JP2022526908A - 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第U01AI142756号、第RM1HG009490号、第R01EB022376号、および第R35GM118062号の下、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
この米国仮出願は、以下の出願、つまり、2019年3月19日出願の米国仮出願第62/820,813号(代理人整理番号B1195.70074US00)、2019年6月7日出願の米国仮出願第62/858,958号(代理人整理番号B1195.70074US01)、2019年8月21日出願の米国仮出願第62/889,996号(代理人整理番号B1195.70074US02)、2019年8月21日出願の米国仮出願第62/922,654号(代理人整理番号B1195.70083US00)、2019年10月10日出願の米国仮出願第62/913,553号(代理人整理番号B1195.70074US03)、2019年10月10日出願の米国仮出願第62/973,558号(代理人整理番号B1195.70083US01)、2019年11月5日出願の米国仮出願第62/931,195号(代理人整理番号B1195.70074US04)、2019年12月5日出願の米国仮出願第62/944,231号(代理人整理番号B1195.70074US05)、2019年12月5日出願の米国仮出願第62/974,537号(代理人整理番号B1195.70083US02)、2020年3月17日出願の米国仮出願第62/991,069号(代理人整理番号B1195.70074US06)、および2020年3月17日出願の米国仮出願(これを出願する時点で連番は入手不可能)(代理人整理番号B1195.70083US03)を指し、参照により組み込む。
病原性のある単一ヌクレオチド突然変異は、ある推計によれば遺伝的要素が存在するヒト疾患のおよそ50%に寄与する7。残念ながら、これら遺伝性障害をもつ患者にとっての処置の選択肢は、数十年に及ぶ遺伝子治療探索に関わらず、依然として極度に限定的である8。おそらく、この治療上の課題への最も簡素な解決策は患者ゲノム中の単一ヌクレオチド突然変異の直接的な修正であって、これは疾患の根本的原因に対処し、かつ永続する恩恵を提供するかもしれない。かかるストラテジーはこれまでに考えられないことであったが、CRISRP/Cas系9の到来によってもたらされたゲノム編集性能における近年の改善は今や、この治療的アプローチを射程圏内に入れる。標的DNA配列に相補的な~20ヌクレオチドを含有するガイドRNA(gRNA)配列の簡単なデザインによって、想定されるほぼ全てのゲノム部位は、CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼによって特異的にアクセスされ得る1,2。今日まで、数種の単量体細菌性Casヌクレアーゼ系が同定されており、ゲノム編集用途に適応された10。このCasヌクレアーゼの天然の多様性は、増え続ける改変バリアントの一群と併せて11~14、新しいゲノム編集技術を開発するための肥沃な土壌を用意する。
本発明は、「プライム編集」と呼ばれるゲノム編集のための全く新しいプラットホームを記載する。プライム編集は、ポリメラーゼ(すなわち、融合タンパク質の形態であるか、または別様にnapDNAbpとはtransで提供される)と共働する核酸プログラム型DNA結合タンパク質(「napDNAbp」)を使用して、新しい遺伝情報を特定DNA部位中へ直接書き込む多目的かつ正確なゲノム編集方法であるが、プライム編集系は、ガイドRNA上へ(例として、ガイドRNAの5'末もしくは3'末にて、または内部にて)改変される伸長(extension)(DNAまたはRNAのいずれか)を経由する置き換えDNA鎖の形態での所望の編集の合成のための標的部位と鋳型との両方を特定するプライム編集(PE)ガイドRNA(「PEgRNA」)でプログラムされる。所望の編集(例として、単一核酸塩基の置換)を含有する置き換え鎖は、編集されるべき標的部位(それが所望の編集を包含するのは例外として)の内生鎖と同じ配列を共有する。DNA修復および/または複製機構を通して、標的部位の内生鎖は、所望の編集を含有する新しく合成された置き換え鎖によって置き換えられる。いくつかのケースにおいて、本明細書に記載のとおりのプライム編集因子は、編集されるべき所望の標的部位を探査し位置付けるのみならず、同時に、内生DNA鎖の対応する標的部位の代わりに組み入れられる所望の編集を含有する置き換え鎖をコードするところ、プライム編集は「探査-と-置き換え(search-and-replace)」ゲノム編集技術であると考えられることもある。
以下の図面は本明細書の一部を形成するものであって、これらの図面の1以上を、本明細書に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせて参照することによってより良好に理解され得る、ある本開示の側面をさらに実証するために包含される。
別様に定められない限り、本願において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の業者によって普通に理解される意味を有する。次の参照は、本発明に用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。別様に規定されない限り、本願において用いられる次の用語はそれらに帰せられる意味を有する。
遺伝学において、二本鎖のDNA内のセグメントの「アンチセンス」鎖は、鋳型鎖であって、3'→5'配向に伸びる(runs)と考えられる。これに反して、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖のDNA内のセグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。タンパク質をコードするDNAセグメントのケースにおいて、センス鎖は、転写の最中にその鋳型としてアンチセンス鎖を取り結局(典型的には、常にではない)翻訳を経てタンパク質になるmRNAと同じ配列を有するDNAの鎖である。よって、アンチセンス鎖は、後にタンパク質へ翻訳されるRNAを担い、一方センス鎖は、mRNAとほぼ同一の組成(makeup)を保有する。dsDNAの各セグメントについて、一方がどの方向から読まれるかに応じて、おそらく(センスおよびアンチセンスは視点に相対するから)センスおよびアンチセンスが2組存在するであろう点に留意する。遺伝子産物またはmRNAは結局、dsDNAの一方のセグメントのどちらかの鎖がセンスまたはアンチセンスと称されることを示す。
本願において用いられる用語「二重特異性リガンド」または「二重特異性部分」は、2つの異なるリガンド結合ドメインに結合するリガンドを言う。ある態様において、リガンドは低分子化合物またはペプチドまたはポリペプチドである。他の態様において、リガンド結合ドメインは「二量体化ドメイン」であり、これがペプチドタグとしてタンパク質上に組み入れられ得る。種々の態様では、同じかまたは異なる二量体化ドメインを夫々が含む2つのタンパク質が、二重特異性リガンドに対する各二量体化ドメインの結合によって二量体化するように誘導され得る。本願において用いられる「二重特異性リガンド」は同等に「二量体化の化学的誘導因子」または「CID」と言われ得る。
用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」は、Cas9ドメインまたはそのフラグメントを含む、RNAにガイドされるヌクレアーゼ(例として、Cas9の活性もしくは不活性なDNA切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質)を指す。「Cas9ドメイン」は、本明細書に使用されるとき、Cas9の活性もしくは不活性な切断ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質フラグメントである。「Cas9タンパク質」は、全長Cas9タンパク質である。Cas9ヌクレアーゼはまた、ときにcasn1ヌクレアーゼまたはCRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))関連ヌクレアーゼとしても言及される。CRISPRは、可動遺伝因子(ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド)に対して保護を提供する適応免疫系である。CRISPRクラスターは、スペーサー、先行する可動因子に相補的な配列、および標的化侵入核酸を含有する。CRISPRクラスターは転写され、プロセスを受けて(processed)CRISPR RNA(crRNA)になる。II型CRISPR系において、pre-crRNAの修正プロセシングは、transでコードされた低分子(small)RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9ドメインを要する。tracrRNAは、pre-crRNAの、リボヌクレアーゼ3に補助された(-aided)プロセシングのためのガイドとして働く。続いて、Cas9/crRNA/tracrRNAは、スペーサーに相補的な線状または環状のdsDNA標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。crRNAに相補的ではない標的鎖は、最初にエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで3'-5'エキソヌクレアーゼ的に切り取られる。本来、DNAの結合および切断は、典型的には、タンパク質および両RNAを要する。しかしながら、単一ガイドRNA(「sgRNA」、または単に「gNRA」)は、crRNAとtracrRNAとの両方の側面を単一RNA種中へ組み込むために、改変され得る。例として、Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)。Cas9は、CRISPR反復配列(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)中の短いモチーフを認識することで、自己・対・非自己を区別するのに役立つ。Cas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である(例として、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を参照(これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))。Cas9オルソログは、これらに限定されないが、S.pyogenesおよびS.thermophilusを包含する様々な種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかであろう。またかかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)に開示された生物および遺伝子座からのCas9配列を包含する。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは、DNA切断ドメインを部分的に損なうかまたは不活性化させる1以上の突然変異を含む。
用語「cDNA」は、RNA鋳型からコピーされたDNAの鎖を指す。cDNAは、RNA鋳型に相補的である。
本明細書に使用されるとき、用語「循環置換体(circular permutant)」は、タンパク質のアミノ酸配列中に現れるアミノ酸の順序の変化を伴うタンパク質の構造上の立体配置における変化である循環置換(circular permutation)を含むタンパク質またはポリペプチド(例として、Cas9)を指す。換言すれば、循環置換体は、野生型対応物と比較してN末端およびC末端が変更されたタンパク質であり、例として、野生型タンパク質のC末端半分が新しいN末端半分になっている。循環置換(またはCP)は本質的に、そのN末端およびC末端が接続され、しばしばペプチドリンカーをもつ、タンパク質1次配列の形態上の再配置であるが、同時にその配列を異なる位置にて分裂させることで、隣接していた新しいN末端およびC末端が創出される。その結果は、接続が異なるが、しばしば同じか全体的には同様の3次元の(3D)形状を有し得るタンパク質構造であって、おそらく、改善または変更された特徴(タンパク分解への低減された感受性、改善された触媒活性、変更された基質結合もしくはリガンド結合、および/または改善された熱安定性を包含する)を包含する。循環置換タンパク質は天然に存在し得る(例として、コンカナバリンAおよびレクチン)。加えて、循環置換は、翻訳後修飾の結果として生じ得るか、または組換え技法を使用して改変されてもよい。
用語「循環置換されたCas9」は、循環置換体として生じたものであり、これによってそのN末端およびC末端が局所的に再配置された、いずれのCas9タンパク質またはそのバリアントも指す。循環置換されたかかるCas9タンパク質(「CP-Cas9」)、またはそれらのバリアントは、ガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときのDNAへの結合能を保持している。Oakes et al.,“Protein Engineering of Cas9 for enhanced function,”Methods Enzymol,2014,546:491-511およびOakes et al.,“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification,”Cell,January10,2019,176:254-267を参照(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。本開示は、これまでに知られているいずれのCP-Cas9も企図するか、または新しいCP-Cas9を、その結果得られた循環置換タンパク質がガイドRNA(gRNA)と複合体化されたときのDNAへの結合能を保持している限り、使用する。例示のCP-Cas9タンパク質は、配列番号77~86である。
CRISPRは、原核生物に侵入したウイルスによる先行する感染のスニペットを表す細菌および古細菌におけるDNA配列(すなわちCRISPRクラスター)のファミリーである。DNAのスニペットは、類似のウイルスによる爾後の攻撃からのDNAを検出および破壊するために原核細胞によって用いられ、CRISPR関連タンパク質(Cas9およびそのホモログを包含する)およびCRISPR関連RNAのアレイと併せて、有効に原核生物免疫防御システムを成す。天然では、CRISPRクラスターはCRISPR RNA(crRNA)へと転写およびプロセシングされる。ある種の型のCRISPRシステム(例えば、II型CRISPRシステム)では、プレcrRNAの正しいプロセシングは、トランスにコードされる低分子RNA(tracrRNA)、内生リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9タンパク質を要求する。tracrRNAはプレcrRNAのリボヌクレアーゼ3によって支援されるプロセシングのためのガイドとしての用をなす。爾後に、Cas9/crRNA/tracrRNAはRNAに対して相補的な直線状または環状dsDNA標的をエンド的に切断する。具体的には、crRNAに対して相補的でない標的鎖が第1にエンド的にカットされ、それから3'-5'エキソ的にトリミングされる。天然では、DNA結合および切断は典型的にはタンパク質および両方のRNAを要求する。しかしながら、シングルガイドRNA(「sgRNA」または単純に「gNRA」)が、crRNAおよびtracrRNA両方の側面を単一のRNA種のガイドRNAに組み込むようにして操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。Cas9はCRISPR反復配列上の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識して、自己対非自己を見分けることを助ける。CRISPR生物学ならびにCas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者には周知である(例えば、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を見よ。これらの夫々の内容全体は参照によって本願に組み込まれる)。Cas9オーソログはS. pyogenesおよびS. thermophilusを包含するがこれらに限定されない種々の種において記載されている。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski,Rhun,and Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737に開示されている生物および座位からのCas9配列を包含する;これの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。
本明細書に使用されるとき、用語「DNA合成鋳型」は、プライム編集因子のポリメラーゼによって鋳型鎖(所望の編集を含有しており、次いでプライム編集の機序を通して、対応する内生DNAの鎖を標的部位にて置き換える、3'単鎖DNAフラップをコードする)として利用される、PEgRNAの伸長アームの領域または部分を指す。様々な態様において、DNA合成鋳型は、図3A(5'伸長アームを含むPEgRNAの文脈(context)において)、図3B(3'伸長アームを含むPEgRNAの文脈において)、図3C(内部伸長アームの文脈において)、図3D(3'伸長アームの文脈において)、および図3E(5'伸長アームの文脈において)に示される。伸長アームは、DNA合成鋳型を包含しており、DNAまたはRNAから構成されていてもよい。RNAのケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)であり得る。DNAのケースにおいて、プライム編集因子のポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼであり得る。様々な(例として、図3D~3Eに描かれるとおりの)態様において、DNA合成鋳型(4)は、「編集鋳型」および「相同アーム」、ならびに任意の5'末修飾領域e2の全部または一部を含んでいてもよい。つまり、e2領域の性質に応じて(例として、これが、ヘアピン、トウループ、またはステム/ループの2次構造を包含するかどうかに関わらず)、ポリメラーゼは、e2領域を何もコードしていなくても、またはその一部もしくは全部をコードしていてもよい。別の言い方をすれば、3'伸長アームのケースにおいて、DNA合成鋳型(3)は、ポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によるDNAの単鎖の合成のための鋳型として動作してもよい、プライマー結合部位(PBS)の5'末からgRNAコアの3'末までに及ぶ伸長アーム(3)の部分を包含し得る。5'伸長アームのケースにおいて、DNA合成鋳型(3)は、PEgRNA分子の5'末から編集鋳型の3'末までに及ぶ伸長アーム(3)の部分を包含し得る。好ましくは、DNA合成鋳型は、3'伸長アームまたは5'伸長アームのいずれかを有するPEgRNAsのプライマー結合部位(PBS)を排除する。本明細書に記載のある態様(例として、図71A)は、編集鋳型および相同アーム、すなわち、DNA合成の最中に鋳型として実際に使用されるPEgRNA伸長アームの配列を包含する「RT鋳型」を指す。用語「RT鋳型」は、用語「DNA合成鋳型」と等価である。
用語「二量体化ドメイン」は、二重特異性リガンドの結合ドメインに結合するリガンド結合ドメインを言う。「第1の」二量体化ドメインは二重特異性リガンドの第1の結合部分に結合し、「第2の」二量体化ドメインは同じ二重特異性リガンドの第2の結合部分に結合する。第1の二量体化ドメインが(例えば、本願において論じられるとおりPEを介して)第1のタンパク質に融合され、第2の二量体化ドメインが(例えば、本願において論じられるとおりPEを介して)第2のタンパク質に融合されるときには、第1および第2のタンパク質は二重特異性リガンドの存在下において二量体化し、二重特異性リガンドは、第1の二量体化ドメインに結合する少なくとも1つの部分と第2の二量体化ドメインに結合する少なくとも別の部分とを有する。
本明細書に使用されるとき、用語「上流」および「下流」は、5'→3'方向に配向された核酸分子(単鎖または二本鎖であるかに関わらず)中に位置付けられた少なくとも2つの要素の線状の位置を定義する相対的な用語である。とりわけ、第1要素が第2要素に対して5'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の上流にある。例えば、SNPがニック部位の5'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の上流にある。逆に言うと、第1要素が第2要素に対して3'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の下流にある。例えば、SNPがニック部位の3'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の下流にある。核酸分子は、DNA(二本鎖もしくは単鎖)、RNA(二本鎖もしくは単鎖)、またはDNAとRNAとのハイブリッドであり得る。二本鎖分子のどちらの鎖を考慮するのか選択する必要がある場合を除き、上流および下流という用語が核酸分子の単鎖にのみ言及するところ、分析は単鎖核酸分子および二本鎖分子について同じである。しばしば、少なくとも2つの要素の相対的な位置を決定するのに使用され得る二本鎖のDNAの鎖は、「センス」鎖または「コード」鎖である。遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖DNA内セグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。よって、例として、SNP核酸塩基がセンス鎖またはコード鎖上のプロモーターの3'側にある場合、SNP核酸塩基はゲノムDNA(二本鎖である)中のプロモーター配列の「下流」にある。
用語「編集鋳型」は、ポリメラーゼ、例えばDNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によって合成される一本鎖3'DNAフラップ上に所望の編集をコードする伸長アームの部分を言う。本明細書に記載のある態様(例として、図71A)は、編集鋳型と相同アームとの両方一緒、すなわち、DNA合成の最中に鋳型として実際に使用されるPEgRNA伸長アームの配列を指す「RT鋳型」を指す。用語「RT編集鋳型」はまた、用語「DNA合成鋳型」とも等価であるが、ここでRT編集鋳型は、逆転写酵素であるポリメラーゼを有するプライム編集因子の使用を反映し、DNA合成鋳型は、いずれのポリメラーゼも有するプライム編集因子の使用をより広く反映する。
本願において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘起するために十分である生物活性薬剤の量を言う。例えば、いくつかの態様では、プライム編集因子(PE)の有効量は、標的部位ヌクレオチド配列、例えばゲノムを編集するために十分である編集因子の量を言い得る。いくつかの態様では、本願において提供されるプライム編集因子(PE)の、例えばニッカーゼCas9ドメインおよび逆転写酵素を含む融合タンパク質の有効量は、融合タンパク質によって特異的に結合および編集される標的部位の編集を誘導するために十分である融合タンパク質の量を言い得る。当業者には了解されるであろうとおり、薬剤、例えば融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質(またはタンパク質二量体)およびポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば、所望の生物学的反応、例えば編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位、標的化されようとする細胞または組織、および用いられようとする薬剤のような種々の因子に依存して変わり得る。
本明細書に使用されるとき、用語「エラーを起こしやすい」逆転写酵素(またはより広くは、いずれのポリメラーゼ)は、天然に存在するか、または野生型M-MLV逆転写酵素の誤差率未満の誤差率を有する別の逆転写酵素(例として、野生型M-MLV逆転写酵素)に由来する逆転写酵素(またはより広くは、いずれのポリメラーゼ)を指す。野生型M-MLV逆転写酵素の誤差率は、1誤差の範囲が15,000(より高い)~27,000(より低い)にあると報告されている。15,000中の1の誤差率は6.7×10-5の誤差率に相当する。27,000中の1の誤差率は3.7×10-5の誤差率に相当する。Boutabout et al.(2001)“DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1,”Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222を参照(これは参照により本明細書に組み込まれる)。よって、本出願の目的において、用語「エラーを起こしやすい」は、15,000核酸塩基の組み込み中1より大きい誤差(6.7×10-5またはこれより高い)、例として、14,000核酸塩基中1誤差(7.14×10-5もしくはこれより高い)、13,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(7.7×10-5もしくはこれより高い)、12,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(7.7×10-5もしくはこれより高い)、11,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(9.1×10-5もしくはこれより高い)、10,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(1×10-4または0.0001もしくはこれより高い)、9,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00011もしくはこれより高い)、8,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00013もしくはこれより高い)、7,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00014もしくはこれより高い)、6,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00016もしくはこれより高い)、5,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.0002もしくはこれより高い)、4,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00025もしくはこれより高い)、3,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00033もしくはこれより高い)、2,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.00050もしくはこれより高い)、あるいは1,000核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.001もしくはこれより高い)、あるいは500核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.002もしくはこれより高い)、あるいは250核酸塩基またはこれより少ない中で1誤差(0.004もしくはこれより高い)である誤差率を有する、それらRTを指す。
本願において用いられる用語「エクステイン」は、インテインによってフランキングされ、タンパク質スプライシングのプロセスの間に別のエクステインにライゲーションされて成熟したスプライシングされたタンパク質を形成するポリペプチド配列を言う。典型的には、インテインは2つのエクステイン配列によってフランキングされ、これらはインテインがそれ自体の切除を触媒するときに一緒にライゲーションされる。エクステインは、従って、mRNA上に見出されるエキソンに対するタンパク質アナログである。例えば、インテインを含むポリペプチドは構造エクステイン(N)-インテイン-エクステイン(C)であり得る。インテインの切除および2つのエクステインのスプライシング後に、もたらされる構造はエクステイン(N)-エクステイン(C)および遊離のインテインである。種々の構成では、エクステインは、夫々が分裂インテインに融合された別個のタンパク質(例えば、Cas9またはPE融合タンパク質の半分)であり得、分裂インテインの切除はエクステイン配列のスプライシングを一緒に引き起こす。
用語「伸長アーム」は、数種の機能(逆転写酵素のためのプライマー結合部位および編集鋳型を包含する)を提供するPEgRNAのヌクレオチド配列構成要素を指す。いくつかの態様、例として、図3Dにおいて、伸長アームは、ガイドRNAの3'末にて位置付けられる。他の態様、例として、図3Eにおいて、伸長アームは、ガイドRNAの5’末にて位置付けられる。いくつかの態様において、伸長アームはまた、相同アームも包含する。様々な態様において、伸長アームは、5'→3'方向に以下の構成要素:相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位を含む。逆転写酵素の重合活性が5'→3'方向であるから、相同アーム、編集鋳型、およびプライマー結合部位の好ましい配置は、逆転写酵素が、アニールされたプライマー配列によって一旦プライムされると、編集鋳型を相補的な鋳型鎖として使用して単鎖DNAを重合する(polymerases)ように、5'→3'方向にある。伸長アームの長さなどのさらなる詳細は、本明細書に記載の他のどこかに記載されている。
本明細書に使用されるとき、用語「フラップエンドヌクレアーゼ」は、5'単鎖DNAフラップの除去を触媒する酵素を指す。これらは、細胞プロセス(DNA複製を包含する)の最中に形成された5'フラップの除去を処理する、天然に存在する酵素である。本明細書に記載のプライム編集方法は、内生で供給されるフラップエンドヌクレアーゼ、またはプライム編集の最中に標的部位にて形成される内生DNAの5'フラップを除去するのにtransで提供されるものを利用してもよい。フラップエンドヌクレアーゼは、当該技術分野において知られており、Patel et al.,“Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,”Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily,”Cell,2011,145(2):198-211、およびBalakrishnan et al.,“Flap Endonuclease 1,”Annu Rev Biochem,2013,Vol 82:119-138(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)の記載から見出され得る。例示のフラップエンドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸配列によって表され得るFEN1である:
用語「機能的等価物」は、機能は等価であるが構造は第1生体分子と必ずしも等価ではない第2生体分子を指す。例えば、「Cas9等価物」は、Cas9と同じかまたは実質的に同じ機能を有するが、必ずしも同じアミノ酸配列は有さないタンパク質を指す。本開示の文脈において、本明細書は通してずっと「タンパク質X、またはその機能的等価物」を指す。これに関連して、タンパク質Xの「機能的等価物」は、タンパク質Xの等価機能を担持する、いずれのホモログ、パラログ、フラグメント、天然に存在するバージョン、改変バージョン、突然変異バージョン、または合成バージョンを受け入れる。
用語「融合タンパク質」は、本明細書に使用されるとき、少なくとも2つの異なるタンパク質からタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。あるタンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端(N末端)部分にて、またはカルボキシ末端(C末端)タンパク質にて位置付けられ、よって「アミノ末端の融合タンパク質」または「カルボキシ末端の融合タンパク質」の夫々を形成してもよい。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸結合ドメイン(例として、タンパク質を標的部位への結合へ向かわせる、Cas9のgRNA結合ドメイン)と、核酸編集タンパク質の核酸切断ドメインまたは触媒ドメインとを含んでいてもよい。別の例は、逆転写酵素と融合したCas9またはその等価物を包含する。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。
用語「着目した遺伝子」または「GOI」は、着目した生体分子(例として、タンパク質またはRNA分子)をコードする遺伝子を指す。着目したタンパク質は、いずれの細胞内タンパク質、膜タンパク質、または細胞外タンパク質、例として、核内タンパク質、転写因子、核膜輸送体、細胞内オルガネラ関連タンパク質、膜受容体、触媒タンパク質、および酵素、治療用タンパク質、膜タンパク質、膜輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、または免疫学的タンパク質(例として、IgGまたは他の抗体タンパク質)、等々を包含し得る。着目した遺伝子はまた、これらに限定されないが、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子核内RNA(snRNA)、アンチセンスRNA、ガイドRNA、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、および無細胞RNA(cfRNA)を包含するRNA分子もコードしていてもよい。
本明細書に使用されるとき、用語「ガイドRNA」は、大部分が一般的にCRISPR-Cas9のCasタンパク質に関連する具体的な型のガイド核酸であって、Cas9に結び付いて、Cas9タンパク質をDNA分子中の特定の配列(ガイドRNAのプロトスペース配列との相補性を包含する)へ向かわせる。しかしながら、この用語はまた、天然に存在するかもしくは天然には存在しない(例として、改変または組換え)かに関わらず、Cas9等価物、ホモログ、オルソログ、またはパラログに結び付き、またCas9等価物を特定の標的ヌクレオチド配列へ局在化するよう別にプログラムする、等価なガイド核酸分子も受け入れる。Cas9等価物は、Cpf1(V型CRISPR-Cas系)、C2c1(V型CRISPR-Cas系)、C2c2(VI型CRISPR-Cas系)およびC2c3(V型CRISPR-Cas系)を包含する、いずれの型のCRISPR系(例として、II型、V型、VI型)からの他のnapDNAbpも包含していてもよい。さらなるCas等価物は、Makarova et al.,“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,”Science 2016;353(6299)(この内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。ガイドRNAの例示の配列および構造は本明細書に提供されている。加えて、適切なガイドRNA配列をデザインするための方法も、本明細書に提供されている。本明細書に使用されるとき、「ガイドRNA」はまた、本明細書に開示のプライム編集方法および組成物のために発明された「プライム編集ガイドRNA」(または「PEgRNA」)と呼ばれる修飾形態のガイドRNAと対比させるために「既存のガイドRNA」とも称されてもよい。
用語「相同アーム」は、結果として得られる、逆転写酵素にコードされた単鎖DNAフラップ(内生鎖を置き換えることによって標的DNA部位中へ取り入れられる)の部分をコードする伸長アームの部分(単数または複数)を指す。相同アームによってコードされる単鎖DNAフラップの部分は、標的DNA配列の非編集済鎖に相補的であって、内生鎖に取って代わることおよびその場所において単鎖DNAフラップとアニールすることを容易にし、これによって編集が組み入れられる。この構成要素は他のどこかでさらに定義される。定義上、それは本明細書に記載のプライム編集因子のポリメラーゼによってコードされるので、相同アームはDNA合成鋳型の一部である。
用語「宿主細胞」は、本明細書に使用されるとき、本明細書に記載のベクター、例として、Cas9もしくはCas9等価物と逆転写酵素とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターの宿主となり(host)複製してこれを発現し得る細胞を指す。
本願において用いられる用語「インテイン」は、生命の全てのドメインからの生物に見出される自己プロセシングポリペプチドドメインを言う。インテイン(介在タンパク質)は、タンパク質スプライシングとして公知の固有の自己プロセシングイベントを実行する。これにおいては、それは、2つのペプチド結合の切断によってより大きい前駆体ポリペプチドからそれ自体を切除、プロセスにおいて、新たなペプチド結合の形成によってフランキングするエクステイン(外部タンパク質)配列同士をライゲーションする。インテイン遺伝子は他のタンパク質コード遺伝子とインフレームで埋め込まれて見出されるので、この再構成は翻訳後に(または共翻訳的に)生起する。さらにその上、インテインによって媒介されるタンパク質スプライシングは自発的である;それは、外部の因子またはエネルギー源ではなくインテインドメインのフォールディングのみを要求する。このプロセスは、「分裂インテイン」によるトランスタンパク質スプライシングの天然のプロセスと対比して、シスタンパク質スプライシングとしてもまた公知である。インテインは自己スプライシングRNAイントロンのタンパク質等価物であり(Perler et al.,Nucleic Acids Res.22:1125-1127(1994)を見よ)、これらは前駆体タンパク質からのそれら自体の切除を触媒し、エクステインとして公知のフランキングするタンパク質配列の付随的融合を有する(Perler et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.1:292-299(1997);Perler,F.B.Cell 92(1):1-4(1998);Xu et al.,EMBO J.15(19):5146-5153(1996)において総説されている)。
本願において用いられる用語「リガンド依存性インテイン」は、リガンド結合ドメインを含むインテインを言う。典型的には、リガンド結合ドメインはインテインのアミノ酸配列上に挿入され、構造インテイン(N)-リガンド結合ドメイン-インテイン(C)をもたらす。典型的には、リガンド依存性インテインは、適当なリガンドの不在下においてはタンパク質スプライシング活性を発揮しないかまたは最小限のみ発揮し、リガンドの存在下においてはタンパク質スプライシング活性の顕著な増大を発揮する。いくつかの態様では、リガンド依存性インテインはリガンドの不在下においては観察可能なスプライシング活性を発揮しないが、リガンドの存在下においてはスプライシング活性を発揮する。いくつかの態様では、リガンド依存性インテインはリガンドの不在下においては観察可能なタンパク質スプライシング活性を、適当なリガンド存在下においては、リガンドの不在下において観察される活性よりも少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも250倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも1500倍、少なくとも2000倍、少なくとも2500倍、少なくとも5000倍、少なくとも10000倍、少なくとも20000倍、少なくとも25000倍、少なくとも50000倍、少なくとも100000倍、少なくとも500000倍、または少なくとも1000000倍多大であるタンパク質スプライシング活性を発揮する。いくつかの態様では、活性の増大は少なくとも1桁、少なくとも2桁、少なくとも3桁、少なくとも4桁、または少なくとも5桁に渡って用量依存的であり、リガンドの濃度を調整することによってインテイン活性の微調整を許す。好適なリガンド依存性インテインは当該技術分野において知られており、下で提供されるものおよび公開米国特許出願第U.S.2014/0065711A1号;Mootz et al.,“Protein splicng triggered by a small molecule.”J.Am.Chem.Soc.2002;124,9044-9045;Mootz et al.,“Conditional protein splicng: a new tool to control protein structure and function in vitro and in vivo.”J.Am.Chem.Soc.2003;125,10561-10569;Buskirk et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2004;101,10505-10510);Skretas & Wood,“Regulation of protein activity with small-molecule-controlled inteins.”Protein Sci.2005;14,523-532;Schwartz,et al.,“Post-translational enzyme activation in an animal via optimized conditional protein splicing.”Nat.Chem.Biol.2007;3,50-54;Peck et al.,Chem.Biol.2011;18(5),619-630に記載されているものを包含する;夫々の内容全体は参照によってここに組み込まれる。例示の配列は次のとおりである:
本願において用いられる用語「リンカー」は、2つの他の分子または部分を連結するある分子を言う。リンカーは、2つの融合タンパク質を連結するリンカーのケースではアミノ酸配列であり得る。例えば、Cas9はアミノ酸リンカー配列によって逆転写酵素に融合され得る。リンカーは、2つのヌクレオチド配列を一緒に連結するケースではヌクレオチド配列でもまたあり得る。例えば、本ケースでは、従来のガイドRNAは、スペーサーまたはリンカーヌクレオチド配列を介して、RT鋳型配列とRTプライマー結合部位とを含み得るプライム編集ガイドRNAのRNA伸長に連結される。他の態様において、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様では、リンカーは、長さが5-100アミノ酸、例えば長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30~35、35~40、40~45、45~50、50~60、60~70、70~80、80~90、90~100、100~150、または150~200アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーもまた企図される。
「単離された」は、自然状態から変更または除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核20酸またはペプチドは「単離され」ていないが、共存材料のその自然状態から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非ネイティブ(non-native)的環境(例えば、宿主細胞など)で存在し得る。
種々の態様では(例えば、図72~73および例19の態様に図示されているとおり)、用語「MS2タグ付け技術」は、RNA-タンパク質相互作用ドメイン、例えば特定のヘアピン構造を特異的に認識および結合するRNA結合タンパク質とペアリングされた「RNA-タンパク質相互作用ドメイン」(「RNA-タンパク質動員ドメインまたはタンパク質」としてもまた公知)の組み合わせを言う。これらの型のシステムは、標的部位に結合されているプライム編集因子複合体に種々の機能性を動員するように活用され得る。MS2タグ付け技術は、ファージのゲノム上に存在するステムループまたはヘアピン構造、すなわち「MS2ヘアピン」とのMS2バクテリオファージコートタンパク質(「MCP」または「MS2cp」)の天然の相互作用に基づく。プライム編集のケースでは、MS2タグ付け技術は、プライム編集に関わる所望のRNA分子(例えば、PEgRNAまたはtPERT)上にMS2ヘアピンを導入することを含む。これは、それから、その構造を認識および結合するRNA結合タンパク質にとっての特異的な相互作用可能な結合標的を構成する。MS2ヘアピンのケースでは、それはMS2バクテリオファージコートタンパク質(MCP)によって認識および結合される。そして、MCPが別のタンパク質(例えば、逆転写酵素または他のDNAポリメラーゼ)に融合される場合には、MS2ヘアピンが、プライム編集複合体によって占有される標的部位にその他のタンパク質をトランスで「動員」するために用いられ得る。
本明細書に使用されるとき、用語「核酸プログラム型DNA結合タンパク質」または「napDNAbp」(そのCas9が一例である)は、DNA分子中の特定の配列を標的にし結合するためにRNA:DNAハイブリダイゼーションを使用するタンパク質を指す。各napDNAbpは、ガイド核酸またはこの一部(例として、ガイドRNAのプロトスペーサー)に相補的なDNA鎖(すなわち、標的鎖)を含むDNA配列へnapDNAbpを局在化する、少なくとも1のガイド核酸(例として、ガイドRNA)に結び付けられている。換言すれば、ガイド核酸は、相補的な配列へ局在化し結合するようnapDNAbp(例として、Cas9または等価物)を「プログラム」する。
用語「ニッカーゼ」は、不活性化された2つのヌクレアーゼドメインのうち1つをもつCas9を指す。この酵素は、標的DNAの一方の鎖のみを切断することが可能である。
用語「核局在化配列」または「NLS」は、タンパク質の細胞核中への、例えば核輸送による、輸入(import)を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は当該技術分野において知られており、当業者に明らかであろう。例えば、NLS配列は、2000年11月23日に出願され、2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された、Plankらの国際PCT出願PCT/EP2000/011690に記載されている(この内容は、例示の核局在化配列のその開示について参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの態様において、NLSは、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号16)またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号17)を含む。
用語「核酸」は、本明細書に使用されるとき、ヌクレオチドのポリマーを指す。ポリマーは、天然のヌクレオシド(すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例として、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5ブロモウリジン、C5フルオロウリジン、C5ヨードウリジン、C5プロピニルウリジン、C5プロピニルシチジン、C5メチルシチジン、7デアザアデノシン、7デアザグアノシン、8オキソアデノシン、8オキソグアノシン、O(6)メチルグアニン、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルシュードウリジン、1-メチルアデノシン、1-メチルグアノシン、N6-メチルアデノシン、および2-チオシチジン)、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基(例として、メチル化された塩基)、インターカレートされた(intercalated)塩基、修飾された糖(例として、2'-フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボース、2'-O-メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース)、または修飾されたホスファート基(例として、ホスホロチオアートおよび5'-Nホスホラミダイト連結)を包含していてもよい。
本明細書に使用されるとき、用語「プライム編集ガイドRNA」または「PEgRNA」または「伸長されたガイドRNA」は、本明細書に記載のプライム編集方法および組成物を実践するための1以上の追加の配列を包含するよう修飾されたガイドRNAの特化された形態を指す。本明細書に記載のとおり、プライム編集ガイドRNAは、核酸配列の1以上の「伸長された領域」を含む。伸長された領域は、これらに限定されないが、単鎖のRNAまたはDNAを含んでいてもよい。さらに、伸長された領域は、既存のガイドRNAの3'末にて生じていてもよい。他の配置において、伸長された領域は、既存のガイドRNAの5’末にて生じていてもよい。また他の配置において、伸長された領域は、既存のガイドRNAの末端の分子内のある領域にて(例えば、napDNAbpへ結び付きおよび/または結合するgRNAコア領域中)生じていてもよい。伸長された領域は、単鎖DNAを(プライム編集因子のポリメラーゼによって)コードする「DNA合成鋳型」を含むが、前記分子は次に(a)編集されるべき内生標的DNAと相同であるようデザインされており、および(b)内生標的DNA中へ誘導または取り入れられるべき少なくとも1の所望のヌクレオチド変化(例として、トランジション、トランスバージョン、欠失、もしくは挿入)を含んでいる。伸長された領域はまた、他の機能的配列要素(これらに限定されないが、「プライマー結合部位」および「スペーサーもしくはリンカー」配列など)、または他の構造的要素(これらに限定されないが、アプタマー、ステムループ、ヘアピン、トウループ(例として、3'トウループ)、もしくはRNA-タンパク質動員ドメイン(例として、MS2ヘアピン))も含んでいてもよい。本明細書に使用されるとき「プライマー結合部位」は、Rループのニック入りDNAから生成された3'末を有する単鎖DNA配列とハイブリダイズする配列を含む。
本願において用いられる「PE1」は、次の構造を有するCas9(H840A)と野生型MMLV RTとを含む融合タンパク質を含むPE複合体を言う:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(wt)]+所望のPEgRNA。PE融合体は配列番号123のアミノ酸配列を有し、これは次のとおり示される;
本願において用いられる「PE2」は、次の構造を有するCas9(H840A)とバリアントMMLV RTとを含む融合タンパク質を含むPE複合体を言う:[NLS]-[Cas9(H840A)]-[リンカー]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]+所望のPEgRNA。PE融合体は配列番号134のアミノ酸配列を有し、これは次のとおり示される:
本願において用いられる「PE3」は、PE2、プラスPE2と複合体化する第2鎖ニッキングガイドRNAを言い、編集される鎖の選好的置き換えを誘導するために非編集DNA鎖上にニックを導入する。
PE3b
用語「ペプチドタグ」は、遺伝子学的にタンパク質配列と融合してタンパク質上へ1以上の機能を付与するペプチドアミノ酸配列を指し、これによって可視化、精製、可溶化、分離等々などの様々な目的でのタンパク質の操作が容易になる。ペプチドタグは、目的または機能によって分類される様々な型のタグを包含し得、これは、「親和性タグ」(タンパク質精製を容易にするための)、「可溶化タグ」(タンパク質の正しい折り畳みを補助するための)、「クロマトグラフィータグ」(タンパク質のクロマトグラフ特性を変更するための)、「エピトープタグ」(高親和性抗体へ結合するための)、「蛍光タグ」(細胞中またはin vitroでのタンパク質の可視化を容易にするための)を包含していてもよい。
本願において用いられる用語「ポリメラーゼ」は、本明細書に記載のプライム編集因子システムに関して用いられ得るヌクレオチド鎖を合成する酵素を言う。ポリメラーゼは「鋳型依存性」ポリメラーゼであり得る(すなわち、鋳型鎖のヌクレオチド塩基の順序に基づいてヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)。ポリメラーゼは「鋳型非依存性」ポリメラーゼでもまたあり得る(すなわち、鋳型鎖の要件なしにヌクレオチド鎖を合成するポリメラーゼ)。ポリメラーゼはさらに「DNAポリメラーゼ」または「RNAポリメラーゼ」としてもまた類別され得る。種々の態様において、プライム編集因子システムはDNAポリメラーゼを含む。種々の態様において、DNAポリメラーゼは「DNA依存性DNAポリメラーゼ」であり得る(すなわち、それによると、鋳型分子はDNAの鎖である)。かかるケースでは、DNA鋳型分子はPEgRNAであり得、伸長アームはDNAの鎖を含む。かかるケースでは、PEgRNAはキメラまたはハイブリッドPEgRNAと言われ得、これはRNA部分(すなわち、スペーサーおよびgRNAコアを包含するガイドRNA構成要素)とDNA部分(すなわち伸長アーム)とを含む。種々の他の態様において、DNAポリメラーゼは「RNA依存性DNAポリメラーゼ」であり得る(すなわち、それによると、鋳型分子はRNAの鎖である)。かかるケースでは、PEgRNAはRNAであり、すなわちRNA伸長を包含する。用語「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素をもまた言い得る(すなわちポリメラーゼ活性)。一般的に、酵素は、ポリヌクレオチド鋳型配列にアニーリングしたプライマー(例えば、例えばPEgRNAのプライマー結合部位にアニーリングしたプライマー配列)の3'端において合成を開始し、鋳型鎖の5'端の方へ進むであろう。「DNAポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒する。DNAポリメラーゼを参照して本願において用いられる用語DNAポリメラーゼは、「その機能的フラグメント」を包含する。「その機能的フラグメント」は、少なくとも1つのセットの条件下においてはポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を保持する、ポリメラーゼのアミノ酸配列全体未満を包摂する野生型または変異体DNAポリメラーゼのいずれかの部分を言う。かかる機能的フラグメントは別個の実態として存在し得るか、またはそれは融合タンパク質などのより大きいポリペプチドの構成成分であり得る。
本願において用いられる用語「プライム編集」は、遺伝子編集のための新規のアプローチを言い、napDNAbp、ポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)、およびそれから標的DNA配列上に組み込まれる所望の新たな遺伝情報をコードする(または遺伝情報を欠失する)ためのDNA合成鋳型を包含する特殊化したガイドRNAを用いる。プライム編集のある種の態様は他の図の中でも図1A-1Hおよび図72(a)-72(c)の態様に記載される。
用語「プライム編集因子」は、napDNAbp(例として、Cas9ニッカーゼ)および逆転写酵素を含む本明細書に記載の融合構築物を指し、PEgRNA(または「伸長されたガイドRNA」)の存在下で標的ヌクレオチド配列上にプライム編集を遂行することが可能である。用語「プライム編集因子」は、融合タンパク質、またはPEgRNAと複合体化された融合タンパク質、および/または第2鎖へニックを入れるsgRNAとさらに複合体化された融合タンパク質を指してもよい。いくつかの態様において、プライム編集因子はまた、本明細書に記載のとおりの非編集済鎖の第2部位へのニック入れステップへ向かうことが可能な、融合タンパク質(napDNAbpと融合した逆転写酵素)、PEgRNA、および定例の(regular)ガイドRNAを含む複合体も指してもよい。他の態様において、「プライマー編集因子」の逆転写酵素構成要素は、transで提供されてもよい。
用語「プライマー結合部位」または「PBS」は、伸長アームの構成要素としてPEgRNA上に位置付けられ(典型的には伸長アームの3'末にある)ヌクレオチド配列であって、プライム編集因子による標的配列のCas9ニック入れ後に形成されるプライマー配列へ結合するのに役立つヌクレオチド配列を指す。他のどこかで詳述されるとおり、プライム編集因子のCas9ニッカーゼ構成要素が標的DNA配列の鎖の一方にニックを入れたとき、3'末のssDNAフラップが形成され、これはPEgRNA上のプライマー結合部位とアニールして逆転写をプライムするプライマー配列として働く。図27および28は、3'および5'伸長アーム上夫々に位置付けられるプライマー結合部位の態様を示す。
用語「プロモーター」は当該技術分野において認識されており、細胞性の転写機構によって認識され、下流遺伝子の転写を開始する能力がある配列を有する核酸分子を言う。プロモーターは、プロモーターが所与の細胞性という文脈において常に活性であるということを意味する恒常的に活性、またはプロモーターが特定の条件の存在下においてのみ活性であるということを意味する条件付きで活性であり得る。例えば、条件付きプロモーターは、プロモーター上の制御エレメントと会合したタンパク質を基本的な転写機構に接続する特定のタンパク質の存在下においてのみ、または阻害分子の不在下においてのみ活性であり得る。条件付きで活性なプロモーターのサブクラスは、活性のために低分子「誘導因子」の存在を要求する誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの例は、アラビノース誘導性プロモーター、Tet-onプロモーター、およびタモキシフェン誘導性プロモーターを包含するが、これらに限定されない。種々の恒常的、条件付き、および誘導性プロモーターが当業者に周知であり、当業者は本発明を実行することに有用な種々のかかるプロモーターを確かめる能力があるであろう。これはこの点について限定されない。
本願において用いられる用語「プロトスペーサー」はPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列に隣接するDNA上の配列(~20bp)を言う。プロトスペーサーはガイドRNAのスペーサー配列と同じ配列を共有する。ガイドRNAは標的DNA上のプロトスペーサー配列の相補体(具体的には、それの1つの鎖、すなわち標的DNA配列の「非標的鎖」に対する「標的鎖」)にアニールする。Cas9が機能するためには、それは特定のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)をもまた要求し、これはCas9遺伝子の細菌種に依存して変わる。S.pyogenesに由来する最も普通に用いられるCas9ヌクレアーゼは、ゲノムDNA上の標的配列の直接的に下流に見出される非標的鎖上のNGGというPAM配列を認識する。当業者は、現況技術の文献が、場合によっては、それを「スペーサー」と言うよりもむしろ、ガイドRNAそれ自体の上の~20nt標的特異的ガイド配列として「プロトスペーサー」を言うということを了解するであろう。それゆえに、いくつかのケースでは、本願において用いられる用語「プロトスペーサー」は用語「スペーサー」と交換可能に用いられ得る。「プロトスペーサー」または「スペーサー」どちらかの出現の周囲の記載という文脈は、用語がgRNAまたはDNA標的を参照しているかどうかについて読み手に情報提供することを助けるであろう。
本願において用いられる用語「プロトスペーサー隣接配列」または「PAM」は、Cas9ヌクレアーゼの重要な標的化構成要素であるおよそ2-6塩基対のDNA配列を言う。典型的には、PAM配列はどちらかの鎖上にあり、Cas9によってカットされる部位の5'から3'方向においては下流である。標準的なPAM配列(すなわち、Streptococcus pyogenesのCas9ヌクレアーゼまたはSpCas9に関連するPAM配列)は5'-NGG-3'であり、「N」は2つのグアニン(「G」)核酸塩基によって後続されるいずれかの核酸塩基である。異なるPAM配列が異なる生物からの異なるCas9ヌクレアーゼまたは同等タンパク質と関連し得る。加えて、いずれかの所与のCas9ヌクレアーゼ、例えばSpCas9は、ヌクレアーゼが代替的なPAM配列を認識するようにしてヌクレアーゼのPAM特異性を変改するように改変され得る。
リコンビナーゼ
本願において用いられる用語「リコンビナーゼ認識配列」または同等に「RRS」または「リコンビナーゼ標的配列」は、リコンビナーゼによって認識され、RRSを有する別のDNA分子との鎖交換を経過するヌクレオチド配列標的を言う。これはリコンビナーゼ認識配列間のDNAフラグメントの切除、取り入れ、逆位、または交換をもたらす。
用語「組み換える」または「組み換え」は、核酸改変(例えばゲノム改変)という文脈において、2つ以上の核酸分子または単一の核酸分子の2つ以上の領域がリコンビナーゼタンパク質(例えば、本願において提供される本発明のリコンビナーゼ融合タンパク質)の作用によって改変されるプロセスを言うために用いられる。組み換えは、例えば1つ以上の核酸分子上または間において、核酸のとりわけ挿入、逆位、切除、または転座をもたらし得る。リコンビナーゼ認識配列
用語「逆転写酵素」はRNA依存性DNAポリメラーゼとして特徴付けられるポリメラーゼのあるクラスを記述する。全ての公知の逆転写酵素はRNA鋳型からDNA転写物を合成するためにはプライマーを要求する。歴史的には、逆転写酵素は主としてmRNAをcDNAに転写するために用いられている。これはそれからさらなる操作のためにベクター上にクローニングされ得る。トリ骨髄芽球症(myoblastosis)ウイルス(AMV)逆転写酵素は最初の広く用いられるRNA依存性DNAポリメラーゼであった(Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1(1977))。酵素は、5'-3'RNA指令型DNAポリメラーゼ活性、5'-3'DNA指令型DNAポリメラーゼ活性、およびRNase H活性を有する。RNase HはRNA-DNAハイブリッドのRNA鎖に特異的なプロセッシブな5'および3'リボヌクレアーゼである(Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons(1984))。公知のウイルス逆転写酵素はプルーフリーディングにとって必要な3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くので、転写のエラーは逆転写酵素によって修正され得ない(Saunders and Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm(1987))。AMV逆転写酵素の活性およびその関連するRNase H活性の詳細な研究は、Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372(1983)によって提示されている。分子生物学に鋭意用いられる別の逆転写酵素はモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)を起源とする逆転写酵素である。例えば、Gerard, G. R., DNA 5:271-279(1986)およびKotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258(1985)を見よ。RNase H活性を実質的に欠くM-MLV逆転写酵素もまた記載されている。例えばU.S.Pat.No.5,244,797を見よ。本発明はいずれかのかかる逆転写酵素またはそれらのバリアントもしくは変異体の使用を企図する。
本願において用いられる用語「逆転写」は、酵素がRNAを鋳型として用いてDNA鎖(つまり、相補的なDNAまたはcDNA)を合成する能力を指示する。いくつかの態様では、逆転写は「エラーを起こしやすい逆転写」であり得る。これは、それらのDNA重合活性がエラーを起こしやすい、ある種の逆転写酵素の特性を言う。
本願において用いられる用語「ファージによって補助される連続的進化(PACE)」は、ウイルスベクターとしてファージを使用する連続的進化を言う。PACE技術の一般概念は、例えば、2009年9月8日出願の国際PCT出願PCT/US2009/056194、2010年3月11日にWO 2010/028347として公開;2011年12月22日出願の国際PCT出願PCT/US2011/066747、2012年6月28日にWO 2012/088381として公開;米国出願、2015年5月5日に発行された米国特許第9,023,594号;2015年1月20日出願の国際PCT出願PCT/US2015/012022、2015年9月11日にWO 2015/134121として公開;および2016年4月15日出願の国際PCT出願PCT/US2016/027795、2016年10月20日にWO 2016/168631として公開(これら全体の各内容は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本願において用語「バクテリオファージ」と交換可能に用いられる用語「ファージ」は、細菌細胞に感染するウイルスを言う。典型的には、ファージは遺伝物質を内包する外側タンパク質カプシドからなる。遺伝物質は直線状または環状形態どちらかのssRNA、dsRNA、ssDNA、またはdsDNAであり得る。ファージおよびファージベクターは当業者には周知であり、本願において提供されるPACE法を実行するために有用であるファージの限定しない例は、λ(溶原体)、T2、T4、T7、T12、R17、M13、MS2、G4、P1、P2、P4、ファイX174、N4、Φ6、およびΦ29である。ある態様において、本発明に利用されるファージはM13である。追加の好適なファージおよびホスト細胞は当業者には明らかであろう。本発明はこの側面において限定されない。追加の好適なファージおよびホスト細胞の例示の記載は、Elizabeth Kutter and Alexander Sulakvelidze:Bacteriophages: Biology and Applications.CRC Press;1st edition(December 2004),ISBN:0849313368;Martha R.J.Clokie and Andrew M.Kropinski:Bacteriophages:Methods and Protocols,Volume 1:Isolation,Characterization,and Interactions(Methods in Molecular Biology)Humana Press;1st edition(December,2008),ISBN:1588296822;Martha R.J.Clokie and Andrew M.Kropinski:Bacteriophages:Methods and Protocols,Volume 2:Molecular and Applied Aspects(Methods in Molecular Biology)Humana Press;1st edition(December 2008),ISBN:1603275649を見よ;これらの全ては、好適なファージおよびホスト細胞、ならびにかかるファージの単離、培養、および操作のための方法およびプロトコールの開示について、それらの全体が参照によって本願に組み込まれる)。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書中、互換的に使用され、ペプチド(アミド)結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基の重合体を指す。用語は、いずれのサイズ、構造、もしくは機能の、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも3アミノ酸長であろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の一群を指してもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の1以上は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、ホスファート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合のためのリンカー、官能基化、または他の修飾等々などの化学的実体(chemical entity)の付加によって修飾されていてもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドのただのフラグメントであってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するもの、組換え体、または合成物、またはいずれのそれらの組み合わせであってもよい。本明細書に提供されるタンパク質のいずれも、当該技術分野において知られているいずれの方法によって産生されてもよい。例えば、本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質にとくに適した、組換えタンパク質の発現および精製を介して産生されてもよい。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)(これらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる))によって記載されるものを包含する。
本願において用いられる用語「タンパク質スプライシング」は、インテイン(または場合に応じて分裂インテイン)の配列がアミノ酸配列内から切り出され、アミノ酸配列の残りのフラグメントのエクステインがアミド結合によってライゲーションされて連続的なアミノ酸配列を形成するプロセスを言う。用語「トランス」タンパク質スプライシングは、インテインが分裂インテインであり、それらが異なるタンパク質上に位置付けられる特定のケースを言う。
プライム編集の結果として形成されるヘテロ二重鎖DNA(すなわち、1つの編集されたおよび1つの非編集の鎖を含有する)の分解は、長期的な編集アウトカムを決定する。言葉にすると、プライム編集のゴールは、相補的な内生鎖上に編集された鎖を永久的に取り入れすることによって、PEの中間体として形成されるヘテロ二重鎖DNA(内生非編集鎖と対形成した編集された鎖)を分解することである。DNA分子上への編集された鎖の永久的な取り入れに有利にヘテロ二重鎖DNAの分解を駆動することを助けるために、「第2鎖ニッキング」のアプローチが本願において用いられ得る。本願において用いられる「第2鎖ニッキング」の概念は、第1のニック(すなわち、ガイドRNAの伸長された部分上の逆転写酵素のプライムへの使用のための遊離の3'端を提供する当初のニック部位)の下流の位置付けにおける、好ましくは編集されない鎖上の第2のニックの導入を言う。ある態様において、第1のニックおよび第2のニックは対向する鎖上にある。他の態様において、第1のニックおよび第2のニックは対向する鎖上にある。さらに別の態様では、第1のニックは非標的鎖(すなわち、Rループの一本鎖部分を形成する鎖)上にあり、第2のニックは標的鎖上にある。なお他の態様において、第1のニックは編集される鎖上にあり、第2のニックは編集されない鎖上にある。第2のニックは、第1のニックの少なくとも5ヌクレオチド下流に、あるいは第1のニックの少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、もしくは150ヌクレオチド、またはより多く下流に位置取り得る。第2のニックは、ある態様において、編集されない鎖上において、PEgRNAによって誘導されるニックの部位から約5-150ヌクレオチドの間、または約5-140の間、もしくは約5-130の間、もしくは約5-120の間、もしくは約5-110の間、もしくは約5-100の間、もしくは約5-90の間、もしくは約5-80の間、もしくは約5-70の間、もしくは約5-60の間、もしくは約5-50の間、もしくは約5-40の間、もしくは約5-30の間、もしくは約5-20の間、もしくは約5-10の間離れて導入され得る。1つの態様では、第2のニックは、PEgRNAによって誘導されるニックから14-116ヌクレオチドの間離れて導入される。理論によって拘束されることなしに、第2のニックは細胞の内生DNA修復および複製プロセスを編集されない鎖の置き換えまたは編集の方へ誘導し、それによって、両方の鎖上に編集された配列を永久的に組み入れし、PEの結果として形成されるヘテロ二重鎖を分解する。いくつかの態様では、編集される鎖は非標的鎖であり、編集されない鎖は標的鎖である。他の態様において、編集される鎖は標的鎖であり、編集されない鎖は非標的鎖である。
遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖のDNA内のセグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。タンパク質をコードするDNAセグメントのケースにおいて、センス鎖は、転写の最中にその鋳型としてアンチセンス鎖を取り結局(典型的には、常にではない)翻訳を経てタンパク質になるmRNAと同じ配列を有するDNAの鎖である。よって、アンチセンス鎖は、後にタンパク質へ翻訳されるRNAを担い、一方センス鎖は、mRNAとほぼ同一の組成(makeup)を保有する。dsDNAの各セグメントについて、一方がどの方向から読まれるかに応じて、おそらく(センスおよびアンチセンスは視点に相対するから)センスおよびアンチセンスが2組存在するであろう点に留意する。遺伝子産物またはmRNAは結局、dsDNAの一方のセグメントのどちらかの鎖がセンスまたはアンチセンスと称されることを示す。
本明細書に使用されるとき、ガイドRNAまたはPEgRNAと関係のある用語「スペーサー配列」は、標的DNA配列中のプロトスペーサー配列に相補的なヌクレオチド配列を含有する、約20ヌクレオチドのガイドRNAまたはPEgRNAの部分を指す。スペーサー配列はプロトスペーサー配列とアニールすることで、標的部位にてssRNA/ssDNAハイブリッド構造が、およびプロトスペーサー配列に相補的な内生DNA鎖の対応するRループssDNA構造が形成される。
用語「対象」は、本明細書に使用されるとき、個々の生物、例えば、個々の哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物である。いくつかの態様において、対象は、齧歯類の動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒツジ、ヤギ、畜牛、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、飛ぶ昆虫(fly)、または線虫である。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子学的に改変されており、例として、遺伝子学的に改変された非ヒト対象である。対象は、いずれの性であってもよく、いずれの発生段階にあってもよい。
インテインは最も頻繁には一続きのドメインとして見出されるが、いくつかは天然に分裂された形態で存在する。このケースでは、2つのフラグメントは別個のポリペプチドとして発現され、スプライシングが生起する、いわゆるタンパク質トランススプライシング前に会合しなければならない。
用語「標的部位」は、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)によって編集される核酸分子上の配列を言う。さらに、標的部位は、プライム編集因子(PE)およびgRNAの複合体が結合する核酸分子上の配列を言う。
「transプライム編集因子「RNA型(tPERT)」に係る定義を参照。
本明細書に使用されるとき、用語「一時的な第2鎖へのニック入れ」は、未編集鎖中の第2ニックの組み入れが、所望の編集が編集済鎖に組み入れられた後でしか生じない、第2鎖へのニック入れのバリアントを指す。これによって、二本鎖DNA切断へ繋がり得る両鎖上の同時ニックが回避される。第2鎖にニックを入れるガイドRNAは、第2鎖ニックが所望の編集の組み入れ後まで導入されないように、一時的制御のためにデザインされている。これは、編集済鎖のみにマッチするが元のアレルにはマッチしないスペーサー配列をもつgRNAをデザインすることによって達成される。このストラテジーを使用すると、プロトスペーサーと未編集アレルとの間のミスマッチによって、PAM鎖上の編集事象が起きた後まで、sgRNAによるニック入れが疎まれるはずである。
本明細書に使用されるとき、用語「transプライム編集」は、分裂PEgRNAを利用するプライム編集の修飾形態を指すが、すなわち、ここでPEgRNAは、2つ別々の分子:sgRNAおよびtransプライム編集RNA鋳型(tPERT)に分離される。sgRNAが、所望のゲノムの標的部位へ、プライム編集因子を標的化させる(またはより一般に、プライム編集因子のnapDNAbp構成要素を標的化させる)よう働く一方で、一旦tPERTが、プライム編集因子上およびtPERT上に位置付けられた結合ドメインの相互作用によって、プライム編集因子へtransに動員されると、tPERTはポリメラーゼ(例として、逆転写酵素)によって使用されて新しいDNA配列を標的遺伝子座中へ書き込む。一態様において、結合ドメインは、tPERT上に位置付けられたMS2アプタマーおよびプライム編集因子と融合したMS2cpタンパク質などの、RNA-タンパク質動員部分を包含し得る。transプライム編集の利点は、DNA合成鋳型をガイドRNAから分離させることによって、潜在的により長い長さの鋳型を使用できる点である。
本明細書に使用されるとき、「transプライム編集因子RNA鋳型(tPERT)」は、transプライム編集に使用される構成要素を指す、プライム編集の修飾バージョンは、PEgRNAを2つの別個の分子:ガイドRNAおよびtPERT分子に分離することによって作動する。tPERT分子は、標的DNA部位にてプライム編集因子複合体と共局在化させて、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型をプライム編集因子へtransで連れていくようプログラムされている。例えば、(1)RP-PE:gRNA複合体および(2)プライマー結合部位とRNA-タンパク質動員ドメインへ結び合わされたDNA合成鋳型とを包含するtPERTを含む2構成要素系を示すtransプライム編集因子(tPE)の態様については、図3Gを参照。ここでRP-PE:gRNA複合体のRP(動員タンパク質)構成要素は、tPERTを、編集されるべき標的部位へ動員させ、それによってPBSおよびDNA合成鋳型がプライム編集因子にtransで結び付けられる。別の言い方をすれば、tPERTは、PEgRNAの伸長アーム(の全部または一部)を含有するよう改変されており、これは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含する。
本明細書に使用されるとき、「トランジション」は、プリン核酸塩基(A⇔G)の相互変換(interchange)またはピリミジン核酸塩基(C⇔T)の相互変換を指す。このクラスの相互変換は、同様の形状の核酸塩基を伴う。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランジションを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方を誘導することも可能である。これらの変化は、A⇔G、G⇔A、C⇔T、またはT⇔Cを伴う。ワトソン・クリック対の核酸塩基をもつ二本鎖DNAの文脈において、トランスバージョンは、以下の塩基対交換:A:T⇔G:C、G:G⇔A:T、C:G⇔T:A、またはT:A⇔C:Gを指す。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランジションを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方、ならびに欠失および挿入を包含する他のヌクレオチド変化を誘導することも可能である。
本明細書に使用されるとき、「トランスバージョン」は、プリン核酸塩基のピリミジン核酸塩基への相互変換、またはその逆を指し、よって、形状が似ていない核酸塩基の相互変換を伴う。これらの変化は、T⇔A、T⇔G、C⇔G、C⇔A、A⇔T、A⇔C、G⇔C、およびG⇔Tを伴う。Watson-Crick対の核酸塩基をもつ二本鎖DNAの文脈において、トランスバージョンは、以下の塩基対交換:T:A⇔A:T、T:A⇔G:C、C:G⇔G:C、C:G⇔A:T、A:T⇔T:A、A:T⇔C:G、G:C⇔C:G、およびG:C⇔T:Aを指す。本明細書に開示の組成物および方法は、標的DNA分子において1以上のトランスバージョンを誘導することが可能である。本明細書に開示の組成物および方法はまた、同じ標的DNA分子においてトランジションとトランスバージョンとの両方、ならびに欠失および挿入を包含する他のヌクレオチド変化を誘導することも可能である。
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりの疾患もしくは障害、または1以上のその症状の発病を、食い止め、緩和し、遅延させるか、あるいはその進行を阻害することを目的とした臨床的介入を指す。本明細書に使用されるとき、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載のとおりの疾患もしくは障害、または1以上のその症状の発病を、食い止め、緩和し、遅延させるか、あるいはその進行を阻害することを目的とした臨床的介入を指す。いくつかの態様において、処置は、1以上の症状が発症した後、および/または疾患と診断された後、施されてもよい。他の態様において、処置は、症状がない中、例として、症状の発病を予防もしくは遅延させるか、または疾患の発病もしくは進行を阻害するために、施されてもよい。例えば、処置は、症状の発現に先立ち(例として、症状の経歴に照らして、および/または遺伝因子もしくは他の感受性因子に照らして)、感受性のある個体へ施されてもよい。処置はまた、症状が消散した後も、例えば、それらの再発を予防または遅延するため、続けられてもよい。
本明細書に使用されるとき、「トリヌクレオチド反復障害」(または代替的に、「拡大反復障害」もしくは「反復拡大障害」)は、ある種の突然変異(あるトリヌクレオチド反復が、ある遺伝子またはイントロンにある)である「トリヌクレオチド反復拡大」によって引き起こされる、一連の遺伝性障害を指す。トリヌクレオチド反復はかつて、ゲノム中のありふれた反復(iterations)であると考えられていたが、1990年代にこれらの障害に分類された。これらDNAの一見した「良性の」伸展(stretches)はときに、拡大して疾患を引き起こし得る。数種の決定的な特色が、トリヌクレオチド反復拡大によって引き起こされた障害に共通する。第1に、突然変異反復は、体細胞と生殖細胞系列との両方に不安定さを示し、より頻繁にはこれらは代々の遺伝(successive transmissions)で縮小するよりむしろ拡大する。第2に、低年齢の発病およびこれに続く世代における表現型の増大した重症度(予想)は一般に、より大きな反復の長さと相関する。最後に、疾患アレルの親の起源はしばしば、父系の遺伝がこれら障害の多くにとって拡大のより大きなリスクを抱えるという予想に影響を及ぼし得る。
本明細書に使用されるとき、用語「上流」および「下流」は、5'→3'方向に配向された核酸分子(単鎖または二本鎖であるかに関わらず)中に位置付けられた少なくとも2つの要素の線状の位置を定義する相対的な用語である。とりわけ、第1要素が第2要素に対して5'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の上流にある。例えば、SNPがニック部位の5'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の上流にある。逆に言うと、第1要素が第2要素に対して3'のどこかに位置付けられている場合、第1要素は、核酸分子中、第2要素の下流にある。例えば、SNPがニック部位の3'側にある場合、SNPは、Cas9に誘導されたニック部位の下流にある。核酸分子は、DNA(二本鎖もしくは単鎖)、RNA(二本鎖もしくは単鎖)、またはDNAとRNAとのハイブリッドであり得る。二本鎖分子のどちらの鎖を考慮するのか選択する必要がある場合を除き、上流および下流という用語が核酸分子の単鎖にのみ言及するところ、分析は単鎖核酸分子および二本鎖分子について同じであるしばしば、少なくとも2つの要素の相対的な位置を決定するのに使用され得る二本鎖のDNAの鎖は、「センス」鎖または「コード」鎖である。遺伝学において、「センス」鎖は、5'から3'へ伸びる二本鎖DNA内セグメントであって、3'から5'へ伸びるDNAのアンチセンス鎖または鋳型鎖に相補的である。よって、例として、SNP核酸塩基がセンス鎖またはコード鎖上のプロモーターの3'側にある場合、SNP核酸塩基はゲノムDNA(二本鎖である)中のプロモーター配列の「下流」にある。
本明細書に使用されるとき、用語「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する属性(qualities)を呈するものを意味するとして解釈されるはずであり、例として、バリアントCas9は、野生型Cas9アミノ酸配列と比較してアミノ酸残基中に1以上の変化を含むCas9である。用語「バリアント」は、参照配列と少なくとも75%、または少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも99%のパーセント同一性を有し、参照配列と同じかまたは実質的に同じ機能活性(単数もしくは複数)を有する、相同のタンパク質を包括する(encompasses)。用語はまた、参照配列の突然変異体、トランケーション体(truncations)、またはドメインであって、参照配列と同じかまたは実質的に同じ機能活性(単数もしくは複数)を呈示するものも包括する。
用語「ベクター」は、本明細書に使用されるとき、着目する遺伝子をコードするよう修飾され得る核酸であって、宿主細胞中へ入って宿主細胞内で突然変異または複製する(次いでベクターの複製形態を別の宿主細胞中へ移す)ことができる核酸を指す。例示の好適なベクターは、レトロウイルスベクターまたはバクテリオファージおよび繊維状ファージ、および接合性プラスミドなどの、ウイルスベクターを包含する。追加の好適なベクターは、本開示に基づき当業者に明らかであろう。
本明細書に使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される専門用語であって、突然変異体もしくはバリアントの形態とは区別されるような、天然に存在するとおりの生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態を意味する。
本願において用いられる用語「内生5'DNAフラップ」は、標的DNA上のPEによって誘導されるニック部位の直ちに下流に所在するDNAの鎖を言う。PEによる標的DNA鎖のニッキングは、ニック部位の上流側の3'ヒドロキシル基およびニック部位の下流側の5'ヒドロキシル基を暴露する。3'ヒドロキシル基で終わる内生鎖は、プライム編集因子のDNAポリメラーゼをプライムするために用いられる(例えば、DNAポリメラーゼは逆転写酵素である)。ニック部位の下流側のかつ暴露された5'ヒドロキシル基で始まる内生鎖は、「5'内生DNAフラップ」と言われ、究極的には除去され、PEgRNAの伸長によってコードされる新たに合成された置き換え鎖(すなわち、「3'置き換えDNAフラップ」)によって置き換えられる。
本明細書に使用されるとき、用語「5'内生DNAフラップ除去」または「5'フラップ除去」は、RTによって合成された単鎖DNAフラップが競合的に侵入して内生DNAとハイブリダイズしたときに形成される5'内生DNAフラップの除去を指し、そのプロセスにおいて内生鎖に取って代わる。取って代わられたこの内生鎖を除去することは、所望のヌクレオチド変化を含む所望の産物を形成する反応を推進し得る。細胞自身のDNA修復酵素は、5'内生フラップの除去または切除を触媒してもよい(例として、EXO1またはFEN1などの、フラップエンドヌクレアーゼ)。また、宿主細胞も、該5'内生フラップの除去を触媒する1以上の酵素を発現するよう形質転換されていてもよく、これによって産物を形成するプロセスが推進される(例として、フラップエンドヌクレアーゼ)。フラップエンドヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、Patel et al.,“Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,”Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,“Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping,and a unified understanding of the FEN1 superfamily,”Cell,2011,145(2):198-211(これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものから見出され得る。
本明細書に使用されるとき、用語「3'置き換えDNAフラップ」、または単に「置き換えDNAフラップ」は、プライム編集因子によって合成され、プライム編集因子PEgRNAの伸長アームによってコードされるDNAの鎖を指す。より具体的には、3'置き換えDNAフラップは、PEgRNAのポリメラーゼ鋳型によってコードされる。3'置き換えDNAフラップは、編集済配列(例として、単一ヌクレオチドの変化)も含有することを除くと、5'内生DNAフラップと同じ配列を含む。3'置き換えDNAフラップは標的DNAとアニールして、5'内生DNAフラップ(これは、例えば、FEN1もしくはEXO1などの5'フラップエンドヌクレアーゼによって、切除され得る)に取って代わるかまたはこれを置き換え、次いで、3'置き換えDNAフラップの3'末を、内生DNAの晒された(5'内生DNAフラップの切除後に晒される)5'ヒドロキシル末と結び合わせるようにライゲートされ、これによってホスホジエステル結合が再形成されて3'置き換えDNAフラップが組み入れられ、1編集済鎖と1未編集鎖とを含有するヘテロ二重鎖DNAが形成される。DNA修復プロセスはヘテロ二重鎖を分解し、編集済鎖の情報を相補鎖へコピーすることによってDNA中へ編集が永続的に組み入れられる。この分解プロセスは、完了まで(to completion)、未編集鎖へニックを入れることによって、すなわち、本明細書に記載のとおりの「第2鎖へのニック入れ」を経由して、さらに推進され得る。
ゲノム編集のための、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復(CRISPR)系の採用は、生命科学に革命をもたらした1~3。CRISPRを使用する遺伝子の断絶は今やルーチンとなっているが、単一ヌクレオチドの編集の正確な組み入れは、疾患が原因の多数の突然変異を研究または修正するのに必要であるにも関わらず、大きな課題のままである。相同組み換え修復(HDR)は、かかる編集を達成させることは可能ではあるが、低い効率(しばしば<5%)、ドナーDNA修復鋳型のための要件、および二本鎖DNA破壊(DSB)形成の有害効果に悩まされている。近年、David Liu教授らの実験室が塩基編集を開発したが、これによってDSBのない効率的な単一ヌクレオチドの編集が達成される。塩基編集因子(BE)は、CRISPR系を塩基修飾デアミナーゼ酵素と組み合わせて、標的C・GまたはA・T塩基対を夫々A・TまたはG・Cへ変換する4~6。既に幅広く研究者らによって世界的に使用されているが、現BEは12塩基対の起こり得る変換のうちたった4つしかできず、小さい挿入または欠失を修正することはできない。その上、塩基編集の標的範囲は、標的塩基に隣接する非標的CまたはA塩基の編集(「バイスタンダー(bystander)編集」)によって、およびPAM配列が標的塩基から15±2bpに存在するという要件によって限定されている。したがって、これらの欠点を克服することは、ゲノム編集の基礎研究および治療用途を大幅に広げるであろう。
本明細書に記載のプライム編集因子およびトランスプライム編集因子は、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を含み得る。
1つの態様では、本明細書に記載のプライマー編集因子構築物は、S.pyogenesからの「標準的なSpCas9」ヌクレアーゼを含み得る。これはゲノム工学のツールとして広く用いられており、クラス2 CRISPR-Casシステムの酵素のII型サブグループとして類別される。このCas9タンパク質は、2つの別物のヌクレアーゼドメインを含有する大きいマルチドメインタンパク質である。1つのまたは両方のヌクレアーゼ活性を廃止するための点変異がCas9上に導入され得、夫々ニッカーゼCas9(nCas9)または不活性型Cas9(dCas9)をもたらす。これは、sgRNAによってプログラムされる様式でDNAに結合するその能力をなお保持する。原理的には、別のタンパク質またはドメインに融合されるときに、Cas9またはそのバリアント(例えばnCas9)は、単純に適当なsgRNAとの共発現によって、そのタンパク質を実質的にいずれかのDNA配列へと標的化し得る。本願において用いられる標準的なSpCas9タンパク質は、次のアミノ酸配列を有するStreptococcus pyogenesからの野生型タンパク質を言う:
他の態様において、Cas9タンパク質は、S.pyogenesからの標準的なCas9とは異なる別の細菌種からの野生型Cas9オーソログであり得る。例えば、次のCas9オーソログが本明細書に記載されるプライム編集因子構築物に関して用いられ得る。加えて、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%配列同一性を下のオーソログのいずれかに対して有するいずれかのバリアントCas9オーソログもまた本プライム編集因子に用いられ得る。
ある態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は、不活性型Cas9、例えば不活性型SpCas9を包含し得る。これは、Cas9の両方のヌクレアーゼドメイン、つまりRuvCドメイン(これは、非プロトスペーサーDNA鎖を切断する)およびHNHドメイン(これはプロトスペーサーDNA鎖を切断する)を不活性化する1つ以上の変異を原因として、ヌクレアーゼ活性を有さない。ヌクレアーゼ不活性化は、コードされるタンパク質、または少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも99%配列同一性をそれに対して有するそのいずれかのバリアントのアミノ酸配列に1つ以上の置換および/または欠失をもたらす1つ以上の変異を原因とし得る。
1つの態様において、本明細書に記載のプライム編集因子はCas9ニッカーゼを含む。用語「Cas9ニッカーゼ」または「nCas9」は、二本鎖DNA分子標的上に一本鎖切断を導入することができるCas9のバリアントを言う。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼは単一の機能するヌクレアーゼドメインのみを含む。野生型Cas9(例えば標準的なSpCas9)は、2つの別個のヌクレアーゼドメイン、つまりRuvCドメイン(これは非プロトスペーサーDNA鎖を切断する)およびHNHドメイン(これはプロトスペーサーDNA鎖を切断する)を含む。1つの態様では、Cas9ニッカーゼはRuvCヌクレアーゼ活性を不活性化するRuvCドメインの変異を含む。例えば、アスパラギン酸(D)10、ヒスチジン(H)983、アスパラギン酸(D)986、またはグルタミン酸(E)762の変異は、RuvCヌクレアーゼドメインの機能喪失変異および機能的なCas9ニッカーゼの生出として報告されている(例えば、Nishimasu et al., “Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA,”Cell 156(5),935-949。これは参照によって本願に組み込まれる)。それゆえに、RuvCドメインのニッカーゼ変異はD10X、H983X、D986X、またはE762Xを包含し得、Xは野生型アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。ある態様において、ニッカーゼはD10A、もしくは(of)H983A、もしくはD986A、もしくはE762A、またはそれらの組み合わせであり得る。
不活性型Cas9およびCas9ニッカーゼバリアントの他に、本願において用いられるCas9タンパク質は、本明細書に開示のかまたは当該技術分野において公知のいずれかの野生型Cas9または変異体Cas9(例えば、不活性型Cas9またはCas9ニッカーゼ)、またはフラグメントCas9、または循環置換体Cas9、またはCas9の他のバリアントを包含するいずれかの参照Cas9タンパク質と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である他の「Cas9バリアント」をもまた包含し得る。いくつかの態様では、Cas9バリアントは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くのアミノ酸変化を、参照Cas9と比較して有し得る。いくつかの態様では、Cas9バリアントは参照Cas9のフラグメント(例えば、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン)を含み、その結果、フラグメントは、野生型Cas9の対応するフラグメントと少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である。いくつかの態様では、フラグメントは(is is)、対応する野生型Cas9(例えば配列番号18)のアミノ酸長さの少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%である。
いくつかの態様では、本願において企図されるプライム編集因子は、標準的なSpCas9配列よりも小さい分子量であるCas9タンパク質を包含する。いくつかの態様では、より小さいサイズのCas9バリアントは、例えば発現ベクター、ナノ粒子、または送達の他の手段による細胞への送達を容易化し得る。ある態様において、より小さいサイズのCas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのII型酵素として類別される酵素を包含し得る。いくつかの態様では、より小さいサイズのCas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのV型酵素として類別される酵素を包含し得る。他の態様において、より小さいサイズのCas9バリアントは、クラス2 CRISPR-CasシステムのVI型酵素として類別される酵素を包含し得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載のプライム編集因子はいずれかのCas9等価物を包含し得る。本願において用いられる用語「Cas9等価物」は、幅広い用語であり、これは、そのアミノ酸一次配列および/またはその三次元構造が異なり得るおよび/または進化的立場からは無関係であり得るにもかかわらず、本プライム編集因子においてCas9と同じ機能を供するいずれかのnapDNAbpタンパク質を包摂する。それゆえに、Cas9等価物は進化的に関係する本願に記載または包摂されるいずれかのCas9オーソログ、ホモログ、変異体、またはバリアントを包含するが、Cas9等価物は、Cas9と同じかまたは類似の機能を有するように収斂進化プロセスによって進化してあり得るが、アミノ酸配列および/または三次元構造についていずれかの類似性を必ずしも有さないタンパク質をもまた包摂する。Cas9等価物が収斂進化によって発生したタンパク質に基づき得るにもかかわらず、ここで記載されるプライム編集因子は、Cas9と同じかまたは類似の機能を提供するであろういずれかのCas9等価物を包摂する。例えば、Cas9がCRISPR-CasシステムのII型酵素を言う場合には、Cas9等価物はCRISPR-CasシステムのV型またはVI型酵素を言い得る。
種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子はCas9の循環置換体を含み得る。
N末端-[1268~1368]-[任意のリンカー]-[1~1267]-C末端;
N末端-[1168~1368]-[任意のリンカー]-[1~1167]-C末端;
N末端-[1068~1368]-[任意のリンカー]-[1~1067]-C末端;
N末端-[968~1368]-[任意のリンカー]-[1~967]-C末端;
N末端-[868~1368]-[任意のリンカー]-[1~867]-C末端;
N末端-[768~1368]-[任意のリンカー]-[1~767]-C末端;
N末端-[668~1368]-[任意のリンカー]-[1~667]-C末端;
N末端-[568~1368]-[任意のリンカー]-[1~567]-C末端;
N末端-[468~1368]-[任意のリンカー]-[1~467]-C末端;
N末端-[368~1368]-[任意のリンカー]-[1~367]-C末端;
N末端-[268~1368]-[任意のリンカー]-[1~267]-C末端;
N末端-[168~1368]-[任意のリンカー]-[1~167]-C末端;
N末端-[68~1368]-[任意のリンカー]-[1~67]-C末端;もしくは
N末端-[10~1368]-[任意のリンカー]-[1~9]-C末端、または
他のCas9タンパク質(他のCas9オーソログ、バリアントなどを包含する)の対応する循環置換体。
N末端-[102~1368]-[任意のリンカー]-[1~101]-C末端;
N末端-[1028~1368]-[任意のリンカー]-[1~1027]-C末端;
N末端-[1041~1368]-[任意のリンカー]-[1~1043]-C末端;
N末端-[1249~1368]-[任意のリンカー]-[1~1248]-C末端;もしくは
N末端-[1300~1368]-[任意のリンカー]-[1~1299]-C末端、または
他のCas9タンパク質(他のCas9オーソログ、バリアントなどを包含する)の対応する循環置換体。
N末端-[103~1368]-[任意のリンカー]-[1~102]-C末端;
N末端-[1029~1368]-[任意のリンカー]-[1~1028]-C末端;
N末端-[1042~1368]-[任意のリンカー]-[1~1041]-C末端;
N末端-[1250~1368]-[任意のリンカー]-[1~1249]-C末端;もしくは
N末端-[1301~1368]-[任意のリンカー]-[1~1300]-C末端、または
他のCas9タンパク質(他のCas9オーソログ、バリアントなどを包含する)の対応する循環置換体。
本開示のプライム編集因子は、改変されたPAM特異性を有するCas9バリアントをもまた含み得る。本開示のいくつかの側面は、標準的なPAM(5'-NGG-3'。ここで、NはA、C、G、またはTである)をその3'端に含まない標的配列に対して活性を発揮するCas9タンパク質を提供する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGG-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNG-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NNT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NGC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAA-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAC-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。いくつかの態様では、Cas9タンパク質は、5'-NAT-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。なお他の態様において、Cas9タンパク質は、5'-NAG-3'PAM配列をその3'端に含む標的配列に対して活性を発揮する。
種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は2つ以上のフラグメントとして細胞に送達され得、これらは、細胞内において、再構成されたプライム編集因子へとアセンブリされるようになる(受動的アセンブリによるか、または分裂インテイン配列を用いることなどの能動的アセンブリによる)。いくつかのケースでは、自己アセンブリは受動的であり得、これによって、2つ以上のプライム編集因子フラグメントは細胞内で共有結合的にまたは非共有結合的に会合してプライム編集因子を再構成する。他のケースでは、自己アセンブリはフラグメントの夫々に組み入れされた二量体化ドメインによって触媒され得る。二量体化ドメインの例は本明細書に記載の。なお他のケースでは、自己アセンブリは、プライム編集因子フラグメントの夫々に組み入れされた分裂インテイン配列によって触媒され得る。
本明細書に記載の種々の態様において、プライム編集因子はCas9タンパク質などのnapDNAbpを含む。これらのタンパク質は、それらがガイドRNA(または場合に応じてPEgRNA)と複合体化するようになることによって「プログラム可能」である。これは、gRNA(またはPEgRNA)のスペーサー部分に対して相補的である配列を所有し、かつ要求されるPAM配列をもまた所有するDNA上の標的部位へとCas9タンパク質をガイドする。しかしながら、ここで想定されるある態様において、napDNAbpは、異なる型のプログラム可能なタンパク質、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)によって置換され得る。
種々の態様において、本明細書に開示のプライム編集因子(PE)システムはポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)またはそのバリアントを包含し、これは、napDNAbpもしくは他のプログラム可能なヌクレアーゼとの融合タンパク質として提供またはトランスで提供され得る。
種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子はポリメラーゼを含む。本開示は、いずれかの天然に存在する生物もしくはウイルスから得られるか、または市販のもしくは非市販のソースから得られるいずれかの野生型ポリメラーゼを企図する。加えて、本開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、いずれかの天然に存在する変異体ポリメラーゼ、操作された変異体ポリメラーゼ、または他のバリアントポリメラーゼを包含し得、機能を保持する短縮されたバリアントを包含する。本願において使用可能なポリメラーゼは、特定のアミノ酸置換、例えば具体的に本明細書に開示のものを含有するようにもまた操作され得る。ある種の好ましい態様では、本開示のプライム編集因子に使用可能なポリメラーゼは、鋳型に基づくポリメラーゼである。すなわち、それらは鋳型依存的な様式でヌクレオチド配列を合成する。
種々の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子はポリメラーゼとして逆転写酵素を含む。本開示は、いずれかの天然に存在する生物もしくはウイルスから得られるかまたは市販のもしくは非市販のソースから得られるいずれかの野生型逆転写酵素を企図する。加えて、本開示のプライム編集因子に使用可能な逆転写酵素は、いずれかの天然に存在する変異体RT、操作された変異体RT、または他のバリアントRTを包含し得、機能を保持する短縮されたバリアントを包含する。RTは、特定のアミノ酸置換、例えば具体的に本明細書に開示のものを含有するようにもまた操作され得る。
本明細書に開示のプライム編集因子による使用のための例示の酵素は、M-MLV逆転写酵素およびRSV逆転写酵素を包含し得るが、これらに限定されない。逆転写酵素活性を有する酵素は市販で利用可能である。ある態様において、逆転写酵素は、プライム編集因子(PE)システムの他の構成要素に対してトランスで提供される。つまり、逆転写酵素は、個々の構成要素として、すなわちnapDNAbpとの融合タンパク質としてではなく、発現または別様に提供される。
逆転写酵素は、相補的なDNA(cDNA)鎖をRNA鋳型から合成することにとって必須である。逆転写酵素は、異なる生化学的活性を発揮する別物のドメインから成る酵素である。酵素は次のとおりRNA鋳型からのDNAの合成を触媒する:アニーリングしたプライマーの存在下において、逆転写酵素はRNA鋳型に結合し、重合反応を開始する。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性が相補的なDNA(cDNA)鎖を合成し、dNTPを組み込む。RNase H活性がDNA:RNA複合体のRNA鋳型を分解する。それゆえに、逆転写酵素は、(a)RNA/DNAハイブリッドを認識および結合する結合活性、(b)RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、および(c)RNase H活性を含む。加えて、逆転写酵素は、一般的に、それらの熱安定性、処理能力(dNTP組み込みの速度)、および忠実性(またはエラー率)を包含する種々の属性を有すると見なされる。本願において企図される逆転写酵素バリアントは、これらの酵素活性(例えば、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNase H活性、またはDNA/RNAハイブリッド結合活性)または酵素特性(例えば、熱安定性、処理能力、または忠実性)のいずれか1つ以上にインパクトを及ぼすかまたは変化させる、逆転写酵素のいずれかの変異を包含し得る。かかるバリアントは、当該技術分野においてパブリックドメインにおいて利用可能、市販で利用可能であり得るか、または指向性進化プロセス(例えば、PACEまたはPANCE)を包含する変異導入の公知の方法を用いて作られ得る。
本明細書に記載のプライム編集因子(PE)システムは、任意にリンカーによって連結されるnapDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)を含む融合タンパク質を企図する。本願は、いずれかの好適なnapDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)が単一の融合タンパク質として組み合わせられることを企図する。napDNAbpおよびポリメラーゼ(例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素)の例は、夫々が本願において定められる。ポリメラーゼは当該技術分野において周知であり、アミノ酸配列は難なく利用可能であるので、本開示は本願において同定される特定のポリメラーゼに限定されることを決して意味されない。
PE融合タンパク質は、napDNAbp(例えば、Cas9ドメイン)およびポリメラーゼドメイン(例えば、RTドメイン)以外に種々の他のドメインを含み得る。例えば、napDNAbpがCas9でありかつポリメラーゼがRTであるケースでは、PE融合タンパク質は、Cas9ドメインをRTドメインと連結する1つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、他の機能ドメイン、例えば核局在配列(NLS)またはFEN1(または他のフラップエンドヌクレアーゼ)をもまたPE融合タンパク質またはそのドメインに連結し得る。
上で定められているとおり、本願において用いられる用語「リンカー」は、2つの分子または部分、例えばヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメインを連結する化学基または分子を言う。いくつかの態様では、リンカーはRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼのgRNA結合ドメインおよびポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)の触媒ドメインを連結する。いくつかの態様では、リンカーはdCas9および逆転写酵素を連結する。典型的には、リンカーは2つの基、分子、または他の部分の間に位置取るかまたはそれらによってフランキングされ、共有結合を介して夫々の1つに接続され、それゆえに2つを接続する。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸(例えば、ペプチドまたはタンパク質)である。いくつかの態様では、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様では、リンカーは長さが5-100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、または150-200アミノ酸である。より長いかまたはより短いリンカーもまた企図される。
GGS(配列番号767);
GGSGGS(配列番号768);
GGSGGSGGS(配列番号769);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS(配列番号127);
SGSETPGTSESATPES(配列番号171);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGGS(配列番号175)。
種々の態様において、PE融合タンパク質は1つ以上の核局在配列(NLS)を含み得、これらは細胞核内へのタンパク質の移行を促進することを助ける。かかる配列は当該技術分野で周知であり、次の例を包含し得る:
種々の態様において、PE融合タンパク質は1つ以上のフラップエンドヌクレアーゼ(例えばFEN1)を含み得、これは5'一本鎖DNAフラップの除去を触媒する酵素を言う。これらは天然に存在する酵素であり、これらはDNA複製を包含する細胞性のプロセスの間に形成される5'フラップの除去をプロセシングする。本明細書に記載のプライム編集法は、プライム編集の間に標的部位において形成される内生(endogenouse)DNAの5'フラップを除去するために、内生で供給されるフラップエンドヌクレアーゼまたはトランスで提供されるものを利用し得る。フラップエンドヌクレアーゼは当該技術分野において知られており、Patel et al.,“Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends,”Nucleic Acids Research,2012,40(10):4507-4519およびTsutakawa et al.,“Human flap endonuclease structures,DNA double-base flipping,and a unified understanding of the FEN1 superfamily,”Cell,2011,145(2):198-211(これら各々は参照により本明細書に組み込まれる)の記載から見出され得る。例示のフラップエンドヌクレアーゼは、以下のアミノ酸配列によって表され得るFEN1である:
Trex2
MSEAPRAETFVFLDLEATGLPSVEPEIAELSLFAVHRSSLENPEHDESGALVLPRVLDKLTLCMCPERPFTAKASEITGLSSEGLARCRKAGFDGAVVRTLQAFLSRQAGPICLVAHNGFDYDFPLLCAELRRLGARLPRDTVCLDTLPALRGLDRAHSHGTRARGRQGYSLGSLFHRYFRAEPSAAHSAEGDVHTLLLIFLHRAAELLAWADEQARGWAHIEPMYLPPDDPSLEA(配列番号3865)。
ヒトエキソヌクレアーゼ1(EXO1)は、DNAミスマッチ修復(MMR)、マイクロ媒介末端結合(micro-mediated end-joining、相同組換え(HR)、および複製を包含する、多くの種々のDNA代謝プロセスに関係する。ヒトEXO1は、真核生物ヌクレアーゼRad2/XPGのファミリーに属し、これはまたFEN1およびGEN1も包含する。Rad2/XPGファミリーは、ファージからヒトまでの種を通してヌクレアーゼドメインが保存されている。EXO1遺伝子産物は、5'エキソヌクレアーゼと5'フラップ活性との両方を呈する。加えて、EXO1は、固有の5'RNase H活性も含有する。ヒトEXO1は、二本鎖DNA(dsDNA)、ニック、ギャップ、シュードY構造のプロセシングに対し高親和性を有し、遺伝で受け継いだそのフラップ活性を使用してホリデイ接点を分解し得る。ヒトEXO1はMMRに関係し、MLH1およびMSH2と直接相互作用する保存された結合ドメインを含有する。EXO1核酸分解活性は、PCNA、MutSα(MSH2/MSH6複合体)、14-3-3、MRN、および9-1-1複合体によって正に刺激される。
MGIQGLLQFIKEASEPIHVRKYKGQVVAVDTYCWLHKGAIACAEKLAKGEPTDRYVGFCMKFVNMLLSHGIKPILVFDGCTLPSKKEVERSRRERRQANLLKGKQLLREGKVSEARECFTRSINITHAMAHKVIKAARSQGVDCLVAPYEADAQLAYLNKAGIVQAIITEDSDLLAFGCKKVILKMDQFGNGLEIDQARLGMCRQLGDVFTEEKFRYMCILSGCDYLSSLRGIGLAKACKVLRLANNPDIVKVIKKIGHYLKMNITVPEDYINGFIRANNTFLYQLVFDPIKRKLIPLNAYEDDVDPETLSYAGQYVDDSIALQIALGNKDINTFEQIDDYNPDTAMPAHSRSHSWDDKTCQKSANVSSIWHRNYSPRPESGTVSDAPQLKENPSTVGVERVISTKGLNLPRKSSIVKRPRSAELSEDDLLSQYSLSFTKKTKKNSSEGNKSLSFSEVFVPDLVNGPTNKKSVSTPPRTRNKFATFLQRKNEESGAVVVPGTRSRFFCSSDSTDCVSNKVSIQPLDETAVTDKENNLHESEYGDQEGKRLVDTDVARNSSDDIPNNHIPGDHIPDKATVFTDEESYSFESSKFTRTISPPTLGTLRSCFSWSGGLGDFSRTPSPSPSTALQQFRRKSDSPTSLPENNMSDVSQLKSEESSDDESHPLREEACSSQSQESGEFSLQSSNASKLSQCSSKDSDSEESDCNIKLLDSQSDQTSKLRLSHFSKKDTPLRNKVPGLYKSSSADSLSTTKIKPLGPARASGLSKKPASIQKRKHHNAENKPGLQIKLNELWKNFGFKKF(配列番号3868)。
いくつかの態様では(例えば、AAV粒子を用いるインビボのプライム編集因子の送達)、ポリペプチド(例えば、デアミナーゼまたはnapDNAbp)または融合タンパク質(例えばプライム編集因子)をN末端の半分およびC末端の半分へと分裂し、それらを別個に送達し、それからそれらの共局在が完全なタンパク質(または場合に応じて融合タンパク質)を細胞内で再形成することを許すことが有利であり得るということは理解されるであろう。タンパク質または融合タンパク質の別個の半分同士は、夫々が、タンパク質トランススプライシングの機序による完全なタンパク質または融合タンパク質の再形成を容易化するための分裂インテインタグを含み得る。
種々の態様において、2つの別個のタンパク質ドメイン(例えば、Cas9ドメインおよびポリメラーゼドメイン)は、「RNA-タンパク質動員システム」、例えば「MS2タグ付け技術」を用いることによって、機能的な複合体(2つの別個のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の機能と同様)を形成するように互いに共局在させられ得る。かかるシステムは、一般的には、1つのタンパク質ドメインを「RNA-タンパク質相互作用ドメイン」(「RNA-タンパク質動員ドメイン」としてもまた公知)によって、他をRNA-タンパク質相互作用ドメイン、例えば特定のヘアピン構造を特異的に認識および結合する「RNA結合タンパク質」によってタグ付けする。これらの型のシステムは、プライム編集因子のドメイン同士を共局在させるためにおよびUGIドメインなどの追加の機能性をプライム編集因子に動員するために活用され得る。1つの例では、MS2タグ付け技術は、ファージのゲノム上に存在するステムループまたはヘアピン構造、すなわち「MS2ヘアピン」とのMS2バクテリオファージコートタンパク質(「MCP」または「MS2cp」)の天然の相互作用に基づく。MS2ヘアピンのケースでは、それはMS2バクテリオファージコートタンパク質(MCP)によって認識および結合される。それゆえに、1つの例示的シナリオでは、デアミナーゼ-MS2融合体はCas9-MCP融合体を動員し得る。
GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(配列番号3872)である。
他の態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は1つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害剤ドメインを含み得る。本願において用いられる用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)」または「UGIドメイン」は、ウラシルDNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を言う。いくつかの態様では、UGIドメインは、野生型UGIまたは配列番号3873で明示されるUGIを含む。いくつかの態様では、本願において提供されるUGIタンパク質は、UGIのフラグメント、およびUGIまたはUGIフラグメントに対して相同的なタンパク質を包含する。例えば、いくつかの態様では、UGIドメインは、配列番号3873で明示されるアミノ酸配列のフラグメントを含む。いくつかの態様では、UGIフラグメントは、配列番号3873で明示されるアミノ酸配列の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、UGIは、配列番号3873で明示されるアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列、または配列番号3873で明示されるアミノ酸配列のフラグメントに対して相同的なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、UGIもしくはUGIのフラグメントまたはUGIもしくはUGIフラグメントのホモログを含むタンパク質は、「UGIバリアント」と言われる。UGIバリアントはUGIまたはそのフラグメントに対する相同性を共有する。例えば、UGIバリアントは、野生型UGIまたは配列番号3873で明示されるUGIと少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または少なくとも99.9%同一である。いくつかの態様では、UGIバリアントは、フラグメントが野生型UGIまたは配列番号3873で明示されるUGIの対応するフラグメントと少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または少なくとも99.9%であるようにして、UGIのフラグメントを含む。いくつかの態様では、UGIは次のアミノ酸配列を含む:
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(配列番号3873)。
ある態様において、本明細書に記載のプライム編集因子は塩基修復の阻害剤を含み得る。用語「塩基修復の阻害剤」または「IBR」は、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することができるタンパク質を言う。いくつかの態様では、IBRはOGG塩基除去修復の阻害剤である。いくつかの態様では、IBRは塩基除去修復の阻害剤(「iBER」)である。塩基除去修復の例示の阻害剤は、APE1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hOGG1、hNEIL1、T7 EndoI、T4PDG、UDG、hSMUG1、およびhAAGの阻害剤を包含する。いくつかの態様では、IBRはEndo VまたはhAAGの阻害剤である。いくつかの態様では、IBRは、触媒的に不活性なグリコシラーゼまたは触媒的に不活性なジオキシゲナーゼ、またはオキシダーゼの低分子もしくはペプチド阻害剤、あるいはそれらのバリアントであり得るiBERである。いくつかの態様では、IBRは、TDG阻害剤、MBD4阻害剤、またはAlkBH酵素の阻害剤であり得るiBERである。いくつかの態様では、IBRは、触媒的に不活性なTDGまたは触媒的に不活性なMBD4を含むiBERである。例示の触媒的に不活性なTDGは配列番号3872(ヒトTDG)のN140A変異体である。
本明細書に記載のプライム編集システムはいずれかの好適なPEgRNAの使用を企図する。本発明者は、所望のヌクレオチド変化をコードする逆転写(RT)鋳型配列を含む特殊に構成されたガイドRNAの使用によって、プライム標的にプライムされた逆転写(TPRT)の機序が、精密かつ汎用的なCRISPR/Casに基づくゲノム編集を行うことに活用または適合され得るということを発見した。RT鋳型配列は標準のまたは従来のガイドRNA分子の伸長として提供され得るので、本願はこの特殊に構成されたガイドRNAを「伸長されたガイドRNA」または「PEgRNA」と言う。本願は伸長されたガイドRNAについていずれかの好適な構成または配置を企図する。
図3Aは、本明細書に開示のプライム編集因子系に使用可能な伸長されたガイドRNAの一態様を示すが、既存のガイドRNA(緑色部分)は、~20ntプロトスペーサー配列とgRNAコア領域とを包含し、napDNAbpとともに結合する。この態様において、ガイドRNAは、5'末にて伸長されたRNAセグメント、すなわち、5'伸長を包含する。この態様において、5'伸長は、逆転写鋳型配列、逆転写プライマー結合部位、および任意の5~20ヌクレオチドリンカー配列を包含する。図1A~1Bに示されるとおり、RTプライマー結合部位の、ニックの後に形成される遊離3'末とのハイブリッドは、Rループの非標的鎖に形成され、これによって5'-3'方向におけるDNA重合のために逆転写酵素がプライムされる。
他の態様において、所望のヌクレオチド変化は、ニック部位から約+1から+2、またはニック部位から約+1~+3、+1~+4、+1~+5、+1~+6、+1~+7、+1~+8、+1~+9、+1~+10、+1~+11、+1~+12、+1~+13、+1~+14、+1~+15、+1~+16、+1~+17、+1~+18、+1~+19、+1~+20、+1~+21、+1~+22、+1~+23、+1~+24、+1~+25、+1~+26、+1~+27、+1~+28、+1~+29、+1~+30、+1~+31、+1~+32、+1~+33、+1~+34、+1~+35、+1~+36、+1~+37、+1~+38、+1~+39、+1~+40、+1~+41、+1~+42、+1~+43、+1~+44、+1~+45、+1~+46、+1~+47、+1~+48、+1~+49、+1~+50、+1~+51、+1~+52、+1~+53、+1~+54、+1~+55、+1~+56、+1~+57、+1~+58、+1~+59、+1~+60、+1~+61、+1~+62、+1~+63、+1~+64、+1~+65、+1~+66、+1~+67、+1~+68、+1~+69、+1~+70、+1~+71、+1~+72、+1~+73、+1~+74、+1~+75、+1~+76、+1~+77、+1~+78、+1~+79、+1~+80、+1~+81、+1~+82、+1~+83、+1~+84、+1~+85、+1~+86、+1~+87、+1~+88、+1~+89、+1~+90、+1~+90、+1~+91、+1~+92、+1~+93、+1~+94、+1~+95、+1~+96、+1~+97、+1~+98、+1~+99、+1~+100、+1~+101、+1~+102、+1~+103、+1~+104、+1~+105、+1~+106、+1~+107、+1~+108、+1~+109、+1~+110、+1~+111、+1~+112、+1~+113、+1~+114、+1~+115、+1~+116、+1~+117、+1~+118、+1~+119、+1~+120、+1~+121、+1~+122、+1~+123、+1~+124、もしくは+1~+125の間である編集窓上に組み入れされる。
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号223)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号224)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号225)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号226)
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号227).
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号228)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号229)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号230)
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号231)
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号232)
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号233)
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号234)
本開示はトランスプライム編集をもまた企図する。これは、PEgRNAを2つの別物の分子:ガイドRNAおよびtPERT分子へと分離することによって作動するプライム編集の改変されたバージョンを言う。tPERT分子は、標的DNA部位においてプライム編集因子複合体と共局在するようにプログラムされ、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型をプライム編集因子にトランスで持って来る。例えば、トランスプライム編集因子(tPE)の態様については図3Gを見よ。これは、(1)動員タンパク質(RP)-PE:gRNA複合体と(2)RNA-タンパク質動員ドメイン(例えば、ステムループまたはヘアピン)に連結されたプライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含するtPERTとを含む2構成要素システムを示す。RP-PE:gRNA複合体の動員タンパク質構成要素は編集されるべき標的部位へとtPERTを動員し、それによって、PBSおよびDNA合成鋳型をプライム編集因子とトランスで会合させる。別の言い方をすると、tPERTは、プライマー結合部位およびDNA合成鋳型を包含するPEgRNAの伸長アーム(の全てまたは一部)を含有するように操作される。このアプローチの1つの利点はPEgRNAの伸長アームをガイドRNAから分離することであり、それによって、伸長アームのPBSとガイドRNAのスペーサー配列との間に生起する傾向があるアニーリング相互作用を最小化する。
本開示はPEgRNAをデザインするための方法にもまた関する。
(a)1つ以上の核酸塩基改変がプライム編集因子によって組み入れされることを望まれる標的配列、すなわちヌクレオチド配列;
(b)標的配列上のカットされる部位の位置付け、すなわち、プライム編集因子が一本鎖ニックを誘導して、ニックの1つの側に3'端RTプライマー配列およびニックの他の側に5'端の内生フラップ(これは究極的にはFEN1またはその等価物によって除去され、3'ssDNAフラップによって置き換えられる)を生出するであろう特定の核酸塩基位置。カットされる部位は「編集の位置付け」に類縁である。なぜなら、これは3'端RTプライマー配列を生出し、これはRNA依存的なDNA重合の間にRTによって伸長されるようになって、所望の編集を含有する3'ssDNAフラップを生出し、これがそれから標的配列上の5'内生DNAフラップを置き換えるからである;
(c)利用可能なPAM配列(標準的なSpCas9 PAM部位、および拡張されたまたは異なるPAM特異性を有するCas9バリアントおよび等価物によって認識される非標準的なPAM部位を包含する);
(d)標的配列上の利用可能なPAM配列とカットされる部位の位置付けとの間の間隔;
(e)用いられようとするプライム編集因子の具体的なCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物;
(f)プライマー結合部位の配列および長さ;
(g)編集鋳型の配列および長さ;
(h)相同アームの配列および長さ;
(i)スペーサー配列および長さ;ならびに
(j)コア配列、
を包含するが、これらに限定されない。
1.標的配列および編集を定める。所望の編集(点変異、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)の位置付けを中心とした標的DNA領域(~200bp)の配列をリトリーブする。図70Aを見よ。
2.標的PAMを位置付ける。所望の編集位置付けに対して近位のPAMを同定する。PAMは所望の編集位置付けに対して近位のDNAのどちらかの鎖上に同定され得る。編集位置に近接するPAMが好ましいが(すなわち、ニック部位は編集位置から30nt未満である。または編集位置からニック部位まで29nt、28nt、27nt、26nt、25nt、24nt、23nt、22nt、21nt、20nt、19nt、18nt、17nt、16nt、15nt、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、もしくは2nt未満)、編集位置から≧30ntのニックを置くプロトスペーサーおよびPAMを用いて編集を組み入れることが可能である。図70Bを見よ。
3.ニック部位を位置付ける。考慮されている各PAMについて、対応するニック部位とどの鎖上かとを同定する。Sp Cas9 H840Aニッカーゼでは、切断はNGG PAMの5'の第3および第4の塩基の間においてPAM含有鎖に生起する。全ての編集されるヌクレオチドはニック部位の3'に存在しなければならない。そのため、適当なPAMはPAM含有鎖上の標的の編集の5'にニックを置かなければならない。下で示される例では、2つの可能なPAMがある。単純のために、残りのステップはPAM 1のみを用いるPEgRNAのデザインを実証する。図70Cを見よ。
4.スペーサー配列をデザインする。Sp Cas9のプロトスペーサーはPAM含有鎖上のNGG PAMの5'の20ヌクレオチドに対応する。効率的なPol III転写開始はGが最初に転写されるヌクレオチドであることを要求する。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGである場合には、PEgRNAのスペーサー配列は単純にプロトスペーサー配列である。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGではない場合には、PEgRNAのスペーサー配列は、G、次にプロトスペーサー配列である。図70Dを見よ。
5.プライマー結合部位(PBS)をデザインする。出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のDNAプライマーを同定する。DNAプライマーの3'端はニック部位のちょうど上流のヌクレオチドである(すなわち、Sp Cas9ではNGG PAMの5'の第4の塩基)。PE2およびPE3への使用のための一般的なデザイン原理として、DNAプライマーに対する12から13ヌクレオチドの相補性を含有するPEgRNAプライマー結合部位(PBS)が、~40-60%GC含量を含有する配列に用いられ得る。低いGC含量を有する配列では、より長い(14から15nt)PBSが試験されるべきである。より高いGC含量を有する配列では、より短い(8から11nt)PBSが試験されるべきである。GC含量にかかわらず、最適なPBS配列は経験的に決定されるはずである。長さpのPBS配列をデザインするためには、出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のニック部位の5'の最初のpヌクレオチドの逆相補体を取る。図70Eを見よ。
6.RT鋳型(またはDNA合成鋳型)をデザインする。RT鋳型(または、ポリメラーゼが逆転写酵素ではないところでは、DNA合成鋳型)は、デザインされた編集と編集に隣接する配列に対する相同性とをコードする。1つの態様では、これらの領域は図3Dおよび図3EのDNA合成鋳型に対応し、DNA合成鋳型は「編集鋳型」および「相同アーム」を含む。最適なRT鋳型長さは標的部位に基づいて変わる。ショートレンジ編集(位置+1から+6)では、短い(9から12nt)、中程度の(13から16nt)、および長い(17から20nt)RT鋳型を試験することが推奨される。ロングレンジ編集(位置+7以降)では、十分な3'DNAフラップ相同性を許すように、編集の位置から少なくとも5nt(好ましくは10nt以上)伸長するRT鋳型を用いることが推奨される。ロングレンジ編集では、機能的なデザインを同定するために、いくつかのRT鋳型がスクリーニングされるべきである。より大きい挿入および欠失(≧5nt)では、RT鋳型上へのより多大な3'相同性(~20nt以上)の組み込みが推奨される。RT鋳型が、逆転写されるDNA産物上の最後のヌクレオチドとしてのG(PEgRNAのRT鋳型上のCに対応する)の合成をコードするときには、編集効率は典型的には損なわれる。多くのRT鋳型が効率的なプライム編集を支持するので、RT鋳型をデザインするときには、最後の合成されるヌクレオチドとしてのGの回避が推奨される。長さrのRT鋳型配列をデザインするためには、所望のアレル配列を用い、PAMを元々含有した鎖上のニック部位の3'の最初のrヌクレオチドの逆相補体を取る。SNP編集と比較して、同じ長さのRT鋳型を用いる挿入または欠失編集は同一の相同性を含有しないであろうということに注意せよ。図70Fを見よ。
7.完全なPEgRNA配列をアセンブリする。PEgRNA構成要素を次の順序(5'から3')でコンカテネーションする:スペーサー、骨格、RT鋳型、およびPBS。図70Gを見よ。
8.PE3のためのニッキングsgRNAをデザインする。編集の上流および下流の非編集鎖上のPAMを同定する。最適なニッキング位置は高度に座位依存的であり、経験的に決定されるはずである。一般的に、PEgRNAによって誘導されるニックの向かいの位置の40から90ヌクレオチド5'に置かれたニックは、より高い編集収量およびより少数のインデルに至る。ニッキングsgRNAは、出発アレル上の20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有する。プロトスペーサーがGで始まらない場合には5'Gの追加を有する。図70Hを見よ。
9.PE3bニッキングsgRNAをデザインする。PAMが相補鎖に存在し、その対応するプロトスペーサーが編集のために標的化される配列とオーバーラップする場合には、この編集はPE3bシステムの候補であり得る。PE3bシステムでは、ニッキングsgRNAのスペーサー配列は出発アレルではなく所望の編集されたアレルの配列にマッチする。編集されるヌクレオチド(単数または複数)がニッキングsgRNAプロトスペーサーのシード領域(PAMに隣接する~10nt)内に収まるときには、PE3bシステムは効率的に作動する。これは、編集された鎖の組み入れ後まで相補鎖のニッキングを防止し、標的DNAに結合することについてのPEgRNAおよびsgRNAの間の競合を防止する。PE3bは、両方の鎖上の同時のニックの生成をもまた回避し、それゆえに、高い編集効率を維持しながらインデル形成を有意に縮減する。PE3b sgRNAは、所望のアレルの20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有するはずである。必要とされる場合には5'Gの追加を有する。図70Iを見よ。
標的化された挿入、欠失、および全ての12の可能な塩基から塩基の変換をヒト細胞の標的座位において二本鎖DNA切断またはドナーDNA鋳型を要求することなしに媒介する新たな「検索置換」ゲノム編集テクノロジーとしての本明細書に記載のプライム編集システムの開発に加えて、本発明者は、特定の適用の広いアレイへのプライム編集因子の使用をもまた企図した。例えば、本願において例示され論じられるとおり、プライム編集は、(a)変異を修正する変化をヌクレオチド配列に組み入れ、(b)タンパク質およびRNAタグを組み入れ、(c)免疫エピトープを目当てのタンパク質に組み入れ、(d)誘導可能な二量体化ドメインをタンパク質に組み入れ、(e)バイオ分子のその活性を変改するために配列を組み入れまたは除去、(f)特定の遺伝子変化を導くためにリコンビナーゼ標的部位を組み入れ、および(g)エラーを起こしやすいRTを用いることによる標的配列の変異導入をするために用いられ得る。目当ての標的部位におけるヌクレオチド配列を一般的に挿入、変化、または欠失させるこれらの方法に加えて、プライム編集因子は、高度にプログラム可能なライブラリを構築するために、ならびに細胞データ記録および系統トレース研究を行うためにもまた用いられ得る。本発明者は、プライム編集の効力を改善することを狙うPEgRNAの追加のデザイン特色をもまた企図した。なお、さらに、本発明者は、インテインドメインを用いてnapDNAbpを分裂することが関わる、ベクター送達システムを用いてプライム編集因子を首尾良く送達するための方法の着想を得た。
種々の態様において、プライム編集(または「プライム編集」)は、標的DNA分子(これに、ヌクレオチド配列の変化が導入されることが望まれる)を、伸長されたガイドRNAと複合体化した核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)と接触させることによって作動する。図1Gを参照すると、伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'もしくは5'端にまたはガイドRNAの分子内の位置付けに伸長を含み、所望のヌクレオチド変化(例えば、1ヌクレオチド変化、挿入、または欠失)をコードする。ステップ(a)では、napDNAbp/伸長されたgRNA複合体がDNA分子に接触し、伸長されたgRNAがnapDNAbpをガイドして標的座位に結合させる。ステップ(b)では、ニックが標的座位のDNAの鎖の1つに導入され(例えば、ヌクレアーゼまたは化学的薬剤による)、それによって利用可能な3'端を標的座位の鎖の1つに生出する。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわちガイドRNA配列にハイブリダイズされない鎖、すなわち「非標的鎖」上に生出される。しかしながら、ニックは鎖のどちらかに導入され得る。つまり、ニックは、Rループ「標的鎖」(すなわち、伸長されたgRNAのプロトスペーサー配列にハイブリダイズされる鎖)または「非標的鎖」(すなわち、Rループの一本鎖部分を形成し、標的鎖に対して相補的である鎖)上に導入され得る。ステップ(c)では、DNA鎖の3'端(ニックによって形成される)は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する(すなわち「プライム標的にプライムされたRT」)。ある態様において、3'端DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分の特定のRTプライム配列、すなわち「逆転写酵素プライム配列」にハイブリダイズする。ステップ(d)では、逆転写酵素が導入され(napDNAbpとの融合タンパク質としてまたはトランスで)、これが、プライムされた部位の3'端から伸長されたガイドRNAの5'端の方へDNAの一本鎖を合成する。これは、ニック部位におけるまたはそれに隣接する内生DNAに対してさもなければ相同的である、所望のヌクレオチド変化(例えば、1塩基変化、挿入、もしくは欠失、またはそれらの組み合わせ)を含む一本鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)では、napDNAbpおよびガイドRNAがリリースされる。ステップ(f)および(g)は一本鎖DNAフラップの分解に関し、その結果、所望のヌクレオチド変化が標的座位に組み込まれるようになる。このプロセスは、ひとたび3'一本鎖DNAフラップが内生DNA配列に侵入およびハイブリダイズすると形成する対応する5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成の方へ駆動され得る(例えば、トランスで、プライム編集因子との融合体として提供、または内生で提供されるFEN1または類似の酵素による)。理論によって拘束されることなしに、細胞の内生DNA修復および複製プロセスは、ミスマッチのDNAを分解してヌクレオチド変化(単数または複数)を組み込んで、所望の変改された産物を形成する。プロセスは、図1Gにおいて例示されるとおり「第2鎖ニッキング」または図1Iにおいて例示され本願において論じられるとおり「時間的(termporal)第2鎖ニッキング」によってもまた、産物形成の方へ駆動され得る。
種々の態様において、プライム編集システム(すなわちプライム編集システム)は、標的化された変異導入を行うための、すなわちゲノムまたは細胞の他のDNAエレメント上の良く定めされたDNAのストレッチのみを変異させるための、エラーを起こしやすい逆転写酵素の使用を包含し得る。図22は、標的座位上のエラーを起こしやすい逆転写酵素による標的化された変異導入を行うことを導入するための例示的プロセスの模式図を提供し、伸長されたガイドRNAと複合体化した核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)を用いる。このプロセスは、標的化された変異導入のためのプライム編集のある態様と言われ得る。伸長されたガイドRNAは、ガイドRNAの3'もしくは5'端にまたはガイドRNAの分子内の位置付けに伸長を含む。ステップ(a)では、napDNAbp/gRNA複合体がDNA分子に接触し、gRNAがnapDNAbpをガイドして、変異導入されるべき標的座位に結合させる。ステップ(b)では、ニックが標的座位のDNAの鎖の1つに導入され(例えば、ヌクレアーゼまたは化学的薬剤による)、それによって利用可能な3'端を標的座位の鎖の1つに生出する。ある態様において、ニックは、Rループ鎖に対応するDNAの鎖、すなわちガイドRNA配列にハイブリダイズされない鎖上に生出される。ステップ(c)では、DNA鎖の3'端は、逆転写をプライムするためにガイドRNAの伸長された部分と相互作用する。ある態様において、3'端DNA鎖は、ガイドRNAの伸長された部分の特定のRTプライム配列にハイブリダイズする。ステップ(d)では、エラーを起こしやすい逆転写酵素が導入され、これが、プライムされた部位の3'端からガイドRNAの3'端の方へDNAの変異導入された一本鎖を合成する。例示の変異がアステリスク「*」によって指示されている。これは所望の変異導入された領域を含む一本鎖DNAフラップを形成する。ステップ(e)では、napDNAbpおよびガイドRNAがリリースされる。ステップ(f)および(g)は一本鎖DNAフラップ(変異導入された領域を含む)の分解に関し、その結果、所望の変異導入された領域が標的座位に組み込まれるようになる。このプロセスは、ひとたび3'一本鎖DNAフラップが他の鎖上の相補的な配列に侵入およびハイブリダイズすると形成する対応する5'内生DNAフラップを除去することによって、所望の産物形成の方へ駆動され得る。プロセスは、図1Fにおいて例示されるとおり第2鎖ニッキングによってもまた産物形成の方へ駆動され得る。内生DNA修復および/または複製プロセス後に、変異導入された領域はDNA座位のDNAの両方の鎖上に組み込まれるようになる。
本明細書に記載のプライム編集システムまたはプライム編集(PE)システムは、ハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復障害などの疾病を処置するために、トリヌクレオチド反復変異(または「トリプレット拡大疾患」)を縮小するために用いられ得る。トリヌクレオチド反復拡大障害は発達神経生物学が関わる複雑な進行性の障害であり、多くの場合には、認知および感覚運動機能に影響する。障害は遺伝学的な表現促進現象(すなわち、各世代での増大した重症度)を示す。DNA伸長または短縮は、通常は減数分裂的に(すなわち、配偶子形成の時の間に、または胚発生中に早期に)起こり、多くの場合には性バイアスを有し、いくつかの遺伝子は女性から受け継がれるときにのみ、他は男性からのみ伸長するということを意味する。ヒトでは、トリヌクレオチド反復拡大障害は転写または翻訳レベルどちらかで遺伝子サイレンシングを引き起こし得、これは本質的に遺伝子機能をノックアウトする。代替的には、トリヌクレオチド反復拡大障害は、大きい繰り返しアミノ酸配列を有して生成された変改されたタンパク質を引き起こし得る。これは、多くの場合にはドミナントネガティブな様式で(例えばポリグルタミン疾患)、タンパク質機能を無効化するかまたは変化させるかどちらかである。
別の側面において、本開示は、プライム編集を用いてタンパク質上に1つ以上のペプチドタグを遺伝子的にグラフトするために本明細書に記載のプライム編集因子を用いるための方法を提供する。より具体的には、本開示は、1つ以上のペプチドタグをタンパク質上に遺伝子的に組み入れるための方法を提供し:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、1つ以上のペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をその中に挿入するように構成されたプライム編集因子と接触させて、タンパク質タグに融合されたタンパク質を含む融合タンパク質をコードする組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含む。
プライム編集は、疾患の過程においてミスフォールディングされるようになるプリオンタンパク質(PRNP)上への1つ以上の防護性変異の組み入れによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させるためにもまた用いられ得る。プリオン病または伝達性海綿状脳症(TSE)は、ヒトおよび動物両方を冒す稀な進行性の神経変性障害のファミリーである。それらは、長い潜伏期間、ニューロン喪失に関連する特徴的な海綿状変化、および炎症性応答を誘導することの失敗によって見分けられる。
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG(配列番号291)。
GCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGATGAGGAAGGTCTTCCTGTTTTCACCATCTTTCTAATCTTTTTCCAGCTTGAGGGAGGCGGTATCCACCTGCAGCCCTTTTAGTGGTGGTGTCTCACTCTTTCTTCTCTCTTTGTCCCGGATAGGCTAATCAATACCCTTGGCACTGATGGGCACTGGAAAACATAGAGTAGACCTGAGATGCTGGTCAAGCCCCCTTTGATTGAGTTCATCATGAGCCGTTGCTAATGCCAGGCCAGTAAAAGTATAACAGCAAATAACCATTGGTTAATCTGGACTTATTTTTGGACTTAGTGCAACAGGTTGAGGCTAAAACAAATCTCAGAACAGTCTGAAATACCTTTGCCTGGATACCTCTGGCTCCTTCAGCAGCTAGAGCTCAGTATACTAATGCCCTATCTTAGTAGAGATTTCATAGCTATTTAGAGATATTTTCCATTTTAAGAAAACCCGACAACATTTCTGCCAGGTTTGTTAGGAGGCCACATGATACTTATTCAAAAAAATCCTAGAGATTCTTAGCTCTTGGGATGCAGGCTCAGCCCGCTGGAGCATGAGCTCTGTGTGTACCGAGAACTGGGGTGATGTTTTACTTTTCACAGTATGGGCTACACAGCAGCTGTTCAACAAGAGTAAATATTGTCACAACACTGAACCTCTGGCTAGAGGACATATTCACAGTGAACATAACTGTAACATATATGAAAGGCTTCTGGGACTTGAAATCAAATGTTTGGGAATGGTGCCCTTGGAGGCAACCTCCCATTTTAGATGTTTAAAGGACCCTATATGTGGCATTCCTTTCTTTAAACTATAGGTAATTAAGGCAGCTGAAAAGTAAATTGCCTTCTAGACACTGAAGGCAAATCTCCTTTGTCCATTTACCTGGAAACCAGAATGATTTTGACATACAGGAGAGCTGCAGTTGTGAAAGCACCATCATCATAGAGGATGATGTAATTAAAAAATGGTCAGTGTGCAAAGAAAAGAACTGCTTGCATTTCTTTATTTCTGTCTCATAATTGTCAAAAACCAGAATTAGGTCAAGTTCATAGTTTCTGTAATTGGCTTTTGAATCAAAGAATAGGGAGACAATCTAAAAAATATCTTAGGTTGGAGATGACAGAAATATGATTGATTTGAAGTGGAAAAAGAAATTCTGTTAATGTTAATTAAAGTAAAATTATTCCCTGAATTGTTTGATATTGTCACCTAGCAGATATGTATTACTTTTCTGCAATGTTATTATTGGCTTGCACTTTGTGAGTATTCTATGTAAAAATATATATGTATATAAAATATATATTGCATAGGACAGACTTAGGAGTTTTGTTTAGAGCAGTTAACATCTGAAGTGTCTAATGCATTAACTTTTGTAAGGTACTGAATACTTAATATGTGGGAAACCCTTTTGCGTGGTCCTTAGGCTTACAATGTGCACTGAATCGTTTCATGTAAGAATCCAAAGTGGACACCATTAACAGGTCTTTGAAATATGCATGTACTTTATATTTTCTATATTTGTAACTTTGCATGTTCTTGTTTTGTTATATAAAAAAATTGTAAATGTTTAATATCTGACTGAAATTAAACGAGCGAAGATGAGCACCA(配列番号292)
プライム編集は、RNAタグ付けによってRNA機能をコードするDNAの配列を操作、変改、および別様に改変するためにもまた用いられ得、このやり方で、RNAの構造および機能を間接的に改変するための手段を提供する。例えば、PEは、非コードRNAまたはmRNAをタグ付けまたは別様に操作するためのRNAレベルで機能的であるモチーフ(これ以降ではRNAモチーフ)を挿入するために用いられ得る。これらのモチーフは、遺伝子発現を増大させるか、遺伝子発現を減少させるか、スプライシングを変改するか、転写後修飾を変化させるか、RNAの細胞下レベル位置付けに影響するか、RNAの単離または細胞内もしくは外の位置付けの決定を可能化するか(例えば、蛍光RNAアプタマー、例えばSpinach、Spinach2、Baby Spinach、またはBroccoliを用いる)、内生もしくは外因的なタンパク質もしくはRNA結合因子を動員するか、sgRNAを導入するか、あるいは自己切断またはRNAseどちらかによるRNAのプロセシングを誘導するための用をなし得る(さらなる詳細については図28Bおよび例6を見よ)。
HEXA mRNAは以下のヌクレオチド配列を有する:
GTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCATGACAAGTTCCAGGCTTTGGTTTTCGCTGCTGCTGGCGGCAGCGTTCGCAGGACGGGCGACGGCCCTCTGGCCCTGGCCTCAGAACTTCCAAACCTCCGACCAGCGCTACGTCCTTTACCCGAACAACTTTCAATTCCAGTACGATGTCAGCTCGGCCGCGCAGCCCGGCTGCTCAGTCCTCGACGAGGCCTTCCAGCGCTATCGTGACCTGCTTTTCGGTTCCGGGTCTTGGCCCCGTCCTTACCTCACAGGGAAACGGCATACACTGGAGAAGAATGTGTTGGTTGTCTCTGTAGTCACACCTGGATGTAACCAGCTTCCTACTTTGGAGTCAGTGGAGAATTATACCCTGACCATAAATGATGACCAGTGTTTACTCCTCTCTGAGACTGTCTGGGGAGCTCTCCGAGGTCTGGAGACTTTTAGCCAGCTTGTTTGGAAATCTGCTGAGGGCACATTCTTTATCAACAAGACTGAGATTGAGGACTTTCCCCGCTTTCCTCACCGGGGCTTGCTGTTGGATACATCTCGCCATTACCTGCCACTCTCTAGCATCCTGGACACTCTGGATGTCATGGCGTACAATAAATTGAACGTGTTCCACTGGCATCTGGTAGATGATCCTTCCTTCCCATATGAGAGCTTCACTTTTCCAGAGCTCATGAGAAAGGGGTCCTACAACCCTGTCACCCACATCTACACAGCACAGGATGTGAAGGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCCGGGGTATCCGTGTGCTTGCAGAGTTTGACACTCCTGGCCACACTTTGTCCTGGGGACCAGGTATCCCTGGATTACTGACTCCTTGCTACCCTGGGTCTGAGCCCTCTGGCACCTTTGGACCAGTGAATCCCAGTCTCAATAATACCTATGAGTTCATGAGCACATTCTTCTTAGAAGTCAGCTCTGTCTTCCCAGATTTTTATCTTCATCTTGGAGGAGATGAGGTTGATTTCACCTGCTGGAAGTCCAACCCAGAGATCCAGGACTTTATGAGGAAGAAAGGCTTCGGTGAGGACTTCAAGCAGCTGGAGTCCTTCTACATCCAGACGCTGCTGGACATCGTCTCTTCTTATGGCAAGGGCTATGTGGTGTGGCAGGAGGTGTTTGATAATAAAGTAAAGATTCAGCCAGACACAATCATACAGGTGTGGCGAGAGGATATTCCAGTGAACTATATGAAGGAGCTGGAACTGGTCACCAAGGCCGGCTTCCGGGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGTACCTGAACCGTATATCCTATGGCCCTGACTGGAAGGATTTCTACGTAGTGGAACCCCTGGCATTTGAAGGTACCCCTGAGCAGAAGGCTCTGGTGATTGGTGGAGAGGCTTGTATGTGGGGAGAATATGTGGACAACACAAACCTGGTCCCCAGGCTCTGGCCCAGAGCAGGGGCTGTTGCCGAAAGGCTGTGGAGCAACAAGTTGACATCTGACCTGACATTTGCCTATGAACGTTTGTCACACTTCCGCTGTGAGTTGCTGAGGCGAGGTGTCCAGGCCCAACCCCTCAATGTAGGCTTCTGTGAGCAGGAG TTTGAACAGACCTGCCCAACTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAAC(配列番号369)。
MTSSRLWFSLLLAAAFAGRATALWPWPQNFQTSDQRYVLYPNNFQFQYDVSSAAQPGCSVLDEAFQRYRDLLFGSGSWPRPYLTGKRHTLEKNVLVVSVVTPGCNQLPTLESVENYTLTINDDQCLLLSETVWGALRGLETFSQLVWKSAEGTFFINKTEIEDFPRFPHRGLLLDTSRHYLPLSSILDTLDVMAYNKLNVFHWHLVDDPSFPYESFTFPELMRKGSYNPVTHIYTAQDVKEVIEYARLRGIRVLAEFDTPGHTLSWGPGIPGLLTPCYPGSEPSGTFGPVNPSLNNTYEFMSTFFLEVSSVFPDFYLHLGGDEVDFTCWKSNPEIQDFMRKKGFGEDFKQLESFYIQTLLDIVSSYGKGYVVWQEVFDNKVKIQPDTIIQVWREDIPVNYMKELELVTKAGFRALLSAPWYLNRISYGPDWKDFYVVEPLAFEGTPEQKALVIGGEACMWGEYVDNTNLVPRLWPRAGAVAERLWSNKLTSDLTFAYERLSHFRCELLRRGVQAQPLNVGFCEQEFEQT(配列番号370)。
プライム編集は、定められたまたは可変の挿入、欠失、または定められたアミノ酸/ヌクレオチド変換を有するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子の高性能ライブラリを生成するためにもまた用いられ得、高スループットスクリーニングおよび指向性進化へのそれらの使用が本明細書に記載の。プライム編集のこの適用は例7においてさらに記載され得る。
競合するアプローチ
遺伝子ライブラリを構築するためのPEの使用
プライム編集因子は、公知の免疫原性エピトープを内生または外生のゲノムDNA上に挿入するための手段としてもまた用いられ得、治療学的またはバイオテクノロジー的適用のための対応するタンパク質の改変をもたらす(図31および32を見よ)。プライム編集の本発明に先行しては、かかる挿入は、非効率的にかつDSBからの高いインデル形成率によってのみ達成され得た。プライム編集は挿入編集からの高いインデル形成の問題を解決しながら、一般的にHDRよりも高い効率をオファーする。このより低いインデル形成率は、特に免疫原性エピトープを挿入するという記載されている適用において、標的化されたDNA挿入のための方法としてのHDRと比べたプライム編集の主要な利点を提示する。エピトープの長さは少数塩基から数百塩基の範囲である。プライム編集因子はかかる標的化された挿入を哺乳類細胞において達成するための効率的なアプローチである。
別の側面において、本開示は、種々の戦略を用いてin vitroおよびインビボのプライム編集因子の送達を可能にし、分裂インテインを用いる別個のベクター、ならびにエレクトロポレーションなどの技術を用いるリボヌクレオタンパク質複合体(すなわち、PEgRNAおよび/または第2部位gRNAと複合体化したプライム編集因子)、カチオン性脂質によって媒介される製剤の使用、およびリボヌクレオタンパク質複合体に融合された受容体リガンドを用いる誘導性エンドサイトーシス法という直接的送達戦略を包含する。いずれかのかかる方法が本願において企図される。
いくつかの側面では、本発明は、1つ以上のプライム編集因子をコードするポリヌクレオチド、例えば本明細書に記載のプライム編集システムの1つ以上の構成要素をコードする本明細書に記載の1つ以上のベクター、その1つ以上の転写物、および/またはそれから転写される1つ以上のタンパク質を、ホスト細胞に送達することを含む方法を提供する。いくつかの側面では、本発明は、さらに、かかる方法によって生ずる細胞、およびかかる細胞を含むかまたはそれから生ずる生物(例えば動物、植物、または真菌)を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載のプライム編集因子は、ガイド配列との組み合わせで(任意に、それと複合体化されて)、細胞に送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法が、哺乳類細胞または標的組織において核酸を導入するために用いられ得る。かかる方法は、プライム編集因子の構成要素をコードする核酸を培養中のまたはホスト生物中の細胞に投与するために用いられ得る。非ウイルスベクター送達システムは、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書に記載のベクターの転写物)、裸の核酸、およびリポソームなどの送達基剤と複合体化した核酸を包含する。ウイルスベクター送達システムはDNAおよびRNAウイルスを包含し、これらは細胞への送達後にエピソーム性のまたは取り入れされたゲノムどちらかを有する。遺伝子療法の総説については、Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm(eds)(1995);およびYu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照。
分裂PEベクターに基づく戦略
(a)第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントをコードする第1の発現ベクターを構築すること;
(b)第2の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントをコードする第2の発現ベクターを構築すること;
(c)第1および第2の発現ベクターを細胞に送達すること、
を含み、
第1および第2の分裂インテイン配列の自己切除を引き起こすトランススプライシング活性の結果として、N末端およびC末端フラグメントは、細胞内においてPE融合タンパク質として再構成される。
(a)第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントをコードする第1の発現ベクターを構築すること;
(b)第2の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントをコードする第2の発現ベクターを構築すること;
(c)第1および第2の発現ベクターを細胞に送達すること、
を含み、
第1および第2の分裂インテイン配列の自己切除を引き起こすトランススプライシング活性の結果として、N末端およびC末端フラグメントは細胞内においてPE融合タンパク質として再構成される。
(a)第1の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のN末端フラグメントをコードする第1の発現ベクターを構築すること;
(b)第2の分裂インテイン配列に融合されたPE融合タンパク質のC末端フラグメントをコードする第2の発現ベクターを構築すること;
(c)第1および第2の発現ベクターを細胞に送達すること、
を含み、
第1および第2の分裂インテイン配列の自己切除を引き起こすトランススプライシング活性の結果として、N末端およびC末端フラグメントは細胞内においてPE融合タンパク質として再構成される。
PEリボヌクレオタンパク質複合体の送達
mRNAによるPEの送達
他のゲノム編集因子のように、PEはそのプログラムされた遺伝子変改をゲノム上の意図されない部位、すなわち「オフターゲット」部位において導入し得るといういくらかのリスクが存在する。しかしながら、現行では、プライム編集因子によるオフターゲット編集を検出するための記載されている方法はない。かかる方法は、プライム編集因子を用いるオフターゲット編集の可能性ある部位の同定を許すであろう。
本明細書に記載のプライム編集因子は、二量体化ドメインを1つ以上のタンパク質標的に組み入れるためにもまた用いられ得る。二量体化ドメインは、二重特異的な様式で結合する連結部分(例えば、低分子、ペプチド、またはタンパク質)を介する1つ以上のタンパク質標的の二量体化に関連する活性の誘導可能な制御を容易化し得る。種々の側面では、二量体化ドメインは、異なるタンパク質(例えば、同じ型または異なるタンパク質)上に組み入れされるときに、夫々が同じ二重特異性部分(例えば、別個に二量体化ドメインに結合する少なくとも(a least)2つの領域を有する二重特異性低分子、ペプチド、またはポリペプチド)に結合し、それによって、二重特異性リガンドに対するそれらの共通の相互作用によってタンパク質の二量体化を引き起こす。この様式で、二重特異性リガンドは2つのタンパク質の二量体化の「誘導因子」として機能する。いくつかのケースでは、二重特異性リガンドまたは化合物は、同じである2つの標的化部分を有するであろう。他の態様において、二重特異性リガンドまたは化合物は夫々が他とは異なる標的化部分を有するであろう。同じ2つの標的化部分を有する二重特異性リガンドまたは化合物は、異なるタンパク質標的上に組み入れされた同じ二量体化ドメインを標的化する能力があるであろう。異なる標的化部分を有する二重特異性リガンドまたは化合物は、異なるタンパク質標的上に組み入れされた異なる二量体化ドメインを標的化する能力があるであろう。
5'-[スペーサー]-[gRNAコア]-[伸長アーム]-3'であって、伸長アームは5'-[相同アーム]-[編集鋳型]-[プライマー結合部位]-3'を含む;または
5'-[伸長アーム]-[スペーサー]-[gRNAコア]-3'であって、伸長アームは5'-[相同アーム]-[編集鋳型]-[プライマー結合部位]-3'を含み、どちらの構成でも「編集鋳型」は二量体化ドメインのヌクレオチド配列を含む。
プライム編集因子およびもたらされるゲノム改変は、細胞性のプロセスおよび発生を研究および記録するためにもまた用いられ得る。例えば、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を有する融合タンパク質をコードする第1の核酸配列を細胞に提供することと、PEgRNAをコードする少なくとも第2の核酸配列を細胞に提供することとによって、本明細書に記載のプライム編集因子は、細胞への刺激の存在および持続時間を記録するために用いられ得る。第1の、第2の、または両方の核酸配列どちらかは、細胞刺激に応答性である誘導性プロモーターに作動可能に連結され、その結果、それは融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現を誘導し、それによって細胞内の標的配列の改変を引き起こす。
本明細書に記載のプライム編集因子の使用は、DNA、RNA、およびタンパク質などのバイオ分子の細胞下レベル局在および修飾状態を制御するためにもまた用いられ得る。転写コントロール、細胞代謝、およびシグナル伝達カスケードのような特定の生物学的機能は、細胞内の具体的な位置付けにおいて丁寧にオーケストレーションされている。タンパク質をこれらのおよび他の固有の細胞区画に輸送する能力は、いくつもの生物学的プロセスを変改するための機会を提供し得る。
PEによって媒介される改変の1つの標的バイオ分子はDNAである。標的座位のアクセス可能性を変化させるいくつものDNA配列を組み入れるためのDNAの改変がなされ得る。クロマチンアクセス可能性は遺伝子転写アウトプットをコントロールする。クロマチンコンパクト化酵素を動員するためのマークの組み入れは、隣り合う遺伝子の転写アウトプットを減少させるはずであるが、クロマチン開放に関連する配列の組み入れは、領域をよりアクセス可能にし、翻って転写を増大させるはずである。ネイティブな制御配列を真似たより複雑な配列モチーフの組み入れは、現行で利用可能なdCas9融合体よりも微妙なかつ生物学的に敏感なコントロールを異なるエピジェネティックなリーダー、ライター、またはイレーサー酵素に提供するはずである。典型的には、具体的な生物学的祖先を有さずにあり得る多数の単一型のマークを組み入れるツールである。3Dゲノムアーキテクチャの急成長分野において実証されているとおり、2つの座位を近接する近位に持って来るかまたは座位を核膜との接触に持って来るであろう配列の組み入れもまた、それらの座位の転写アウトプットを変改するはずである。
それらの細胞局在、相互作用パートナー、構造ダイナミクス、またはフォールディングの熱力学を変化させることによってそれらの活性を変改するためのRNAの改変もまたなされ得る。翻訳中断またはフレームシフトを引き起こすであろうモチーフの組み入れは、種々のmRNAプロセシング機序によってmRNA種の存在量を変化させ得る。コンセンサススプライス配列を改変することもまた、異なるRNA種の存在量および保有率を変改するであろう。異なるスプライスアイソフォームの相対比を変化させることは、予測可能に、タンパク質翻訳産物の比の変化に至るであろう。これは多くの生物学的経路を変改するために用いられ得る。例えば、ミトコンドリア対核のDNA修復タンパク質のバランスをシフトさせることは、化学療法試薬に対する異なるがんのレジリエンスを変改するであろう。さらにその上、RNAは、新規のタンパク質標的への結合を可能化する配列によって修飾され得る。高い親和性で細胞タンパク質に結合するいくつものRNAアプタマーが開発されている。これらのアプタマーの1つの組み入れは、それらの翻訳、生物活性を防止するであろうタンパク質標的への結合によって異なるRNA種を隔離するために、またはRNA種を特定の細胞下レベル区画に持って来るためにどちらかで用いられ得る。バイオ分子分解は局在改変の別のクラスである。
翻訳後修飾(PTM)によるタンパク質の修飾もまたPEによって実行され得るバイオ分子操作の重要なクラスを表す。RNA種のように、細胞内のタンパク質の存在量を変化させることは、PEの重要な能力である。オープンリーディングフレームに停止コドンを組み入れるための編集がされ得る。これは編集されたDNA配列から生ずる全長産物を消去するであろう。代替的には、タンパク質分解の速度が標的タンパク質について変改されることを引き起こすペプチドモチーフが組み入れられ得る。遺伝子本体上への分解タグの組み入れが、細胞内のタンパク質の存在量を変改するために用いられ得る。その上、低分子によって誘導されるデグロンの導入はタンパク質分解の時間的コントロールを可能化し得る。これは研究および治療学両方にとって重要な関連性を有し得る。なぜなら、研究者は所与の標的の低分子によって媒介される治療学的タンパク質分解が見込みある治療学的戦略であるかどうかを難なく評価し得るからである。タンパク質の細胞下レベル局在を変化させるためのタンパク質モチーフもまた組み入れられ得る。核、ミトコンドリア、細胞膜、ペルオキシソーム、リソソーム、プロテアソーム、エキソソーム、および他を包含するいくつもの細胞下レベル区画にタンパク質を選好的に輸送するためのアミノ酸モチーフが組み入れられ得る。
セクションIに引用された参考文献
以下の参考文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
他の態様において、プライム編集システムはプライム編集効率を改善し得るPEgRNAデザインおよび戦略の使用を包含し得る。これらの戦略は、プライム編集に要求されるマルチステッププロセスゆえに存在するいくつかのイシューを克服することを探究する。例えば、PEgRNA上に形成し得る好ましくないRNA構造は、DNA編集がPEgRNAからゲノム座位にコピーされることの阻害をもたらし得る。これらの限定はPEgRNA構成要素の再デザインおよび操作によって克服され得る。これらの再デザインはプライム編集因子効率を改善し得、ゲノム上へのより長い挿入配列の組み入れを許し得る。
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号501)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号502)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号503)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号504)
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号505)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号228)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号229)
を包含し得る。
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号230)
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号231)
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号232)
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号233)
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号234)
を包含するが、これらに限定されない。
Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)を用いるプライム編集(PE)は、SpCas9が効率的に結合し得る好適に置かれたNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)があるゲノム座位において、全ての1塩基置換、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせを効率的に組み入れ組み入れ得る。しかしながら、別の側面において、本明細書に記載の方法は、アクセス可能なPAM、よって効率的なPEのためのアクセス可能な標的化可能なゲノム座位を拡張することによって、PEの標的化能力を幅広くする。SpCas9以外のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質を用いるプライム編集因子は、異なるPAMへのアクセスを許すことによってゲノム座位の拡張された標的化可能な範囲を可能化する。加えて、SpCas9よりも小さいRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質の使用は、より効率的なウイルス送達をもまた許す。SpCas9以外のCasタンパク質または他のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質によるPEは、SpCas9に基づくPEを用いてはアクセス不可能または非効率的どちらかであった高効率の治療学的編集を許すであろう。
別の側面において、プライム編集は、リコンビナーゼ部位(または「リコンビナーゼ認識配列」)を所望のゲノム部位に挿入するために用いられ得る。リコンビナーゼ部位の挿入は、部位特異的な遺伝子変化をゲノムに成し遂げるためのプログラムされた位置付けを提供する。かかる遺伝子変化は、他の遺伝子変化の中でも、例えばプラスミドのゲノム取り入れ、ゲノム欠失または挿入、染色体転座、およびカセット交換を包含し得る。遺伝子変化のこれらの例示の型は図64(b)~(f)において例解されている。それから、組み入れされたリコンビナーゼ認識配列は、その部位における部位特異的な組み換えを行うために用いられて、種々の組み換えアウトカム、例えば切除、取り入れ、逆位、またはDNAフラグメントの交換を成就し得る。例えば、図65はリコンビナーゼ部位の組み入れを例解し、これはそれからGFP発現マーカーを含むDNAドナー鋳型を取り入れするために用いられ得る。リコンビナーゼ部位に取り入れされたGFP発現システムを含有する細胞は、蛍光発光するであろう。
表7.チロシンリコンビナーゼおよびSSR標的配列。
本開示は、例示されるとおりであるがプリオン病(例えば本願の例5)、トリヌクレオチド反復拡大疾患(例えば本願の例3)、またはCDKL5欠損症障害(CDD)(例えば本願の例23)に限定されない、本願において提供されるプライム編集システムによって修正され得る点変異または他の変異(例えば、欠失、挿入、逆位、重複など)に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患と診断された対象の処置のための方法を提供する。
(a)1つ以上の核酸塩基改変がプライム編集因子によって組み入れされることを望まれる標的配列、すなわちヌクレオチド配列;
(b)標的配列上のカットされる部位の位置付け、すなわち、プライム編集因子が一本鎖ニックを誘導して、ニックの1つの側に3'端RTプライマー配列およびニックの他の側に5'端の内生フラップ(これは究極的にはFEN1またはその等価物によって除去され、3'ssDNAフラップによって置き換えられる)を生出するであろう特定の核酸塩基位置。カットされた部位は3'端プライマー配列を生出し、これはRNA依存的なDNA重合の間にPE融合タンパク質(例えばRT酵素)のポリメラーゼによって伸長されるようになって、所望の編集を含有する3'ssDNAフラップを生出し、これがそれから標的配列上の5'内生DNAフラップを置き換える;
(c)利用可能なPAM配列(標準的なSpCas9 PAM部位、および拡張されたまたは異なるPAM特異性を有するCas9バリアントおよび等価物によって認識される非標準的なPAM部位を包含する);
(d)PAM鎖上の利用可能なPAM配列とカットされる部位の位置付けとの間の間隔;
(e)用いられるべき利用可能なプライム編集因子の具体的なCas9、Cas9バリアント、またはCas9等価物(これは部分的には利用可能なPAMによって記述される);
(f)プライマー結合部位の配列および長さ;
(g)編集鋳型の配列および長さ;
(h)相同アームの配列および長さ;
(i)スペーサー配列および長さ;ならびに
(j)gRNAコア配列。
1.標的配列および編集を定める。所望の編集(点変異、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせ)の位置付けを中心とした標的DNA領域(~200bp)の配列をリトリーブする。図70Aを見よ。
2.標的PAMを位置付ける。所望の編集位置付けに対して近位のPAMを同定する。PAMは所望の編集位置付けに対して近位のDNAのどちらかの鎖上に同定され得る。編集位置に近接するPAMが好ましいが(すなわち、ニック部位は編集位置から30nt未満である。または編集位置からニック部位まで29nt、28nt、27nt、26nt、25nt、24nt、23nt、22nt、21nt、20nt、19nt、18nt、17nt、16nt、15nt、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、もしくは2nt未満)、編集位置から≧30ntのニックを置くプロトスペーサーおよびPAMを用いて編集を組み入れることが可能である。図70Bを見よ。
3.ニック部位を位置付ける。考慮されている各PAMについて、対応するニック部位とどの鎖上かとを同定する。Sp Cas9 H840Aニッカーゼでは、切断はNGG PAMの5'の第3および第4の塩基の間においてPAM含有鎖に生起する。全ての編集されるヌクレオチドはニック部位の3'に存在しなければならない。そのため、適当なPAMはPAM含有鎖上の標的の編集の5'にニックを置かなければならない。下で示される例では、2つの可能なPAMがある。単純のために、残りのステップはPAM 1のみを用いるPEgRNAのデザインを実証する。図70Cを見よ。
4.スペーサー配列をデザインする。Sp Cas9のプロトスペーサーはPAM含有鎖上のNGG PAMの5'の20ヌクレオチドに対応する。効率的なPol III転写開始はGが最初に転写されるヌクレオチドであることを要求する。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGである場合には、PEgRNAのスペーサー配列は単純にプロトスペーサー配列である。プロトスペーサーの最初のヌクレオチドがGではない場合には、PEgRNAのスペーサー配列は、G、次にプロトスペーサー配列である。図70Dを見よ。
5.プライマー結合部位(PBS)をデザインする。出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のDNAプライマーを同定する。DNAプライマーの3'端はニック部位のちょうど上流のヌクレオチドである(すなわち、Sp Cas9ではNGG PAMの5'の第4の塩基)。PE2およびPE3への使用のための一般的なデザイン原理として、DNAプライマーに対する12から13ヌクレオチドの相補性を含有するPEgRNAプライマー結合部位(PBS)が、~40-60%GC含量を含有する配列に用いられ得る。低いGC含量を有する配列では、より長い(14から15nt)PBSが試験されるべきである。より高いGC含量を有する配列では、より短い(8から11nt)PBSが試験されるべきである。GC含量にかかわらず、最適なPBS配列は経験的に決定されるはずである。長さpのPBS配列をデザインするためには、出発アレル配列を用いて、PAM含有鎖上のニック部位の5'の最初のpヌクレオチドの逆相補体を取る。図70Eを見よ。
6.RT鋳型(またはDNA合成鋳型)をデザインする。RT鋳型(または、ポリメラーゼが逆転写酵素ではないところでは、DNA合成鋳型)は、デザインされた編集と編集に隣接する配列に対する相同性とをコードする。1つの態様では、これらの領域は図3Dおよび図3EのDNA合成鋳型に対応し、DNA合成鋳型は「編集鋳型」および「相同アーム」を含む。最適なRT鋳型長さは標的部位に基づいて変わる。ショートレンジ編集(位置+1から+6)では、短い(9から12nt)、中程度の(13から16nt)、および長い(17から20nt)RT鋳型を試験することが推奨される。ロングレンジ編集(位置+7以降)では、十分な3'DNAフラップ相同性を許すように、編集の位置から少なくとも5nt(好ましくは10nt以上)伸長するRT鋳型を用いることが推奨される。ロングレンジ編集では、機能的なデザインを同定するために、いくつかのRT鋳型がスクリーニングされるべきである。より大きい挿入および欠失(≧5nt)では、RT鋳型上へのより多大な3'相同性(~20nt以上)の組み込みが推奨される。RT鋳型が、逆転写されるDNA産物上の最後のヌクレオチドとしてのG(PEgRNAのRT鋳型上のCに対応する)の合成をコードするときには、編集効率は典型的には損なわれる。多くのRT鋳型が効率的なプライム編集を支持するので、RT鋳型をデザインするときには、最後の合成されるヌクレオチドとしてのGの回避が推奨される。長さrのRT鋳型配列をデザインするためには、所望のアレル配列を用い、PAMを元々含有した鎖上のニック部位の3'の最初のrヌクレオチドの逆相補体を取る。SNP編集と比較して、同じ長さのRT鋳型を用いる挿入または欠失編集は同一の相同性を含有しないであろうということに注意せよ。図70Fを見よ。
7.完全なPEgRNA配列をアセンブリする。PEgRNA構成要素を次の順序(5'から3')でコンカテネーションする:スペーサー、骨格、RT鋳型、およびPBS。図70Gを見よ。
8.PE3のためのニッキングsgRNAをデザインする。編集の上流および下流の非編集鎖上のPAMを同定する。最適なニッキング位置は高度に座位依存的であり、経験的に決定されるはずである。一般的に、PEgRNAによって誘導されるニックの向かいの位置の40から90ヌクレオチド5'に置かれたニックは、より高い編集収量およびより少数のインデルに至る。ニッキングsgRNAは、出発アレル上の20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有する。プロトスペーサーがGで始まらない場合には5'Gの追加を有する。図70Hを見よ。
9.PE3bニッキングsgRNAをデザインする。PAMが相補鎖に存在し、その対応するプロトスペーサーが編集のために標的化される配列とオーバーラップする場合には、この編集はPE3bシステムの候補であり得る。PE3bシステムでは、ニッキングsgRNAのスペーサー配列は出発アレルではなく所望の編集されたアレルの配列にマッチする。編集されるヌクレオチド(単数または複数)がニッキングsgRNAプロトスペーサーのシード領域(PAMに隣接する~10nt)内に収まるときには、PE3bシステムは効率的に作動する。これは、編集された鎖の組み入れ後まで相補鎖のニッキングを防止し、標的DNAに結合することについてのPEgRNAおよびsgRNAの間の競合を防止する。PE3bは、両方の鎖上の同時のニックの生成をもまた回避し、それゆえに、高い編集効率を維持しながらインデル形成を有意に縮減する。PE3b sgRNAは所望のアレルの20ntプロトスペーサーにマッチするスペーサー配列を有するべきである。必要とされる場合には5'Gの追加を有する。図70Iを見よ。
よび4;頭蓋縫合早期癒合症および歯異常;クレアチン欠損症、X連鎖;クルーゾン症候群;潜在眼球症候群;停留精巣、片側または両側;クッシング指節癒合症;皮膚悪性黒色腫1;骨異栄養症と、肺、胃腸、および泌尿器の重度の異常とを伴う皮膚弛緩症;チアノーゼ、一過的な新生児のおよび非定型の腎症;嚢胞性線維症;シスチン尿症;シトクロムcオキシダーゼi欠損症;シトクロムcオキシダーゼ欠損症;D-2-ヒドロキシグルタル酸尿症2;分節性ダリエー病;内耳形成不全、小耳症、および小歯症(LAMM)を伴う難聴;難聴、常染色体優性3a,4,12,13,15、常染色体優性の非症候性感音性17,20および65;難聴、常染色体劣性1A,2,3,6,8,9,12,15,16,18b,22,28,31,44,49,63,77,86および89;難聴、蝸牛の、近視および知的障害あり、前庭障害なし、常染色体優性、X連鎖2;2-メチルブチリル-CoA脱水素酵素の欠損症;3-ヒドロキシアシル-CoA脱水素酵素の欠損症;アルファ-マンノシダーゼの欠損症;芳香族-L-アミノ酸脱炭酸酵素の欠損症;ビスホスホグリセリン酸ムターゼの欠損症;ブチリル-CoA脱水素酵素の欠損症;フェロキシダーゼの欠損症;ガラクトキナーゼの欠損症;グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼの欠損症;ヒアルロノグルコサミニダーゼの欠損症;リボース-5-リン酸イソメラーゼの欠損症;ステロイド11-ベータ-モノオキシゲナーゼの欠損症;UDPグルコース-ヘキソース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの欠損症;キサンチンオキシダーゼの欠損症;デジェリン・ソッタス病;シャルコー・マリー・トゥース病、ID型およびIVF型;デジェリン・ソッタス症候群、常染色体優性;樹状細胞、単球、Bリンパ球、およびナチュラルキラーリンパ球の欠損症;デビュクワ(Desbuquois)異形成症2; デビュクワ症候群;DFNA 2非症候性の聴力低下;視神経萎縮および難聴を伴う糖尿病および尿崩症;2型糖尿病、およびインスリン依存性20;ダイアモンド・ブラックファン貧血1,5,8および10;下痢3(分泌性ナトリウム、先天性、症候性)、および5(タフティング腸症(tufting enteropathy)を伴う、先天性);ジカルボキシルアミノ酸尿症;びまん性掌蹠角化症、ボスニア型;デジトレノ脳症候群;ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症;拡張型心筋症1A,1AA,1C,1G,1BB,1DD,1FF,1HH,1I,1KK,1N,1S,1Yおよび3B;左心室非圧縮3;シトクロムp450酸化還元酵素欠損症に起因するステロイド産生異常;遠位型関節拘縮2B型;遠位型遺伝性運動ニューロン症2B型;遠位型ミオパチーMarkesbery-Griggs型;遠位型脊髄性筋萎縮症、X連鎖3;二重睫毛・リンパ浮腫症候群;皮膚の欠如を伴う、優性栄養傷害性表皮水疱症;優性遺伝性視神経萎縮症;ドンナイ・バロウ症候群;ドーパミン ベータ水酸化酵素欠損症;ドーパミン受容体d2、脳内密度低下;ダウリング・デゴス病4;ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー;マラティア・レベンチーヌ(Malattia leventinese);2型デュアン症候群;デュビン・ジョンソン症候群;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ベッカー型筋ジストロフィー;異常フィブリノーゲン血症;常染色体優性の先天性角化異常症および常染色体優性、3;常染色体劣性の先天性角化異常症1,3,4および5;X連鎖性の先天性角化異常症;顔面ミオキミアを伴う、家族性ジスキネジア;プラスミノーゲン分子異常症;ジストニア2(捻転、常染色体劣性),3(捻転、X連鎖),5(ドーパ反応型),10,12,16,25,26(ミオクロニー);良性家族性乳児の発作2;早期乳児てんかん性脳症2,4,7,9,10,11,13および14;非定型レット症候群;初期T細胞前駆体急性リンパ性白血病;外胚葉性異形成表皮水疱症候群;外胚葉性異形成-合指症候群1;偏位水晶体、単独で(isolated)常染色体劣性および優性;裂手裂足(Ectrodactyly)、外胚葉性異形成、および口唇口蓋裂症候群3;エーラス・ダンロス症候群7型(常染色体劣性)、古典型、2型(早老性)、ヒドロキシリジン欠損型、4型、4型バリアント、およびテナシンX欠損に起因するもの;アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー;内分泌-大脳骨異形成症(cerebroosteodysplasia);S錐体増強症候群;拡大前庭水管症候群;エンテロキナーゼ欠損症;疣贅状表皮発育異常症;単純型表皮水疱症および肢帯筋ジストロフィー、斑状色素沈着(mottled pigmentation)を伴う単純型、幽門閉鎖を伴う単純型、単純型、常染色体劣性、および幽門閉鎖を伴う;表皮剥離性掌蹠角化症;家族性熱性痙攣8;てんかん、小児欠神2,12(特発性全身、感受性),5(夜間前頭葉型)、夜間前頭葉型1、部分性、可変の病巣があるもの(with variable foci)、進行性ミオクロニー3、およびX連鎖性、可変の学習障害および行動障害があるもの;てんかん性脳症、小児期発症、乳児期早期、1,19,23,25,30および32;骨端異形成症、多発性、近視および伝音難聴を伴う;一過性運動失調症2型;一過性疼痛症候群、家族性、3;エプスタイン症候群;フェクトナー症候群;赤芽球増殖性プロトポルフィリン症;エストロゲン抵抗性;滲出性硝子体網膜症6;ファブリー病、およびファブリー病、心臓変異型;第H因子、第VII因子、第X因子、第v因子、および第viii因子の、2つの複合欠損症、第xiii因子、サブユニット、欠損症;家族性腺腫性ポリポーシス1および3;蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイド腎症;家族性寒冷蕁麻疹;家族性の小脳虫部無発生;家族性良性天疱瘡;家族性乳がん;乳がん感受性(Breast cancer, susceptibility to);骨肉腫;膵臓がん3;家族性心筋症;家族性寒冷自己炎症性症候群2;家族性大腸がん;家族性滲出性硝子体網膜症、X連鎖性;家族性片麻痺性片頭痛1型および2型;家族性高コレステロール血症;家族性肥大型心筋症1,2,3,4,7,10,23および24;家族性低カリウム血症-低マグネシウム血症;家族性低形成の、糸球体嚢胞腎;家族性乳児筋無力症;家族性若年性痛風;家族性地中海熱、および家族性地中海熱、常染色体優性;家族性多弁症;家族性晩発性皮膚ポルフィリン症;家族性肺毛細血管腫症;家族性腎性糖尿;家族性腎性低尿酸血症;家族性拘束性心筋症1;家族性1型および3型高リポ蛋白血症;ファンコニー貧血,補欠群E,I,NおよびO;ファンコニー・ビッケル症候群;ファビズム感受性(Favism, susceptibility to);熱性痙攣、家族性、11;フェインゴールド症候群1;胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座1;FG症候群およびFG症候群4;眼球外筋の線維症、先天性、1,2,3a(眼球外病変の有無に関わらない),3b;魚眼病;フレック角膜ジストロフィー;フローティング・ハーバー症候群;精神遅滞の有無に関わらない、言語障害を伴う焦点てんかん;巣状分節性糸球体硬化症5;前脳欠損症;フランク・テル・ハール症候群;Borrone Di Rocco Crovato症候群;フレイジャー症候群;ウィルムス腫瘍1;フリーマン・シェルドン症候群;前頭骨幹端異形成症1および3;前頭側頭型認知症;前頭側頭型認知症および/または筋萎縮性側索硬化症3および4;前頭側頭型認知症第3染色体連鎖性および前頭側頭型認知症ユビキチン陽性;フルクトース-ビホスファターゼ欠損症;フールマン(Fuhrmann)症候群;ガンマ-アミノ酪酸トランスアミナーゼ欠損症;ガムストープ・ウォールファールト(Gamstorp-Wohlfart)症候群; ゴーシェ病1型および亜急性神経障害性;進行性の脊椎側弯症を伴う、家族性水平注視麻痺;全般性優性ジストロフィー型表皮水疱症;全般性てんかん、熱性痙攣プラス3,1型,2型を伴う;レノックス・ガストー型てんかん脳症;巨大軸索ニューロパチー;グランツマン血栓症;緑内障1、開放角、e,FおよびG;緑内障3、原発性先天性、d;先天性緑内障、および先天性緑内障、コロボマ;緑内障、原発性開放角、若年性発症;神経膠腫感受性1;グルコーストランスポーター1型欠損症候群;ルコース-6-リン酸輸送欠損症;GLUT1欠損症候群2;特発性全般性てんかん感受性、12;グルタミン酸ホルミノトランスフェラーゼ欠損症;グルタル酸血症IIAおよびIIB;グルタル酸尿症1型;グルタチオン合成酵素欠損症;糖原病0(筋肉),II(成人形),IXa2,IXc,1A型;II型,IV型,IV(肝とミオパチーとの複合),V型およびVI型;ゴールドマン・ファーブル症候群;ゴードン症候群;ゴーリン症候群;全前脳胞症シークエンス;全前脳胞症7;顆粒腫性疾患、慢性、X連鎖性、バリアント;卵巣の顆粒膜細胞腫瘍;灰色血小板症候群;グリセリ症候群3型;グレーノー角膜ジストロフィーI型;成長および精神遅滞、下顎顔面異形症、小頭症、および口蓋裂;下垂体異常を伴う成長ホルモン欠損症;免疫不全を伴う成長ホルモン不感受性;GTPシクロハイドロラーゼI欠損症;ハジュ・チーニー症候群;手足子宮症候群;聴覚障害;小児毛細血管腫;血液腫瘍;ヘモクロマトーシス1型,2B型および3型;糖尿病の微小血管合併症7;トランスフェリン血清レベル量的形質座2;ヘモグロビンH病、無欠損;グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症に起因する、溶血性貧血、非球状赤血球性;血球貪食性リンパ組織球症、家族性、2;血球貪食性リンパ組織球症、家族性、3;ヘパリン補因子II欠損症;遺伝性腸性先端皮膚炎;遺伝性乳がん・卵巣がん症候群;運動失調・毛細血管拡張症様障害;遺伝性びまん性胃がん;スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症;遺伝性第II,第IX,第VIII因子欠損症;遺伝性出血性毛細血管拡張症2型;無汗症を伴う遺伝性無痛症;遺伝性リンパ浮腫I型;視神経萎縮を伴う遺伝性運動・感覚神経症;早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー;遺伝性神経痛性筋萎縮症;遺伝性非ポリポーシス大腸新生物;リンチ症候群IおよびII;遺伝性膵炎;慢性膵炎感受性;遺伝性感覚・自律神経障害IIB型およびIIA型;遺伝性鉄芽球性貧血;ヘルマンスキー・ポドラック症候群1,3,4および6;内臓錯位、2,4および6、常染色体;内臓錯位、X連鎖性;組織球性髄様細網症;異所形成;組織球症-リンパ節腫大プラス症候群;ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症;全前脳胞症2,3,7および9;ホルト・オラム症候群;MTHFR欠損症、CBS欠損症、およびホモシステイン尿症に起因するホモシステイン血症、ピリドキシン応答性;コバラミン代謝異常に起因する、ホモシステイン尿症-巨赤芽球性貧血、cblE相補型;ハウエル・エバンス(Howel-Evans)症候群;ハーラー症候群;ハッチンソン・ギルフォード症候群;水頭症;高アンモニア血症、III型;高コレステロール血症、および高コレステロール血症、常染色体劣性;過剰驚愕症2および遺伝性の過剰驚愕症;高フェリチン血症白内障症候群;高グリシン尿症;周期性発熱を伴う高免疫グロブリンD;メバロン酸尿症;高免疫グロブリンE症候群;家族性の高インスリン血症性低血糖症3,4および5;高インスリン血症-高アンモニア血症症候群;高リシン血症;ジストニア、赤血球増加症、および肝硬変を伴う高マンガン血症;高オルニチン血症-高アンモニア血症-ホモシトルリン尿症症候群;副甲状腺機能亢進症1および2;副甲状腺機能亢進症、新生児重度;部分的pts欠損症、BH4欠損症、D、非pkuに起因する、高フェニルアラニン血症、bh4欠損症、a;精神遅滞症候群2,3および4を伴う高リン酸血症;多毛性骨軟骨異形成症;apob32に関連する、低ベータリポ蛋白血症、家族性;低カルシウム血症、常染色体優性1;低カルシウム尿性高カルシウム血症、家族性、1型および3型;低軟骨形成症;鉄過剰症を伴う低クロム小球性貧血;肝臓中グリコーゲン合成酵素の欠損症を伴う低血糖症;臭覚障害の有無に関わらない低ゴナドトロピン性性腺機能低下症11;免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全症;発汗低下のX連鎖性外胚葉異形成;低カリウム性周期性四肢麻痺1および2;低マグネシウム血症1、腸の;低マグネシウム血症、発作、および精神遅滞;低髄性白質ジストロフィー7;左心低形成症候群;房室中隔欠損症および共通房室接合部;尿道下裂1および2、X連鎖性;甲状腺機能低下症、先天性非甲状腺腫、1;減毛症8および12;減毛症-リンパ浮腫-血管拡張症候群;I血液型系;シーメンス型水疱性魚鱗癬;剥脱性魚鱗癬;未熟児魚鱗癬症候群;特発性基底核石灰化症5;特発性線維性肺胞炎、慢性型;先天性角化不全症、常染色体優性、2および5;乳児期の特発性高カルシウム血症;カルシウム流入障害2に起因するT細胞不活性化を伴う免疫機能障害; 1型および2型高IgMを伴う、cd3-ゼータの欠陥に起因する、免疫不全15,16,19,30,31C,38,40,8、ならびにマグネシウム欠陥を伴う、X連鎖性、エプスタイン・バーウイルス感染、および新形成;免疫不全-動原体不安定性-顔面奇形症候群2;封入体ミオパチー2および3;野中ミオパチー;乳児痙攣および発作性舞踏症、家族性;乳児皮質過骨症;乳児GM1ガングリオシドーシス;乳児低ホスファタシアーゼ血症;乳児ネフロン癆;乳児眼振、X連鎖性;乳児パーキンソン病-ジストニア;多尾性精子および過剰なDNAに関連する不妊症;イ
ンスリン抵抗性;インスリン抵抗性糖尿病および黒色表皮腫;インスリン依存性糖尿病分泌性下痢症候群;間質性腎炎、核巨大化(karyomegalic);子宮内発育遅延、骨幹端異形成症、先天性副腎低形成、および性器奇形;ヨードチロシン結合欠損症;IRAK4欠損症;虹彩隅角異発生優性型および1型;脳内鉄蓄積;坐骨膝蓋骨異形成;膵島細胞過形成;17,20-リアーゼ単独欠損症;ルトロピン単独欠損症;イソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症;ヤンコヴィッチ・リベラ症候群;ジャーベルおよびランゲ・ニールセン症候群2;ジュベール症候群1,6,7,9/15(2遺伝子性),14,16および17、ならびに口顔面指症候群xiv;ヘルリッツの接合部表皮水疱症;若年性GM>1<ガングリオシドーシス;若年性ポリポーシス症候群;若年性ポリポーシス/遺伝性出血性毛細血管拡張症症候群;若年性網膜炎;歌舞伎メーキャップ症候群;カルマン症候群1,2および6;思春期遅延症;神崎病;カラック症候群;カルタゲナー症候群;ケニー・ケイフィ症候群2型;ケッペン・ルビンスキー(Keppen-Lubinsky)症候群;円錐角膜1;毛包性角化症;掌蹠膿疱症1;キンドラー症候群;L-2-ヒドロキシグルタル酸尿症;ラーセン症候群、優性型;格子状角膜ジストロフィーIII型;レーバー黒内障;ツェルウェガー症候群;ペルオキシソーム生合成異常症;ツェルウェガー症候群スペクトラム;レーバー先天性黒内障11,12,13,16,4,7および9;レーバー視神経萎縮症;アミノグリコシド誘発性難聴;難聴、非症候性感音性、ミトコンドリア;左心室非圧縮症5;左右軸奇形;リー病;ミトコンドリア短鎖エノイル-CoAヒドラターゼ1欠損症;ミトコンドリア複合体I欠損症に起因するリー症候群;ライナー病;レリー・ワイル軟骨骨異形成症;致死性先天性拘縮症候群6;白血球接着不全症I型およびIII型;白骨ジストロフィー、ミエリン形成不全性、11および6;白質脳症、運動失調を伴う、脳幹・脊髄障害と乳酸値上昇とを伴う、白質の消失を伴う、および進行性の、卵巣不全を伴う;全白爪;レビー小体型認知症;リヒテンシュタイン・クノール症候群;リー・フラウメニ症候群1;Lig4症候群;肢帯筋ジストロフィー1B型,2A型,2B型,2D型,C1型,C5型,C9型,C14型;脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー-ジストログリカノパチー、A14型およびB14型;複合型リパーゼ欠損症;脂肪蛋白症;リポジストロフィー、家族性部分的、2型および3型;脳回欠損1,2(X連鎖性),3,6(小頭症を伴う),X連鎖性;皮質下帯状ヘテロトピア、X連鎖性;急性乳児肝不全;ロイス・ディーツ症候群1,2,3;QT延長症候群1,2,2/9,2/5,(2遺伝子性),3,5および5、後天性、感受性;肺がん;リンパ浮腫、遺伝性、id;リンパ浮腫、原発性、骨髄異形成を伴う;リンパ増殖症候群1,1(X連鎖性)および2;リソソーム酸リパーゼ欠損症;大頭症、巨人症、顔面異形症候群;黄斑変性症、卵黄様、成人期に発症;悪性高熱感受性1型;悪性リンパ腫、非ホジキン;悪性黒色腫;前立腺の悪性腫瘍;下顎骨異形成症;A型またはB型リポジストロフィーを伴う下顎骨異形成症、非定型;下顎顔面異形成症、トレーチャー・コリンズ型、常染色体劣性;マンノース結合タンパク質欠乏症;メープルシロップ尿症1A型および3型;マルデン・ウォーカー様症候群;マルファン症候群;マリネスコ・Sj\xc3\xb6gren症候群;マートソフル(Martsolf)症候群;成熟期に発症する若年性糖尿病、1型,2型,11型,3型および9型;メイ・ヘグリン異常症;MYH9関連疾患;セバスチャン症候群;マキュン・オルブライト症候群;体細胞腺腫;性索-間質性腫瘍;クッシング症候群;マクシック・カウフマン症候群;マクラウド神経赤血球症症候群;メッケル・グルーバー症候群;中鎖アシル-補酵素A脱水素酵素欠損症;髄芽腫;皮質下嚢胞1および2aを伴う大脳白質脳症;大頭-先天性大理石様皮膚;PIK3CA関連過成長スペクトラム;巨脳-多小脳回-多指-水頭症候群2;巨大芽球性貧血、チアミン反応性、糖尿病および感音性難聴を伴う;マイヤー・ゴーリン症候群1および4;メルニック・ニードルズ症候群;髄膜腫;精神遅滞、X連鎖性、3,21,30および72;精神遅滞および小頭症、脳橋および小脳の低形成を伴う;X連鎖精神遅滞症候群5;精神遅滞、上顎前突、および斜視;精神遅滞、常染色体優性12,13,15,24,3,30,4,5,6および9;精神遅滞、常染色体劣性15,44,46および5;精神遅滞、定型動作、てんかん、および/または脳奇形;精神遅滞、症候群性、クラース・ジェンセン(Claes-Jensen)型、X連鎖性;精神遅滞、X連鎖、非特異的、症候性、ヘデラ(Hedera)型、および症候性、ウー(wu)型;メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー;異染性白質ジストロフィー若年型、乳児期後期型、および成人型;異染性白質ジストロフィー;変容性骨異形成症;メトヘモグロビン血症I型および2型;メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症、常染色体優性;ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症;メチルマロン酸尿症cblB型;メチルマロニル-CoAムターゼ欠損症に起因するメチルマロン酸尿症;メチルマロン酸尿症mut(0)型;小頭症性骨異形成原基性小人症2型;絨毛網膜症、リンパ浮腫、または精神遅滞の有無に関わらない小頭症;小頭症、裂孔ヘルニア、およびネフローゼ症候群;小頭症;脳梁の低形成症;痙性対麻痺50、常染色体劣性;全身性発育遅延;CNSミエリン形成不全症;脳萎縮;小頭症、正常な知能および免疫不全;小頭症-毛細血管奇形症候群;小球性貧血;症候群性小眼球症5,7および9;小眼球症、単独3,5,6,8、およびコロボマ6を伴う;微小球症;片頭痛、家族性片麻痺性;ミラー症候群;外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー;コアを伴う先天性ミオパチー;ミッチェル・ライリー症候群;ミトコンドリア3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA合成酵素欠損症;ミトコンドリア複合体I,II,III,III(核型2,4または8)欠損症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群11,12(心筋症型),2,4B(MNGIE型),8B(MNGIE型);ミトコンドリアDNA枯渇症候群3および7,肝脳型および13(脳筋症型);ミトコンドリアリン酸担体およびピルビン酸担体欠損症;ミトコンドリア三機能性タンパク質欠損症;長鎖3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症;三好型筋ジストロフィー1;遠位型ミオパチー、前脛骨発症を伴う;モーア・トラネジャーグ(Mohr-Tranebjaerg)症候群;モリブデン補因子欠損症、相補群A;モワット・ウィルソン症候群;ムコリピドーシスIIIガンマ;ムコ多糖症VI型,VI型(重症)およびVII型;ムコ多糖症、MPS-I-H/S,MPS-II,MPS-III-A,MPS-III-B,MPS-III-C、MPS-IV-A,MPS-IV-B;網膜色素変性症73;ガングリオシドーシスGM1型1(心臓障害を伴う)3;多中心性骨溶解腎症;多中心性骨溶解、結節症、および関節症;多発性先天異常;心房中隔欠損症2;多発性先天異常-筋緊張低下-発作症候群3;多発性の皮膚および粘膜静脈奇形;多発性内分泌腺新形成1型および4型;多発性骨端異形成症5型または優性;多発性腸管閉鎖症;多発性翼状片症候群エスコバール型;多発性スルファターゼ欠損症;多発性骨癒合症症候群3;筋AMPグアニンオキシダーゼ欠損症;筋眼脳疾患;筋ジストロフィー、先天性、巨円錐体型;筋無力症、家族性小児、1;アセチルコリン受容体欠損症に関連する、先天性筋無力症症候群11;先天性筋無力症症候群17,2A(スローチャネル),4B(ファストチャネル)および管状集合体を伴わない;ミエロペルオキシダーゼ欠損症;MYH関連ポリポーシス;子宮内膜癌;心筋梗塞1;ミオクローヌス性ジストニア;ミオクローヌス性-無緊張性てんかん;赤色ボロ繊維・ミオクローヌスてんかん;筋原線維ミオパチー1およびZASP関連;ミオグロビン尿、急性再発性、常染色体劣性;筋神経胃腸管性脳症症候群;進行性外眼筋麻痺を伴う小児小脳性運動失調症;ミトコンドリアDNA枯渇症候群4B、MNGIE型;ミオパチー、中心核、1、先天性、過剰の筋紡錘を伴う、遠位の、1、乳酸アシドーシス、および鉄芽球性貧血1、先天性白内障を伴うミトコンドリア進行性の、聴覚消失、および発育遅延、および管状集合体、2;近視6;筋硬化症、常染色体劣性;先天性筋強直症;先天性筋強直症、常染色体優性型および劣性型;爪膝蓋骨症候群;ナンス・ホラン症候群;小眼球症2;ナバホ神経肝障害;ネマリンミオパチー3および9;新生児筋緊張低下;知的障害;痙攣;言語発達遅延;精神遅滞、常染色体優性31;シトリン欠損症によって引き起こされる新生児肝内胆汁うっ滞;腎性尿崩症、腎性尿崩症、X連鎖性;腎結石症/骨粗鬆症、低リン酸血症性、2;ネフロン癆13,15および4;不妊症;脳-眼-腎症候群(ネフロン癆、眼球運動失効、および小脳異常);ネフローゼ症候群、3型,5型、眼球異常の有無に関わらない、7型および9型;ネスター・グレルモプロジェリア症候群;ノイ・ラクソバ(Neu-Laxova)症候群1;脳鉄蓄積を伴う神経変性症4および6;神経フェリチン症;神経線維腫症、1型および2型;神経線維肉腫;神経下垂体性尿崩症;ニューロパチー、遺伝性感覚性、IC型;中性1アミノ酸輸送障害;ミオパチーを伴う中性脂質蓄積症;好中球免疫不全症候群;ニコライデス・バライスター症候群;ニーマン・ピック病C1型,C2型,A型およびC1、成人型;非ケトーシス性高グリシン血症;ヌーナン症候群1および4、LEOPARD症候群1;若年性骨髄単球性白血病の有無に関わらないヌーナン症候群様障害;正常カリウム血性周期性四肢麻痺、カリウム感受性;ノルム病;てんかん、聴覚消失、および精神遅滞症候群;精神遅滞、X連鎖性102および症候性13;肥満;眼白子症、I型;眼皮膚白子症1B型,3型および4型;眼歯指異形成症;歯限局型低ホスファターゼ症;歯-毛髪-四肢症候群(Odontotrichomelic syndrome);大口病;減歯症-大腸直腸癌症候群;オピッツG/BBB症候群;視神経萎縮症9;口腔顔面指趾症候群;オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症;口腔顔面裂11および7、口唇/口蓋外胚葉異形成症候群;オルスタビック・リンデマン・ソルベルグ症候群;軽度の軟骨異形成症を伴う骨関節炎;離断性骨軟骨炎;骨形成不全症12型,5型,7型,8型,I型,III型、正常な強膜を伴う、優性型、劣性周産期致死性;頭蓋骨硬化症を伴う線条骨症;常染色体優性の大理石骨症1型および2型,劣性4型,劣性1型,劣性6型;偽神経膠腫を伴う骨粗鬆症;耳口蓋指症候群I型およびII型;卵巣形成不全1;卵巣白質脳症;先天性爪肥厚症4および2型;骨パジェット病、家族性;パリスター・ホール症候群;掌蹠角化症、非表皮剥離性、局所性またはびまん性;膵臓無形成および先天性心疾患;パピロン・Lef\xc3\xa8vre症候群;傍神経膠節腫3;フォン・オレインブルグ(von Eulenburg)の先天性異常筋強直症;副甲状腺癌;パーキンソン病14,15,19(若年性発症),2,20(早期発症),6,(常染色体劣性の早期発症)および9;限局性白皮証;ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ部分欠損症;網膜色素上皮の模様ジストロフィー;PC-K6a;ペリザウス・メルツバッハー病;ペンドレッド症候群;末梢性脱髄性神経障害、中枢性脱髄性;ヒルシュスプルング病;永続型新生児糖尿病;永続型新生児糖尿病、神経学的特色を伴う;新生児インスリン依存性糖尿病;若年発症成人型糖尿病、2型;ペルオキシソーム生合成障害14B,2A,4A,5B,6A,7Aおよび7B;ペロー症候群4;ペリー症候群;新生児の持続性高インスリン性低血糖症;家族性高インスリン症;表現型;フェニルケトン尿症;褐色細胞腫;遺伝性パラガングリオーマ-褐色細胞腫症候群;パラガングリオーマ1;腸のカルチノイド腫瘍;カウデン症候群3;ホスホグリセリン酸脱水素酵素欠損症;ホスホグリセリン酸キナーゼ1欠損症;光感受性硫黄欠乏性毛髪発育異常症;フィタン酸蓄積病;ピック病;ピアソン症候群;色素性網膜ジストロフィー;色素性結節状副腎皮質病変、原発性、1;石灰化上皮腫;ピット・ホプキンス症候群;下垂体依存性高コルチゾール症;下垂体ホルモン欠損症、複合型1,2,3および4;プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1型欠損症;プラスミノーゲン欠損症、I型;血小板型出血障害15および8;多形皮膚萎縮症、遺伝性線維化、腱性拘縮、ミオパチー、および肺線維症を伴う;多発性嚢胞腎疾患2、成人型および乳児型;硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症;免疫不全の有無に関わらないポリグルコサン体ミオパチー1;多小脳回、非対称性、両側性前頭頭頂部;多発性神経炎、聴覚消失、運動失調、網膜色素変性、および白内障;4型橋小脳形成不全症;膝窩部贅皮症候群;孔脳症2;汗孔角化症8、伝染性表層化学活性型;ポルフォビリノーゲン合成酵素欠損症;晩発性皮膚ポルフィリン症;網膜色素変性症を伴う脊髄後索性失調症;後極白内障2型;プラダー・ウィリー様症候群;早発卵巣不全4,5,7および9;原発性常染色体劣性小頭症10,2,3および5;原発性線毛機能不全24;原発性拡張
型心筋症;左心緻密化障害6;4、左心緻密化障害10;発作性心房細動;原発性高シュウ酸尿症、I型およびIII型;原発性肥大性骨関節症、常染色体劣性2;原発性低マグネシウム血症;原発性開放隅角緑内障若年発症1;原発性肺高血圧症;プリムローズ症候群;進行性家族性心ブロック1B型;進行性家族性肝内胆汁うっ滞2および3;進行性肝内胆汁うっ滞;運動失調症を伴う進行性ミオクローヌスてんかん;進行性偽リウマチ性異形成症;進行性硬化性灰白異栄養症;プロリダーゼ欠損症;プロリン脱水素酵素欠損症;統合失調症4;プロパジン欠損症、X連鎖性;プロピオン酸血症;プロタンパク質変換酵素1/3欠損症;前立腺がん、遺伝性、2;プロタン欠損症;蛋白尿;フィンランド型先天性ネフローゼ症候群;プロテウス症候群;乳腺癌;偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成症;偽性低アルドステロン症1型常染色体優性および劣性および2型;偽性副甲状腺機能低下症1A型;偽性偽性副甲状腺機能低下症;仮性新生児副腎白質ジストロフィー;偽原発性高アルドステロン症;弾性線維性仮性黄色腫;乳児の全身性動脈石灰化症2;多発性凝固因子欠損症を伴う弾性線維性仮性黄色腫様障害;乾癬感受性2;PTEN過誤腫症候群;遺伝性出血性毛細血管拡張症に関連する肺動脈性高血圧症;肺線維症および/または骨髄不全、テロメアに関連する、1および3;遺伝性出血性毛細血管拡張症を伴う、肺高血圧症、原発性、1;プリン-ヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症;ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症;ピルビン酸脱水素酵素E1-アルファ欠損症;赤血球のピルビン酸キナーゼ欠損症;レイン症候群;ラスオパチー;劣性栄養障害性表皮水疱症;爪障害、非症候性先天性、8;ライフェンスタイン症候群;腎欠損症;腎カルニチン輸送障害;腎コロボマ症候群;腎異形成症;腎異形成症、網膜色素性ジストロフィー、小脳性運動失調症、および骨格異形成症;遅発性感音性聴覚消失を伴うか、または溶血性貧血を伴う、腎尿細管性アシドーシス、遠位型、常染色体劣性;眼球異常および精神遅滞を伴う、腎尿細管性アシドーシス、近位型;網膜錐体ジストロフィー3B;網膜色素変性症;網膜色素変性症10,11,12,14,15,17および19;網膜色素変性症2,20,25,35,36,38,39,4,40,43,45,48,66,7,70,72;網膜芽細胞腫;レット障害;ラブドイド腫瘍素因症候群2;裂孔原生網膜剥離、常染色体優性;肢根型点状軟骨異形成症2型および3型;ロバーツ-SCあざらし肢奇形症候群;ロビノー・ソラウフ(Robinow Sorauf)症候群;ロビノー症候群、常染色体劣性、短合多指症を伴う常染色体劣性;ロスムンド・トムソン症候群;ラパデリノ症候群;RRM2B関連ミトコンドリア病;ルービンシュタイン・タイビ症候群;サラ病;サンドホフ病、成人型および乳児型;サルコイドーシス、早期発症;ブラウ症候群;シンドラー病、1型;裂脳症;統合失調症15;蝸牛様骨盤異形成症;神経鞘腫症2;シュワルツ・ヤンペル症候群1型;角膜硬化、常染色体劣性;硬結性骨化症;二次性甲状腺機能低下症;瀬川症候群、常染色体劣性;セニオール・ローケン症候群4および5;感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺;セピアプテリン還元酵素欠損症;SeSAME症候群;小頭症、成長遅延、電離放射線感受性を伴う、ADA欠損症に起因する重症複合免疫不全症、非定型、常染色体劣性、T細胞陰性、B細胞陽性、NK細胞陽性のNK細胞陰性;重症先天性好中球減少症;重症先天性好中球減少症3、常染色体劣性または優性;重症先天性好中球減少症および6、常染色体劣性;乳児期の重篤なミオクロニーてんかん;熱性痙攣プラスの全般てんかん、1型および2型;重篤なX連鎖性筋細管ミオパチー;QT短縮症候群3型;非特異的な骨格異常を伴う低身長;低身長、耳道狭窄症、下顎形成不全、骨格異常;低身長、爪甲形成不全、顔異形、および貧毛症;原基性小人症;多指症の有無に関わらない短肋胸郭異形成症11または3;シアリドーシスI型およびII型;シルバー痙性対麻痺症候群;神経伝導速度遅延、常染色体優性;スミス・レムリ・オピッツ症候群;スナイダー・ロビンソン症候群;成長ホルモン分泌腺腫;プロラクチノーマ;家族性、下垂体腺腫素因;ソトス症候群1または2;痙性失調症5、常染色体劣性、シャルルボワ・サグネ型、1,10または11、常染色体劣性;筋萎縮性側索硬化症5型;痙性対麻痺15,2,3,35,39,4、常染色体優性、55、常染色体劣性、および5A;胆汁酸合成障害、先天性、3;精子形成不全11,3および8;球状赤血球症4型および5型;球状体ミオパチー;脊髄性筋萎縮症、下肢優位2、常染色体優性;脊髄性筋萎縮症、II型;脊髄小脳失調症14,21,35,40および6;脊髄小脳失調症、常染色体劣性1および16;脾臓低形成;脊椎手根骨足根骨癒合症候群;脊椎手掌異形成、エーラス・ダンロス症候群様、免疫調節異常を伴う、アグリカン型、先天性関節脱臼を伴う、短肢-手型、セダガッテン(Sedaghatian)型、錐体桿体ジストロフィーを伴う、およびコズロウスキー型; 捩れ小人症;シュタルガルト病1;錐体桿体ジストロフィー3;スティックラー症候群1型;クニースト(Kniest)異形成症;スティックラー症候群、1型(非症候性眼性)および4型;スティング関連脈管障害、小児期発症;ストームオルケン症候群;スタージ・ウェーバー症候群、毛細血管奇形、先天性、1;サクシニル-CoAアセト酢酸転移酵素欠損症;スクラーゼ-イソマルターゼ欠損症;乳児突然死症候群;亜硫酸酸化酵素欠損症、独立型;大動脈弁上狭窄;肺サーファクタント代謝機能障害、2および3;指節癒合症、近位、1b;セナニー・レンツ型合指症;3型合指症;症候性X連鎖性精神遅滞16;内反尖足;タンジール病;TARP症候群;テイ・サックス病、B1バリアント、Gm2ガングリオシドーシス(成人)、Gm2ガングリオシドーシス(成人発症);テムタリー(Temtamy)症候群;テノリオ症候群;肢端骨異形成;テストステロン17-ベータ-デヒドロゲナーゼ欠損症;無四肢症、常染色体劣性;ファロー四徴症;左心低形成症候群2;動脈瘤;心臓および大血管の奇形;心室中隔欠損症1;ティール・ベーンケ(Thiel-Behnke)角膜ジストロフィー;胸部大動脈瘤および大動脈解離;マルファン様体型;3M症候群2;血小板減少症、血小板機能障害、溶血、およびグロビン合成不均衡;血小板減少症、X連鎖性;血栓症、遺伝性、プロテインC欠損症に起因、常染色体優性および劣性;甲状腺無形成;甲状腺がん、濾胞性;甲状腺ホルモン代謝異常;甲状腺ホルモン抵抗性、汎発性、常染色体優性;甲状腺中毒性周期性四肢麻痺および甲状腺中毒性周期性四肢麻痺2;サイトロピン放出ホルモン抵抗性、汎発性;チモシー症候群;TNF受容体関連周期熱症候群(TRAPS);歯無発生、選択的、3および4;多形性心室頻拍(Torsades de pointes);タウンズ・ブロックス鰓弓耳腎様症候群;新生児の一過性表皮水疱症;トリーチャー・コリンズ症候群1;精神遅滞、小人症、および網膜の色素変性を伴う長睫毛症;三叉神経節異形成症I型;三叉神経節症候群3型;トリメチルアミン尿症;結節性硬化症症候群;リンパ管筋腫症;結節性硬化症1および2;チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症;チロシナーゼ陽性眼皮膚白皮症;チロシン血症I型;UDPグルコース-4-エピメラーゼ欠損症;ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー;重度の四肢欠損を伴う尺骨・腓骨欠損症;アップショー・シュールマン症候群;ウロカニン酸加水酵素欠損症;アッシャー症候群、1型,1B型,1D型,1G型,2A型,2C型および2D型;網膜色素変性症39;紫外線感受性症候群;ファン・デル・ウーデ(Van der Woude)症候群;ヴァン・マルダーゲム(Van Maldergem)症候群2;ヘンカムリンパ管拡張症-リンパ浮腫症候群2;異型ポルフィリン症;嚢胞性腎疾患を伴う脳室拡大;ヴェルヘイ(Verheij)症候群;超長鎖アシル-CoA脱水素酵素欠損症;膀胱尿管逆流症8;内臓逆位5、常染色体;腹部ミオパチー;ビタミンD依存性くる病、1型および2型;卵黄型ジストロフィー;フォン・ヴィルブランド病2M型および3型;ワールデンブルグ症候群1型,4C型および2E型(神経学的病変を伴う);クライン・ワールデンブルグ症候群;ウォーカー・ワールブルグ先天性筋ジストロフィー;ワールブルグ・マイクロ症候群2および4;イボ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留;ウィーバー症候群;ヴァイユ・マルケザーニ症候群1および3;ヴァイユ・マルケザーニ様症候群;ワイセンバッハー・ツウェイミュラー(Weissenbacher-Zweymuller)症候群;ウェルドニッヒ・ホフマン病;シャルコー・マリー・トゥース病;ウェルナー症候群;WFS1関連障害;ウィデマン・スタイナー症候群;ウィルソン病;ウォルフラム様症候群、常染色体優性;ワース(Worth)病;ファン・ブッヘム病2型;色素性乾皮症、相補群b,群D,群Eおよび群G;X連鎖無ガンマグロブリン血症;X連鎖性 遺伝性運動感覚性ニューロパチー;ステリルスルファターゼ欠損症を伴うX連鎖性魚鱗癬;X連鎖性脳室周囲異所性灰白質;耳口蓋指症候群、I型;X連鎖性重症複合免疫不全症;チンメルマン・レーバンド(Zimmermann-Laband)症候群およびチンメルマン・レーバンド症候群2;ならびに小帯(Zonular)粉状白内障3。
トリヌクレオチド反復拡大は、ハンチントン病、脆弱X症候群、およびフリードライヒ運動失調症を包含するいくつものヒト疾患に関連する。最も普通のトリヌクレオチド反復はCAGトリプレットを含有するが、GAAトリプレット(フリードライヒ運動失調症)およびCGGトリプレット(脆弱X症候群)もまた生起する。拡大の素因を受け継ぐことまたはすでに伸長した親のアレルを獲得することは、疾患を獲得する蓋然性を増大させる。トリヌクレオチド反復の病原性の拡大は仮説上はプライム編集を用いて修正され得る。
プライム編集は、疾患の過程においてミスフォールディングされるようになるプリオンタンパク質(PRNP)上への1つ以上の防護性変異の組み入れによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させるためにもまた用いられ得る。プリオン病または伝達性海綿状脳症(TSE)は、ヒトおよび動物両方を冒す稀な進行性の神経変性障害のファミリーである。それらは、長い潜伏期間、ニューロン喪失に関連する特徴的な海綿状変化、および炎症性応答を誘導することの失敗によって見分けられる。
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPV(配列番号291)。
GCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGATGAGGAAGGTCTTCCTGTTTTCACCATCTTTCTAATCTTTTTCCAGCTTGAGGGAGGCGGTATCCACCTGCAGCCCTTTTAGTGGTGGTGTCTCACTCTTTCTTCTCTCTTTGTCCCGGATAGGCTAATCAATACCCTTGGCACTGATGGGCACTGGAAAACATAGAGTAGACCTGAGATGCTGGTCAAGCCCCCTTTGATTGAGTTCATCATGAGCCGTTGCTAATGCCAGGCCAGTAAAAGTATAACAGCAAATAACCATTGGTTAATCTGGACTTATTTTTGGACTTAGTGCAACAGGTTGAGGCTAAAACAAATCTCAGAACAGTCTGAAATACCTTTGCCTGGATACCTCTGGCTCCTTCAGCAGCTAGAGCTCAGTATACTAATGCCCTATCTTAGTAGAGATTTCATAGCTATTTAGAGATATTTTCCATTTTAAGAAAACCCGACAACATTTCTGCCAGGTTTGTTAGGAGGCCACATGATACTTATTCAAAAAAATCCTAGAGATTCTTAGCTCTTGGGATGCAGGCTCAGCCCGCTGGAGCATGAGCTCTGTGTGTACCGAGAACTGGGGTGATGTTTTACTTTTCACAGTATGGGCTACACAGCAGCTGTTCAACAAGAGTAAATATTGTCACAACACTGAACCTCTGGCTAGAGGACATATTCACAGTGAACATAACTGTAACATATATGAAAGGCTTCTGGGACTTGAAATCAAATGTTTGGGAATGGTGCCCTTGGAGGCAACCTCCCATTTTAGATGTTTAAAGGACCCTATATGTGGCATTCCTTTCTTTAAACTATAGGTAATTAAGGCAGCTGAAAAGTAAATTGCCTTCTAGACACTGAAGGCAAATCTCCTTTGTCCATTTACCTGGAAACCAGAATGATTTTGACATACAGGAGAGCTGCAGTTGTGAAAGCACCATCATCATAGAGGATGATGTAATTAAAAAATGGTCAGTGTGCAAAGAAAAGAACTGCTTGCATTTCTTTATTTCTGTCTCATAATTGTCAAAAACCAGAATTAGGTCAAGTTCATAGTTTCTGTAATTGGCTTTTGAATCAAAGAATAGGGAGACAATCTAAAAAATATCTTAGGTTGGAGATGACAGAAATATGATTGATTTGAAGTGGAAAAAGAAATTCTGTTAATGTTAATTAAAGTAAAATTATTCCCTGAATTGTTTGATATTGTCACCTAGCAGATATGTATTACTTTTCTGCAATGTTATTATTGGCTTGCACTTTGTGAGTATTCTATGTAAAAATATATATGTATATAAAATATATATTGCATAGGACAGACTTAGGAGTTTTGTTTAGAGCAGTTAACATCTGAAGTGTCTAATGCATTAACTTTTGTAAGGTACTGAATACTTAATATGTGGGAAACCCTTTTGCGTGGTCCTTAGGCTTACAATGTGCACTGAATCGTTTCATGTAAGAATCCAAAGTGGACACCATTAACAGGTCTTTGAAATATGCATGTACTTTATATTTTCTATATTTGTAACTTTGCATGTTCTTGTTTTGTTATATAAAAAAATTGTAAATGTTTAATATCTGACTGAAATTAAACGAGCGAAGATGAGCACCA(配列番号292)
他の本開示の側面は、本明細書に記載のプライム編集系の様々な構成要素のいずれも(例として、これらに限定されないが、napDNAbp、逆転写酵素、融合タンパク質(例として、napDNAbpsと逆転写酵素とを含む)、伸長されたガイドRNA、および融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含む複合体、ならびに第2鎖へニックを入れる構成要素および5'内生DNAフラップ除去エンドヌクレアーゼなどの、編集済産物形成へのプライム編集プロセスを推進するのに役立つ付属要素を包含する)含む医薬組成物に関する。
キット
本開示の組成物は、キット中へ集められ得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載のプライム編集因子の発現のための核酸ベクターを含む。他の態様において、キットはさらに、適切なガイドヌクレオチド配列(例として、PEgRNAおよび第2部位gRNA)、またはかかるガイドヌクレオチド配列(Cas9タンパク質またはプライム編集因子に所望の標的配列を標的にさせる)の発現のための核酸ベクターを含む。
本明細書に記載の組成物のいずれも含有していてもよい細胞は、原核細胞および真核細胞を包含する。本明細書に記載の方法は、Cas9タンパク質またはプライム編集因子を真核細胞(例として、ヒト細胞などの哺乳動物の細胞)中へ送達するのに使用される。いくつかの態様において、細胞は、in vitroにある(例として、培養された細胞)。いくつかの態様において、細胞は、in vivoにある(例として、ヒト対象などの対象中にある)。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoにある(例として、対象から単離され、同じ対象へ戻すかまたは異なる対象へ投与されてもよい)。
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載のプライム編集因子またはその構成要素(例として、分裂Cas9タンパク質もしくは分裂核酸塩基プライム編集因子)の細胞中への送達のための、組換えウイルスベクター(例として、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター)の使用に関する。分裂-PEアプローチのケースにおいて、全長Cas9タンパク質またはプライム編集因子が様々なウイルスベクター(例として、rAAV(~4.9kb))のパッケージング限界を超えることから、PE融合タンパク質のN末端部分およびPE融合のC末端部分は、別々の組換えウイルスベクター(例として、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター)によって同じ細胞中へ送達される。
いくつかの側面において、本発明は、それらの1以上の転写産物、および/またはそれらから転写される1以上のタンパク質をコードする1以上のベクターなどの、本明細書に記載のとおりの1以上のポリヌクレオチドを宿主細胞へ送達することを含む方法を提供する。いくつかの側面において、本発明はさらに、かかる方法によって産生される細胞、およびかかる細胞を含むかまたはかかる細胞から産生される生物(動物、植物、もしくは真菌など)を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの塩基編集因子は、ガイド配列と組み合わせて(任意にこれと複合化されて)、細胞へ送達される。
例1.ゲノム中に正確なヌクレオチド変化を組み入れるためのプライム編集(PE)
目的は、正確なゲノム編集の変革技術を開発すること、および哺乳動物ゲノム中の単一ヌクレオチドの変化の組み入れを生成することである。この技術は、研究者らに、事実上いずれの哺乳動物遺伝子においても、単一ヌクレオチドのバリエーションの効果を研究できるようにさせ、ヒト患者における病原性の点突然変異を修正するための治療的介入を潜在的に可能にさせるであろう。
変異誘発DNA鎖の、ガイドRNAを鋳型にした逆転写を確立する。先行研究によって、DNA切断の後であって複合体解離の前に、Cas9が非標的DNA鎖を放出して遊離の3'末端を晒すことが示された。このDNA鎖が、ポリメラーゼ酵素による伸長へアクセス可能であって、gRNAが、それらの5'末端または3'末端の伸長を通してDNA合成の鋳型として働くよう改変され得るものと仮定する。in vitroでの予備研究において、Cas9:gRNA結合複合体内のニックが入ったDNA鎖が、結合したgRNAを鋳型として使用する逆転写(transのRT酵素)を実際にプライムし得ることが確立された。次に、種々のgRNAリンカー、プライマー結合部位、および合成鋳型を、in vitroでの最適なデザイン規則を決定するために詳しく研究する。次いで、transで作用するかまたはCas9との融合体として作用する種々のRT酵素をin vitroで評価する。最終的に、細胞中の効率的な結合および切断活性を保持する改変gRNAデザインを同定する。これを目的とした実証実験の成功によって、細胞中の変異誘発鎖合成を遂行するための基盤が提供される。
ヒト細胞中のプライム編集を確立する。DNAプロセシングおよび修復機序に基づき、変異誘発DNA鎖(単鎖フラップ)は、標的ヌクレオチドの特異的かつ効率的な編集に向かうのに使用し得るものと仮定する。有望な予備研究において、このストラテジーの実現性を、変異誘発フラップを含有するモデルプラスミド基質での編集を実証することによって確立した。目的1と同時に、修復成果を、変異誘発フラップの長さ、配列組成、標的ヌクレオチドの同一性、および3'末端を系統的に変動させることによってさらに評価する。1~3ヌクレオチドの小さい挿入および欠失もまた試験する。目的1と並行して目的1から組み立て、融合タンパク質および非共有結合動員ストラテジーを包含するCas9-RT構造を評価する。Cas9-RT構造および伸長されたgRNAを、ヒトゲノム中の複数の標的部位での細胞の編集についてアッセイし、次いで高効率のために最適化する。成功した場合、この目的によって、基礎科学への適用のためのTPRTゲノム編集(すなわち、プライム編集)が即時に確立される。
培養ヒト細胞中の病原性の突然変異の部位特異的編集を達成する。この技術の潜在的な普遍性は、目下BEによっては修正不能なトランスバージョン突然変異およびインデルの編集を可能にし得る。目的1および目的2の結果によって導かれて、鎌状赤血球病の創始者突然変異をベータグロビン中に(修正にはA・T→T・Aトランスバージョンを要する)および最も蔓延しているウィルソン病の突然変異をATP7B中に(修正にはG・C→T・Aトランスバージョンを要する)包含する培養ヒト細胞中の病原性のトランスバージョン突然変異を標的にする。嚢胞性線維症を引き起こすCFTR中の3ヌクレオチド△F508欠失を包含する、小さい挿入および欠失の突然変異の修正もまた調べる。成功した場合、これは、これらの重要なヒト疾患に対処する強力な治療的アプローチを開発するための基盤を据える。
目標は、標的にされたゲノム部位にて点突然変異を直接組み入れるゲノム編集ストラテジーを開発することである。技術開発段階において、CRISPR/Cas系中へTPRT機能性を組み込む努力が、タンパク質およびRNA工学に注がれる。TPRTの各ステップの機能を慎重に探り、基礎から組み立てるのにIn vitroアッセイを使用する(目的1)。第2集中領域は、モデル基質と改変CRISPR/Cas系との組み合わせを使用して哺乳動物の細胞中の編集成果を評価する(目的2)。最終的に、適用段階は、他の方法によるゲノム編集では解決困難な突然変異を修正する技術を使用する(目的3)。
背景および論拠
提案されたゲノム編集ストラテジーにおいて、Cas9によってニックが入れられた非標的DNA鎖(Rループを形成するPAM含有鎖)は、DNA合成のためのプライマーとして作用する。これは生化学的データおよび構造のデータの数種の実例(pieces)に基づき起こり得るものと仮定される。ヌクレアーゼ保護実験32、結晶学的研究33、および塩基編集窓4,24は、Cas9結合複合体の所謂Rループ内の非標的鎖ヌクレオチド-20~-10について、柔軟性および障害のかなりの程度を実証した(ナンバリングは第1PAMヌクレオチドの5'からの距離を示す)。その上、相補的なssDNAが加えられたとき、切断された非標的鎖のPAM遠位部分は、緊密に結合した3元複合体から外され得る20。これらの研究によって、非標的鎖が高度に柔軟であって酵素へのアクセスが可能であること、およびニックが入った後にPAM遠位フラグメントの3'末端がCas9解離に先立ち放出されることが支持される。さらにまた、gRNAが、鋳型DNA合成まで伸長され得るものと仮定される。先行研究によって、SpCas9、SaCas9、およびLbCas12a(かつてはCpf1)のためのgRNAが、RNAアプタマー34、リガンド誘導性自己切断型リボザイム35、および長鎖ノンコーディングRNA36でのgRNA伸長を許容することが示された。生かされる2つの主要な特色に対し、この文献によって前例が確立される。このストラテジーの査定において、数種のCRISPR-Cas系を、in vitroでのアッセイと細胞アッセイとの組み合わせを使用し5'および3'伸長されたgRNAデザインと併せて評価する(図2A~2C)。
Cas9によってニックが入れられたDNAは、gRNA鋳型の逆転写をプライムする。ニックが入れられた非標的DNA鎖へのアクセス可能性を評価するため、in vitroでの生化学的アッセイを、S.pyogenes(SpCas9)からのCas9ヌクレアーゼおよびCy5蛍光標識二重鎖DNA基質(51塩基対)を使用して実施した。第1に、合成鋳型の長さが変動する一連の5'伸長含有gRNAを、in vitroでの転写によって調製した(全体的なデザインは図2Bに示される)。ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって、5'伸長されたgRNAが標的への結合親和性を維持することが確立された(データは示さず)。次に、TPRT活性を、dCas9、5'伸長されたgRNA、およびモロニー-マウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(Superscript III)を使用して、予めニックが入れられたCy5標識二重鎖DNA基質に対し試験した。37℃での1時間のインキュベーション後、産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって評価し、Cy5蛍光を使用して撮像した(図4A)。5'伸長されたgRNAバリアントは各々、有意な産物形成をもたらし、観察されたDNA産物サイズは伸長鋳型の長さと一致した(図4B)。重要なことに、dCas9の不在下で、予めニックが入れられた基質はDNA基質の全長51bpまで伸長されたが、これは相補的なDNA鎖(gRNAではない)が、dCas9が存在しないときにDNA合成のための鋳型として使用されたことを強く示唆する(図4C)。注目すべきは、新しく合成されたDNA鎖が、標的部位の編集に要求される産物(単一ヌクレオチドの変化と相同の鎖)を映し出す(mirrors)ように、系をデザインした。この結果は、Cas9:gRNA結合によってニックが入れられた非標的鎖の3'末が晒されること、および非標的鎖が逆転写へアクセス可能であることを確立する。
先のセクションにおいて提示されたものと同様の実験を、S.aureusからのCas9およびL.bacteriumからCas12aを包含する他のCas系を使用して、遂行する(図2A~2Cを参照)。TRPTもまた、これらのCasバリアントについて実証され得る場合、潜在的な編集範囲および細胞において全般的に成功する可能性が増大するであろう。
第1に、商業的に入手可能または精製可能な一連のRT酵素をTPRT活性についてtransで評価する。M-MLVからの既に試験されたRTに加えて、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)、Geobacillus stearothermophilusグループIIイントロン(GsI-IIC)41,42、およびEubacterium rectaleグループIIイントロン(Eu.re.I2)43,44からのRTを評価する。有意に、後者2つのRTは、それら天然の生物学的な文脈において、TPRTを実施する。関係のある場合、RNAse不活性化突然変異および他の潜在的に有益なRT酵素修飾も試験する。transで供給されたとき機能的RTが同定されたら、各々を融合タンパク質としてCas9バリアントに対し評価する。N末端融合配向とC末端融合配向との両方を、様々なリンカー長さおよび構造と併せて試験する。速度論的な時間経過実験を、TPRTがRT酵素をcisで使用して生じ得るか決定するのに使用する。効率的なTPRT化学を可能にするRT-Cas9融合構造体が構築され得る場合、これは、細胞という文脈における機能的編集の可能性を大いに増大するであろう。
先の副目的(sub-aims)において開発された改変gRNA候補を、Cas9標的化効率を確認するため、ヒト細胞培養実験(HEK293)において評価する。野生型SpCas9を採用する、確立されたインデル形成アッセイ45を使用して、改変gRNAを、ヒトゲノム中5部位またはそれ以上の部位にわたり、標準のgRNAと並べて(side-by-side)比較する。ゲノム編集効率を、実験室に収納されているIllumina MiSeqプラットホームを使用する多重アンプリコン配列決定によって特徴付ける。本セクションおよび先行するセクションからの結果から、これに続くデザイン-組み立て-試験サイクルの反復(iterations)という情報を与える洞察力が生み出されることが予想されるが、ここでgRNAは細胞中、逆転写の鋳型化と効率的なCas9標的化との両方に最適化され得る。
(1)RTは、融合体としては機能しない:分子密集および/または好ましくない形状(geometries)は、Cas9融合RT酵素によるポリメラーゼ伸長を妨げ得る。第1に、リンカー最適化は試験できる。DNAプライマーとgRNAとRT酵素との間の空間的な関係性を再配向し得るCas9の循環置換バリアントを評価する。目的2に詳述したとおりの非共有結合のRT動員ストラテジーは試験できる。(2)伸長されたgRNAバリアントによって減少したCas標的化効率:これは、最も5'伸長されたgRNAの問題点になり得るものである。構造データ24に基づき、Cas9突然変異体をデザイン、スクリーニングし、gRNA伸長に対してより耐性があるバリアントを同定できる。加えて、gRNAライブラリは、標的化活性を改善するリンカーについて細胞中でスクリーニングできる。
これらの予備実験結果は、Cas9ニッカーゼおよび伸長されたgRNAが、transで供給された逆転写酵素を使用して、結合したDNA標的上、標的にプライムされた逆転写を開始し得ることを確立する。重要なことに、Cas9結合は、産物形成にとって極めて重要であることが見出された。おそらく細胞中のゲノム編集にとって絶対的な要件ではないが、RT酵素機能をcisで組み込む系のさらなる開発は、細胞ベースの適用において成功する可能性を有意に増大させるであろう。この目的の残りの側面を達成すると、ヒトゲノムという文脈における高精度ゲノム編集を遂行するための分子基盤が提供されるであろう。
背景および論拠
提案のストラテジーにおいて、改変RT-Cas9:gRNA複合体は、変異誘発3'DNAフラップをゲノムの標的部位にて導入する。単一ミスマッチを含有する変異誘発3'フラップは、エネルギー的に利用しやすい隣接5'フラップ(これは優先的に除去される)との平衡を通して、DNA修復機構によって組み込まれるものと仮定する(図1C~1D)。DNA複製および修復機構は、岡崎フラグメントをプロセシングするとき46かつ長いパッチの塩基切除修復(LP-BER)の最中47、5'ssDNAフラップに遭遇する。5'フラップは、幅広く発現されるフラップエンドヌクレアーゼFEN1の好ましい基質であって、前記酵素は、ホモ三量体のスライド型(sliding)クランプ複合体PCNAによってDNA修復部位へ動員される48。PCNAはまた、他の修復因子(DNAリガーゼLig1を包含する)も同時に動員するための骨格としても働く49。PCNAは、「ツールベルト(toolbelt)」として作用すると、細胞分裂の最中ごとに生成される数百万の岡崎フラグメントをプロセシングするのに不可欠である連続フラップ切断およびライゲーションを加速させる50,51。これら天然のDNA中間体との類似点に基づき、変異誘発鎖は、5'フラップとの平衡、これに続く5'フラップ切除とライゲーションとの連携を通して組み込まれるものと仮定される。次いで、ミスマッチ修復(MMR)が、いずれかの鎖上に等しい確率で生じるはずであって、編集または復元へ繋がる(図1C~1D)。代替的に、DNA複製が最初に生じ、新しく合成された娘鎖中の編集の組み込みへ直接繋がり得る。このプロセスから期待される最も高い収率は50%ではあるが、複数の基質編集を試みることによって、編集修復の不可逆性に起因して完成へ向かう反応が推進され得る。
DNAフラップは、酵母およびHEK細胞中のプラスミドモデル基質中に部位特異的変異誘発を包含する。提案の編集ストラテジーを試験するため、TPRT産物と似ている変異誘発3'フラップ含有モデルプラスミド基質で研究を始めた。GFPとmCherryとの間に停止コドンをコードする二重蛍光タンパク質レポーターを創出した。変異誘発フラップは停止コドンへの修正をコードしており(図9A)、mCherry合成を可能にさせる。よって、変異誘発効率はGFP:mCherry比率によって定量化できる。プラスミド基質をin vitroで調製し、酵母(S.cerevisiae)またはヒト細胞(HEK293)中へ導入した。高頻度変異誘発が両系ともに観察され(図9B)、単離された酵母コロニーは、元の状態の(reverted)塩基、突然変異塩基、または両産物の混合物のいずれかを含有していた(図9C)。後者の検出は、これらのケースにおいてプラスミド複製がMMRに先立ち生じたことを示唆し、さらに、フラップ切除およびライゲーションがMMRに先行することを示唆する。この結果は、3'変異誘発鎖を使用するDNA編集の実現性を確立する。
上に記載の予備実験結果に基づき、効率的な編集の原理を推察するため、より広範囲のフラップ基質をHEK細胞において評価する。ミスマッチ対形成の影響、フラップに沿った変異誘発ヌクレオチドの場所、および末端ヌクレオチドの同一性を決定するため、3'ssDNAフラップを系統的に変動させる(図9D)。単一ヌクレオチドの挿入および欠失もまた試験する。編集高精度を分析するため、アンプリコン配列決定を使用する。これらの結果は、gRNA逆転写鋳型のデザイン情報を与えるのに役立つ。
先の目的から最適化された構築物を、哺乳動物発現およびヒトゲノム中の標的部位での編集のために適合させる。複数のRT酵素および融合構造体を、2次gRNA(ニックが入れられるのを防止するためにトランケートされた)での隣接標的化に加えて、試験する。非共有結合のRT動員もまた、Sun-Tag系52およびMS2アプタマー系53を使用して評価する。インデル形成アッセイを、標準のgRNAおよびRT-Cas9融合体(上のとおり)での標的化効率を評価するのに使用する。次いで、各ゲノムの部位について、伸長されたgRNAとRT-Cas9との対を、単一ヌクレオチドの編集についてアッセイする。編集成果をMiSeqで評価する。
細胞中でプライム編集を実施できるCas9-RT構造体を同定した後、構成要素およびデザインを、高効率編集を達成するのに最適化する。コードされた点突然変異の場所およびヌクレオチド同一性、ならびに新しく合成されたDNA鎖の全長を、編集範囲および潜在的な欠点を評価するために変動させる。短い挿入および欠失の突然変異もまた評価する。タンパク質発現構築物をコドン最適化する。成功した場合、これは、哺乳動物細胞中の効率的なプライム編集を確立するであろう。
万一、融合RT酵素による分子内逆転写が起こり得なかったという場合には、追加のgRNAを、RT酵素が編集遺伝子座にてより高い局所濃度になるようデザインした。これらの補助ガイドを5'末にてトランケートするが(14~15ntスペーサー)、これによってCas9切断は防止されるが結合は保持されることがこれまでに示されている(図16を参照)。HEK3遺伝子座を、このストラテジーを探索するために選んだ。
(1)細胞中のgRNA分解:伸長されたgRNA末端が細胞中でトランケートされた場合、安定化2次構造を組み入れるか、または安定化修飾をもつ合成gRNAを試験できる。(2)ヒト細胞中で編集が観察されない:RT-Cas9融合体の隣接ゲノム部位への2次標的化を包含する、追加のストラテジーを探索する54。加えて、E.coliまたはS.cerevisiae中の潜在的な指向進化ストラテジーも探索できる。
プライム編集を実験の細胞株中で確立できた場合、これは、ヒト遺伝子中の多数の点突然変異の迅速な生成および特徴付けを可能にすることによって、生物医学の基礎研究に直接の影響を有するであろう。塩基編集因子に関する方法の一般論、およびその直交する編集窓は、目下アクセス不能な多くの突然変異を取り入れるアプローチを提供する。その上、プライム編集を高い効率および産物純度に最適化できた場合、他のヒト細胞型中の疾患突然変異を修正することへのその潜在的な適用性は意義深い。
背景および論拠。
予備実験結果。
●HEK3細胞中のT→A編集は、最新の塩基編集では達成できないが、TRPT編集では達成できる(図17A~17Cを参照)。
図18は、ハイスループットアンプリコン配列決定による配列決定分析の入力を示す。入力は、編集済細胞の最も豊富な遺伝子型を表示する。注目すべきことに、主要なインデル産物は得られず、所望の点突然変異(T→A)は、バイスタンダー編集をせずとも明確に取り入れられる。第1配列は参照遺伝子型を示す。上側2つの産物は、内生多型を含有する出発遺伝子型(GまたはA)である。下側2つの産物は、修正して編集された遺伝子型を表す。
Baranauskasら(doi:10.1093/protein/gzs034)に記載される突然変異逆転写酵素を、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞中の標的ヌクレオチド編集について、Cas9(H840A)ニッカーゼとのC末端融合体として試験した。Cas9-RT編集因子プラスミドを、逆転写の鋳型となる3'プライム編集ガイドRNAをコードするプラスミドとともに共トランスフェクトした。図19において標的ヌクレオチドでの編集効率(青色バー)を、インデル率(オレンジ色バー)と並べて示す。WTは野生型MLV RT酵素を指す。突然変異酵素(M1~M4)は、右に列挙された突然変異を含有する。編集率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。
この実験は、単鎖ニックが、標的ヌクレオチドに近接する相補的なDNA鎖中に導入されたときの、標的ヌクレオチドの編集効率を評価する(これがミスマッチ修復へ指向して、元のヌクレオチドを優先的に除去しかつ塩基対を所望の編集へ変換するとの仮説から)。Cas9(H840A)-RT編集構築物を、2つのガイドRNA(その一方が逆転写反応の鋳型になり、他方が、ニックを入れるための相補的なDNA鎖を標的にする)をコードするプラスミドとともに共トランスフェクトした。標的ヌクレオチドから様々な距離にてニックを入れることを試験した(オレンジ色三角形)(図20を参照)。標的塩基対での編集効率(青色バー)を、インデル率(オレンジ色バー)と並べて示す。「なし」の例は、相補鎖へニックを入れるガイドRNAを含有しない。編集率をゲノムDNAアンプリコンのハイスループット配列決定によって定量化した。
新しい編集技術のための潜在的な範囲を図13に示し、デアミナーゼ媒介の塩基編集因子技術と比較する。これまでに開発された塩基編集因子は、PAMの上流、~15±2bp領域を標的にする。標的CまたはAヌクレオチドを夫々、TまたはGへ変換することによって、これまでに開発された塩基編集因子は、すべてのトランジション突然変異(A:T→G:C変換)を可能にする。しかしながら、これまでに開発された塩基編集因子は、トランスバージョン突然変異(A→T、A→C、G→T、G→C、T→A、T→G、C→A、C→G)を取り入れることはできない。その上、編集窓に複数の標的ヌクレオチドがある場合、望ましくない追加の編集をもたらすことがある。
関係のある突然変異を内包する細胞株(鎌状赤血球病:CD34+造血幹細胞;ウィルソン病:培養線維芽細胞;嚢胞性線維症:培養気管支上皮)を、ATCC、Coriell Biobank、またはハーバード/ブロード連携共同研究所(collaborating Harvard/Broad affiliate laboratories)から得る。編集効率をハイスループット配列決定によって評価し、修正された遺伝子型の有効性を、表現型アッセイ(ヘモグロビンHPLC、ATP7B免疫染色、およびCFTR膜電位アッセイ)を使用して試験する。
潜在的なオフターゲット編集を、野生型Cas9と対になった標的gRNAを使用し、GUIDE-seq55およびCIRCLE-seq56などの確立された方法でスクリーニングする。潜在的なオフターゲットが同定された場合、これらの遺伝子座をTPRT編集済細胞から探り、真のオフターゲット編集事象を同定する。
(1)低い編集効率:プライム編集因子(PE)は各標的について最適化を要することがある。このケースにおいて、gRNAライブラリは、特定の用途への最高機能バリアントを同定するのに試験できる。RT-Cas融合体の発現および核局在化は最適化できる。リポソームRNP送達を、オフターゲット編集を制限するのに使用できる。
gRNAデザインの最適化は、プライマー結合部位の長さおよび編集鋳型の伸長のさらなる探査によって達成できる。範囲および一般性を試験することは、種々のヌクレオチド変換、小さい挿入および欠失、ならびに、PAMに関する種々の編集位置、およびヒトゲノム中の複数部位を包含する。RT構成要素の最適化は、MLV RT中の活性(Rnase Hの不活化、プライマー-鋳型結合親和性の増大、処理能力(processivity)の調整)を増強する突然変異、および新しいRT酵素(グループIIイントロンRT、他のレトロウイルスのRT)中の突然変異を探査することを包含する。
無数の遺伝性障害は、個々の遺伝子中の単一ヌクレオチドの変化からもたらされる。ここに記載のゲノム編集技術を開発すること、およびこれを疾患に関係のある細胞型に適用することは、臨床へ移行するための基礎を確立するであろう。鎌状赤血球病などのいくつかの疾患について、単一の点突然変異は、その集団全体にわたって優性遺伝子型を表す。しかしながら、多くの他の遺伝性障害について、単一遺伝子内の種々の点突然変異の大きな不均一性は、患者集団(この各々は同様の疾患表現型を生じている)全体にわたって観察される。したがって、一般のゲノム編集方法は理論上かかる多数の突然変異を標的にできるところ、この技術はこれら患者および彼らの家族の多くへ莫大な潜在的利益を提供できる。これら適用のための原理の証明が細胞中で確立できた場合、疾患の動物モデルにおいて研究するための基盤を確立するであろう。
高精度:所望の編集は、核酸配列にコード、指向される。一般性:理論上、トランスバージョン編集、ならびに小さい挿入または欠失を包含する、いずれの塩基対変換もなし得る。Cas9プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に関する塩基編集因子とは違う編集窓がある。この方法は相同組み換え修復(HDR)の編集能の多くを獲得するが、HDRの主な欠点(ほとんどの細胞型において非効率であって、大抵、インデルなどの望ましくない過剰の副産物が付随する)がない。前記方法はまた、二本鎖DNA破壊(DSB)、極少数のインデル、転座、大きな欠失、p53活性化等々もない。
本明細書に記載のプライム編集システムまたはプライム編集(PE)システムは、トリヌクレオチド反復変異(または「トリプレット拡大疾患」)を短縮してハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復障害などの疾病を処置するために用いられ得る。理論によって拘束されることなしに、トリプレット拡大はDNA複製またはDNA修復合成の間のスリップによって引き起こされる。タンデム反復は互いに同一の配列を有するので、2つのDNA鎖間の塩基対形成は配列上の複数の点において生起し得る。これはDNA複製またはDNA修復合成の間の「ループアウト」構造の形成に至り得る。これは繰り返し配列の繰り返しのコピーに至り得、反復数を伸長させる。ハイブリッドRNA:DNA中間体が関わる追加の機序が提案されている。プライム編集は、害をなす繰り返しのコドントリプレットの(or)1つ以上を欠失させること(deletion)によって、これらのトリプレット拡大領域を縮減または消去するために用いられ得る。この使用のある態様では、図23が、プライム編集によってトリヌクレオチド反復配列を短縮または縮減するためのPEgRNAデザインの模式図を提供する。
本明細書に記載のプライム編集システム(すなわち、PEシステム)は、種々のペプチドタグをタンパク質コード遺伝子上に導入するためにもまた用いられ得る。かかるタグはHEXAヒスチジンタグ、FLAGタグ、V5タグ、GCN4タグ、HAタグ、Mycタグ、および他を包含し得る。このアプローチは、タンパク質蛍光標識、免疫沈降、イムノブロッティング、免疫組織化学、タンパク質動員、誘導可能なタンパク質デグロン、およびゲノムワイドスクリーニングなどの適用に有用であり得る。態様が図25および26に図示されている。
哺乳類、真核生物、および細菌細胞においてRNAをタグ付けまたは別様に操作する遺伝子配列上へのモチーフの挿入のための新たな方法が、本明細書に記載の。ヒトゲノムの1%のみがタンパク質をコードするということが見積もられているが、ゲノムの実質的に全ては何らかのレベルで転写される。もたらされる非コードRNA(ncRNA)のどれくらい多くが機能的な役割を演ずるのか、ましてやこれらの推定RNAのほとんどの役割が何であるのかは、未解決の問いかけである。目当ての遺伝子上への有用な特性を有する新規のRNAコード配列の挿入によるこれらのRNA分子の「タグ付け」は、細胞におけるRNA分子の生物学的機能を研究するための有用な方法である。それは、どのようにしてmRNA修飾が細胞機能に影響し得るかを撹乱し、それゆえにより良く理解するための手段として、タンパク質をコードするmRNA上にタグを組み入れるにもまた有用であり得る。例えば、ユビキタスな天然のRNAタグのポリアデニル化は、細胞質へのmRNAの輸送に影響するために細胞によって用いられる。異なる型のポリアデニル化シグナルは、異なる輸送速度および異なるmRNA寿命、それゆえにコードされるタンパク質が発現されるレベルの違いをもたらす。
定められたまたは可変の挿入、欠失、または定められたアミノ酸/ヌクレオチド変換を有するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子の高度に高性能なライブラリの細胞性の生成のための新たな方法と、高スループットスクリーニングおよび指向性進化へのそれらの使用とが、本明細書に記載の。例において引用される参照はこの例の終わりに包含される参照のリストに基づく。
多様なライブラリが現行で生成される主だった方法は、上に記載されている変異誘発PCRによってである1。挿入または欠失はPCRの間に定められた部位において縮重したNNKプライマーによって導入され得るが、かかる変異を複数の部位において導入することは、より多様なライブラリを変異誘発PCRによって構築する前に複数のラウンドの反復的なPCRおよびクローニングを要求し、方法を低速にする。代替的な補完的な方法はDNAシャッフリングであり、ここでは、DNase処置によって生成された遺伝子のライブラリのフラグメントがプライマーなしのPCR反応に導入され、互いに対する異なるフラグメントのアニーリングと、変異誘発PCR単独よりも多様なライブラリの急速な生成とをもたらす6。このアプローチは理論的にはインデル変異を生成し得るが、それはより多くの場合には遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす。さらにその上、DNAシャッフリングは遺伝子フラグメント間に高い度合の相同性を要求する。これらの方法の両方はin vitroでされなければならず、もたらされるライブラリは細胞に形質転換されるが、PEによって生成されるライブラリはin situで構築され得、連続的進化へのそれらの使用を可能化する。ライブラリはインビボの変異導入によってin situで構築され得、これらのライブラリはホスト細胞機構に依拠し、インデルに対してバイアスを発揮する。類似に、従来のクローニング方法は部位特異的な変異プロファイルを生成するために用いられ得るが、それらはin situでは用いられ得ず、一般的には、細胞に形質転換される前にin vitroで1度に1つずつアセンブリされる。原核および真核細胞型両方におけるPEの効率および幅広い機能性は、さらに、E.coliなどのモデル生物にクローニングされることおよびそれから目当ての細胞または生物に移入されることと対比して、これらのライブラリが目当ての細胞型内において直接的に構築され得るということを示唆する。標的化された多様化の別の競合するアプローチは自動多重ゲノム工学またはMAGEであり、複数の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが複製フォークに組み込まれ得、プログラム可能な変異をもたらし得る7。しかしながら、MAGEはホスト株の有意な改変を要求し、オフターゲットまたはバックグラウンド変異の100倍の増大に至り得るが8、PEはより高度にプログラムされており、より少数のオフターゲット効果をもたらすことが予期される。加えて、MAGEは哺乳類細胞を包含する広い種々の細胞型においては実証されていない。プライム編集はライブラリ生成のための新規のかつ非自明な補完的な技術である。
遺伝子ライブラリを構築するための指向性進化におけるPEの例
CRISPR/Casシステムを用いる精密なゲノム標的化テクノロジーが、最近では、標的ゲノム座位上への操作されたDNA配列の挿入を包含する広い範囲の適用において調査されている。先には、相同組み換え修復(HDR)がこの適用について用いられ、ssDNAドナー鋳型と二本鎖DNA切断(DSB)の手段による修復開始とを要求した。この戦略は、細胞になされるべき可能な変化の最も幅広い範囲をオファーし、大きいDNA配列を哺乳類細胞に挿入するために利用可能な唯一の方法である。しかしながら、HDRは、そのDSBを開始することから派生する望まれない細胞副作用、例えば高いレベルのインデル形成、DNA転座、大きい欠失、およびP53活性化によって邪魔される。これらの欠点に加えて、HDRは多くの細胞型における低い効率によって限定される(T細胞はこの観察の注意すべき例外である)。これらの欠点を克服するための最近の作業は、ヒトRad51変異体をCas9 D10Aニッカーゼに融合することを包含し(RDN)、DSBフリーHDRシステムをもたらす。これは、改善されたHDR産物:インデル比およびより低いオフターゲット編集を特色とするが、細胞型依存性および控えめなのみのHDR編集効率によってなお邪魔される。
CRISPR/Casシステムを用いる精密なゲノム標的化テクノロジーが、最近では、遺伝子治療を包含する広い範囲の適用において調査されている。遺伝子治療におけるCas9およびCas9に基づくゲノム編集薬剤の適用の主要な限定はCas9のサイズ(>4kb)であり、組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)によるその効率的な送達の足枷となる。逆転写酵素へのCas9の最近開発された融合体(「プライム編集因子」)は、存在するゲノム編集法と比べていくつもの利点を所有する新規のゲノム編集テクノロジーを表し、部位特異的な様式でいずれかの1ヌクレオチド置換を組み入れおよびヌクレオチドのいずれかの随意に定められた短い(<~20)ストレッチを挿入または欠失する能力を包含する。そのため、この方法は先には修正をし難かったヒト病原性バリアントの編集を可能化する。プライム編集試薬の送達は、ヒト疾患を引き起こす遺伝子配列の修正を可能化し得るか、または疾患を防止する遺伝子バリアントの組み入れを許し得る。
現行では、プライム編集因子によるオフターゲット編集を検出するための記載された方法はない(プライム編集それ自体がまだ公開されていない)。これらの方法は、研究者がプライム編集因子を用いてオフターゲット編集の可能性ある部位を同定することを許すであろう。これは、この技術が患者の遺伝子疾患を処置するために用いられる場合には重要な考慮事項であろう。
本明細書に記載のプライム編集因子は、プライム編集による低分子結合タンパク質をコードする遺伝子のゲノム取り入れによって、二量体化によって誘導される生物学的プロセス、例えば受容体シグナルを、便利な低分子薬物のコントロール下に置くためにもまた用いられ得、本明細書に記載の。本明細書に記載のプライム編集因子を用いて、低分子結合タンパク質をコードする遺伝子配列が、生細胞または患者の目当ての標的タンパク質をコードする遺伝子上に挿入され得る。この編集は単独では生理学的効果を有さないはずである。典型的には夫々が標的タンパク質のコピーに融合されている2つの薬物結合タンパク質ドメインに同時に結合し得る二量体低分子である低分子薬物の投与によって、低分子は標的タンパク質の二量体化を誘導する。それから、この標的タンパク質二量体化イベントは、生物学的シグナルイベント、例えば赤血球形成またはインスリンシグナルを誘導する。
現行のゲノム編集法は、プログラム可能なヌクレアーゼを用いて二本鎖DNA切断の随伴する副産物と共に標的遺伝子を遮断、欠失、または挿入し得、塩基編集因子を用いて標的座位に4つのトランジション点変異を組み入れ組み入れ得る。しかしながら、小さい挿入、小さい欠失、および8つのトランスバージョン点変異は、集合的にはほとんどの病原性の遺伝子バリアントを表すが、ほとんどの細胞型において、効率的にかつ余分な副産物なしに修正はされ得ない。標的部位を規定することおよび所望の編集をコードすることの両方をする操作されたプライム編集ガイドRNA(PEgRNA)によってプログラムされる操作された逆転写酵素に融合された触媒的に損なわれたCas9を用いて、新たな遺伝情報を規定されたDNA部位に直接的に書き込む高度に汎用的なかつ精密なゲノム編集法、プライム編集が本明細書に記載の。ヒト細胞の175よりも多大な別物の編集を行って、プライム編集が、標的化された挿入、欠失、全ての12の可能な型の点変異、およびそれらの組み合わせを、効率的に(未ソーティングの細胞において典型的には20-60%、最高で77%)かつ低い副産物(典型的には1-10%)によって、二本鎖切断またはドナーDNA鋳型を要求することなしになし得るということを確立した。プライム編集をヒト細胞において適用して、鎌状赤血球症(HBBのA・TからT・Aのトランスバージョンを要求する)およびテイ・サックス病(HEXAの4塩基欠失を要求する)の一次的な遺伝学的原因を修正し、両方のケースにおいて、最小限の副産物によって病原性のゲノムアレルを野生型に効率的に復帰させた。これらの病原性のHBBトランスバージョンおよびHEXA挿入変異を有するヒト細胞株を生出するために、プリオン病に対する耐性を付与するG127V変異をPRNPに組み入れるために(G・CからT・Aのトランスバージョンを要求する)、ならびにHis6タグ、FLAGエピトープタグ、および伸長されたLoxP部位をヒト細胞の標的座位に効率的に挿入するためにもまた、プライム編集を用いた。プライム編集は、HDRと比べて効率および産物純度の利点、ならびに塩基編集と比較して補完的な強さおよび弱さをオファーする。3つの別物の塩基対形成イベントを要求するその検索置換機序と整合して、プライム編集は公知のCas9オフターゲット部位においてCas9よりもかなりオフターゲットDNA改変をしにくい。プライム編集はゲノム編集の範囲および能力を実質的に拡張し、原理的には、公知の病原性のヒト遺伝子バリアントの~89%を修正し得る。
伸長されたガイドRNAからの情報を標的DNA座位上に移入するための戦略
Cas9は、標的DNA部位にハイブリダイズするスペーサー配列を含有するガイドRNAを用いてDNAを標的化する112~114,136,137。狙いは、天然のCRISPRシステムのようにDNA標的を規定するように138,139、また、標的座位の対応するDNAヌクレオチドを置き換える新たな遺伝情報を含有するように両方でガイドRNAを操作することであった。伸長されたガイドRNAから規定されたDNA部位への遺伝情報の直接的移入、次に元々の編集されないDNAの置き換えは、原理的には、DSBまたはドナーDNA鋳型への依存性なしに、標的化されたDNA配列変化を生細胞に組み入れる一般的手段を提供し得る。この直接的情報移入を達成するために、狙いは、3'-ヒドロキシル基を暴露するように標的部位においてニッキングされたゲノムDNAを用いて、操作されたガイドRNA(これ以降では、プライム編集ガイドRNAまたはPEgRNAと言われる)の伸長から直接的に標的部位への遺伝情報の逆転写をプライムすることであった(図38A)。
Cas9のRuvCヌクレアーゼドメインによるPAM含有DNA鎖の切断後に、この鎖のPAM遠位フラグメントは、さもなければ安定なCas9:sgRNA:DNA複合体から解離し得る143。この解放された鎖の3'端は、DNA重合をプライムするために十分にアクセス可能であり得るという仮説が立てられた。ガイドRNA操作作業144~146およびCas9:sgRNA:DNA複合体の結晶構造147~149は、sgRNAの5'および3'末端がCas9:sgRNA活性を廃止することなしに伸長され得るということを示唆する。2つの重大な構成要素を包含するようにsgRNAを伸長することによって、PEgRNAをデザインした:ニッキングされたDNA鎖の3'端がPEgRNAにハイブリダイズすることを許すプライマー結合部位(PBS)、およびニッキングされたDNA鎖の3'端がポリメラーゼによってRNA鋳型上を伸長されるとゲノムDNA部位に直接的にコピーされるであろう所望の編集を含有する逆転写酵素(RT)鋳型である(図38C)。
in vitroのおよび酵母の結果によって促されて、哺乳類細胞のゲノムDNAを編集することができる最小の数の構成要素によるプライム編集システムを、開発のために探求した。3'伸長されたPEgRNA(これ以降では単純にPEgRNAと言われる。図39A)とフレキシブルなリンカーを介した逆転写酵素へのCas9 H840Aの直接的融合体とは、機能的な2構成要素プライム編集システムを構成し得るという仮説が立てられた。HEK293T(不死化ヒト胎児腎臓)細胞を、Cas9 H840Aニッカーゼのどちらかの末端への野生型M-MLV逆転写酵素の融合体をコードする1つのプラスミドと、PEgRNAをコードする第2のプラスミドとによってトランスフェクションした。当初の試みはHEK3標的座位における検出可能なT・AからA・Tの変換には至らなかった。
一般的な方法
PE1 M-MLV RT:
TLNIEDEYRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLIENSSP(配列番号739)
M3 M-MLV RT(D200N、T330P、L603W)(Baranauskas et al.182を参照):
背景
ゲノム改変は、細胞性のプロセスおよび発生を研究および記録するためにもまた用いられ得る。細胞分裂またはシグナルカスケード活性化のような細胞性のイベントをDNA配列改変にリンクすることは、解釈可能なDNA配列変化として細胞の履歴を貯蔵し、これらは特定の細胞性のイベントが生起したかどうかを記述するであろう。DNAは、RNAおよびタンパク質がされないやり方で1つの細胞から次へと忠実に受け渡されるので、DNA編集はこれらの適用にとって必要である。改変が短寿命のタンパク質およびRNA分子になされるときには、細胞状態および系統に関する情報は一般的には失われる。単一の細胞内の細胞性のイベントを記録することは、どのようにして疾患状態が開始、維持、および健康な対照に対して相対的に変化するかを理解するための強力なやり方である。これらの問いかけを探査する能力は、がん、神経学的疾患、およびヒトの健康の幾多の他の重要な問題の発生を理解することに関連性を有する。プライム編集(PE)は、標的化されたかつ配列によって規定されたゲノム挿入、欠失、または変異を生出するためのシステムを提供する。標的アンプリコン配列決定および/またはRNA配列決定(これは単細胞記録実験にとって特に価値がある)によって配列決定され得るDNA標的の繰り返しの改変が、シグナルカスケードの活性化、代謝状態、および細胞分化プログラムを包含する幾多の重要な生物学的プロセスを記録するために用いられ得る。内部のおよび外部の細胞性シグナルをゲノム上の配列改変に接続することは、理論上は、シグナル応答性プロモーターが存在するいずれかのシグナルについて可能である。PEは、培養条件およびインビボの両方において真核および原核細胞の細胞系統およびシグナルの履歴を探査するための多大に拡張されたツールキットを可能化するということが信じられる。
以下の参考文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
1.Recording development with single cell dynamic lineage tracing. Aaron McKenna,James A.Gagnon.
2.Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing.Mckenna et al.Science.2016 Jul 29;353(6298):aaf7907.doi10.1126/science.aaf7907. Epub 2016 May 26.
3.Molecular recording of mammalian embryogenesis.Chan et al.2019.Nature.Jun;570(7759):77-82.doi:10.1038/s41586-019-1184-5.Epub 2019 May 13.
バイオ分子の細胞下レベルの局在および修飾状態はそれらの活性を制御する。転写コントロール、細胞代謝、およびシグナル伝達カスケードのような特定の生物学的機能は、全て、細胞内の具体的な位置付けにおいて丁寧にオーケストレーションされている。そのため、タンパク質の細胞局在および修飾状態を調節することは、疾患の処置のための可能性ある治療学的戦略を表す。標的タンパク質の局在を変改するためのいくつかの存在する治療学が開発されている。例えば、ファルネシル化阻害剤は、KRASのような重要な発がんタンパク質の脂質修飾および膜標的化を防止するようにデザインされる。類似に、標的タンパク質の低分子によって誘導されるユビキチン化は、それらを分解のためのプロテアソームに導く。タンパク質をこれらのおよび他の固有の細胞区画に輸送する能力は、いくつもの生物学的プロセスを変改するための機会を提供する。治療学の目的で、遺伝子にコードされたシグナルによってバイオ分子(例えばタンパク質、脂質、糖、および核酸)の修飾状態および細胞下レベルの輸送を変改するための遺伝子にコードされたハンドルを組み入れるために、プライム編集(PE)を用いることが本願において提案される。
以下の参考文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
1. Selective Target Protein Degradation via Phthalimide Conjugation.Winter et al.Science.Author manuscript;available in PMC 2016 Jul 8.
3. Ribosomal frameshifting and transcriptional slippage:From genetic steganography and cryptography to adventitious use.Atkins et al.Nucleic Acids Research,Volume 44,Issue 15,6 September 2016,Pages 7007-7078.
4. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.Lee and Young.Cell.Author manuscript;available in PMC 2014 Mar 14.
5. Protein localization in disease and therapy.Mien-Chie Hung,Wolfgang Link Journal of Cell Science 2011 124:3381-3392.
6. Loss of post-translational modification sites in disease.Li et al.Pac Symp Biocomput.2010:337-47.PTMD:A Database of Human Disease-associated Post-translational Modifications.Xu et al.Genomics Proteomics Bioinformatics.2018 Aug;16(4):244-251.Epub 2018 Sep 21.
7. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.Zhao et al.Nature Reviews Molecular Cell Biology volume18,pages31-42(2017).
本明細書に記載されるのは、プライム編集(PE)効率を改善し得る一連のPEgRNAデザインおよびストラテジーである。
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT(配列番号757)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号758)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(配列番号759)
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号760)
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA(配列番号761)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号228)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT(配列番号229)
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号230)
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT(配列番号231)
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT(配列番号232)
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT(配列番号233)
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT(配列番号234)
以下の参考文献の各々は例15において引用されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
1. Schechner,DM,Hacisuleyman E.,Younger ST,Rinn JL.Nat Methods 664-70(2015).
2. Brown JA,et al.Nat Struct Mol Biol 633-40(2014).
3. Conrad NA and Steitz JA.EMBO J 1831-41(2005).
4. Bartlett JS,et al.Proc Natl Acad Sci USA 8852-7(1996).
5. Mitton-Fry RM,DeGregorio SJ,Wang J,Steitz TA,Steitz JA.Science 1244-7(2010).
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10. Roth A,Weinberg Z,Chen AG,Kim PG,Ames TD,Breaker RR.Nat Chem Biol.2013.
11. Borchardt EK,et al.RNA 1921-30(2015).
12. Zhang Y,et al.Mol Cell 792-806(2013).
13. Dang Y,et al.Genome Biol 280(2015).
14. Schaefer M,Kapoor U,and Jantsch MF.Open Biol 170077(2017).
15. Nahar S,et al.Chem Comm 2377-80(2018).
SpCas9が効率的に結合し得る好適に置かれたNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)があるゲノム座位において、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)を用いるプライム編集(PE)は全ての1塩基置換、挿入、欠失、およびそれらの組み合わせを効率的に組み入れ組み入れ得る。本明細書に記載の方法は、効率的なPEにとってアクセス可能なPAM、よってアクセス可能な標的化可能なゲノム座位を拡張することによって、PEの標的化能力を幅広くする。SpCas9以外のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質を用いるプライム編集因子は、異なるPAMへのアクセスを許すことによってゲノム座位の拡張された標的化可能な範囲を可能化する。加えて、SpCas9よりも小さいRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質の使用は、より効率的なウイルス送達をもまた許す。SpCas9以外のCasタンパク質または他のRNAによってガイドされるDNA結合タンパク質によるPEは、SpCas9に基づくPEを用いてはアクセス不可能または非効率的どちらかであった高効率の治療学的編集を許すであろう。
この例は、高い特異性および効率で哺乳類および他のゲノムにリコンビナーゼ標的部位(SSR標的部位)を導入するためにプライム編集(PE)を用いることによって、遺伝子疾患に対処するかまたはテーラーメイド動物もしくは植物モデルを生成するための方法を記載する。
表6.大スケールゲノム改変にリンクした遺伝子疾患の例。
さらにPE活性を改善するために、本発明者らは、3'伸長アームを有するPEgRNAの3'末にてトウループ配列を付加することを企図した。図71Aは、3'伸長アームを有する全体的な(generic)SpCas9 PEgRNAの例(上の分子)を提供する。次に、3'伸長アームは、RT鋳型(これは、その所望の編集を包含する)および分子の3'末にてプライマー結合部位(PBS)を含む。分子は、3つのU核酸塩基を含むポリ(U)配列(すなわち、5'-UUU-3')で終止する。
この例に先行して、プライム編集はPEgRNAを要求することが記載される。プライム編集への使用のための好適なPEgRNAの可能な構成を記載する例示の態様が、図3A(5'伸長アームを有するPEgRNA)、図3B(3'伸長アームを有するPEgRNA)、図3C(内部に伸長されたPEgRNA)、図3D(3'伸長アームを有し、プライマー結合部位、編集鋳型、相同アーム、ならびに任意の3'および5'修飾領域と、DNA合成鋳型として指示される領域とを含むPEgRNA)、および図3E(5’伸長アームを有し、プライマー結合部位、編集鋳型、相同アーム、ならびに任意の3'および5'修飾領域と、DNA合成鋳型として指示される領域とを含むPEgRNA)に図示されている。加えて、PEgRNA構造および組成は本願において発明を実施するための形態および至る所で鋭意に記載される。
本明細書に記載の種々の態様では、プライム編集はプログラム可能な標的化分子および編集をコードする分子両方としての用をなす単一のPEgRNAを利用する。この態様は3’伸長アームを有するPEgRNAについて図72(a)に図示されている。しかしながら、いくつかのケースでは、これは、特に、より複雑なPEgRNA分子、例えば大きい挿入をコードするものにとっては不利であり得る。これらのRNAは大規模な二次構造を含有し得、これがPEgRNA骨格構造およびCas9との相互作用に干渉し得る。代替的には、プライム編集はPEgRNAを2つの別個のRNA分子によって置換することによって実行され得る:図72(b)に図示されているとおりsgRNAおよびトランスプライム編集RNA鋳型(tPERT)である。sgRNAはCas9(またはより一般的にはnapDNAbp)を所望のゲノム標的部位へと標的化するための用をなし、tPERTは新たなDNA配列を標的座位に書き込むためにポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)によって用いられる。
代替的な核酸鋳型が化学合成PEgRNA上に用いられ得る(図72c)。例えば、合成PEgRNAはRNA/DNAハイブリッドとして構築され得、スペーサー配列およびsgRNA骨格がRNAヌクレオチドから成り、プライマー結合部位および合成鋳型(図72cにおいて3'伸長として示される)がDNAヌクレオチドから成る。これはDNA依存性DNAポリメラーゼが逆転写酵素の代わりにプライム編集因子上に用いられることを許し得る。それはsgRNA骨格配列を鋳型とするDNAの合成をもまた防止し得る。他のデザインでは、鋳型とされないヌクレオチドから成る化学的リンカーまたは他の好適なリンカー部分が、核酸編集鋳型(RNAまたはDNAから成る)をsgRNA骨格にテザリングするために用いられ得る。これはsgRNA骨格の連続したDNA重合を防止し得、より効率的な鋳型による合成を許す伸長のフレキシビリティーを許し得る。最後に、核酸合成鋳型の方向性が逆位させられ得、その結果、DNA重合が、それの方と対比してsgRNA骨格から別方向に進む。
プライム編集の主な態様では、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素酵素)はnapDNAbp(例えば、Cas9ニッカーゼ)への融合体として発現される。代替的には、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)はトランスで発現され得、その活性が、MS2 RNAアプタマーおよびMS2コートタンパク質などの動員システム、または当該技術分野で公知の他の類似の動員システムを用いて編集部位に局在し得る。このシステムでは、PEgRNAはMS2アプタマーをsgRNA骨格ヘアピンの1つに包含するように改変され、ポリメラーゼ(例えば、逆転写酵素)はMS2cpへの融合タンパク質として発現される。napDNAbp(例えば、Cas9ニッカーゼ)は独立したポリペプチドとしてもまた発現される。このシステムは野生型M-MLV逆転写酵素について実証されており(図74)、他のRTバリアントに適用可能であるはずである。加えて、他のRNA-タンパク質相互作用またはタンパク質-タンパク質相互作用がRT動員に用いられ得る。
次の配列は例19に当てはまる:
tPERTの配列:
この例は、別個のベクターによって細胞にプライム編集因子を送達するための手段として、プライム編集因子がインテインを用いて分裂され得るということを実証する。各ベクターはプライム編集因子融合タンパク質のある部分をコードする。この例は標準的なSpCas9(配列番号18)を含むPE融合タンパク質にフォーカスする。他のCas9タンパク質の分裂部位は対応する同じ部位であり得るか、または各異なるCas9タンパク質について最適化されることを必要とし得る。本例では、プライム編集因子をSpCas9(配列番号18)の残基1023および1024の間で分裂した。これは「1023/1024」分裂部位と言われる。
Npuトランススプライシングインテインによって残基1023および1024の間で分裂されたプライム編集因子はAAV内にパッケージングされる(packages)ようになり、同じ様式で生じた類似のゲノムサイズの塩基編集因子のものと遜色ない高い力価を有する。
P0マウスへの脳室内注射によってAAV9によって送達された分裂SpPE3は、インビボの脳組織においてプライム編集を媒介する。GからTの位置+5におけるヌクレオチド置換(すなわち、ニック部位の5ヌクレオチド塩基下流かつPAM配列上)は、DNMT1のN末端の近くのPro>Glnをコードする変異の組み入れをもたらす。この編集はインビボのプライム編集の実行可能性を実証し、編集された細胞に対するいずれかの選択圧を導入するとは考えられない(「+5」はニック部位の下流の+5位置を言う)。試験されたAAVアーキテクチャは全長MMLV RTとRNAse Hドメインを欠く短縮されたバリアントとを包含する。短縮された転写後制御エレメントW3をもまた評価した。なぜなら、それは、インビボのウイルスカセットからの発現を増大させることが示されているが、その重要性は塩基編集因子またはプライム編集因子コンテキストにおいては試験されていなかったからである。全長RTは短縮されたRTに優り、W3配列の追加は活性を改善するということが見出された。W3が存在するときの編集活性の増大は、プライム編集因子の発現がインビボでは限定されるということを指示し、細胞培養に対してインビボのプライム編集の別物の課題を実証する。
Oakes,B.L.,Fellmann,C.et al.CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification.Cell.2019 Jan 10;176(1-2):254-267.e16.doi:10.1016/j.cell.2018.11.052.
この例は、全てPE2に基づくいくつものバリアントプライム編集因子を構築した。PE2は次の配列および構造を有する:
種々の態様において、PEgRNAは標的DNA部位および編集依存的であることが蓋然的である。つまり、PEgRNAの配列は、標的DNA配列およびプライム編集によってそれに導入されようとする具体的な編集(例えば、欠失、挿入、逆位、置換)に依存するであろう。例えば、ある態様において、PEgRNAのプライマー結合部位(PBS)の3'のモチーフを取り付けるときには、PE融合タンパク質のポリメラーゼドメイン(例えば、逆転写酵素)との立体的衝突を防止するために、PBSおよびモチーフの間のリンカーが好ましい。しかしながら、そのリンカーの性質は各部位について異なり得る。例えば、同じリンカーが各部位に用いられた場合には、それはスペーサー配列に対する偶然の対形成によって偽性的に13nt PBSを16nt PBSにし得る。類似に、リンカーはPBSそれ自体に塩基対形成し得、その閉じ込めをもたらし、可能性としては活性を縮減する。そのため、PEまたはBE4などのタンパク質に基づく編集因子とは違って、2つのエレメントを接続する単一リンカー配列オプションは各構築物に有効ではなくあり得、部分的には、標的DNA配列および目当ての編集の配列に依存するであろう。
非pol IIIプロモーターからのPEgRNAの発現
GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUGCUUCGGCAUGGCGAAUGGGAC [配列番号3923]
ある種のモチーフ、例えばPEgRNAの3'のHDVリボザイム、またはG四重鎖挿入、P1伸長、鋳型ヘアピン、およびテトラループサークルの詳細については、図82を見よ。これらはその性能を改善するためにPEgRNA上に導入され得る。
1412delA変異を有するCDKL5のマウスモデルをデザインするためのPEの使用
CDKL5欠損症障害(CDD)は神経変性疾患であり、最も多くの場合にはサイクリン依存性キナーゼ様5遺伝子の自然突然変異によって引き起こされる。症状は早期小児期に現れ、痙攣発作、不規則な睡眠パターン、胃腸ストレス、および発達遅滞を包含する。1412delAを包含するCDDを引き起こすいくつかの変異は塩基編集によって修正され得ない。しかしながら、プライム編集は全ての塩基から塩基の変化、欠失、および挿入を精密に修正するポテンシャルを有する。1412delA変異へのフォーカスによって、変異を抱くマウスニューロン細胞株(N2A)を確立することを期待して、この例は変異を挿入することができるpegRNAをデザインおよび試験した。これは、変異を修正する可能性として治療学的なpegRNAを大規模スクリーニングすることを許すであろう。究極的なゴールは、1412delA変異を有するCDDマウスモデルまで進展して、治療学的効果を評価する能力があることである。CDDの現行のマウスモデルはヒト化アレルを有さない。しかしながら、pegRNAの最適化がHEK293T細胞においても進行中である。図87および88はpegRNAが1412Adelを組み入れるN2A細胞におけるパイロットスクリーンからの結果であり、プライマー結合部位(PBS)長さおよび逆転写酵素(RT)鋳型長さについての詳細を有する(インデルありおよびなしで示されている)。
鎌状赤血球症(SCA)は劣性血液障害であり、β-グロビン遺伝子の位置6におけるグルタミン酸からバリンの変異によって引き起こされる。結果は鎌状赤血球であり、これらは不良な酸素輸送体であり、凝集をしやすい。凝集の症状は生命を脅かし得る。先に、D. LiuラボはDNAプラスミドトランスフェクションによるプライム編集を用いてHEK293T細胞のSCA座位の組み入れおよび修正両方を示す能力があった。造血幹細胞(HSC)はDNAプラスミドトランスフェクションによって編集することが困難であるので、この例はタンパク質およびmRNAヌクレオフェクションによってHSCにおいてPE3システムを試験した。図89は、健康なHSCのβ-グロビン遺伝子の近位(proxy)座位およびHEK3における編集の結果であり、編集因子対pegRNAおよびニッキングgRNAの濃度を変えている。
編集因子対ガイドの比([編集因子]対[ガイド]比または編集因子:ガイド比)を調整することによって、プロトコールを改善した。
CATGGTGCACCTGACTCCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAGACTTCTCTTCAGGAGTCAGGTGCACTTTであった。
野生型CDKL5タンパク質(受託番号NP_001032420)(アイソフォーム1-ヒト)
MKIPNIGNVM NKFEILGVVG EGAYGVVLKC RHKETHEIVA IKKFKDSEEN EEVKETTLRE LKMLRTLKQE NIVELKEAFR RRGKLYLVFE YVEKNMLELL EEMPNGVPPE KVKSYIYQLI KAIHWCHKND IVHRDIKPEN LLISHNDVLK LCDFGFARNL SEGNNANYTE YVATRWYRSP ELLLGAPYGK SVDMWSVGCI LGELSDGQPL FPGESEIDQL FTIQKVLGPL PSEQMKLFYS NPRFHGLRFP AVNHPQSLER RYLGILNSVL LDLMKNLLKL DPADRYLTEQ CLNHPTFQTQ RLLDRSPSRS AKRKPYHVES STLSNRNQAG KSTALQSHHR SNSKDIQNLS VGLPRADEGL PANESFLNGN LAGASLSPLH TKTYQASSQP GSTSKDLTNN NIPHLLSPKE AKSKTEFDFN IDPKPSEGPG TKYLKSNSRS QQNRHSFMES SQSKAGTLQP NEKQSRHSYI DTIPQSSRSP SYRTKAKSHG ALSDSKSVSN LSEARAQIAE PSTSRYFPSS CLDLNSPTSP TPTRHSDTRT LLSPSGRNNR NEGTLDSRRT TTRHSKTMEE LKLPEHMDSS HSHSLSAPHE SFSYGLGYTS PFSSQQRPHR HSMYVTRDKV RAKGLDGSLS IGQGMAARAN SLQLLSPQPG EQLPPEMTVA RSSVKETSRE GTSSFHTRQK SEGGVYHDPH SDDGTAPKEN RHLYNDPVPR RVGSFYRVPS PRPDNSFHEN NVSTRVSSLP SESSSGTNHS KRQPAFDPWK SPENISHSEQ LKEKEKQGFF RSMKKKKKKS QTVPNSDSPD LLTLQKSIHS ASTPSSRPKE WRPEKISDLQ TQSQPLKSLR KLLHLSSASN HPASSDPRFQ PLTAQQTKNS FSEIRIHPLS QASGGSSNIR QEPAPKGRPA LQLPDGGCDG RRQRHHSGPQ DRRFMLRTTE QQGEYFCCGD PKKPHTPCVP NRALHRPISS PAPYPVLQVR GTSMCPTLQV RGTDAFSCPT QQSGFSFFVR HVMREALIHR AQVNQAALLT YHENAALTGK
野生型CDKL5タンパク質(受託番号NP_001310218)(アイソフォーム2-ヒト)
MKIPNIGNVM NKFEILGVVG EGAYGVVLKC RHKETHEIVA IKKFKDSEEN EEVKETTLRE LKMLRTLKQE NIVELKEAFR RRGKLYLVFE YVEKNMLELL EEMPNGVPPE KVKSYIYQLI KAIHWCHKND IVHRDIKPEN LLISHNDVLK LCDFGFARNL SEGNNANYTE YVATRWYRSP ELLLGAPYGK SVDMWSVGCI LGELSDGQPL FPGESEIDQL FTIQKVLGPL PSEQMKLFYS NPRFHGLRFP AVNHPQSLER RYLGILNSVL LDLMKNLLKL DPADRYLTEQ CLNHPTFQTQ
RLLDRSPSRS AKRKPYHVES STLSNRNQAG KSTALQSHHR SNSKDIQNLS VGLPRADEGL PANESFLNGN LAGASLSPLH TKTYQASSQP GSTSKDLTNN NIPHLLSPKE AKSKTEFDFN IDPKPSEGPG TKYLKSNSRS QQNRHSFMES SQSKAGTLQP NEKQSRHSYI DTIPQSSRSP SYRTKAKSHG ALSDSKSVSN LSEARAQIAE PSTSRYFPSS CLDLNSPTSP TPTRHSDTRT LLSPSGRNNR NEGTLDSRRT TTRHSKTMEE LKLPEHMDSS HSHSLSAPHE SFSYGLGYTS PFSSQQRPHR HSMYVTRDKV RAKGLDGSLS IGQGMAARAN SLQLLSPQPG EQLPPEMTVARSSVKETSRE GTSSFHTRQK SEGGVYHDPH SDDGTAPKEN RHLYNDPVPR RVGSFYRVPS PRPDNSFHEN NVSTRVSSLP SESSSGTNHS KRQPAFDPWK SPENISHSEQ LKEKEKQGFF RSMKKKKKKS QTVPNSDSPD LLTLQKSIHS ASTPSSRPKE WRPEKISDLQ TQSQPLKSLR KLLHLSSASN HPASSDPRFQ PLTAQQTKNS FSEIRIHPLS QASGGSSNIR QEPAPKGRPA LQLPGQMDPG WHVSSVTRSA TEGPSYSEQL GAKSGPNGHP YNRTNRSRMP NLNDLKETAL
この例は、腎疾患を処置またはそれを発生する蓋然性を縮減するためのプライム編集への使用のための、病原性のAPOL1アレルを標的化することができるPEgRNAをデザインした。
以下の態様は本開示の範囲内にある。しかも、本開示は、列挙された態様の1以上からの1以上の限定、要素、節、および記述用語(descriptive terms)が、本セクション中に列挙された別の態様中へ導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包括する。例えば、列挙された別の態様に従属する、列挙されたいずれの態様も、同じ基本態様に従属する、本セクション中に列挙されたいずれか他の態様中に見出される1以上の限定を包含するように修飾され得る。要素が、例として、マーカッシュ群形式において列挙されたものとして提示されている場合、要素の各下位群もまた開示されており、いずれの要素(単数または複数)も群から除去され得る。一般に、本開示、または本開示の側面が、具体的な要素および/または特色を含むものとして見なされる場合、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および/または特色からなるか、あるいは実質的にそれらからなると理解されるはずである。用語「含むこと(comprising)」および「含有すること(containing)」が、オープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を容認することにもまた留意する。範囲が与えられるとき、エンドポイントも包含される。しかも、別段の指示がないか、またはそれとは別に、文脈および当業者の理解から明らかでない場合に限り、範囲として表現された値は、いずれか具体的な値、または本発明の異なる態様において述べられた範囲内の部分範囲を、文脈が明確に別段の指図をしない限り範囲の下限の単位の10倍まで、想定し得る。
群1.態様1~212
1.融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む。
2.態様1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、伸長されたガイドRNAの存在下において、プライム標的にプライムされた逆転写によるゲノム編集を実行することができる。
3.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。
4.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。
5.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
6.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
7.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが:Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。
8.態様1の融合タンパク質であって、融合タンパク質が伸長されたガイドRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。
9.態様8の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。
10.態様8の融合タンパク質であって、伸長されたガイドRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。
11.態様10の融合タンパク質であって、Rループが、(i)伸長されたガイドRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッド、および(ii)相補的な非標的鎖を含む。
12.態様11の融合タンパク質であって、相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有する逆転写酵素プライム配列を形成する。
13.態様2の融合タンパク質であって、伸長されたガイドRNAが(a)ガイドRNAおよび(b)ガイドRNAの5'もしくは3’端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおけるRNA伸長を含む。
14.態様13の融合タンパク質であって、RNA伸長が(i)所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
15.態様14の融合タンパク質であって、逆転写鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
16.態様13の融合タンパク質であって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
17.態様15の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップがニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れる。
18.態様15の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。
19.態様18の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。
20.態様18の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
21.態様14の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化がPAM配列の約-4から+10の間もしくはPAM配列の約-10から+20の間もしくはPAM配列の約-20から+40の間もしくはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされるか、または所望のヌクレオチド変化がニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド下流に組み入れされる。
22.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含む。
23.態様1の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
24.態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が配列番号11-17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
25.態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、配列番号11-17のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
26.態様1の融合タンパク質であって、逆転写酵素が、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。
27.先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[逆転写酵素]-COOH;またはNH2-[逆転写酵素]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。
28.態様27の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号37-47のアミノ酸配列を含む。
29.態様14の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が、1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。
30.態様29の融合タンパク質であって、挿入または欠失が少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。
31.ガイドRNAと少なくとも1つのRNA伸長とを含む伸長されたガイドRNA。
32.態様1の伸長されたガイドRNAであって、RNA伸長が、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置である。
33.態様31の伸長されたガイドRNAであって、伸長されたガイドRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
34.態様33の伸長されたガイドRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズしてRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
35.態様31の伸長されたガイドRNAであって、少なくとも1つのRNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
36.態様35の伸長されたガイドRNAであって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
37.態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
38.態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写プライマー結合部位配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
39.態様35の伸長されたガイドRNAであって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
40.態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
41.態様40の伸長されたガイドRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。
42.態様41の伸長されたガイドRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。
43.態様41の伸長されたガイドRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
44.態様31の伸長されたガイドRNAであって、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18~36のいずれか1つとの少なくとも85%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
45.態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的と少なくとも80%または85%または90%または95%または99%同一であるヌクレオチド配列を含む。
46.態様35の伸長されたガイドRNAであって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
47.態様35の伸長されたガイドRNAであって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15ヌクレオチドである。
48.態様1~30のいずれか1つの融合タンパク質と伸長されたガイドRNAとを含むことを含む複合体。
49.態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置におけるRNA伸長とを含む。
50.態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
51.態様50の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
52.態様49の複合体であって、少なくとも1つのRNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
53.態様48の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85%、もしくは少なくとも90%、もしくは少なくとも95%、もしくは少なくとも98%、もしくは少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
54.態様52の複合体であって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的との少なくとも80%または85%または90%または95%または99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
55.態様52の複合体であって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
56.napDNAbpおよび伸長されたガイドRNAを含むことを含む複合体。
57.態様56の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。
58.態様56の複合体であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
59.態様57の複合体であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
60.態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置におけるRNA伸長とを含む。
61.態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAがnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
62.態様61の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、スペーサー配列が標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
63.態様61の複合体であって、RNA伸長が、(i)逆転写鋳型配列、(ii)逆転写プライマー結合部位、および(iii)任意にリンカー配列を含む。
64.態様57の複合体であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85%、もしくは少なくとも90%、もしくは少なくとも95%、もしくは少なくとも98%、もしくは少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
65.態様63の複合体であって、逆転写鋳型配列が、内生DNA標的と少なくとも80%または85%または90%または95%または99%同一であるヌクレオチド配列を含む。
66.態様63の複合体であって、逆転写プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
67.態様63の複合体であって、任意のリンカー配列が、長さが少なくとも1ヌクレオチド、または少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15ヌクレオチドである。
68.態様1~30のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
69.態様68のポリヌクレオチドを含むベクター。
70.態様1~30のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合した伸長されたガイドRNAとを含む細胞。
71.態様48~67のいずれか1つの複合体を含む細胞。
72.(i)態様1~30のいずれかの融合タンパク質、態様48-67の複合体、態様68のポリヌクレオチド、または態様69のベクター;および(ii)薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
73.(i)態様48~67の複合体、(ii)トランスで提供される逆転写酵素;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
74.キットであって:(i)態様1~30のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸配列;および(ii)(i)の配列の発現を駆動するプロモーターを含む核酸構築物を含む。
75.所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:
(i)融合タンパク質および伸長されたガイドRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよび逆転写酵素を含み、伸長されたガイドRNAが所望のヌクレオチド変化を含む逆転写鋳型配列を含むこと;
(ii)非標的鎖上において二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって3'端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;
(iii)遊離の一本鎖DNAの3'端を逆転写鋳型配列にハイブリダイズさせ、それによって逆転写酵素ドメインをプライムすること;
(iv)3'端からDNAの鎖を重合し、それによって所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;
(v)カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。
76.態様75の方法であって、(v)置き換えるステップが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成すること、を含む。
77.態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。
78.態様77の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。
79.態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。
80.態様76の方法であって、所望のヌクレオチド(nucleoid)変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。
81.態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。
82.態様76の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。
83.態様82の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
84.態様82の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
85.態様76の方法であって、napDNAbpが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。
86.態様76の方法であって、napDNAbpが配列番号2のアミノ酸配列を含む。
87.態様76の方法であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
88.態様76の方法であって、逆転写酵素が配列番号11-17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
89.態様76の方法であって、逆転写酵素ドメインが、配列番号11-17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
90.態様76の方法であって、伸長されたガイドRNAが、ガイドRNAの5'もしくは3'端または分子内の位置付けにおけるRNA伸長を含み、RNA伸長が逆転写鋳型配列を含む。
91.態様90の方法であって、RNA伸長が、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
92.態様76の方法であって、伸長されたガイドRNAが、配列番号18-36からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
93.標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:
(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するガイドRNAとDNA分子を接触させ、ガイドRNAが少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列を含むこと;
(ii)標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成すること;
(iii)暴露された3'端をRT鋳型配列にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;
(vi)逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;および
(v)少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。
94.態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。
95.態様94の方法であって、トランジションが:(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。
96.態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。
97.態様96の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。
98.態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
99.態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。
100.態様93の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。
101.態様100の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
102.態様100の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
103.態様93の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。
104.態様93の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。
105.態様93の方法であって、napDNAbpが配列番号2のアミノ酸配列を含む。
106.態様93の方法であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
107.態様93の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。
108.態様93の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。
109.態様93の方法であって、逆転写酵素が配列番号11~17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
110.態様93の方法であって、逆転写酵素が、配列番号11~17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
111.態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。
112.態様111の方法であって、ヌクレアーゼがnapDNAbpであるか、napDNAbpの融合ドメインとして提供されるか、またはトランスで提供される。
113.態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。
114.態様93の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。
115.態様93の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。
116.態様115の方法であって、暴露された3’端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。
117.態様93の方法であって、ガイドRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列を含む伸長された部分を含む。
118.態様117の方法であって、伸長された部分が、ガイドRNAの3’端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。
119.態様93の方法であって、ガイドRNAがさらにプライマー結合部位を含む。
120.態様93の方法であって、ガイドRNAがさらにスペーサー配列を含む。
121.態様93の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。
122.プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むことを含む。
123.態様122の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。
124.態様122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
125.請求項122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が:(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。
126.請求項122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が:(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。
127.態様122の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
128.態様31~47のいずれか1つの伸長されたガイドRNAをコードするポリヌクレオチド。
129.態様128のポリヌクレオチドを含むベクター。
130.態様129のベクターを含む細胞。
131.態様1-30のいずれかの融合タンパク質であって、逆転写酵素がエラーを起こしやすい逆転写酵素である。
132.プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子に変異導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすい逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、変異導入された一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、変異導入された一本鎖DNAを標的座位におけるDNA分子上に組み込むことを含む。
133.態様132の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
134.態様132の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
135.態様132の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
136.態様132の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
137.態様132の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。
138.健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させ、前記融合タンパク質が導入すること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。
139.態様138の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
140.態様138の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
141.態様138の方法であって、napDNAbpが配列番号18~25のアミノ酸配列を含む。
142.態様138の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
143.態様138の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3’端プライマー結合配列を生成することを含む。
144.態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。
145.態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。
146.態様138の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。
147.プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に機能部分を組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と機能部分とを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
148.態様147の方法であって、機能部分がペプチドタグである。
149.態様148の方法であって、ペプチドタグがアフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、または蛍光タグである。
150.態様148の方法であって、ペプチドタグが:AviTag(配列番号245);Cタグ(配列番号246);カルモジュリンタグ(配列番号247);ポリグルタミン酸タグ(配列番号248);Eタグ(配列番号249);FLAGタグ(配列番号250);HAタグ(配列番号251);Hisタグ(配列番号252-262);Mycタグ(配列番号263);NEタグ(配列番号264);Rho1D4タグ(配列番号265);Sタグ(配列番号266);SBPタグ(配列番号267);Softag-1(配列番号268);Softag-2(配列番号269);Spotタグ(配列番号270);Strepタグ(配列番号271);TCタグ(配列番号272);Tyタグ(配列番号273);V5タグ(配列番号274);VSVタグ(配列番号275);およびXpressタグ(配列番号276)からなる群から選択される。
151.態様148の方法であって、ペプチドタグが:AU1エピトープ(配列番号278);AU5エピトープ(配列番号279);バクテリオファージT7エピトープ(T7タグ)(配列番号280);ブルータングウイルスタグ(Bタグ)(配列番号281);E2エピトープ(配列番号282);ヒスチジンアフィニティータグ(HAT)(配列番号283);HSVエピトープ(配列番号284);ポリアルギニン(Argタグ)(配列番号285);ポリアスパラギン酸(Aspタグ)(配列番号286);ポリフェニルアラニン(Pheタグ)(配列番号287);S1タグ(配列番号288);Sタグ(配列番号289);およびVSV-G(配列番号290)からなる群から選択される。
152.態様147の方法であって、機能部分が免疫エピトープである。
153.態様152の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラス I HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
154.態様147の方法であって、機能部分が目当てのタンパク質の局在を変改する。
155.態様147の方法であって、機能部分が分解タグであり、その結果、目当てのタンパク質の分解速度が変改される。
156.態様155の方法であって、分解タグ。
157.態様147の方法であって、機能部分が低分子結合ドメインである。
158.態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
159.態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
160.態様157の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492~494のシクロフィリンである。
161.態様157の方法であって、低分子結合ドメインが目当ての2つ以上のタンパク質上に組み入れされる。
162.態様161の方法であって、目当ての2つ以上のタンパク質が低分子に接触することによって二量体化し得る。
163.態様157の方法であって、低分子が:
164.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
165.態様164の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
166.態様164の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
167.態様164の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
168.態様164の方法であって、napDNAbpが配列番号18~25のアミノ酸配列を含む。
169.態様164の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
170.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
171.態様170の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。
172.態様171の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。
173.態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
174.態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
175.態様170の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492~494のシクロフィリンである。
176.態様170の方法であって、低分子が:
177.態様170の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
178.態様170の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
179.態様170の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
180.態様170の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
181.プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。
182.態様181の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。
183.態様181の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)、Myc(例えばEQKLISEED)、GSTなどである。
184.態様181の方法であって、ペプチドタグが、配列番号245-290からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
185.態様181の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。
186.態様181の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。
187.態様181の方法であって、リンカーが配列番号127、165-176、446、453、および767-769のアミノ酸配列を有する。
188.態様181の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号18-25のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。
189.態様181の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
190.態様181の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
191.プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
192.態様191の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。
193.態様191の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。
194.態様192の方法であって、プリオン病がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。
195.態様193の方法であって、プリオン病が牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。
196.態様191の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291-292である。
197.態様191の方法であって、方法が、配列番号293-323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。
198.態様191の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
199.態様191の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
200.態様191の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
201.態様191の方法であって、ガイドRNAが配列番号222を含む。
202.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
203.態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。
204.態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。
205.態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。
206.態様202の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3'ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。
207.態様202の方法であって、PEgRNAが配列番号18~25を含む。
208.態様202の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
209.態様202の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
210.態様202の方法であって、napDNAbpが配列番号18~25のアミノ酸配列を含む。
211.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。
212.態様211の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化状態を変改する。
群2.態様213~424
213.融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含む。
214.態様213の融合タンパク質であって、融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行することができる。
215.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがニッカーゼ活性を有する。
216.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである。
217.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
218.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
219.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する。
220.態様213の融合タンパク質であって、融合タンパク質がPEgRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる。
221.態様220の融合タンパク質であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む。
222.態様220の融合タンパク質であって、PEgRNAと複合体化した融合タンパク質の結合がRループを形成する。
223.態様222の融合タンパク質であって、Rループが、(i)PEgRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む。
224.態様223の融合タンパク質であって、相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3’端を有するプライム配列を形成する。
225.態様214の融合タンパク質であって、PEgRNAが(a)ガイドRNAおよび(b)ガイドRNAの5'もしくは3’端またはガイドRNAの分子内の位置付けにおける伸長アームを含む。
226.態様225の融合タンパク質であって、伸長アームが(i)所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型配列および(ii)プライマー結合部位を含む。
227.態様226の融合タンパク質であって、DNA合成鋳型配列が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
228.態様225の融合タンパク質であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
229.態様227の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を組み入れる。
230.態様227の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる。
231.態様230の融合タンパク質であって、5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される。
232.態様230の融合タンパク質であって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
233.態様226の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化がPAM配列の約-4から+10の間もしくはPAM配列の約-10から+20の間もしくはPAM配列の約-20から+40の間もしくはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされるか、または所望のヌクレオチド変化がニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100ヌクレオチド下流に組み入れされる。
234.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
235.態様213の融合タンパク質であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
236.態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11-17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
237.態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11-17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
238.態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼがレトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である。
239.先の態様のいずれか1つの融合タンパク質であって、融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[ポリメラーゼ]-COOH;またはNH2-[ポリメラーゼ]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する。
240.態様239の融合タンパク質であって、リンカー配列が配列番号37-47のアミノ酸配列を含む。
241.態様226の融合タンパク質であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド変化、1つ以上のヌクレオチドの挿入、または1つ以上のヌクレオチドの欠失である。
242.態様241の融合タンパク質であって、挿入または欠失が、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、または少なくとも50である。
243.ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含むPEgRNA。
244.態様241のPEgRNAであって、核酸伸長アームがガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置であり、核酸伸長アームがDNAまたはRNAである。
245.態様242のPEgRNAであって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
246.態様245のPEgRNAであって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズしてRNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
247.態様243のPEgRNAであって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。
248.態様247のPEgRNAであって、核酸伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
249.態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
250.態様247のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである。
251.態様243のPEgRNAであって、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。
252.態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。
253.態様252のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する。
254.態様253のPEgRNAであって、遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される。
255.態様253のPEgRNAであって、一本鎖DNAフラップの細胞性修復が所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する。
256.態様243のPEgRNAであって、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも98%、または少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
257.態様247のPEgRNAであって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80%または85%または90%または95%または99%同一であるヌクレオチド配列を含む。
258.態様247のPEgRNAであって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
259.態様251のPEgRNAであって、少なくとも1つの追加の構造がPEgRNAの3'または5'端に位置付けられる。
260.態様213-242のいずれか1つの融合タンパク質とPEgRNAとを含むことを含む複合体。
261.態様260の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。
262.態様260の複合体であって、PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
263.態様262の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
264.態様261の複合体であって、少なくとも1つの核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。
265.態様260の複合体であって、PEgRNAが、配列番号18~36のヌクレオチド配列、または配列番号18~36のいずれか1つとの少なくとも85%、もしくは少なくとも90%、もしくは少なくとも95%、もしくは少なくとも98%、もしくは少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
266.態様264の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80%または85%または90%または95%または99%同一であるヌクレオチド配列を含む。
267.態様264の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
268.napDNAbpおよびPEgRNAを含むことを含む複合体。
269.態様268の複合体であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼである。
270.態様268の複合体であって、napDNAbpが配列番号2のアミノ酸配列を含む。
271.態様268の複合体であって、napDNAbpが、配列番号2-10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
272.態様268の複合体であって、PEgRNAが、ガイドRNAと、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置における核酸伸長アームとを含む。
273.態様268の複合体であって、PEgRNAがnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる。
274.態様272の複合体であって、標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含み、PEgRNAのスペーサー配列が標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する。
275.態様273の複合体であって、核酸伸長アームが(i)DNA合成鋳型および(ii)プライマー結合部位を含む。
276.態様269の複合体であって、PEgRNAが、配列番号18-36のヌクレオチド配列、または配列番号18-36のいずれか1つとの少なくとも85%、もしくは少なくとも90%、もしくは少なくとも95%、もしくは少なくとも98%、もしくは少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
277.態様276の複合体であって、DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80%または85%または90%または95%または99%同一であるヌクレオチド配列を含む。
278.態様276の複合体であって、プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする。
279.態様276の複合体であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。
280.態様213~242のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
281.態様280のポリヌクレオチドを含むベクター。
282.態様213~242のいずれかの融合タンパク質と融合タンパク質のnapDNAbpに結合したPEgRNAとを含む細胞。
283.態様260~279のいずれか1つの複合体を含む細胞。
284.医薬組成物であって:(i)態様213~242のいずれかの融合タンパク質、態様260~279の複合体、態様68のポリヌクレオチド、または態様69のベクター;および(ii)薬学的に許容される賦形剤を含む。
285.医薬組成物であって:(i)態様260~279の複合体、(ii)トランスで提供されるポリメラーゼ;および(iii)薬学的に許容される賦形剤を含む。
286.キットであって:(i)態様213~242のいずれか1つの融合タンパク質をコードする核酸配列;および(ii)(i)の配列の発現を駆動するプロモーターを含む核酸構築物を含む。
287.所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れるための方法であって、方法が:
(i)融合タンパク質およびPEgRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよびポリメラーゼを含み、PEgRNAが所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むこと;
(ii)二本鎖DNA配列にニッキングし、それによって、3'端を有する遊離の一本鎖DNAを生成すること;
(iii)遊離の一本鎖DNAの3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせ、それによってポリメラーゼをプライムすること;
(iv)プライマー結合部位にハイブリダイズした3'端からDNAの鎖を重合し、それによって、DNA合成鋳型に対して相補的であるかつ所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを生成すること;
(v)カットされた部位に隣接する内生DNA鎖を一本鎖DNAフラップによって置き換え、それによって所望のヌクレオチド変化を二本鎖DNA配列に組み入れること、
を含む。
288.態様287の方法であって、(v)置き換えるステップが:(i)一本鎖DNAフラップをカットされた部位に隣接する内生DNA鎖にハイブリダイズさせて、配列ミスマッチを生出すること;(ii)内生DNA鎖を切り出すこと;および(iii)ミスマッチを修復して、所望のヌクレオチド変化をDNAの両方の鎖に含む所望の産物を形成すること、を含む。
289.態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が1ヌクレオチド置換、欠失、または挿入である。
290.態様289の方法であって、1ヌクレオチド置換がトランジションまたはトランスバージョンである。
291.態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)GからTの置換、(2)GからAの置換、(3)GからCの置換、(4)TからGの置換、(5)TからAの置換、(6)TからCの置換、(7)CからGの置換、(8)CからTの置換、(9)CからAの置換、(10)AからTの置換、(11)AからGの置換、または(12)AからCの置換である。
292.態様288の方法であって、所望のヌクレオチド(nucleoid)変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変換する。
293.態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失である。
294.態様288の方法であって、所望のヌクレオチド変化が疾患関連遺伝子を修正する。
295.態様294の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
296.態様294の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
297.態様287の方法であって、napDNAbpが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、またはヌクレアーゼ活性Cas9である。
298.態様287の方法であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
299.態様287の方法であって、napDNAbpが、配列番号2~10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
300.態様287の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11~17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
301.態様287の方法であって、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、配列番号11~17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
302.態様287の方法であって、PEgRNAが核酸伸長アームをガイドRNAの3'もしくは5'端または分子内の位置付けに含み、伸長アームがDNA合成鋳型配列およびプライマー結合部位を含む。
303.態様302の方法であって、伸長アームが、長さが少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、または少なくとも25ヌクレオチドである。
304.態様287の方法であって、PEgRNAが、配列番号18~36からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
305.標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって:
(i)DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するPEgRNAと接触させ、PEgRNAが、少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含むことと;
(ii)標的座位におけるDNA鎖の暴露された3'端を形成すること;
(iii)暴露された3'端をプライマー結合部位にハイブリダイズさせて逆転写をプライムすること;
(iv)逆転写酵素によって、RT鋳型配列に基づく少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAフラップを合成すること;および
(v)少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を対応する内生DNA上に組み込み、それによって、標的座位においてDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入すること、
を含む。
306.態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランジションを含む。
307.態様306の方法であって、トランジションが、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択される。
308.態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化がトランスバージョンを含む。
309.態様308の方法であって、トランスバージョンが、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択される。
310.態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(9)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
311.態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの挿入または欠失を含む。
312.態様305の方法であって、ヌクレオチド配列の1つ以上の変化が疾患関連遺伝子の修正を含む。
313.態様312の方法であって、疾患関連遺伝子が:アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症;アルファ-1アンチトリプシン欠損症;嚢胞性線維症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー;ガラクトース血症;ヘモクロマトーシス;ハンチントン病;メープルシロップ尿症;マルファン症候群;1型神経線維腫症;先天性爪肥厚症;フェニルケトン尿症;重症複合免疫不全;鎌状赤血球症;スミス・レムリ・オピッツ症候群;トリヌクレオチド反復障害;プリオン病;およびテイ・サックス病からなる群から選択される単一遺伝子障害に関連する。
314.態様312の方法であって、疾患関連遺伝子が:心臓病;高血圧;アルツハイマー病;関節炎;糖尿病;がん;および肥満からなる群から選択される多遺伝子性障害に関連する。
315.態様305の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9またはそのバリアントである。
316.態様305の方法であって、napDNAbpがヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)もしくはCas9ニッカーゼ(nCas9)またはそのバリアントである。
317.態様305の方法であって、napDNAbpが、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
318.態様305の方法であって、napDNAbpが、配列番号2~10のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
319.態様305の方法であって、逆転写酵素がトランスで導入される。
320.態様305の方法であって、napDNAbpが逆転写酵素への融合体を含む。
321.態様305の方法であって、逆転写酵素が配列番号11~17のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
322.態様305の方法であって、逆転写酵素が、配列番号11~17のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
323.態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、ヌクレアーゼによってDNA鎖へニックを入れることを含む。
324.態様323の方法であって、ヌクレアーゼがトランスで提供される.
325.態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、DNA鎖を化学的薬剤と接触させることを含む。
326.態様305の方法であって、標的座位におけるDNA鎖の暴露された3’端を形成するステップが、複製エラーを導入することを含む。
327.態様305の方法であって、DNA分子をnapDNAbpおよびガイドRNAと接触させるステップがRループを形成する。
328.態様327の方法であって、暴露された3’端が形成されるDNA鎖がRループ上にある。
329.態様315の方法であって、PEgRNAが、逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含む伸長アームを含む。
330.態様329の方法であって、伸長アームが、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置にある。
331.態様305の方法であって、PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む。
332.態様305の方法であって、PEgRNAがさらに相同アームを含む。
333.態様305の方法であって、RT鋳型配列が、対応する内生DNAに対して相同的である。
334.プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子のヌクレオチド配列の1つ以上の変化を導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、所望のヌクレオチド変化を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって標的座位におけるDNA分子上に所望のヌクレオチド変化を組み込むことを含む。
335.態様334の方法であって、RT鋳型が、ガイドRNAの3'端、ガイドRNAの5'端、またはガイドRNAの分子内の位置付けに位置付けられる。
336.態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、トランジション、トランスバージョン、挿入、もしくは欠失、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
337.態様334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからC;(b)AからG;(c)CからT;および(d)GからAからなる群から選択されるトランジションを含む。
338.請求項334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(a)TからA;(b)TからG;(c)CからG;(d)CからA;(e)AからT;(f)AからC;(g)GからC;および(h)GからTからなる群から選択されるトランスバージョンを含む。
339.請求項334の方法であって、所望のヌクレオチド変化が、(1)G:C塩基対をT:A塩基対に、(2)G:C塩基対をA:T塩基対に、(3)G:C塩基対をC:G塩基対に、(4)T:A塩基対をG:C塩基対に、(5)T:A塩基対をA:T塩基対に、(6)T:A塩基対をC:G塩基対に、(7)C:G塩基対をG:C塩基対に、(8)C:G塩基対をT:A塩基対に、(9)C:G塩基対をA:T塩基対に、(10)A:T塩基対をT:A塩基対に、(11)A:T塩基対をG:C塩基対に、または(12)A:T塩基対をC:G塩基対に変化させることを含む。
340.態様243~259のいずれか1つのPEgRNAをコードするポリヌクレオチド。
341.態様340のポリヌクレオチドを含むベクター。
342.態様341のベクターを含む細胞。
343.態様213の融合タンパク質であって、ポリメラーゼがエラーを起こしやすい逆転写酵素である。
344.プライム標的にプライムされた逆転写によって標的座位におけるDNA分子に変異導入するための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすい逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;(b)RT鋳型のプライム標的にプライムされた逆転写を行なって、変異導入された一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、変異導入された一本鎖DNAを標的座位におけるDNA分子上に組み込むことを含む。
345.いずれかの先行する態様の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
346.いずれかの先行する態様の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
347.態様344の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
348.態様344の方法であって、ガイドRNAが配列番号26-36を含む。
349.態様344の方法であって、(b)プライム標的にプライムされた逆転写を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによって逆転写をプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。
350.健康な数の反復トリヌクレオチドを含む健康な配列によって標的DNA分子上のトリヌクレオチド反復拡大変異を置き換えるための方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含む融合タンパク質ならびに(ii)置き換え配列を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むPEgRNAと接触させること;(b)プライム編集を行なって、置き換え配列を含む一本鎖DNAを生成すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。
351.態様350の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
352.態様350の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
353.態様350の方法であって、napDNAbpが配列番号18~25のアミノ酸配列を含む。
354.態様350の方法であって、ガイドRNAが配列番号26~36を含む。
355.態様350の方法であって、(b)プライム編集を行うステップが、ガイドRNA上のプライマー結合部位へのアニーリングによってポリメラーゼをプライムすることができる標的座位における3'端プライマー結合配列を生成することを含む。
356.態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がハンチントン病、脆弱X症候群、またはフリードライヒ運動失調症に関連する。
357.態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がCAGトリプレットの繰り返し単位を含む。
358.態様350の方法であって、トリヌクレオチド反復拡大変異がGAAトリプレットの繰り返し単位を含む。
359.プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に機能部分を組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードするDNA合成鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と機能部分とを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
360.態様359の方法であって、機能部分がペプチドタグである。
361.態様360の方法であって、ペプチドタグがアフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープもしくは免疫エピトープタグ、または蛍光タグである。
362.態様360の方法であって、ペプチドタグが:AviTag(配列番号245);Cタグ(配列番号246);カルモジュリンタグ(配列番号247);ポリグルタミン酸タグ(配列番号248);Eタグ(配列番号249);FLAGタグ(配列番号250);HAタグ(配列番号251);Hisタグ(配列番号252-262);Mycタグ(配列番号263);NEタグ(配列番号264);Rho1D4タグ(配列番号265);Sタグ(配列番号266);SBPタグ(配列番号267);Softag-1(配列番号268);Softag-2(配列番号269);Spotタグ(配列番号270);Strepタグ(配列番号271);TCタグ(配列番号272);Tyタグ(配列番号273);V5タグ(配列番号274);VSVタグ(配列番号275);およびXpressタグ(配列番号276)からなる群から選択される。
363.態様360の方法であって、ペプチドタグが:AU1エピトープ(配列番号278);AU5エピトープ(配列番号279);バクテリオファージT7エピトープ(T7タグ)(配列番号280);ブルータングウイルスタグ(Bタグ)(配列番号281);E2エピトープ(配列番号282);ヒスチジンアフィニティータグ(HAT)(配列番号283);HSVエピトープ(配列番号284);ポリアルギニン(Argタグ)(配列番号285);ポリアスパラギン酸(Aspタグ)(配列番号286);ポリフェニルアラニン(Pheタグ)(配列番号287);S1タグ(配列番号288);Sタグ(配列番号289);およびVSV-G(配列番号290)からなる群から選択される。
364.態様359の方法であって、機能部分が免疫エピトープである。
365.態様364の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
366.態様359の方法であって、機能部分が目当てのタンパク質の局在を変改する。
367.態様359の方法であって、機能部分が分解タグであり、その結果、目当てのタンパク質の分解速度が変改される。
368.態様367の方法であって、分解タグが、タグ付けされたタンパク質の消去をもたらす。
369.態様359の方法であって、機能部分が低分子結合ドメインである。
370.態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
371.態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
372.態様359の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492-494のシクロフィリンである。
373.態様359の方法であって、低分子結合ドメインが目当ての2つ以上のタンパク質上に組み入れされる。
374.態様373の方法であって、目当ての2つ以上のタンパク質が低分子に接触することによって二量体化し得る。
375.態様369の方法であって、低分子が:
376.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質に免疫エピトープを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と免疫エピトープとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
377.態様376の方法であって、免疫エピトープが:破傷風トキソイド(配列番号396);ジフテリア毒素変異体CRM197(配列番号398);ムンプス免疫エピトープ1(配列番号400);ムンプス免疫エピトープ2(配列番号402);ムンプス免疫エピトープ3(配列番号404);風疹ウイルス(配列番号406);ヘマグルチニン(配列番号408);ノイラミニダーゼ(配列番号410);TAP1(配列番号412);TAP2(配列番号414);クラスI HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号416);クラスI HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号418);クラスII HLAに対するヘマグルチニンエピトープ(配列番号420);クラスII HLAに対するノイラミニダーゼエピトープ(配列番号422);ヘマグルチニンエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号424);ノイラミニダーゼエピトープH5N1結合クラスIおよびクラスII HLA(配列番号426)からなる群から選択される。
378.態様376の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
379.態様376の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
380.態様376の方法であって、napDNAbpが配列番号18~25のアミノ酸配列を含む。
381.態様376の方法であって、PEgRNAが配列番号26~36を含む。
382.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上に低分子二量体化ドメインを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)低分子二量体化ドメインをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)免疫エピトープをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質と低分子二量体化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
383.態様382の方法であって、さらに、目当ての第2のタンパク質に対して方法を行うことを含む。
384.態様383の方法であって、目当ての第1のタンパク質および目当ての第2のタンパク質が、前記タンパク質の夫々の二量体化ドメインに結合する低分子の存在下において二量体化する。
385.態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号488のFKBP12である。
386.態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号489のFKBP12-F36Vである。
387.態様382の方法であって、低分子結合ドメインが配列番号492-494のシクロフィリンである。
388.態様382の方法であって、低分子が:
389.態様382の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
390.態様382の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
391.態様382の方法であって、napDNAbpが配列番号18~25のアミノ酸配列を含む。
392.態様382の方法であって、PEgRNAが配列番号26~36を含む。
393.プライム編集を用いてタンパク質上にペプチドタグまたはエピトープを組み入れる方法であって:タンパク質をコードする標的ヌクレオチド配列を、ペプチドタグをコードする第2のヌクレオチド配列をそれに挿入するように構成されたプライム編集因子構築物と接触させて、組み換えヌクレオチド配列をもたらすことを含み、その結果、ペプチドタグおよびタンパク質が融合タンパク質として組み換えヌクレオチド配列から発現される。
394.態様383の方法であって、ペプチドタグがタンパク質の精製および/または検出に用いられる。
395.態様383の方法であって、ペプチドタグが、ポリヒスチジン(例えば、HHHHHH)、FLAG(例えば、DYKDDDDK)、V5(例えば、GKPIPNPLLGLDST)、GCN4、HA(例えば、YPYDVPDYA)、Myc(例えばEQKLISEED)、またはGSTである。
396.態様383の方法であって、ペプチドタグが、配列番号245-290からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
397.態様383の方法であって、ペプチドタグがリンカーによってタンパク質に融合される。
398.態様383の方法であって、融合タンパク質が次の構造を有し:[タンパク質]-[ペプチドタグ]または[ペプチドタグ]-[タンパク質]、「]-[」が任意のリンカーを表す。
399.態様383の方法であって、リンカーが配列番号37-47のアミノ酸配列を有する。
400.態様383の方法であって、プライム編集因子構築物が、配列番号18-25のヌクレオチド配列を含むPEgRNAを含む。
401.態様383の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
402.態様383の方法であって、PEgRNAがスペーサー、gRNAコア、および伸長アームを含み、スペーサーが標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、伸長アームがペプチドタグをコードする逆転写酵素鋳型を含む。
403.プライム編集によって標的ヌクレオチド配列によってコードされるPRNP上に1つ以上の防護性変異を組み入れることによって、プリオン病を防止またはその進行を停止させる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)防護性変異をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、ミスフォールディングに対して耐性である防護性変異を含むPRNPをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
404.態様403の方法であって、プリオン病がヒトプリオン病である。
405.態様403の方法であって、プリオン病が動物プリオン病である。
406.態様404の方法であって、プリオン病がクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、またはクールー病である。
407.態様403の方法であって、プリオン病が牛海綿状脳症(BSEまたは「狂牛病」)、慢性消耗病(CWD)、スクレイピー、伝達性ミンク脳症、ネコ海綿状脳症、および有蹄類海綿状脳症である。
408.態様403の方法であって、野生型PRNPアミノ酸配列が配列番号291~292である。
409.態様403の方法であって、方法が、配列番号293~323からなる群から選択される改変されたPRNPアミノ酸配列をもたらし、前記改変されたPRNPタンパク質がミスフォールディングに対して耐性である。
410.態様403の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
411.態様403の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
412.態様403の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
414.態様403の方法であって、PEgRNAが配列番号26-36を含む。
414.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生ずる。
415.態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが検出部分である。
416.態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの発現レベルに影響する。
417.態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが目当てのRNAの輸送または細胞下レベル位置付けに影響する。
418.態様414の方法であって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグが、SV40 1型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE-mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNAボックス、U1 snRNA 3’ボックス、tRNA-リジン、broccoliアプタマー、spinachアプタマー、mangoアプタマー、HDVリボザイム、およびm6Aからなる群から選択される。
419.態様414の方法であって、PEgRNAが配列番号18~25を含む。
420.態様414の方法であって、融合タンパク質がPE1、PE2、またはPE3のアミノ酸配列を含む。
421.態様414の方法であって、napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である。
422.態様414の方法であって、napDNAbpが配列番号18-25のアミノ酸配列を含む。
423.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのタンパク質上の機能部分を組み入れまたは欠失する方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)機能部分またはその欠失をコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;(b)機能部分またはその欠失をコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびに(c)DNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、目当てのタンパク質および機能部分またはその除去を含む改変されたタンパク質をコードする組み換え標的ヌクレオチド配列を生じ、機能部分がタンパク質の修飾状態または局在状態を変改する。
424.態様423の方法であって、機能部分が、目当てのタンパク質のリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、脂質修飾、ヒドロキシル化、メチル化、アセチル化、クロトニル化、SUMO化状態を変改する。
態様1.融合タンパク質であって、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
態様1.ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含むPEgRNA。
を含む。
態様1.プライム編集のための複合体であって:
を含む。
群D.変異を修正するためのPE法
融合タンパク質およびPEgRNAを含む複合体と二本鎖DNA配列を接触させ、融合タンパク質がnapDNAbpおよびポリメラーゼを含み、PEgRNAが所望のヌクレオチド変化を含むDNA合成鋳型とプライマー結合部位とを含むこと;
を含む。
DNA分子を、核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびnapDNAbpを標的座位へと標的化するPEgRNAと接触させ、PEgRNAが少なくとも1つの所望のヌクレオチド変化を含む逆転写酵素(RT)鋳型配列とプライマー結合部位とを含むこと;
を含む。
を含む。
(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)および逆転写酵素を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含むRT鋳型を含むガイドRNAと接触させること;
を含む。
を含み;
を含み;
態様1.プライム編集によって標的座位におけるDNA分子に変異導入する方法であって、方法が:(a)標的座位におけるDNA分子を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびエラーを起こしやすいポリメラーゼ(polymer)(例えば、エラーを起こしやすい逆転写酵素)を含む融合タンパク質ならびに(ii)所望のヌクレオチド変化を含む編集鋳型を含むガイドRNAと接触させること;それによって、編集鋳型を鋳型とする一本鎖DNAを重合すること、ならびにDNA修復および/または複製プロセスによって、標的座位におけるDNA分子上に一本鎖DNAを組み込むことを含む。
を含み;
を含み;
態様1.ポリペプチドであって、プライム編集因子融合タンパク質のN末端半分またはC末端半分を含む。
態様78.態様8のポリペプチドであって、分裂部位が、配列番号18の1023および1024の間、または配列番号18との少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは少なくとも99.5%配列同一性を有するアミノ酸配列上の対応する位置である。
態様1.プライム編集によって、標的ヌクレオチド配列によってコードされる目当てのRNA上にリボヌクレオチドモチーフまたはタグを組み入れる方法であって、方法が:(a)標的ヌクレオチド配列を(i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)およびポリメラーゼを含むプライム編集因子ならびに(ii)リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする編集鋳型を含むPEgRNAと接触させること;それによって、リボヌクレオチドモチーフまたはタグをコードする一本鎖DNA配列を重合すること;ならびにDNA修復および/または複製プロセスによって、標的ヌクレオチド配列における対応する内生鎖の代わりに一本鎖DNA配列を組み込むことを含み、方法が、リボヌクレオチドモチーフまたはタグを含む目当ての修飾されたRNAをコードする標的ヌクレオチド配列を生ずる。
態様1.プライム編集によって、プログラムされた変異体遺伝子ライブラリを構築する方法であって、方法が:
を含む。
態様1.プライム編集因子によるオフターゲット編集を評価する方法であって、方法が:
を含む。
態様1.プライム編集によって細胞性のイベントを記録する方法であって、方法が:(A)細胞に(i)napDNAbpおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含むプライム編集因子融合タンパク質と(ii)PEgRNAとをコードする1つ以上の構築物を導入し、融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現が、細胞性のイベントの生起によって誘導され、融合タンパク質および/またはPEgRNAの発現によって、細胞のゲノム上の標的編集部位のプライム編集をもたらして、検出可能な配列を導入すること、ならびに(B)検出可能な配列を同定し、それによって細胞性のイベントの生起を同定することを含む。
を含み、
クレームにおいて、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、1または1より多いことを意味してもよいが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。ある群の1以上のメンバー間に「または」を包含するクレームまたは記載は、その群のメンバーのうち、1つ、1つより多いか、または、すべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係があるか、を満たすと考えるが、それと反する指示がないか、またはそれとは別に、文脈から明らかでない場合に限る。本発明は、その群のうち、正確に1つのメンバーが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。本発明は、その群のメンバーのうち、1つより多いかまたはすべてが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それに採用されるか、またはそれとは別に、それに関係がある態様を包含する。
Claims (52)
- (i)核酸プログラム型DNA結合タンパク質(napDNAbp)とRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインとを含む融合タンパク質;および
(ii)プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)
を含む、プライム編集のための複合体。 - 融合タンパク質が、プライム編集ガイドRNA(PEgRNA)の存在下においてプライム編集を実行して所望のヌクレオチド変化を標的配列上に組み入れることができる、請求項1に記載の複合体。
- napDNAbpがニッカーゼ活性を有する、請求項11に記載の複合体。
- napDNAbpがCas9タンパク質またはそのバリアントである、請求項1に記載の複合体。
- napDNAbpがヌクレアーゼ活性Cas9、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)、またはCas9ニッカーゼ(nCas9)である、請求項1に記載の複合体。
- napDNAbpがCas9ニッカーゼ(nCas9)である、請求項1に記載の複合体。
- napDNAbpが:Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c、およびアルゴノートからなる群から選択され、任意にニッカーゼ活性を有する、請求項1に記載の複合体。
- RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89~100、105~122、128~129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701~716、739~741、および766のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、請求項1に記載の複合体。
- RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが逆転写酵素であり、配列番号89~100、105~122、128~129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701~716、739~741、および766のいずれか1つのアミノ酸配列との少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の複合体。
- RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインが、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾンからの天然に存在する逆転写酵素である、請求項1に記載の複合体。
- 融合タンパク質が、PEgRNAと複合体化したときに標的DNA配列に結合することができる、請求項1に記載の複合体。
- PEgRNAが、ガイドRNAとDNA合成鋳型を含む少なくとも1つの核酸伸長アームとを含む、請求項1に記載の複合体。
- 核酸伸長アームが、ガイドRNAの3'もしくは5'端またはガイドRNAの分子内の位置の位置であり、核酸伸長アームがDNAまたはRNAである、請求項12に記載の複合体。
- PEgRNAが、napDNAbpに結合することおよびnapDNAbpを標的DNA配列へと導くことができる、請求項12に記載の複合体。
- 標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む、請求項14に記載の複合体。
- ガイドRNAが標的鎖にハイブリダイズして、RNA-DNAハイブリッドおよびRループを形成する、請求項12に記載の複合体。
- 少なくとも1つの核酸伸長アームがさらにプライマー結合部位を含む、請求項12に記載の複合体。
- 核酸伸長アームが、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも16ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも18ヌクレオチド、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、少なくとも28ヌクレオチド、少なくとも29ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも31ヌクレオチド、少なくとも32ヌクレオチド、少なくとも33ヌクレオチド、少なくとも34ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも36ヌクレオチド、少なくとも37ヌクレオチド、少なくとも38ヌクレオチド、少なくとも39ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも41ヌクレオチド、少なくとも42ヌクレオチド、少なくとも43ヌクレオチド、少なくとも44ヌクレオチド、少なくとも45ヌクレオチド、少なくとも46ヌクレオチド、少なくとも47ヌクレオチド、少なくとも48ヌクレオチド、少なくとも49ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである、請求項12に記載の複合体。
- DNA合成鋳型が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチド、または少なくとも15ヌクレオチドである、請求項12に記載の複合体。
- プライマー結合部位が、長さが少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも11ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも14ヌクレオチドs、または少なくとも15ヌクレオチドである、請求項17に記載の複合体。
- PEgRNAが、さらに、リンカー、ステムループ、ヘアピン、トウループ、アプタマー、またはRNA-タンパク質動員ドメインからなる群から選択される少なくとも1つの追加の構造を含む、請求項12に記載の複合体。
- DNA合成鋳型が、ニック部位に隣接する内生DNA配列に対して相補的である一本鎖DNAフラップをコードし、一本鎖DNAフラップが、所望のヌクレオチド変化を含む、請求項12に記載の複合体。
- 一本鎖DNAフラップが、ニッキングされた標的DNA配列上の5'端を有する内生一本鎖DNAを押し除け、内生一本鎖DNAがニック部位の下流において直ちに隣接する、請求項22に記載の複合体。
- 遊離の5'端を有する内生一本鎖DNAが細胞によって切除される、請求項23に記載の複合体。
- 一本鎖DNAフラップの細胞性修復が、所望のヌクレオチド変化の組み入れをもたらし、それによって所望の産物を形成する、請求項23に記載の複合体。
- PEgRNAが、配列番号18~36のヌクレオチド配列、または配列番号101~104、181~183、223~244、277、325~334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499~505、735~761、776~777のいずれか1つとの少なくとも85%もしくは少なくとも90%もしくは少なくとも95%もしくは少なくとも98%もしくは少なくとも99%配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載の複合体。
- DNA合成鋳型が、内生DNA標的と少なくとも80%、または85%、または90%、または95%、または99%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載の複合体。
- プライマー結合部位が、カットされたDNAの遊離の3'端とハイブリダイズする、請求項17に記載の複合体。
- 少なくとも1つの追加の構造がPEgRNAの3'または5'端に位置付けられる、請求項21に記載の複合体。
- リンカーが、配列番号127、165~176、446、453、および767~769からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の複合体。
- ステムループが、本明細書に記載のステムループから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の複合体。
- ヘアピンが、本明細書に記載のヘアピンから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の複合体。
- トウループが、本明細書に記載のトウループから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の複合体。
- アプタマーが、本明細書に記載のアプタマーから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の複合体。
- RNA-タンパク質動員ドメインが、本明細書に記載のRNA-タンパク質動員ドメインから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の複合体。
- 標的DNA配列が標的鎖および相補的な非標的鎖を含む、請求項1に記載の複合体。
- Rループが(i)PEgRNAと標的鎖とを含むRNA-DNAハイブリッドおよび(ii)相補的な非標的鎖を含む、請求項36に記載の複合体。
- 標的または相補的な非標的鎖がニッキングされて、遊離の3'端を有するプライム配列を形成する、請求項37に記載の複合体。
- ニック部位が標的鎖上のPAM配列の上流である、請求項38に記載の複合体。
- ニック部位が非標的鎖上のPAM配列の上流である、請求項38に記載の複合体。
- ニック部位がPAM配列の5'端に対して相対的に-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、または-9である、請求項38に記載の複合体。
- 一本鎖DNAフラップが、ニック部位に隣接する内生DNA配列にハイブリダイズし、それによって所望のヌクレオチド変化を標的鎖上に組み入れる、請求項22に記載の複合体。
- 一本鎖DNAフラップが、遊離の5'端を有しかつニック部位に隣接する内生DNA配列に取って代わる、請求項22に記載の複合体。
- 5'端を有する内生DNA配列が細胞によって切除される、請求項22に記載の複合体。
- 5'端を有する内生DNA配列がフラップエンドヌクレアーゼによって切除される、請求項44に記載の複合体。
- 一本鎖DNAフラップの細胞性修復が、所望のヌクレオチド変化を非標的鎖に組み込み、それによって所望の産物を形成する、請求項43に記載の複合体。
- 所望のヌクレオチド変化が、PAM配列の約-4から+10の間、またはPAM配列の約-10から+20の間、またはPAM配列の約-20から+40の間、またはPAM配列の約-30から+100の間である編集窓上に組み入れされる、請求項46に記載の複合体。
- 所望のヌクレオチド変化が、ニック部位の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100ヌクレオチド下流に組み入れされる、請求項47に記載の複合体。
- 融合タンパク質が構造NH2-[napDNAbp]-[RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメイン]-COOH;またはNH2-[RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメイン]-[napDNAbp]-COOHを含み、「]-[」の夫々のものが任意のリンカー配列の存在を指示する、請求項1~48のいずれか1項に記載の複合体。
- リンカー配列が配列番号127、165~176、446、453、および767~769のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の複合体。
- 融合タンパク質が、さらに、napDNAbpとRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むドメインとを連結するリンカーを含む、請求項1に記載の複合体。
- リンカー配列が配列番号3887(1×SGGS)、3888(2×SGGS)、3889(3×SGGS)、3890(1×XTEN)、3891(1×EAAAK)、3892(2×EAAAK)、および3893(3×EAAAK)のアミノ酸配列を含む、請求項51に記載の複合体。
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