CN108486111A - CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及其特异性sgRNA - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR‑Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的sgRNA，所述sgRNA在人SMYD3基因上的靶位点位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一。本发明利用含有Cas9蛋白和上述sgRNA的CRISPR‑Cas9系统靶向敲除人SMYD3基因，以构建SMDY3基因敲除的细胞模型，以及制备预防和/或治疗肿瘤细胞的药物。

Description

CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及其特异性sgRNA
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种基于CRISPR-Cas9特异性靶向敲除人SMYD3基因的方法，以及用于特异性靶向SMYD3基因的sgRNA。
背景技术
CRISPR/Cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统内，其主要功能是对抗入侵病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统作为基因体的剪辑工具，与TALEN和ZFN技术并称为现代基因工程技术的三大基因编辑技术。
CRISPR系统包含Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种不同的类型，其中Ⅱ型CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。其原理为CRISPR序列转录RNA(crRNAs)与反式激活RNA(tracrRNA)结合，形成成熟的crRNA-tracrRNA，引导Cas9核酸内切酶到靶序列上，并在PAM位点上游3bp处特异性剪切DNA双链，形成DSB(Double strand break)。DNA双链断裂后主要通过两种途径被修复，一是同源重组修复，一是非同源末端连接。Cas9核酸内切酶作用于DNA双链产生DSB，可通过非同源末端连接进行修复，产生碱基的插入或缺失，造成移码突变，从而破坏基因；也可能突变造成终止密码子，过早终止蛋白的合成。
SMYD3(SET and MYND domain containing 3)是发现于2004年的一种组蛋白甲基转移酶，可以通过使染色体组蛋白H3-赖氨酸4(H3K4)形成二甲基化或三甲基化，从而造成染色体空间结构的异常改变，并进而影响下游许多癌基因、细胞周期调控基因、信号转导相关基因等的表达，最终导致细胞增殖速度加快。人SMYD3基因位于人染色体lq44，共有12个外显子，由428个蛋白质组成。SMYD3编码的蛋白折叠成两叶结构，形成五个结构域，其中重要的两个功能结构域为位于N端第201-239位氨基酸的SET domin和第49-87位氨基酸的zf-MYND结构域。SET domin具有甲基化转移酶功能，可以特异性的使染色体组蛋白H3K4形成二甲基化或三甲基化，从而使染色体空间结构变得松散。
SMYD3基因在很大程度上是一种胞质赖氨酸甲基转移酶，在肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等许多癌细胞中高度表达，而在正常组织中表达量相对较低，表明SMYD3的高度表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系。
近年来，随着基因编辑技术的进步，在基因水平治疗肿瘤有了很大的希望。有研究表明，SMYD3在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡方面起着很大的作用，可以作为肿瘤治疗的靶点，为今后临床治疗肿瘤提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是构建一种CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法，以及用于特异性靶向人SMYD3基因的sgRNA，以制备得到SMYD3基因敲除的细胞模型。
本发明首先提供了一种特异性靶向人SMYD3基因的sgRNA，所述sgRNA在人SMYD3基因上的靶位点位于所述基因的第二个外显子区域，且靶序列唯一。具体地，所述sgRNA含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明上述sgRNA针对的人SMYD3基因的靶位点序列如SEQ ID NO.2所示。
接着，本发明提供了一种用于靶向敲除人SMYD3基因的CRISPR-Cas9系统，在所述系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向人SMYD3基因的sgRNA，或者含有携带有编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列。
优选地，所述CRISPR-Cas9系统中，所述Cas9蛋白的编码序列与sgRNA的编码序列位于同一质粒载体上。
更优选地，所述的质粒载体为PX459质粒。
进而，本发明提供了一种CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括下述步骤：
1) 构建特异性靶向人SMYD3基因的sgRNA，所述sgRNA含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，在人SMYD3基因上的靶位点位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一；
2) 根据所述sgRNA合成1对互补的寡聚核苷酸，磷酸化、退火后形成双链sgRNA寡聚核苷酸；
3) BbsI酶切质粒载体PX459，使其线性化，与所述双链sgRNA寡聚核苷酸连接，构建真核表达载体PX459-sgRNA；
4) 以PX459-sgRNA质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有Ampicillin的LB固体培养板，挑选单克隆，于含有Ampicillin的LB液体培养基中培养，提取无内毒素的PX459-sgRNA质粒；
5) 以Lipofectamine®2000脂质体包裹PX459-sgRNA质粒，转染目标细胞，构建SMDY3基因敲除的细胞模型。
本发明所构建的用于靶向敲除人SMYD3基因的CRISPR-Cas9系统可应用于制备SMYD3基因敲除的细胞模型，以为进一步研究SMYD3基因的功能及其有关通路提供便利。
具体地，本发明应用所构建的CRISPR-Cas9系统，敲除了人Bel-7402肝癌细胞的SMYD3基因，并经过筛选挑取单克隆细胞，方便快捷的构建得到了SMYD3基因敲除的人Bel-7402肝癌细胞单克隆细胞系。
更进一步地，本发明所构建的CRISPR-Cas9系统可以应用于制备用于预防和/或治疗肿瘤细胞的药物。
更具体地，本发明所构建的CRISPR-Cas9系统可以应用于制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物；可以应用于制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的药物；可以应用于制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物。
本发明构建的CRISPR-Cas9系统能够快速、简便、高效、特异性的靶向敲除人SMYD3基因，为实现肿瘤的免疫治疗提供了一种可行的策略，可以有力的推动基因技术在肿瘤治疗方面的进展。
附图说明
图1是SMDY3基因敲除的Bel-7402细胞模型的PCR扩增产物电泳图。
图2是Western Blot检测SMYD3蛋白的表达。
图3是SMDY3基因敲除的Bel-7402细胞模型的迁移能力图。
图4是SMDY3基因敲除的Bel-7402细胞模型的增殖能力图。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中，若未特别指明，实验中未注明的具体实验方法，均按照常规条件或说明书进行操作，所用试剂均为市售商品试剂。
实施例1：靶向人SMYD3基因位点的sgRNA的设计与合成。
根据Genebank中人SMYD3的基因序列，在人SMYD3基因的第二个外显子区域设计潜在的靶点。通过在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)及sgRNA设计原则，设计并评估获得了一条DNA序列如SEQ ID NO.1所示的sgRNA。
该sgRNA针对的人SMYD3基因上的靶序列位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一，核苷酸序列为CACTACAGTATTTGGCGACG。
实施例2：靶向人SMYD3基因位点的sgRNA寡核苷酸的合成和构建。
根据实施例1设计好的sgRNA，在其5’端连接上G和CACC粘性末端，得到下述正向寡核苷酸(Forward oligo)：5’-CACCGCACTACAGTATTTGGCGACG-3’。
根据所设计的sgRNA序列，获得其互补链，并在5’端连接AAAC，3’端连接C，得到下述反向寡核苷酸(Reverse oligo)：5’-AAACCGTCGCCAAATACTGTAGTGC-3’。
上述设计好的sgRNA寡核苷酸序列送生物公司合成。将合成出的人SMYD3基因靶位点序列对应的两寡核苷酸序列Forward oligo和Reverse oligo成对磷酸化、退火，形成磷酸化修饰的、带有粘性末端的短双链sgRNA寡聚核苷酸。
反应体系如下：蒸馏水重悬sgRNA到终浓度100µM，取Forward oligo 1µL，Reverseoligo 1µL，10×T4 Ligation Buffer 1µL，T4 PNK 0.5µL，以ddH2O补足至10µL。
将上述反应体系在200µL PCR管中混合均匀，放入PCR仪中，37℃孵育30min，95℃变性5min，然后以每分钟5℃的速率降温至25℃，完成反应，获得可以连入PX459真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
实施例3：真核表达质粒的构建。
取真核表达载体pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)，以BbsI酶切使其线性化，37℃水浴30min后，1%琼脂糖凝胶电泳，以OMEGE胶回收试剂盒(货号D2500-01)回收凝胶产物。
具体酶切体系如下：PX459 1µg，Fast Digest BbsI 1µL，Fast AP 1µL，10×FastDigest Buffer 2µL，以ddH2O补足至20µL。
将上述线性化的PX459与实施例2制备的双链sgRNA寡聚核苷酸进行连接，反应体系如下：线性化PX459 50ng，退火产物(1∶99稀释) 1µL，2×Quick Ligation Buffer 5µL，Quick Ligase 1µL，以ddH2O补足至10µL。
将上述反应体系于室温孵育10min，将所述双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化的PX459片段连接后，获得真核表达质粒PX459-sgRNA。
以所述PX459-sgRNA质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100µg/mLAmpicillin的LB固体培养板上，过夜培养。挑选单克隆，于5mL含100µg/mL Ampicillin的LB液体培养基，37℃培养12～16h。
以sgRNA为上游引物，5’-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’为下游引物，菌液为模板，PCR验证阳性菌落。
PCR反应体系如下：模板1µL，PCR mix Taq10µL，上游引物1µL，下游引物1µL， 以ddH2O补足至20µL。
PCR扩增程序如下：94℃ 10min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，4℃ 59min，共30个循环。
以U6为引物，经测序验证，所述短双链sgRNA寡聚核苷酸已经准确连入真核表达载体PX459中。提取得到PX459-sgRNA质粒。
实施例4：无内毒素真核表达质粒的制备。
取PX459-sgRNA质粒1ng，加入50µL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激45s，冰上放置2min，加入500µL LB液体培养基，37℃培养1h。10000rpm离心1min，倒掉大部分上清液，剩余培养基重悬感受态细胞，涂布于含有100µg/mL Ampicillin的LB固体培养板，过夜培养。
取单克隆菌落于5mL含有100µg/mL Ampicillin的LB液体培养基，37℃培养12～16h。
收集菌液，4℃，10000rpm离心，收集菌体，以OMEGA plasmid DNA Mini Kit试剂盒提取得到无内毒素的PX459-sgRNA质粒。
实施例5：脂质体转染Bel-7402细胞构建SMDY3基因敲除细胞模型。
复苏Bel-7402细胞，将细胞放入完全培养基培养瓶中，于37℃，5% CO2培养箱中培养。
转染前一天，将细胞接种于六孔板中，第二天观察细胞密度，达到70～80%时即可进行转染。
将六孔板中的培养基弃掉，PBS缓冲液冲洗两遍，每孔加1mL不含血清和青链霉素的RPMI-1640培养基。取6µg PX459-sgRNA，18µL Lipofectamine®2000，分别与600µL Opti-MEM培养基混匀，室温孵育5min。孵育完成后，将Lipofectamine®2000与PX459-sgRNA混匀，室温孵育20min，加入到六孔板中，每孔加200µL混合液。4～6h后更换含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。
转染后24～48h，换含有11mg/mL Puromycin的完全培养基，筛选4～5天。
筛选完成后，利用胰酶消化仍贴壁的细胞，1000rpm离心，收集细胞，加1mL完全培养基重悬，取一部分提取DNA，剩余细胞种回培养瓶。
以提取的DNA为模板，扩增靶位点序列。
上游引物：5’-TGGAAGGTTCAAGAGGAGGCT-3’。
下游引物：5’-CCTGGCAACCTGTGTGACTC-3’。
PCR反应体系如下：DNA模板 1µL，PCR mix Taq 10µL，上游引物 1µL，下游引物1µL，以ddH2O补足至20µL。
PCR扩增程序如下：94℃ 10min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，4℃ 59min，共30个循环。
以PCR产物连接pEASY®-T1，PCR产物 1µL，pEASY®-T1 Simple Clone Vector 1µL，室温连接5min。
连接产物中加入50µL感受态细胞Trans1-T1，混匀，冰浴30min，42℃热激30s，冰上放置2min，加入500µL LB液体培养基，37℃培养1h。取菌液100µL，涂布于LB固体培养基，37℃过夜培养。
挑取三个单菌落，分别加入5mL LB液体培养基(含5µLAMP)，37℃培养12h。取1µL菌液，以M13F为上游引物，M13R为下游引物进行PCR扩增。扩增结果如图1所示，证明PCR产物已经被连入pEASY®-T1载体中，可用于基因测序。
取阳性菌液进行测序，测序引物SR Primer。
测序结果如SEQ ID NO.3所示，与SEQ ID NO.2所示的sgRNA针对的人SMYD3基因靶序列比较，显示sgRNA靶位点的序列发生了移码突变。证明基因敲除成功，本发明特异性靶向敲除人SMYD3基因的方法能建立稳定可靠的SMYD3基因敲除细胞模型。
实施例6：Westernblot检测SMYD3敲除效果。
按照实施例5方法，分别以PX459-sgRNA质粒和PX459质粒转染Bel-7402细胞。转染后24～48h，每孔加入2mL含有11mg/mL Puromycin的完全培养基，Puromycin筛选3～4天后，提取细胞蛋白。
同时取不做任何处理的Bel-7402细胞，待培养长至80%左右，提取细胞蛋白质。
弃去六孔板中培养基，PBS清洗两遍，加入200µL蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解30min。
吹打六孔板底部，将裂解反应物吸入离心管中。13000rpm离心10min，吸取上清，转移至新的离心管中。
沸水浴煮沸蛋白质5min，使蛋白质变性，于-20℃冰箱保存。
以BCA法测定蛋白样品的浓度，其中，Bel-7402细胞蛋白浓度4.74µg/µL，转染PX459的Bel-7402细胞蛋白浓度6.58µg/µL，转染PX459-sgRNA的Bel-7402细胞蛋白浓度4.48µg/µL。
电泳装置中装入分离胶和浓缩胶，取样品蛋白和适量上样缓冲液，涡旋混匀，煮沸5min后，点样于电泳孔中，同时于边缘孔中点3µL Maker，100V电泳至溴酚蓝在分离胶中压成一条直线，然后以120V电泳至溴酚蓝到达电泳槽底部。
恒流转膜(电流大小为膜面积×1.5mA)，转膜时间100min。
配制5%蛋白封闭液，转膜结束后将膜放于封闭液中，摇床上低速摇动1h。
以PBST稀释SMYD3一抗和GAPDH一抗(1∶1000)，将膜放于一抗液中，4℃冰箱中摇床过夜。PBST洗膜3次，每次10min。
以PBST稀释相应二抗(1∶5000)，将膜放于其中，室温孵育1h。PBST洗膜3次，每次5min。
显影，结果如图2。从图中可以看出，与不做任何处理的Bel-7402细胞(野生型细胞)和PX459质粒处理的Bel-7402细胞相比，以PX459-sgRNA质粒处理的Bel-7402细胞(基因缺陷型细胞)的SMYD3蛋白表达明显下降。
实施例7：细胞划痕实验检测细胞迁移。
分别将野生型Bel-7402细胞和基因缺陷的PX459-sgRNA-Bel-7402细胞接种于六孔板中，观察细胞生长状况，当细胞密度为80%左右时，用200µL枪头比着直尺在六孔板中画直线，用PBS轻柔冲洗两遍，去除漂浮细胞，加入无血清培养基，37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，0h、24h、48h时拍照记录，测量细胞生长边缘距离中点的距离。
测量结果如图3。结果表明SMYD3基因缺陷的Bel-7402细胞株比野生型Bel-7402细胞株的迁移能力弱。差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例8：CCK-8实验检测细胞增殖。
收集野生型Bel-7402细胞和基因缺陷的PX459-sgRNA-Bel-7402细胞，计数后，按每孔1000个细胞，将细胞接种于96孔板，周围用PBS填充。将96孔板放入37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，每隔24h进行CCK-8实验，每孔加入10µL CCK-8溶液，37℃细胞培养箱孵育4h，用酶标仪在450nm下测量每孔的吸光度值，绘制细胞生长曲线。
CCK-8实验结果表明，在培养72h后，SMYD3基因缺陷的Bel-7402细胞株比野生型Bel-7402细胞株的增殖能力下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
SEQUENCE LISTING
<110> 山西医科大学
<120> CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及其特异性sgRNA
<160> 3
<170> SIPO Sequence Listing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMYD3基因第二外显子的sgRNA
<400> 1
cactacagta tttggcgacg 20
<210> 2
<211> 349
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> 野生型SMYD3基因序列(152095-152444)
<400> 2
catcagtgtg aaaatccaaa tcttaaggga ctgtacataa tggagtaaac agaacatacg 60
ggtgtccgta tgttgactta tgttttcttt cttcaactat gtactatgtt tcccactcat 120
ttcttaatgc agaattaatt tttttcccca caggaaggaa aagctgatgc gatgctctca 180
gtgccgcgtc gccaaatact gtagtgctaa gtgtcaggta agacttttca gccatatata 240
agtgaagctt tcaaattctt tactcttaaa tttgtccttc actatacctg ttggcctgtg 300
tctacttctt tacagccttt aatttacttt tacttgttat tcacctgct 349
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> 突变型SMYD3基因序列(152095-152444)
<400> 3
catcagtgtg aaaatccaaa tcttaaggga ctgtacataa tggagtaaac agaacatacg 60
ggtgtccgta tgttgactta tgttttcttt cttcaactat gtactatgtt tcccactcat 120
ttcttaatgc agaattaatt tttttcccca caggaaggaa aagctgatgc gatgctctca 180
gtgccgcgtc gccaaatact gtagtgctaa gtgtcaggta gacttttcag ccatatataa 240
gtgaagcttt caaattcttt actcttaaat ttgtccttca ctatacctgt tggcctgtgt 300
ctacttcttt acagccttta atttactttt acttgttatt cacctgct 348

Claims (10)

1.一种CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法中用于特异性靶向人SMYD3基因的sgRNA，所述sgRNA含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其在人SMYD3基因上的靶位点位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一。
2.一种用于靶向敲除人SMYD3基因的CRISPR-Cas9系统，在所述系统中含有Cas9蛋白和权利要求1所述的sgRNA，或者含有携带有编码Cas9蛋白的编码序列和编码权利要求1所述sgRNA的编码序列。
3.根据权利要求2所述的CRISPR-Cas9系统，在所述CRISPR-Cas9系统中，所述Cas9蛋白的编码序列与sgRNA的编码序列位于同一质粒载体上。
4.根据权利要求3所述的CRISPR-Cas9系统，其特征是所述的质粒载体为PX459质粒。
5.一种CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括下述步骤：
1) 构建特异性靶向人SMYD3基因的sgRNA，所述sgRNA含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，在人SMYD3基因上的靶位点位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一；
2) 根据所述sgRNA合成1对互补的寡聚核苷酸，磷酸化、退火后形成双链sgRNA寡聚核苷酸；
3) BbsI酶切质粒载体PX459，使其线性化，与所述双链sgRNA寡聚核苷酸连接，构建真核表达载体PX459-sgRNA；
4) 以PX459-sgRNA质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有Ampicillin的LB固体培养板，挑选单克隆，于含有Ampicillin的LB液体培养基中培养，提取无内毒素的PX459-sgRNA质粒；
5) 以Lipofectamine®2000脂质体包裹PX459-sgRNA质粒，转染目标细胞，构建SMDY3基因敲除的细胞模型。
6.权利要求2、3、4任一所述CRISPR-Cas9系统在制备SMYD3基因敲除的细胞模型的应用。
7.权利要求2、3、4任一所述CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗肿瘤细胞的药物的应用。
8.权利要求2、3、4任一所述CRISPR-Cas9系统在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物的应用。
9.权利要求2、3、4任一所述CRISPR-Cas9系统在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的药物的应用。
10.权利要求2、3、4任一所述CRISPR-Cas9系统在制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
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