它们较低的总体负电荷(图2F)。为了进一步探究净阴离子电荷与蛋白递送效率之间的关系，分别使用(-7)GFP和(-20)GFP产生了作为3xFLAG-Cre和VP64-Cre的两种新的具有可比电荷的阴离子GFP-Cre融合物。(-7)GPF-Cre和(-20)GFP-Cre融合物显示了与其类似电荷的经阴离子肽标签的对应物几乎相同的蛋白递送功效(图2F)，表明阴离子蛋白和具有可比净电荷的短阴离子肽会引起类似有效的阳离子脂质介导的蛋白递送。这些结果还证明，阳离子脂质的递送功效主要是净负电荷程度的函数，而不是带电荷的残基的分布或密度的函数，并且确认(-30)GFP以外的异常带负电荷的蛋白或肽也可以调节向哺乳动物细胞的高效的基于阳离子脂质的递送。
TALE激活蛋白的功能性递送：接下来测试了TALE-VP64转录激活物(大约+4理论净电荷，取决于所用TALE变体)向培养的人细胞中的脂质介导的递送。尽管递送的TALEN蛋白对内源基因适度有效的切割已经在哺乳动物细胞中在不存在血清的情况下使用像Arg9这样的阳离子肽证明(Liu，J.等PLoSONE9，e85755(2014))，但是基于TALE的转录因子蛋白的递送尚未被报道，并且之前没有描述过血清中TALE蛋白的有效递送。神经营养蛋白-3(NTF3)(一种已经被与神经退化性疾病相联系的神经生长因子)的基因被靶向(Tessarollo，L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，11844-11848(1994))。将之前所述的靶向NTF3的TALE-VP64(Maeder，M.L.等，Nat.Methods10，243-245(2013))与(-30)GFP融合(图3A)并用25nM(-30)GFP-NTF3TALE1-VP64和1.5RNAiMAX在为Cre递送优化的条件下处理HEK293T细胞。处理4小时后NTF3的基因表达水平在用25nM(-30)GFP-NTF3TALE-VP64和RNAiMAX处理的细胞中比未处理细胞、仅用RNAiMAX处理的细胞、或用靶向VEGF的TALE转录激活物处理的细胞高3.5倍(图3bB)。在转染编码相同的靶向NTF3的TALE-VP64的质粒48小时后观察到可比水平的NTF3表达(图3B)。
因为靶向同一基因上不同位点的多个TALE激活物的协同表达已经显示会增强基因激活(Maeder，M.L.等，Nat.Methods10，243-245(2013))，与(-30)GFP融合的5种不同的靶向NTF3的TALE激活物使用RNAiMAX同时递送。蛋白-脂质复合物通过添加5种每种均为5nM的(-30)GFP-NTF3-TALE-VP64蛋白如上所述制备总计25nM的蛋白。温育4小时后观察到优化6.5倍的NTF3表达的增加(图3B和图9A)，同时所有5种NTF3TALE激活物的质粒共转染，接着是48小时温育，导致NTF3表达水平的10倍增加(图3B)。为了描述与质粒DNA转染相比阳离子脂质递送的TALE激活蛋白作用的时间进程，蛋白或DNA递送后进行NTF3表达分析4到48小时。蛋白递送后的TALE激活物活性在处理～4小时后达到峰值并在44小时内下跌(图9B)，而质粒DNA转染则需要24小时来显示出高于背景水平的NTF3激活，其在～36-48小时达到平稳状态(图9B)。这些发现共同证明，TALE激活蛋白可使用阳离子脂质递送，以迅速和短暂地活化人细胞中的基因表达。可程控转录激活蛋白的递送可使得能够进行靶基因的一次性激活，同时避免长期基因表达，一个可程控转录因子的基于DNA的递送的一般忧虑。可证明这一能力对于在被瞬时表达时会实现细胞状态或细胞命运的一次性永久改变的蛋白是特别有价值的(Jopling，C，等，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.12，79-89(2011))。
Cas9:sgRNA蛋白:RNA复合物向人细胞中的高效递送：鉴于聚阴离子Cre和TALE激活蛋白变体在全血清培养基中有力的脂质介导的递送，据推测CRISPR-Cas9:sgRNA复合物(作为与(-30)GFP的融合物或作为天然聚阴离子Cas9:向导RNA复合物)也可以使用该方法递送到人细胞中。使用确立的Cas9引发的基因破坏分析(Fu，Y.等，Nat.Biotechnol.32，279-284(2014))靶向在人类U2OS细胞中的基因组EGFP报告基因内的特定位点(图10A)。在靶Cas9切割会引发EGFP中的非同源末端连接(NHEJ)和细胞荧光的损失。为了避免(-30)GFP荧光的干扰，Y67S突变被引入(-30)GFP中以除去它的荧光，并指定该非萤光变体为(-30)dGFP。
U2OS报告细胞用25nM(-30)dGFP-NLS-Cas9和具有RNAiMAX的50nM靶向EGFP的sgRNA在含有10％FBS的培养基中的处理显示在48％的细胞中损失EGFP表达(图4A)。在优化的质粒转染条件下表达Cas9或sgRNA的质粒的共转染在37％的细胞中导致EGFP损失(图4A)。在转染仅编码EGFP sgRNA、仅编码Cas9的质粒时或者在共转染编码Cas9的质粒和设计为靶向VEGF遗传位点的sgRNA时未观察到显著的EGFP破坏(图4A、图10B)。确定的是，对EGFP的有力破坏不是细胞毒性的结果(图I0C、10D)。还观察到，在存在10％FBS血清的情况下用(+36)dGFP-NLS-Cas9和sgRNA处理细胞没有引起有效的基因破坏(图4A)，表明Cas9和sgRNA的基于阳离子蛋白的递送方法可能无效，可能是由于阳离子蛋白对gRNA:Cas9复合物的形成或核酸酶功能的干扰(McNaughton，B.R.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106，6111-6116(2009))。与该模型一致，描述用寡聚精氨酸肽标签递送Cas9蛋白的一个近期研究使用了比本研究多几个量级的Cas9蛋白和sgRNA，重复给药，以获得中度水平的基因破坏(Ramakrishna，S.等，Genome Res.24，1020-1027(2014))。
DNA转染条件的优化没有产生高于40％的EGFP破坏(图11A)，并且与HeLadsRed细胞中Cre-编码的质粒的转染的以上结果类似，毒性在使用脂质体2000转染的U2OS细胞中是显著的(图11B)，在最大化EGFP破坏的条件下<50％的细胞会存活。总之，这些结果确定，与基于阳离子肽的蛋白递送或质粒DNA转染方法不同，(-3)dGFP-NLS-Cas9:sgRNA复合物的阳离子脂质介导的递送可导致人细胞中依赖于sgRNA的靶基因的有效破坏并具有最小的毒性。
聚阴离子sgRNA对于有效的脂质介导的Cas9递送是必须的和足够的：由于天然Cas9蛋白(+22理论净电荷)和sgRNA(～103个阴离子磷酸酯基团)的复合物总体上应该是高度阴离子性的，接下来对它测试未与聚阴离子蛋白融合的天然Cas9：sgRNA复合物是否可以使用阳离子脂质递送到人细胞中。使用100nM Cas9、100nM EGFP sgRNA和0.8μL RNAiMAX处理U2OS EGFP报告细胞导致了65％的EGFP报告基因破坏(图4A)。使用Cas9蛋白和sgRNA但不使用RNAiMAX处理细胞没有导致GFP荧光的损失(图4A)。这些观察表明，甚至在不存在超负电荷融合蛋白的情况下仅sgRNA就可以提供调节Cas9的基于阳离子脂质的递送需要的高度阴离子性特性。
来自(-30)dGFP-NLS-Cas9:sgRNA与Cas9:sgRNA的阳离子脂质介导的递送的基因破坏效率的对比显示，在低剂量下(-30)dGFP-NLS-Cas9会导致比天然Cas9更有效的基因破坏(图12A)，它在更高的浓度下，以及在两者中任一种蛋白的相应的最佳蛋白:sgRNA剂量下不如天然Cas9(图12B-12C)。这些结果进一步确定，sgRNA可提供足够的负电荷来支持复合的Cas9蛋白的基于阳离子脂质的递送。
还观察到，尽管总体上(-30)dGFP-NLS-Cas9的最佳递送比Cas9需要更少的蛋白，但是最大的(-30)dGFP-NLS-Cas9-介导的EGFP基因破坏比天然Cas9-介导的基因破坏需要更高的sgRNA:蛋白比例(图12D)。据推测，由于融合的(-30)dGFP可能会静电干扰Cas9:sgRNA复合，需要更多当量的sgRNA来与(-30)dGFP-NLS-Cas9复合。由于对于(-30)dGFP-NLS-Cas9介导的EGFP基因破坏的理想蛋白的剂量比野生型Cas9的低10倍，本文结果还表明，(-30)dGFP-Cas9会由于它更高的总体负电荷而比Cas9:sgRNA更有效地与阳离子脂质体形成复合物，但是该电荷的大小可能会干扰Cas9:sgRNA的相互作用，从而对于每个蛋白需要更多的sgRNA并可能会降低递送的Cas9的总活性。另外还产生和测试了NLS-Cas9和Cas9-NLS蛋白。观察到尽管NLS在(-30)dGFP-NLS-Cas9中的存在可至少部分解释在很低浓度下递送功效的不同，但是Cas9、NLS-Cas9和Cas9-NLS在25nM或更高的浓度下均会导致比(-30)dGFP-NLS-Cas9更高的EGFP破坏效率(图13A-13C)。据推测，(-30)dGFP-NLS-Cas9更低的总体性能是由于融合物相对于缺少(-30)dGFP的Cas9构建体更低的活性。尽管如(-30)dGFP-NLS-Cas9、NLS-Cas9、Cas9-NLS和Cas9的剂量反应曲线的形状所证明，似乎在更低的蛋白剂量下(-30)dGFP融合会改进复合和递送(图13A-13C)，由于大的阴离子融合配偶体存在于Cas9中而引起的活性降低会损害它的总体性能。
用RNAiMAX以外的阳离子脂质制剂对Cas9:sgRNA递送进行了测试。使用脂质体2000的EGFP破坏比使用RNAiMAX的显著更有效，导致高达80％的Cas9-介导的基因破坏(图14A)，并且甚至在1nM蛋白下仍保持高效(60％的基因破坏)(图14A)。但是，由于在细胞培养条件下脂质体2000(图14B)针对蛋白:sgRNA递送相较于RNAiMAX(图14C)稍微更高的毒性，RNAiMAX被用于随后的细胞培养研究。还观察到，增加Cas9:sgRNA的剂量增加了在恒定量的RNAiMAX或脂质体2000下的毒性(图14D)。这一关系可能是由于蛋白:RNA:脂质复合物在更高的Cas9和sgRNA浓度下越来越有效的形成，导致更多与细胞结合和被细胞内吞的总的转染物质，包括毒性阳离子脂质成分。
为了证实EGFP破坏来自基因组修饰而不是仅来自Cas9结合(Qi，L.S.等Cell152，1173-1183(2013))，T7核酸内切酶I(T7EI)分析(Guschin，D.Y.等MethodsMol.Biol.Clifton NJ 649，247-256(2010))被用来检测和定量Cas9-介导的基因组插入缺失突变(插入缺失)在靶向EGFP遗传位点(图4B)的频率。T7EI分析结果显示，处理48小时后只有经Cas9和EGFP sgRNA质粒两者处理的那些细胞或者Cas9蛋白和纯化的EGFP sgRNA在靶位点含有插入缺失。综上所述，这些发现确定，活性Cas9:sgRNA复合物可以取决于由sgRNA提供的负电荷的方式用阳离子脂质有效递送到人细胞中。
U2OS EGFP报告细胞使用与靶向EGFP、CLTA、EMX和VEGF的4种gRNA的混合物复合的Cas9的单个脂质介导的递送处理来处理。该处理导致了所有4个靶点的有效破坏，如T7E1切割试验所测量，切割效率分别是58％、28％、16％和40％。这些来自50nM Cas9和每种25nMsgRNA(总sgRNA为100nM)的单个递送的高的基因破坏效率证明，脂质介导的Cas9:sgRNA递送可支持有效的多种基因组编辑(图4C)。
Cas9切口酶和dCas9激活物的功能性递送：接下来测试了基于阳离子脂质的蛋白递送是否能够被延伸到递送其它衍生自Cas9的基因组改造工具，例如Cas9切口酶(Ran，F.A.等Cell154，1380-1389(2013))和基于Cas9的转录激活物(Maeder，M.L.等，Nat.Methods10，977-979(2013))。通过切口酶和适当配对的靶向EGFP的sgRNA质粒的共转染或者作为与成对的EGFP sgRNA(每个50nM)复合的100nM纯化蛋白使用RNAiMAX在来源于Cas9D10A切口酶的递送的U2OS EGFP报告细胞中测量了基因破坏效率(图4D)。双Cas9切口酶的质粒和阳离子脂质介导的蛋白:RNA递送仅在存在靶向相对链的sgRNA对(sgRNA对gl+g5，以及g3+g7)的情况下导致具有类似效率的EGFP破坏(图4D)，但是靶向相同链的sgRNA对(sgRNA对g5+g7)则没有导致(Fig4D)，与之前Cas9切口酶切割要求的报道一致(Guilinger，J.P.等，Nat.Biotechnol.32，577-582(2014))。
在来源于质粒转染或者融合于VP64激活域的dCas9的蛋白:sgRNA复合物的直接递送的HEK293T细胞中对比了NTF3转录激活效率(Maeder，M.L.等，Nat.Methods10，977-979(2013))。通过质粒转染或RNAiMAX-介导的蛋白递送对dCas9-VP64激活物的递送导致了强力的(>～10倍)NTF3转录的激活(图4E和图15A)。在每种递送方法的最佳分析时间来源于质粒转染的转录激活水平比来源于蛋白递送的激活更强力(图44)，可能是由于持续表达Cas9激活蛋白和来自质粒的sgRNA与短暂单剂量的纯化蛋白和sgRNA对比(图15B)。尽管以上结果表明此类因素不会限制通过递送的Cas9核酸酶和切口酶蛋白的不可逆基因组修饰的效力(图4A和4D)，但是递送的蛋白的低剂量和短暂性质可能会更强力地限制像转录激活这样的动态过程的效力。然而，这些结果共同表明，Cas9切口酶和Cas9转录激活物两者也均可被阳离子脂质介导的蛋白:sgRNA复合物递送有效递送。
Cas9:sgRNA递送会修饰基因组并导致比DNA转染更高的特异性：功能性Cas9:sgRNA复合物的无DNA的递送可避免与病毒或其它基因递送方法相关的风险，并且具有在靶向遗传位点被修饰后通过避免基因编辑剂的不必要表达改进基因组修饰的特异性的潜力。为了测试所采用的方法是否能够破坏人细胞中的内源基因，基因组基因位点EMX1、CLTA2和VEGF基因中被靶向，这是由于它们可能的生物医学关联性和它们在以前Cas9脱靶切割活性的研究中的用途(Fu，Y.等，Nat.Biotechnol.32，279-284(2014)；Guilinger，J.P.等，Nat.Biotechnol.32，577-582(2014)；Pattanayak，V.等，Nat.Biotechnol.31，839-843(2013))。Cas9:sgRNA复合物向HEK.293T细胞中的阳离子脂质介导的递送导致了所有3种人类基因的强健切割，效率与使用之前为U2OS细胞优化的相同Cas9:sgRNA递送条件通过T7EI分析显示的质粒转染方法的效率相当或更高(图5A)。
为了对比质粒相较于蛋白:RNA递送方法针对Cas9的内源基因修饰特异性，在靶遗传位点以及几种已知脱靶位点(表1)被从从在导致可比在靶修饰效率的条件下通过Cas9和sgRNA表达质粒的转染或者通过RNAiMAX-介导的Cas9:sgRNA复合物递送处理的HEK293细胞分离的基因组DNA扩增。通过高通量DNA测序分析了在3个在靶位点和11个脱靶位点的插入缺失频率(表2)。对于所有3种靶基因，来源于质粒或蛋白:sgRNA递送的在靶DNA修饰的频率是～10％(图16A、16B、16C)，使得能够在会导致非常类似的在靶基因组修饰效率的处理条件下对比两种技术之间的脱靶修饰。重要的是，与质粒递送相比，来自蛋白:sgRNA递送的所有11个脱靶位点的脱靶基因组修饰的频率更低，结果是，蛋白:sgRNA递送的针对测试的所有位点的在靶脱靶修饰比例的比例比质粒递送高至多19倍(图5B、5C、5D)。
在具有高水平脱靶修饰的基因位点(例如4个VEGF脱靶位点，针对它们质粒递送产生了在4倍和20倍之间的平均在靶:脱靶修饰比例，但是蛋白:sgRNA递送产生了在9倍和400倍之间的平均在靶:脱靶修饰比例)以及具有更低水平的脱靶修饰的基因位点(例如3个EMX脱靶基因位点，针对它们质粒递送产生了最低64倍的平均在靶:脱靶修饰比例，但是蛋白:RNA递送产生了500倍到2,000倍的平均在靶:脱靶修饰比例)，蛋白:sgRNA递送的DNA修饰特异性比质粒递送更高。
最后，观察到的Cas9蛋白递送的特异性的增加与在靶修饰频率之间的关系使用VEGF靶点和它的4个相关脱靶位点进行了测试。通过缩放递送的Cas9:sgRNA的量，Cas9-介导的在靶修饰比率在宽的范围内变换，所得条件会产生低(～1％)、中度(-10％)和高(-40％)在靶DNA修饰。开发了各种条件以实现可比范围的Cas9质粒转染的在靶修饰比率用于对比。在测试的条件下，观察到蛋白和DNA递送方法的在靶和脱靶修饰效率一起增加(图17A、17B)，从而在更高的蛋白或质粒递送剂量下特异性稍微更高，尽管绝对脱靶修饰总体增加(图17B-17F)。重要的是，观察到在在靶修饰的所有水平，Cas9:sgRNA递送总是导致比可比Cas9质粒DNA转染显著(通常～10倍)更高的在靶:脱靶修饰比例(图17C-17F)。综上所述，这些结果显示，使用阳离子脂质递送Cas9:sgRNA复合物可高效实现靶基因修饰，特异性比表达Cas9和sgRNA的DNA的递送显著更高。
针对蛋白:sgRNA递送的Cas9特异性的显著增加很可能是TALE-激活物和dCas9-激活物递送两者均直接观察到的递送的蛋白的短暂特性的结果(图3B、15B)。进行了时间进程实验，在处理后72小时的期限内通过来自蛋白:sgRNA或质粒DNA递送的Surveyor分析测量插入缺失修饰比率(图18)。尽管Cas9质粒转染后插入缺失在U2OS EGFP报告细胞中的形成在DNA递送后会继续增长72小时，但是蛋白:sgRNA递送在处理12到24小时后导致几乎最大的插入缺失修饰(图18)。总之这些结果证明，蛋白:sgRNA递送会迅速获得短暂剂量的Cas9:sgRNA活性，其会调节有效的基因组修饰并在脱靶修饰可积累到它从DNA转染后的长期表达产生的程度之前被降解。
最后，被细胞内化的蛋白的量使用基于阳离子脂质的蛋白递送方法定量。将Cas9蛋白用Alexa647标记，并将它以50nM与100nM sgRNA递送到U2OS细胞。4小时后，将细胞充分洗涤以除去结合的蛋白并胰蛋白酶化。测量细胞的Alexa647荧光，并与在存在相同的培养基、细胞和脂质的组合物的情况下已知的Cas9-Alexa647的量的标准曲线的荧光对比。发现几乎所有经处理的细胞具有内化的Cas9-Alexa647蛋白(图19A)，并且用于处理的总蛋白的4％被细胞内化(图19B)。与标准曲线的对比表明每个细胞进入3x107个Cas9-Alexa647分子，相当于0.4％的总细胞蛋白(Lodish，H.等《分子细胞生物学(Molecular CellBiology)》。(W.H.Freeman，2000))。但应注意，很可能大部分该蛋白在核内体内会被螯合，并且不能够马上实现基因组修饰(Thompson，D.B.等Chem.Biol.19，831-843(2012)；Gilleron，J.等，Nat.Biotechnol.31，638-646(2013))。
确定(-30)GFP-Cre的蛋白递送功效：为了确定与阳离子蛋白递送的效力相比脂质体-介导的(-30)GFP-Cre递送的更高效力是来自细胞更多的总蛋白摄取，还是来自被细胞摄取的更高比例的功能性、非核内体蛋白分子，使用了流式细胞仪来测量在它们相应的最佳Cre递送条件下被(+36)GFP-Cre或脂质体(-30)GFP-Cre处理的细胞的GFP荧光。不论核内体或非核内体的本地化，细胞荧光会报告总的内吞的(-30)GFP-Cre或(+36)GFP-Cre(Putney，S.D.&Burke，P.A.Nat.Biotechnol.16，153-157(1998))。尽管脂质介导的功能性Cre递送的高效，脂质介导的蛋白递送导致了令人惊讶的小的总蛋白摄取的增加(图8A)。尽管(+36)GFP-Cre处理以剂量依赖性的方式使细胞GFP荧光增加高达3个数量级(图8A)，与以前的报道一致(Putney，S.D.&Burke，P.A.Nat.Biotechnol.16，153-157(1998)；Mullen，L.等ExpertOpin.DrugDeliv.11，101-110(2014))，但是脂质体(-30)GFP-Cre处理引发了最多5倍的细胞GFP荧光增加。细胞荧光和重组效率的对比显示，(-30)GFP-Cre的脂质介导的功能性递送对于每单位量的内吞的蛋白比(+36)GFP-Cre的递送有力9,800倍(图8B)。
为了测试阴离子(-30)GFP与阳离子脂质的复合是否会干扰GFP荧光从而掩盖进入细胞mCherry的物质(其为萤光性的但不是高度阴离子性的)的真正的量，与(-30)GFP或(+36)GFP融合并将蛋白融合物递送到HeLa细胞。用PBS+肝素(20U/mL)将可能已经粘附到细胞表面但尚未进入细胞的蛋白洗掉之后，处理4小时和24小时后通过FACS对细胞分析mCherry荧光。观察到，(-30)GFP-融合的mCherry的脂质介导的递送仅导致细胞mCherry荧光的轻微增加，而在递送(+36)GFP-mCherry时mCherry荧光通常高>100倍(图8C)，表明与(-30)GFP的融合不会导致大量的蛋白物质进入细胞中。另外，将脂质添加到(-30)GFP-Cre没有可测量地改变GFP荧光信号(图8D)，尽管阳离子脂质和阴离子(-30)GFP显然会相互作用。综上所述，这些结果证明，异常高效力的阴离子蛋白的脂质介导的递送不是由每个细胞中异常高的蛋白摄取引起，而是由很可能包括避免蛋白降解和核内体向细胞质中的逃逸的内吞作用后过程引起。
脱靶切割试验的敏感性限制：用来检测基因组脱靶切割的高通量测序方法的敏感性被基因组DNA(gDNA)输入每个基因组靶位点的PCR扩增的量限制。一个1ng的人类gDNA样品仅代表～330个唯一的基因组，因此每个基因组位点仅存在～330个唯一的拷贝。每个基因组靶点的PCR扩增在总共150ng输入的gDNA上进行，其提供分别衍生自最多50,000个唯一的gDNA拷贝的扩增子。因此，高通量测序分析不能检测发生频率小于1/50,000(0.002％)的罕见基因组修饰事件(表2)。
Cas9:sgRNA向小鼠胚胎干细胞中的递送：迅速、有力且短暂的Cas9:sgRNA的阳离子脂质介导的递送以实现基因组编辑在干细胞中可能特别有用，其中在多个细胞分裂过程中的Cas9脱靶活性可导致不希望的突变和镶嵌性。为了测试Cas9:sgRNA递送在干细胞中的有效性，表达Tau-EGFP的小鼠胚胎干细胞(Li，H.等BMCNeurosci.10，122(2009))用Cas9和EGFP靶向性sgRNA处理。在标准干细胞培养条件下形成了EGFP阳性的浮球。这些浮球用与脂质体2000或与Cas9和脂质体2000复合的Cas9:sgRNA处理，没有sgRNA作为对照。处理3天后，在用Cas9:sgRNA处理的球中观察到与对照样品相比GFP荧光的降低(图20A)。将经处理的球解离，并且容许细胞附着到涂有层粘蛋白的盘上并分化成祖细胞。使用抗-GFP抗体的免疫组织化学确认经Cas9:sgRNA处理的样品的细胞中EGFP表达的坠落，许多细胞核缺少任何表面EGFP。相反，衍生自对照球的所有细胞都是EGFP阳性的(图20B)。从经Cas9:sgRNA处理的细胞收获的基因组DNA进行T7EI分析，产生在Tau-EGFP遗传位点插入缺失的明显证据(图20C)。从这一分析，从阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA递送以及Cas9和sgRNADNA的转染计算了24％的插入缺失频率。在缺少Cas9:sgRNA或含有Cas9和无关gRNA的对照样品中未检测到靶点修饰。这些发现证明，阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA递送可在小鼠胚胎干细胞中实现有效的基因破坏。
Cre重组酶和Cas9:sgRNA的体内阳离子脂质介导的递送：功能性基因编辑蛋白的体内高效递送可使得能够进行宽范围的应用，包括非病毒治疗基因组编辑以纠正遗传性疾病。为了评估活的哺乳动物中该蛋白的递送方法，选择了向小鼠内耳的递送，这是由于其有限空间、充分鉴定的内耳细胞类型、以及可使得能够进行听觉恢复研究的遗传性耳聋小鼠模型的存在。尝试了两种类型的蛋白向小鼠内耳中的体内递送。首先，测试了(-30)GFP-Cre蛋白的递送以评估内耳细胞类型靶向性和功能性蛋白递送的效率。第二，评估了Cas9:sgRNA复合物向内耳的递送，以确定阳离子脂质介导的蛋白:sgRNA复合物递送是否能够支持基于CRISPR的体内基因编辑。
已经显示，(+36)GFP-Cre可被递送到小鼠视网膜，尽管蛋白仅导致暗示无效体内递送的适度水平的重组转化。对于初始内耳递送实验，(-30)GFP-Cre与RNAiMAX复合，并且复合物被注射到出生后1天(PI)的具有基因组整合的floxed-STOPtdTomato报告物的报告小鼠的耳蜗中。与体外Cre报告细胞系一样，Cre向内耳细胞的功能性递送，接着是核内体逃逸、核定位以及Cre-介导的重组会导致tdTomato的表达。注射后，收获了耳蜗以用内耳细胞标记来进行免疫标记，用于与tdTomato的共定位。仅RNAiMAX注射被用作对照。在(-30)GFP-Cre和RNAiMAX的注射5天后，耳蜗外毛细胞(一种可检测声音的听觉感觉细胞)显示强烈的tdTomato信号，其与毛细胞标记myosinVila(Myo7a)共定位，证明向毛细胞的功能性Cre递送(图6A、6B)。在对照耳蜗中未检测到tdTomato表达(图6A)。tdTomato信号集中在耳蜗底圈的注射位点区域。在耳蜗基部平均33±3％的外毛细胞是TdTomato阳性的(P<0.001；平均值±SEM，n＝4)。
为了进一步确定阳离子脂质介导的(-30)GFP-Cre蛋白递送对靶细胞的影响，在注射后10天后检查了毛细胞纤毛，一种对于听觉必要的精细结构。TdTomato阳性的外毛细胞具有如通过espin表达成像的典型的纤毛结构，与对照纤毛类似(图6B)。再一次，在对照耳蜗中未检测到tdTomato表达。这些观察表明，阳离子脂质介导的(-30)GFP-Cre蛋白的递送会在耳蜗外毛细胞中引起重组而不会明显影响毛细胞结构。
由于靶物体积、蛋白剂量和体内sgRNA剂量与细胞培养实验中的不同，因此在不同的递送条件下重复了以上实验。由于它较高的体外活性(图13A)，测试了使用脂质体2000的递送，并且观察到显著更高的重组效率：在用(-30)GFP-Cre+脂质体2000处理的耳蜗中91±5％的外毛细胞是TdTomato阳性的(图6C)。与对照样品相比，观察到一些外毛细胞的丢失(图6C)，这与之前观察到的脂质体2000的较高细胞毒性一致，尽管保持了总体耳蜗结构。
为了测试体内Cas9:sgRNA递送的有效性，将Cas9和靶向EGFP的sgRNA与RNAiMAX结合，并将所得复合物注射到出生2天后(P2)的转基因Atohl-GFP小鼠耳蜗中，其中所有毛细胞在毛细胞特异性增强剂的控制下为转录因子Atohl表达GFP(Lumpkin，E.A.等GeneExpr.PatternsGEP3，389-395(2003))。使用该模型，Cas9:sgRNA-介导的EGFP的破坏导致外毛细胞中EGFP荧光的损失。在具有阳离子脂质的Cas9:sgRNA的注射10天后，观察到在13％的注射位点附近的外毛细胞中缺少GFP。相反，经Cas9蛋白和没有任何sgRNA的RNAiMAX注射的对照耳蜗未显示EGFP信号的损失(图6D)。经Cas9:sgRNARNAiMAX复合物注射的耳蜗的外毛细胞似乎未受到影响，具有Myo7a的常规表达和健康的细胞核，与最小的毛细胞毒性一致(图6D)。从耳蜗组织样品分离的基因组DNA的高通量DNA测序显示了与经处理的样品中的GFP靶基因破坏一致的插入缺失，但缺少sgRNA的对照样品则未显示(图21A)。另外，使用靶向EMZ基因的sgRNA的Cas9:sgRNA的内耳体内递送被重复并类似地观察经处理的动物但不是对照动物中EMX基因的插入缺失(图21B)。
由于与脂质体2000复合的(-30)GFP-Cre导致了靶向毛细胞群体相较于与RNAiMAX复合的(-30)GFP-Cre更有效的修饰(图6A，6C)，其用途如上所述对向Atohl-GFP耳蜗的Cas9:sgRNA递送进行了测试。10天后在注射位点附近20±3％的外毛细胞中观察到GFP表达的损失，而所有外毛细胞则在用Cas9和脂质体2000但不用sgRNA注射的对照耳蜗中保持了强烈的GFP表达(图6D)。与(-30)GFP-Cre的脂质体2000递送后(图6C)观察到的适度的毛细胞损失相比，被Cas9:sgRNA靶向的外毛细胞未呈现明显的毒性或结构改变(图6D)。
与(-30)GFP-Cre一样，Cas9:sgRNA向小鼠内耳中的无病毒的、阳离子脂质介导的递送成功地修饰了外毛细胞群体中特定的基因组遗传位点，导致靶基因表达的损失。几乎一半所有类型的遗传性耳聋起因于毛细胞损失或功能障碍，这些结果证明了基于递送Cas9:sgRNA复合物以遗传性地修饰这些细胞从而实现听觉恢复的策略。综上所述，这些发现证明，基因编辑蛋白的阳离子脂质介导的递送可用作强有力的工具和用于遗传性疾病的治疗的潜在的体内策略。
讨论
有效的体外、尤其是体内细胞内蛋白递送在生物医学研究和蛋白疗法中一直是一个持续挑战。尽管使用阳离子肽和蛋白的递送已经被广泛研究二十多年，对血清蛋白的敏感性、被抗体中和、被细胞外和细胞内蛋白酶降解、以及差的内化后核内体逃逸限制了使用那一方法的蛋白递送应用的范围。
在本文中的工作中，报道了利用阴离子蛋白与阳离子脂质体复合的蛋白递送的通用策略。该方法用来将多种多样的蛋白类型(包括Cre酪胺酸重组酶、TALE转录激活物和Cas9核酸酶、切口酶和转录激活物)(图1A)递送到培养的细胞系、干细胞群体、以及小鼠内耳内治疗相关的体内位点。该方法是高度有效的，在细胞培养中产生类似于或超过已经确立的核酸转染方法的修饰比率，并使得在活小鼠的内耳毛细胞群体内Cre重组酶-介导的和Cas9-介导的基因组修饰比率分别高达90％和20％，(图6C和6D)。在～4h、～12h和～24h分别观察到TALE-激活物、Cas9-激活物、以及Cas9核酸酶的脂质介导的蛋白递送达到峰值活性水平，大大提前于DNA转染后获得相应的活性水平(图9B、15B和18)。这些结果还证明，使用阳离子脂质通过将它们与核酸复合来有效递送其它核酸-结合蛋白(包括在细胞命运中引发治疗相关的变化的转录因子)是可能的。
对于每单位量的内吞蛋白，基于阳离子脂质的阴离子蛋白递送在性能上超过一种有力的阳离子蛋白递送融合配偶体((+36)GFP)高达9,800倍，用低几个数量级的剂量的蛋白即可引发经处理的细胞更有效的修饰(图2C和图8A-8D)。对于Cas9核酸酶递送，该方法通常也会导致比常规质粒转染多>10倍的特定的基因组修饰(图5B-5C)，这很可能是由于与DNA递送方法相比短暂的每个基因组暴露于其的Cas9活性窗口(图18)(Sojung Kim，D.K.Genome Res.(2014))。
本文使用纯化的可递送的蛋白实施的方法和受欢迎的商用核酸转染试剂的用途(图1B)。使给定蛋白适用于该方法要求与像(-30)GFP这样的高度阴离子性伙伴的简单转译融合(图1A)，并且甚至常规转译融合标签(包括VP64激活域，以及3xFLAG亲和性标签)也是有效的(图2F)。在某些情况下，与Cas9蛋白一样，与同源核酸(这一情况下为sgRNA)预复合就足够了(图4A)，由于部分暴露的结合的核酸可能会提供足够的阴离子电荷来调节与阳离子脂质的复合。
该研究确定，蛋白递送是切实可行的进行体内基因组编辑的方法。由于本研究使用的商用脂质试剂被优化以递送DNA和RNA，很可能以后开发的脂质体制剂的特定成分会进一步改进该平台的性能，特别是对于体内用途。
表1.靶向EMX、VEGF和CLTA中的位点的Cas9:sgRNA的在靶和已知的脱靶底物。显示了一列EMX、VEGF和CLTA的基因组在靶和脱靶位点，来自在靶序列的突变以小写显示。PAM以黑体显示。
表2.EMX、切割A和VEGF在靶位点以及11个已知的脱靶位点的插入缺失频率、P值和在靶:脱靶切割特异性比例。总计：序列计数的总数目；仅对头10,000个序列分析在靶位点序列。修饰比例：插入缺失数目除以序列总数目作为百分比。对未观察到插入缺失的位点计算可能修饰的上限，计算通过假定存在少于1个插入缺失然后除以总序列计数以得到上限修饰百分比进行，或者取理论检测限(1/49,500)，取更大的数值。P-值：对于模拟处理、Cas9质粒转染和脂质体Cas9蛋白:sgRNA递送，使用每个CLTA靶向性处理样品(DNA转染或蛋白:sgRNA递送)与用Cas9蛋白和靶向EGFP的sgRNA处理的对照样品(模拟处理)之间的双侧鱼类er确切测试来计算P值。在靶:脱靶特异性是对于每个位点，在靶与脱靶基因组修饰频率的比例，(b)应用于EMX靶位点的如(a)中的实验和分析方法，(c)应用于VEGF靶位点的如(a)中的实验和分析方法。质粒转染和蛋白:sgRNA递送两者的插入缺失数目减去模拟处理对照中的插入缺失数目，确定插入缺失总数目，并计算图5正文中以及图15中的在靶:脱靶比例。
用于本研究的蛋白的氨基酸序列
(+36)GFP-Cre-6xHis(SEQ ID NO:1):
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(-7)GFP-Cre-6xHis(SEQ ID NO:2):
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(-20)GFP-Cre-6xHis(SEQ ID NO:3):
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(-30)GFP-Cre-6xHis(SEQ ID NO:4):
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Cre-6xHis(SEQ ID NO:5):
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Cas9(SEQ ID NO:6):
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Cas9-6xHis(SEQ ID NO:7):
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NLS-Cas9-6xHis(SEQ ID NO:8):
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Cas9-NLS-6xHis(SEQ ID NO:9):
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(+36)dGFP-NLS-Cas9-6xHis(Y67S)(SEQ ID NO:10):
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(-30)dGFP-NLS-Cas9-6xHis(Y67S)(SEQ ID NO:11):
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dCas9-VP64-6xHis(D10A和H840A)(SEQ ID NO:12):
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Cas9切口酶(D10A)(SEQ ID NO:13):
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(-30)GFP-Cre-6xHis(SEQ ID NO:14):
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Cre-6xHis(SEQ ID NO:15):
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(-30)dGFP-NLS-Cas9-6xHis(SEQ ID NO:16):
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(+36)dGFP-NLS-Cas9(SEQ ID NO:17):
ATGGGTGCTAGCAAAGGTGAACGTCTGTTTCGTGGTAAAGTACCGATCTTAGTGGAATTAAAGGGCGACGTGAACGGTCATAAATTTAGCGTGCGCGGCAAAGGCAAAGGTGACGCTACCCGTGGTAAATTGACCCTGAAGTTTATTTGCACAACAGGCAAATTACCCGTTCCGTGGCCCACCTTAGTGACCACCCTGACCTATGGCGTTCAGTGCTTCAGTCGTTACCCTAAACATATGAAACGTCACGATTTTTTCAAATCAGCCATGCCTAAAGGATATGTTCAAGAGCGTACAATCAGCTTCAAGAAGGATGGCAAATATAAAACGCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCCGCACATTAGTAAATCGTATCAAACTGAAAGGTCGTGACTTCAAAGAAAAAGGCAACATTTTAGGCCATAAACTGCGTTATAACTTTAATTCTCATAAGGTGTATATTACGGCCGATAAACGCAAGAATGGTATCAAGGCAAAATTCAAAATTCGCCATAACGTGAAAGACGGCAGCGTTCAATTAGCGGATCATTATCAACAAAACACGCCGATTGGTCGCGGGCCTGTACTGTTACCTCGCAACCACTACCTGAGCACCCGTTCTAAACTGAGCAAAGATCCGAAAGAAAAACGCGATCACATGGTTCTGTTAGAATTCGTGACCGCTGCAGGCATTAAGCACGGACGCGACGAACGCTACAAGACCGGTGGTAGCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGTGGTAGCGGTGGCAGCGGCGGTACCGCGCTCGCGCTGCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGAmTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTITTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCT-f-＝GATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACCATCACCACCACCATCAC
Cas9-NLS-6xHis(SEQ ID NO:18):
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dCas9-VP64-6xHis(SEQ ID NO:19):
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATGCCATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACGGTTCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGAGGCGGTGGAAGCGGGCGCGCCGACGCGCTGGACGATTTCGATCTCGACATGCTGGGTTCTGATGCCCTCGATGACTTTGACCTGGATATGTTGGGAAGCGACGCATTGGATGACTTTGATCTGGACATGCTCGGCTCCGATGCTCTGGACGATTTCGATCTCGATATGTTACATCACCACCACCATCAC
每个基因组靶位点的上游和下游侧翼序列列出如下。
实例2：在遗传性聋的小鼠模型中通过Cas9/gRNA的体内递送和CRISPR介导的基因编辑抢救听觉损失
为了将通过gRNA与Cas9复合的脂质体制剂用于CRISPR介导的基因编辑作为对遗传性耳聋的可能治疗，研究了对Pmca2耳聋小鼠突变型的抢救效果。Pmca2是质膜Ca2+泵，其在内耳毛细胞中高度表达，所述泵具有主动泵出Ca2+的功能，Ca2+在听觉和前庭觉起作用期间在信号的机械电子转换过程中进入毛细胞。已经证明，PMCA2突变会增加人类听觉损失的严重性(MSchultz等，N Engl J Med 352，第15(2005年4月14日)：1557-64，doi：10.1056/NEJMoa043899)。在具有点突变(S877F)的小鼠突变型(Oblivion)中，在杂合小鼠和纯合小鼠中观察到严重的到深度(即完全的)听觉损失(Spiden等，PLoSGenetics4，el000238-el000238.2008)。这样，该小鼠突变型用作卓越模型以确定Cas9/gRNA方法是否可用来打乱杂合小鼠中的Pmca2突变从而恢复听觉，暗示可减小人类听觉损失。
为了研究听觉抢救效果，设计了12个向导RNA，其中4个靶向突变(图22)。每个gRNA与Cas9复合的脂质体2000制剂之后，复合物被注射进出生后第3天(P3)的小鼠的耳蜗。小鼠突变体和野生型的对照小鼠两者都被注射。对于每个小鼠，注射了右耳而没有注射左耳。注射3星期或4星期后，进行了声音的听觉脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)测试。
对于ABR和DPOAE测试，用甲苯噻嗪(10mg/kg，腹腔注射)和氯胺酮(100mg/kg，腹腔注射)将任何一个性别的注射的小鼠麻醉。ABR和DPOAE如之前所述进行(Huang等，2013)。ABR测量从毛细胞到大脑的听觉通路；而DPOAE则主要测量外毛细胞功能。通过它们的组合可推断出听觉缺陷是毛细胞缺陷还是中枢通路缺陷。
注射后3个星期时，在杂合的Pmca2小鼠中，未注射的内耳得到如ABR和DPOAE所示的深度听觉损失。在注射有Cas9/gRNA-Pmca-2.4(具有向导RNA2.4)的耳朵中，通过ABR在16、22.64、32和45.24kHz的频率观察到显著的听觉恢复。通过DPOAE，在注射有Cas9/gRNA-Pmca-2.4的内耳中在16到45.24kHz的频率检测到显著恢复，与ABR恢复相当。DPOAE恢复意味着毛细胞功能的修复。为了研究听觉恢复的长期效果，注射后听觉研究进行了4个星期，并观察到类似的听觉恢复。听觉研究会在注射6、12和26星期后继续进行。除了未注射的对照耳朵之外，也研究了经与其它Pmca2向导RNA复合的Cas9注射的Pmca2杂合小鼠。通过ABR或DPOAE的听觉恢复均未检测到(未显示数据)。这样，与Cas9复合的向导RNA Pmca2-2.4引起了Pmca2突变的特定序列的基因编辑，从而导致听觉的显著改进。
为了研究与Cas9/gRNA递送关联的可能毒性，Cas9/gRNA-Pmca-2.4被注射到P3野生型的(WT)小鼠中，并在注射3星期后进行听觉研究。在ABR和DPOAE中在最高频率(45.24kHz)下观察到轻微升高，但在任何其它频率下未观察到。因此，Cas9/gRNA-Pmca-2.4复合物未对健康毛细胞或内耳功能导致附加损害。总之，研究表明在要不然会完全聋的小鼠突变体中靶向毛细胞中Pmca2突变的Cas9/gRNA可恢复听觉。因此，类似策略可应用于具有Pmca2突变的聋的人类患者，以改进或恢复听觉。
注射有Cas9/gRNA-Pmca-2.4的耳朵的听觉恢复在所有频率不是统一的(例如在8kHz无恢复)。进一步地，恢复是不均匀的，在45.24kHz的最高频率下看到较好恢复。这可能是由于所用的手术步骤仅容许主要进入耳蜗基底，这是造成高频听觉的原因。低频下恢复的缺乏可能是由于Cas9/gRNA复合物向耳蜗顶端区域的不充分扩散。为了测试这个假设，在Pmca2小鼠中在6天中进行了多次注射的附加实验。到4星期时，在从16-45.24kHz的大部分频率观察到好得多的听觉恢复(40dB)(图23)。小鼠内耳的尺寸极小，约人类内耳尺寸的l/50。尽管小鼠内耳在蛋白递送上给出了手术挑战，但是可预期在人类内耳中递送会容易得多。因此，多次注射在大部分频率下会大大改善听觉修复。
所述技术最重要的应用之一是能够在成熟哺乳动物内耳中递送Cas9/gRNA复合物。进行了第一组实验，并显示当注射到P9小鼠耳蜗中时，观察到了类似的听觉抢救效果(未显示数据)。
本工作证明Cas9/gRNA直接体内递送到哺乳动物内耳毛细胞中在会引起听觉的功能性恢复的突变打断中的实用性。因为20％的遗传性耳聋是由显性突变引起的，可调整该方法以靶向那些突变从而修复听觉。
最普遍形式的耳聋是隐性的，对其会需要突变修复以获得听觉修复。人类中最普遍形式之一的耳聋是跟年龄相关的听觉损失(ARHL)或者老年性耳聋，影响全世界数亿的人群。尽管ARHL的主要机理是未知的，但是识别会导致可使毛细胞容易受到老化影响的突变或多态性的基因是可能的。在这一条件下，Cas9/gRNA可被用来打断或修复突变/多态性，以恢复或减慢听觉损失的进程。尽管目前所述方法靶向毛细胞，会进行改动从而使得所述方法可被用于靶向像支持细胞、实验血管和神经元这样的内耳细胞类型，在其中可获得类似的基因编辑，从而获得听觉的功能恢复。最后，许多隐性遗传性耳聋在出生时是先天性的，由于细胞类型的退化，简单的基因编辑可能不足以恢复细胞功能或听觉。但是，将细胞类型的再生与基因编辑结合以在修正突变的同时产生新细胞事可能的。这些结合可被用来在由于不同原因患有听觉损失的患者中恢复听觉。

Claims (83)

1.一种治疗需要的患者中与遗传性突变关联的耳聋或其疾病的方法，其包含：给所述患者施用治疗有效量的与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的包含至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合的嵌合分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合分子是阴离子并包封在阳离子脂质制剂中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合分子靶向患者中一个或多个与耳聋相关的遗传位点并调节所述遗传位点的复制、表达、运转或活动。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一个或多个与耳聋相关的遗传位点包含：突变、插入、缺失、取代或其组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述嵌合分子包含一种或多种基因编辑剂、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、重组酶、核酸酶、结合DNA的蛋白或核酸或其组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、干涉RNA、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因组或基因编辑剂、合成分子或其组合。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述阳离子脂质体包封的嵌合分子被施用到患者内耳。
11.一种治疗受由遗传性突变引起的耳聋困扰的患者的方法，其包含：给患者内耳施用与带负电荷的分子复合、融合或链接的包封治疗有效量的阴离子分子的阳离子脂质体，所述阳离子脂质体包含至少一种蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述嵌合分子靶向患者中一个或多个与耳聋相关的遗传位点并调节所述遗传位点的复制、表达、运转或活动。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个与耳聋相关的遗传位点包含：突变、插入、缺失、取代或其组合。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述阴离子分子包含一种或多种基因编辑剂、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述基因编辑剂包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述阴离子分子包含任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到包含SEQ ID NOS:1到19的序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到19中的至少一个或多个。
19.一种包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质的药物组合物，所述嵌合分子包含至少一种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。
20.一种包含嵌合分子的药物组合物，所述嵌合分子包含至少一种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。
21.一种包封阴离子分子的阳离子脂质体，所述阴离子分子包含至少一种与带负电荷的分子复合、融合或链接的蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。
22.根据权利要求21所述的阳离子脂质体，其中所述带负电荷的分子包含寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。
23.根据权利要求22所述的阳离子脂质体，其中所述多聚核苷酸或寡核苷酸是向导RNA、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
24.根据权利要求22所述的阳离子脂质体，其中所述蛋白或肽是带负电荷的萤光蛋白。
25.根据权利要求22所述的阳离子脂质体，其中所述一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。
26.根据权利要求25所述的阳离子脂质体，其中所述蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
27.根据权利要求26所述的阳离子脂质体，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
28.根据权利要求27所述的阳离子脂质体，其中所述基因编辑剂包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。
29.根据权利要求21所述的阳离子脂质体，其中所述阴离子分子任选地包含一种或多种可检测标记物、放射性标记物、标签、阴离子、靶向剂或其组合。
30.根据权利要求21所述的阳离子脂质体，其中所述脂质体包含一种或多种阳离子脂质、修饰的脂质或其组合。
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求21所述的阳离子脂质体。
32.一种分子，其包含任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到如SEQID NOS:1到123所列的序列。
33.根据权利要求32所述的分子，其中所述一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到123。
34.一种包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质的组合物，所述嵌合分子包含一种或多种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的蛋白或肽。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述一种或多种阴离子分子包含一个或多个阴离子区域或者与阴离子核酸区域结合。
36.根据权利要求34所述的组合物，其中所述一种或多种阴离子分子为所述嵌合分子赋予总体净负电荷。
37.根据权利要求34所述的组合物，其中所述阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、干涉RNA、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。
40.根据权利要求37所述的组合物，其中所述蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
42.根据权利要求34所述的组合物，其中所述嵌合分子进一步包含一种或多种可检测标记物、阴离子、放射性标记物、标签、靶向剂或其组合。
43.一种包含至少一种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的蛋白或肽的嵌合分子，其中所述一种或多种阴离子分子包含一个或多个阴离子区域或者与阴离子核酸区域结合。
44.根据权利要求43所述的嵌合分子，其中所述嵌合分子包含总体净负电荷。
45.根据权利要求43所述的嵌合分子，其中所述阴离子分子包含：寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。
46.根据权利要求45所述的嵌合分子，其中所述寡核苷酸或多聚核苷酸包含：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、合成RNA或DNA序列、修饰的RNA或DNA序列、互补DNA(cDNA)、短链向导RNA(sgRNA)、干涉RNA、mRNA、包含一种或多种修饰的核碱基或骨架的核酸序列、或其组合。
47.根据权利要求45所述的嵌合分子，其中所述一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。
48.根据权利要求45所述的嵌合分子，其中所述蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
49.根据权利要求48所述的嵌合分子，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、重组酶、核酸酶、结合DNA的蛋白或核酸、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
50.根据权利要求43所述的嵌合分子，其进一步包含一种或多种可检测标记物、放射性标记物、标签、阴离子、靶向剂或其组合。
51.一种包含包封一种或多种嵌合分子的阳离子脂质的药物组合物，所述嵌合分子包含一种或多种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的蛋白或肽。
52.一种包含嵌合分子的药物组合物，所述嵌合分子包含至少一种与一种或多种阴离子分子融合、复合或链接的蛋白或肽。
53.一种包封阴离子分子的阳离子脂质体，其中所述阴离子分子包含至少一种与带负电荷的分子复合、融合或链接的蛋白、肽、多聚核苷酸、寡核苷酸或其组合。
54.根据权利要求53所述的阳离子脂质体，其中所述带负电荷的分子包含寡核苷酸、多聚核苷酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)、合成分子或其组合。
55.根据权利要求54所述的阳离子脂质体，其中所述多聚核苷酸或寡核苷酸是向导RNA。
56.根据权利要求54所述的阳离子脂质体，其中所述蛋白或肽是带负电荷的萤光蛋白。
57.根据权利要求54所述的阳离子脂质体，其中所述一种或多种蛋白或肽是阳离子性的、阴离子性的，或者是电中性的。
58.根据权利要求54所述的阳离子脂质体，其中所述蛋白或肽包含：酶、激素、化疗剂、免疫治疗剂、基因编辑剂、合成分子或其组合。
59.根据权利要求58所述的阳离子脂质体，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
60.根据权利要求59所述的阳离子脂质体，其中所述基因编辑剂包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。
61.根据权利要求53所述的阳离子脂质体，其中所述阴离子分子进一步包含一种或多种可检测标记物、放射性标记物、标签、阴离子、靶向剂或其组合。
62.根据权利要求53所述的阳离子脂质体，其中所述脂质体包含一种或多种阳离子脂质、修饰的脂质或其组合。
63.一种包含根据权利要求53所述的阳离子脂质体的药物组合物。
64.一种分子，其包含任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到如SEQID NOS:1到123所列的序列。
65.根据权利要求64所述的分子，其中所述一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到123中的至少一个。
66.根据权利要求64所述的分子，其中所述一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到19中的至少一个。
67.一种阳离子脂质体，其包封任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到包含SEQ ID NOS:1到123的序列。
68.根据权利要求67所述的阳离子脂质体，其中所述一种或多种分子包含SEQ ID NOS:1到123中的至少一个。
69.根据权利要求67所述的阳离子脂质体，其中所述一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到19中的至少一个。
70.一种体外或体内基因编辑的方法，其包含：在体外接触细胞或者给需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求19、20、21、32、34、43、53、63、64、或67所述的组合物或分子。
71.一种在体外或体内靶向特定的蛋白、肽或核酸的方法，其包含：在体外接触细胞或者给需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求19、20、21、31、32、34、43、51、52、53、63、64或67所述的组合物或分子。
72.一种在体外或体内递送治疗剂的方法，其包含：在体外接触细胞或者给需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求19、20、21、31、32、34、43、51、52、53、63、64或67所述的组合物或分子。
73.一种在受耳聋或相关疾病困扰的患者中治疗听觉损失的方法，其包含给患者内耳施用包封治疗有效量的阴离子分子的阳离子脂质体，所述阴离子分子包含与带负电荷的分子复合、融合或链接的蛋白或肽。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述嵌合分子靶向患者中一个或多个与耳聋或其相关疾病相关的遗传位点并调节所述遗传位点的复制、表达、运转或活动。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述阴离子分子会再生并/或修复细胞、组织、神经元、细胞间的连接、神经元和组织并/或防止对细胞、神经元和组织的损害。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述一个或多个与耳聋及其相关疾病相关的遗传位点包含：突变、插入、缺失、取代或其组合。
77.根据权利要求74所述的方法，所述阴离子分子包含一种或多种基因编辑剂、转录调节剂、转译调节剂、转译后调节剂和/或调节蛋白表达、运转、活动或其组合的调节剂。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述基因编辑剂包含：转录激活物、转录阻抑剂、转录因子、增强剂调节分子、重组酶、核酸酶、结合核酸的蛋白、结合核酸的多聚核苷酸或寡核苷酸、结合DNA的蛋白或结合DNA的核酸、或其组合。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述基因编辑剂包含：Cre重组酶、CRISPR/Cas分子、TALE转录激活物、Cas9核酸酶、切口酶、转录调节剂或其组合。
80.根据权利要求73所述的方法，其中所述阴离子分子包含任意一个或多个具有至少约75％的序列同一性的序列到如SEQ ID NOS:1到19所列的序列。
81.根据权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个序列包含SEQ ID NOS:1到19。
82.一种包封阴离子分子的阳离子脂质体，其中所述阳离子脂质体包含：脂质体、脂质、纳米脂质体、非离子表面活性剂囊泡、微球体、纳米球体、纳米颗粒、胶束、或古细菌体。
83.一种试剂盒，其包含任意一种或多种根据权利要求19、20、21、31、32、34、43、51、52、53、63、64或67所述的组合物或分子。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019184663A1 (zh) * 2018-03-29 2019-10-03 中国医学科学院基础医学研究所 植物来源"汤剂体"的提取和"本草体"的人工制备及其相关产品
CN113637708A (zh) * 2021-08-09 2021-11-12 中国科学院过程工程研究所 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9962361B2 (en) 2011-01-03 2018-05-08 The William M. Yarbrough Foundation Isothiocyanate functional surfactants, formulations incorporating the same, and associated methods of use
US9532969B2 (en) 2011-02-08 2017-01-03 The William M. Yarbrough Foundation Method for treating psoriasis
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10441561B2 (en) 2012-07-26 2019-10-15 The William M. Yanbrough Foundation Method for treating benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis, and prostate cancer
US10434081B2 (en) 2012-07-26 2019-10-08 The William M. Yarbrough Foundation Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor
US10434082B2 (en) 2012-07-26 2019-10-08 The William M. Yarbrough Foundation Isothiocyanate functional compounds augmented with secondary antineoplastic medicaments and associated methods for treating neoplasms
US10335387B2 (en) 2012-07-26 2019-07-02 The William M. Yarbrough Foundation Method for treating infectious diseases with isothiocyanate functional compounds
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN107530399B (zh) 2014-10-10 2022-03-18 马萨诸塞眼科耳科诊所 治疗分子在体外和体内的有效递送
EP3365357B1 (en) 2015-10-23 2024-02-14 President and Fellows of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
AU2017306676B2 (en) 2016-08-03 2024-02-22 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
AU2019255789A1 (en) 2018-04-19 2020-10-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene editing
EA202092934A1 (ru) * 2018-06-11 2021-04-05 Дзе Уистар Инститьют Оф Энэтоми Энд Байолоджи Композиции и способы для посттрансляционной модификации in vivo
AU2019335055A1 (en) * 2018-09-04 2021-03-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
JP7425066B2 (ja) 2018-09-04 2024-01-30 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 核酸を臓器特異的送達するための組成物および方法
JP2022526908A (ja) 2019-03-19 2022-05-27 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
US20220111002A1 (en) * 2019-05-21 2022-04-14 University Of Miami Treatment of sensorineural deafness
AU2021267940A1 (en) 2020-05-08 2022-12-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2022032151A1 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 University Of Miami Treatment of sensorineural deafness

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101501193A (zh) * 2006-08-11 2009-08-05 普罗森那技术公司 用于治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段
CN103397018A (zh) * 2013-08-20 2013-11-20 中国医学科学院医学生物学研究所 一种dna病毒基因组的定点改造方法
WO2014039908A1 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for regenerating hair cells and/or supporting cells
US20140186919A1 (en) * 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
CN105745221A (zh) * 2013-09-06 2016-07-06 哈佛大学的校长及成员们 用于功能性核酸酶的投递系统

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4260410A (en) 1978-03-31 1981-04-07 Chevron Research Company Herbicidal and plant-growth-regulating N-haloacetylphenylamino carbonyl oximes
CA1219824A (en) 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US6889383B1 (en) * 2000-10-23 2005-05-03 Clearplay, Inc. Delivery of navigation data for playback of audio and video content
CA2655990A1 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Tai June Yoo Restoration of hearing loss
JP6576904B2 (ja) * 2013-04-04 2019-09-18 トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡのｉｎｖｉｖｏ切除のための組成物及び方法
WO2016070129A1 (en) * 2014-10-30 2016-05-06 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
CN107530399B (zh) 2014-10-10 2022-03-18 马萨诸塞眼科耳科诊所 治疗分子在体外和体内的有效递送

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101501193A (zh) * 2006-08-11 2009-08-05 普罗森那技术公司 用于治疗与dna重复不稳定性相关的遗传病的方法和手段
WO2014039908A1 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for regenerating hair cells and/or supporting cells
US20140186919A1 (en) * 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
CN103397018A (zh) * 2013-08-20 2013-11-20 中国医学科学院医学生物学研究所 一种dna病毒基因组的定点改造方法
CN105745221A (zh) * 2013-09-06 2016-07-06 哈佛大学的校长及成员们 用于功能性核酸酶的投递系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JULIE M. SCHULTZ等: "Modification of Human Hearing Loss by Plasma-Membrane Calcium Pump PMCA2", 《THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE》 *
SARAH L. SPIDEN等: "The Novel Mouse Mutation Oblivion Inactivates the PMCA2 Pump and Causes Progressive Hearing Loss", 《PLOS GENETICS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019184663A1 (zh) * 2018-03-29 2019-10-03 中国医学科学院基础医学研究所 植物来源"汤剂体"的提取和"本草体"的人工制备及其相关产品
CN111971072A (zh) * 2018-03-29 2020-11-20 中国医学科学院基础医学研究所 植物来源“汤剂体”的提取和“本草体”的人工制备及其相关产品
CN111971072B (zh) * 2018-03-29 2023-06-13 中国医学科学院基础医学研究所 植物来源“汤剂体”的提取和“本草体”的人工制备及其相关产品
CN113637708A (zh) * 2021-08-09 2021-11-12 中国科学院过程工程研究所 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用

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