KR20220110739A - 유형 v crispr-cas 염기 편집제 및 그의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제, 및 그의 융합 및 동원 핵산 구축물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이를 이용한 표적화된 핵산 변형의 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면은 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 데아미나제; 및 (c) 가이드 핵산과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제와 접촉되고, 여기서 데아미나제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원되고 (예를 들어, 단백질 대 단백질 상호작용, RNA 대 단백질 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 통해 동원되고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하며, 임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 및 가이드 핵산은 공동-발현되는 것인, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
Description
서열 목록의 전자적 출원에 관한 진술
37 C.F.R. § 1.821 하에 제출되고, 명칭이 1499-10WO_ST25.txt이고, 크기가 351,999 바이트이고, 2020년 10월 30일에 생성되고, EFS-웹을 통해 출원된 ASCII 텍스트 형식의 서열 목록은 종이 사본 대신 제공된다. 이 서열 목록은 그의 개시내용에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제, 및 그의 융합 및 동원 핵산 구축물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이를 이용한 표적화된 핵산 변형의 방법에 관한 것이다.
유전자 편집은 부위-지정된 뉴클레아제를 이용하여 표적화된 게놈 위치에서 변동을 도입하는 프로세스이다. C에서 T로의 염기 편집은 표적화 모듈로서 Cas9를 사용하는 염기 편집제로 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Komor et al. (Sci Advances 3(8):eaao4774) (2017))] 및 [Koblan et al. (Nat Biotechnol 36(9):843-846 (2018)]은 APOBEC1 데아미나제, Cas9 니카제 (D10A), 및 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)의 2개의 카피를 포함하는 융합 단백질로서 Cas9를 사용하는 염기 편집제를 개시하고 있다. 문헌 [Li et al. (Nat Biotechnol. 36(4):324-327 (2018))]은 Cas9를 불활성화된 Cpf1로 대체한다. 인간 세포에서 활성이지만, 이 Cpf1 구축물은 그의 Cas9 대응물보다 덜 효율적이다. 염기 편집을 식물을 포함한 보다 많은 수의 유기체에 걸쳐 보다 유용하게 만들기 위해, 새로운 염기 편집 툴이 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 한 측면은 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 데아미나제; 및 (c) 가이드 핵산과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제와 접촉되고, 여기서 데아미나제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원되고 (예를 들어, 단백질 대 단백질 상호작용, RNA 대 단백질 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 통해 동원되고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하며, 임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 및 가이드 핵산은 공동-발현되는 것인 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 측면은 표적 핵산을 (a) 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고, 임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 표적 핵산을 (a) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고, 임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
제4 측면은 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산, 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고, 임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 동원 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 (a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산; 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 (a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하는 가이드 핵산을 포함하고, 여기서 가이드 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질의 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질에 융합된 펩티드 태그에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V CRISPR-Cas 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템을 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 (a) 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산, 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하고, 여기서 동원 가이드 핵산은 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하고, 가이드 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 동원 가이드 핵산은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 동원 가이드 핵산에 융합된 RNA 동원 모티프에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V CRISPR-Cas 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터, 및 본 발명의 폴리펩티드, 융합 단백질 및/또는 핵산 구축물을 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 핵산 구축물 및 이를 포함하는 발현 카세트, 벡터 및/또는 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
한 실시양태에 관하여 기재된 본 발명의 측면은 그에 비해 구체적으로 기재되지 않지만 상이한 실시양태에 포함될 수 있음이 주목된다. 즉, 모든 실시양태 및/또는 임의의 실시양태의 특색은 임의의 방식으로 및/또는 조합으로 조합될 수 있다. 출원인은 임의의 원래 출원된 청구항을 보정하여 그 방식으로 원래 청구되지 않지만 임의의 다른 청구항 또는 청구항들의 임의의 특색으로부터 종속하고/거나 이를 혼입할 수 있는 권리를 포함한 임의의 원래 출원된 청구항을 변화시키고/거나 그에 따라 임의의 새로운 청구항을 출원할 권리를 남겨 둔다. 본 발명의 이들 및 다른 목적 및/또는 측면은 하기 제시된 명세서에서 상세하게 설명된다. 본 발명의 추가의 특색, 이점 및 상세사항은 이어지는 도면 및 바람직한 실시양태의 상세한 설명을 읽음으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이고, 이러한 설명은 단지 본 발명을 예시한다.
도 1은 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120029를 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120360을 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120300을 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120301을 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 상이한 가이드 핵산을 사용한 편집 시스템에 대한 A에서 G로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120360을 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120300을 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 가이드 핵산으로서 pWg120301을 사용한 편집 시스템에 대한 C에서 T로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 상이한 가이드 핵산을 사용한 편집 시스템에 대한 A에서 G로의 편집 효율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 이제 본 발명의 실시양태가 나타내어진 첨부된 도면 및 실시예를 참고로 이하 기재될 것이다. 이 설명은 본 발명이 실행될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 첨가될 수 있는 모든 특색의 상세한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에 관하여 예시된 특색은 다른 실시양태에 포함될 수 있고, 특정 실시양태에 관하여 예시된 특색은 그 실시양태로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 또한, 본원에서 제안된 다양한 실시양태에 대한 다수의 변동 및 첨가는 본 발명으로부터 벗어나지 않는 본 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 설명은 본 발명의 일부 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도되며, 그의 모든 순열, 조합 및 변동을 철저하게 특정하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참고문헌이 제시된 문장 및/또는 단락에 관한 교시내용에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.
맥락이 달리 지시하지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특색은 임의의 조합으로 사용될 수 있음이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예시하기 위해, 본 명세서가 조성물이 성분 A, B 및 C를 포함한다고 진술하는 경우, 임의의 A, B 또는 C, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 청구배제될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
본 발명의 설명 및 첨부된 청구항에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
또한 본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
측정가능한 값, 예컨대 양 또는 농도 등을 언급하는 경우 본원에 사용된 용어 "약"은 특정된 값의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동 뿐만 아니라 특정된 값을 포괄하는 것으로 의미된다. 예를 들어, "약 X" (여기서 X는 측정가능한 값임)는 X 뿐만 아니라 X의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의미된다. 측정가능한 값에 대해 본원에서 제공된 범위는 임의의 다른 범위 및/또는 그 안의 개별적 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "X 내지 Y" 및 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미하고, "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 나열은 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 단지, 개별적으로 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 지칭하는 약칭 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 별개의 값은 그것이 본원에 개별적으로 나열된 것처럼 명세서에 포함된다. 예를 들어, 범위 10 내지 15가 개시되는 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.
본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 진술된 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 및/또는 성분의 존재를 특정하지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 성분, 및/또는 그의 군의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지 않는다.
본원에 사용된 전이적 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위가 청구항에 나열된 특정된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포괄하는 것으로 해석되어야 함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 청구항에 사용되는 경우 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "증가시키다", "증가시키는", "증진시키다", "증진시키는", "개선시키다" 및 "개선시키는" (및 그의 문법적 파생어)은 대조군과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 초과의 상승을 기재한다.
본원에 사용된 용어 "감소시키다(reduce)", "감소된", "감소시키는", "감소", "감소시키다(diminish)" 및 "감소시키다(decrease)" (및 그의 문법적 파생어)는 예를 들어, 대조군과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 감소를 기재한다. 특정 실시양태에서, 감소는 검출가능한 활성 또는 양이 없거나 본질적으로 없는 것 (즉, 비유의한 양, 예를 들어, 약 10% 또는 심지어 5% 미만)을 발생시킬 수 있다.
"이종" 또는 "재조합" 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 뉴클레오티드 서열의 비-천연 발생 다중 카피를 포함한, 그것이 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 연관되지 않은 뉴클레오티드 서열이다.
"천연" 또는 "야생형" 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 천연 발생 또는 내인성 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "야생형 mRNA"는 참조 유기체에서 천연 발생이거나 그에 대해 내인성인 mRNA이다. "상동" 핵산 서열은 그것이 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 연관된 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 그의 하이브리드인 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포괄한다. dsRNA가 합성적으로 생산되는 경우, 덜 통상적인 염기, 예컨대 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 히포크산틴 등은 또한 안티센스, dsRNA, 및 리보자임 쌍형성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 RNA에 고 친화도로 결합하고, 유전자 발현의 강력한 안티센스 억제제인 것으로 나타났다. 다른 변형, 예컨대 포스포디에스테르 백본, 또는 RNA의 리보스 당 기에서 2'-히드록시에 대한 변형은 또한 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드의 이종중합체 또는 핵산 분자의 5'에서 3' 단부로 이들 뉴클레오티드의 서열을 지칭하며, cDNA, DNA 단편 또는 부분, 게놈 DNA, 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, 플라스미드 DNA, mRNA, 및 안티-센스 RNA (이들 중 임의의 것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있음)를 포함한 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 구축물", "재조합 핵산", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 또한 뉴클레오티드의 이종중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 제공된 핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 5'에서 3' 방향으로, 좌측에서 우측으로 제시되며, 미국 서열 규칙, 37 CFR §§1.821 내지 1.825 및 국제 지적 재산권 기구 (WIPO) 표준 ST.25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 문자를 나타내기 위한 표준 부호를 사용하여 나타내어진다. 본원에 사용된 "5' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 5' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드에서 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다. 본원에 사용된 "3' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 3' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드에서 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, miRNA, 안티-마이크로RNA 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (AMO) 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능적 단백질 또는 유전자 생성물을 생산하는데 사용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 유전자는 코딩 및 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역) 둘 다를 포함할 수 있다. 유전자는 "단리될" 수 있으며, 이는 그의 자연 상태에서 핵산과 관련하여 통상적으로 발견되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 핵산을 의미한다. 이러한 성분은 세포 물질, 재조합 생산으로부터의 배양 배지, 및/또는 핵산을 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학물질을 포함한다.
용어 "돌연변이"는 점 돌연변이 (예를 들어, 미스센스, 또는 넌센스, 또는 격자 이동을 발생시키는 단일 염기 쌍의 삽입 또는 결실), 삽입, 결실, 및/또는 말단절단을 지칭한다. 돌연변이가 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입인 경우, 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기, 이어서 서열 내의 잔기의 위치 및 새롭게 치환된 잔기의 신원을 확인함으로써 기재된다.
본원에 사용된 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기-쌍형성에 의한 허용적인 염 및 온도 조건 하에서의 폴리뉴클레오티드의 천연 결합을 지칭한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T" (5'에서 3'로)는 상보적 서열 "T-C-A" (3'에서 5'로)에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자 사이의 상보성은 뉴클레오티드의 단지 일부가 결합하는 "부분적"일 수 있거나, 또는 이는 총 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재하는 경우 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대한 유의한 효과를 갖는다.
본원에 사용된 "상보체"는 비교자 뉴클레오티드 서열과의 100% 상보성을 의미할 수 있거나, 또는 이는 100% 미만의 상보성 (예를 들어, "실질적으로 상보적", 예를 들어 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등의 상보성)을 의미할 수 있다.
뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드의 "부분" 또는 "단편"은 각각 참조 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드에 비해 감소된 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 잔기(들) (예를 들어, 뉴클레오티드(들) 또는 펩티드(들)만큼 감소된) 길이의 및 참조 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드와 동일한 또는 거의 동일한 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 인접한 잔기를 포함하고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 단편 또는 부분은, 적절한 경우, 그것이 구성요소인 보다 큰 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 예로서, 본 발명의 가이드 핵산의 반복 서열은 야생형 CRISPR-Cas 반복 서열 (예를 들어, 야생형 유형 V CRISPR Cas 반복부, 예를 들어, Cas12a (Cpf1), Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CRISPR Cas 시스템으로부터의 반복부)의 부분을 포함할 수 있다.
상동성을 갖는 상이한 핵산 또는 단백질은 본원에서 "동족체"로 지칭된다. 용어 동족체는 동일한 및 다른 종으로부터의 상동 서열 및 동일한 및 다른 종으로부터의 이종상동 서열을 포함한다. "상동성"은 위치적 동일성 (즉, 서열 유사성 또는 동일성)의 퍼센트의 관점에서 2개 이상의 핵산 및/또는 아미노산 서열 사이의 유사성의 수준을 지칭한다. 상동성은 또한 상이한 핵산 또는 단백질 중에서 유사한 기능적 특성의 개념을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 대한 동족체를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "이종상동"은 종분화 동안 공통 조상 유전자로부터 발생한 상이한 종에서의 상동 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 동족체는 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열과 실질적 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%)을 갖는다.
본원에 사용된 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 성분, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 정렬의 창 전반에 걸쳐 불변하는 정도를 지칭한다. "동일성"은 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 [Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 경우 시험 ("대상") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)와 비교하여 참조 ("의문") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "퍼센트 동일성"은 참조 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열에서 동일한 아미노산의 백분율을 지칭할 수 있다.
2개의 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열의 맥락에서 본원에 사용된 어구 "실질적으로 동일한", 또는 "실질적 동일성"은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같은, 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬된 경우, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 실질적 동일성은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 60개의 뉴클레오티드, 약 70개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드, 약 90개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이, 및 그 안의 임의의 범위 내지 서열의 전장인 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 연속적 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 뉴클레오티드)에 걸쳐 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 또는 단백질 서열은 그것이 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 (또는 코딩된 단백질 서열)와 실질적으로 동일한 기능을 수행한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터 내로 들어가고, 하위서열 좌표가 필요에 따라 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열에 비해 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 스미스 및 와터만(Smith and Waterman)의 국소 상동성 알고리즘, 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 및 리프만(Pearson and Lipman)의 유사성에 대한 검색 방법과 같은 툴에 의해, 및 임의로 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행, 예컨대 GCG® 위스콘신 패키지(Wisconsin Package)® (악셀리스 인크.(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)의 일부로서 이용가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA에 의해 수행될 수 있다. 시험 서열 및 참조 서열의 정렬된 절편에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열에 의해 공유된 동일한 성분의 수 나누기 참조 서열 절편, 예를 들어 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작은 한정된 부분에서의 성분의 총 수이다. 퍼센트 서열 동일성은 동일성 분율 곱하기 100으로서 나타내어진다. 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분에 대한 것, 또는 보다 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "퍼센트 동일성"은 또한 번역된 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTX 버전 2.0 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열은 또한 2개의 서열이 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하는 경우 실질적으로 상보적인 것으로 간주될 수 있다. 일부 대표적인 실시양태에서, 실질적으로 상보적인 것으로 간주되는 2개의 뉴클레오티드 서열은 고도로 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화한다.
핵산 혼성화 실험, 예컨대 서던 및 노던 혼성화의 맥락에서 "엄격한 혼성화 조건" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경적 파라미터 하에서 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.
Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대해 Tm과 동등하도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 초과의 상보적 잔기를 갖는 상보적 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1 mg의 헤파린을 갖는 50% 포름아미드이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 고도로 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.1 5M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2x SSC 세척이다 (SSC 완충제의 설명에 대해서는, 상기 문헌 [Sambrook] 참조). 종종, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 저 염격성 세척은 고 염격성 세척에 선행한다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 두가닥에 대한 중간 엄격성 세척의 예는 45℃에서 15분 동안 1x SSC이다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 두가닥에 대한 저 염격성 세척의 예는 40℃에서 15분 동안 4 내지 6x SSC이다. 짧은 프로브 (예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 수반하고, 온도는 전형적으로 적어도 약 30℃이다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 일반적으로, 특정 혼성화 검정에서 비관련된 프로브에 대해 관찰된 것보다 2x (이상)의 신호 대 잡음 비는 특이적 혼성화의 검출을 지시한다. 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하지 않는 뉴클레오티드 서열은 이들이 코딩하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 카피가 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우 일어날 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 재조합 핵산 구축물은 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트, 및/또는 벡터 (유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 융합 단백질, 및 동원 가이드 핵산 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질, 및 가이드 핵산을 포함함/코딩함)는 유기체 (예를 들어, 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 코돈 최적화된 핵산 구축물, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터는 코돈 최적화되지 않은 참조 핵산 구축물, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터와 약 70% 내지 약 99.9% (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%) 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 유기체 또는 그의 세포 (예를 들어, 식물 및/또는 식물의 세포)에서의 발현을 위해 다양한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소와 작동적으로 회합될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 프로모터, 인트론, 인핸서, 및/또는 종결자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 인트론 (예를 들어, Ubi1 프로모터 및 인트론)과 작동가능하게 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론과 회합된 프로모터는 "프로모터 영역" (예를 들어, Ubi1 프로모터 및 인트론)으로 지칭될 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"이란, 지시된 요소가 서로와 기능적으로 관련되고, 또한 일반적으로 물리적으로 관련됨을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"은 기능적으로 연관된 단일 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 제2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열은 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 놓인 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 실행하는 경우 상기 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 회합된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)은, 제어 서열이 그의 발현을 지정하도록 기능하는 한, 그것이 작동가능하게 회합된 뉴클레오티드 서열과 인접할 필요는 없음을 인정할 것이다. 따라서, 예를 들어, 개재하는 비번역된, 그러나 전사된 핵산 서열은 프로모터 및 뉴클레오티드 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터는 뉴클레오티드 서열과 "작동가능하게 연결된" 것으로 여전히 간주될 수 있다.
폴리펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "연결된" 또는 "융합된"은 한 폴리펩티드의 또 다른 것에의 부착을 지칭한다. 폴리펩티드는 직접적으로 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) 또는 링커 (예를 들어, 펩티드 링커)를 통해 (N-말단 또는 C-말단에서) 또 다른 폴리펩티드에 연결되거나 융합될 수 있다.
폴리펩티드에 관하여 용어 "링커"는 관련 기술분야에 인식되어 있으며, 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어, 융합 단백질의 2개의 폴리펩티드 (예를 들어, 도메인), 예컨대, 예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 펩티드 태그 및/또는 관심의 폴리펩티드를 연결하는 화학기, 또는 분자를 지칭한다. 링커는 단일 연결 분자 (예를 들어, 단일 아미노산)로 구성될 수 있거나, 또는 1개 초과의 연결 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티, 예컨대 2가 유기 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산일 수 있거나, 또는 이는 펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 펩티드 링커는 약 2 내지 약 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이, 예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 60, 약 4 내지 약 40, 약 4 내지 약 50, 약 4 내지 약 60, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 50, 약 5 내지 약 60, 약 9 내지 약 40, 약 9 내지 약 50, 약 9 내지 약 60, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 60개, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개의 아미노산 내지 약 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 105, 110, 115, 120, 130, 140 150개 또는 그 초과의 아미노산의 길이)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 GS 링커일 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티, 예컨대 2가 유기 모이어티일 수 있는 링커에 의해 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 왓슨-크릭 염기-쌍형성을 포함한 공유 또는 비-공유 연결 또는 결합을 통해, 또는 1개 이상의 연결 뉴클레오티드를 통해 (5' 단부 또는 3' 단부에서) 또 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되거나 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 구조의 폴리뉴클레오티드 모티프는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입될 수 있다 (예를 들어 가이드 RNA에서 헤어핀 구조의 연장). 일부 실시양태에서, 연결 뉴클레오티드는 천연 발생 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드일 수 있다.
"프로모터"는 프로모터와 작동가능하게 회합된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 코딩 서열)의 전사를 제어하거나 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터에 의해 제어되거나 조절되는 코딩 서열은 폴리펩티드 및/또는 기능적 RNA를 코딩할 수 있다. 전형적으로, "프로모터"는 RNA 폴리머라제 II에 대한 결합 부위를 함유하고 전사의 개시를 지정하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터는 상응하는 코딩 서열의 코딩 영역의 시작부에 비해 5', 또는 상류에서 발견된다. 프로모터는 유전자 발현의 조절제로서 작용하는 다른 요소; 예를 들어, 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이들은 TATA 박스 컨센서스 서열, 및 종종 CAAT 박스 컨센서스 서열을 포함한다 (Breathnach and Chambon, (1981) Annu. Rev. Biochem. 50:349). 식물에서, CAAT 박스는 AGGA 박스에 의해 치환될 수 있다 (Messing et al., (1983) in Genetic Engineering of Plants, T. Kosuge, C. Meredith and A. Hollaender (eds.), Plenum Press, pp. 211-227). 일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 적어도 1개의 인트론 (예를 들어, 서열식별번호(SEQ ID NO):1 또는 서열식별번호:2)을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 프로모터는 예를 들어, 재조합 핵산 분자, 예를 들어, "합성 핵산 구축물" 또는 "단백질-RNA 복합체"의 제조에 사용하기 위한 구성적, 유도성, 시간적으로 조절된, 발달적으로 조절된, 화학적으로 조절된, 조직-바람직한 및/또는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 다양한 유형의 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
프로모터의 선택은 발현을 위한 시간적 및 공간적 요건에 따라 다양할 수 있으며, 또한 형질전환되는 숙주 세포에 기반하여 다양할 수 있다. 많은 상이한 유기체에 대한 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 관련 기술분야에 존재하는 광범위한 지식에 기반하여, 적절한 프로모터는 관심의 특정 숙주 유기체에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모델 유기체에서 고도로 구성적으로 발현된 유전자의 상류의 프로모터에 관하여 많은 것이 공지되어 있으며, 이러한 지식은 용이하게 접근되고, 적절한 경우 다른 시스템에서 실행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물에서 기능적인 프로모터는 본 발명의 구축물에 사용될 수 있다. 식물에서 발현을 유도하는데 유용한 프로모터의 비-제한적 예는 루비스코(RubisCo) 소형 서브유닛 유전자 1의 프로모터 (PrbcS1), 액틴 유전자의 프로모터 (팩틴(Pactin)), 니트레이트 리덕타제 유전자의 프로모터 (Pnr) 및 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1의 프로모터 (Pdca1)를 포함한다 (문헌 [Walker et al. Plant Cell Rep. 23:727-735 (2005)]; [Li et al. Gene 403:132-142 (2007)]; [Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)] 참조). PrbcS1 및 팩틴은 구성적 프로모터이고, Pnr 및 Pdca1은 유도성 프로모터이다. Pnr은 니트레이트에 의해 유도되고, 암모늄에 의해 억제되며 (Li et al. Gene 403:132-142 (2007)), Pdca1은 염에 의해 유도된다 (Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)).
식물에 유용한 구성적 프로모터의 예는 세스트룸 바이러스 프로모터 (cmp) (미국 특허 번호 7,166,770), 벼 액틴 1 프로모터 (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,641,876), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), CaMV 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), nos 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), Adh 프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), 수크로스 신타제 프로모터 (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), 및 유비퀴틴 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유비퀴틴으로부터 유래된 구성적 프로모터는 많은 세포 유형에서 축적된다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물에 사용하기 위한 몇몇 식물 종, 예를 들어, 해바라기 (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), 메이즈 (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), 및 아라비돕시스 (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906)로부터 클로닝되었다. 메이즈 유비퀴틴 프로모터 (UbiP)는 트랜스제닉 단자엽식물 시스템에서 개발되었으며, 그의 서열 및 단자엽식물 형질전환을 위해 구축된 벡터는 유럽 특허 공개 EP0342926에 개시되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물, 특히 단자엽식물에서의 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합하다. 추가로, 문헌 [McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991))]에 의해 기재된 프로모터 발현 카세트는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 용이하게 변형될 수 있으며, 단자엽식물 숙주에 사용하는데 특히 적합하다.
일부 실시양태에서, 조직 특이적/조직 바람직한 프로모터는 식물 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드의 발현에 사용될 수 있다. 조직 특이적 또는 바람직한 발현 패턴은 녹색 조직 특이적 또는 바람직한, 뿌리 특이적 또는 바람직한, 줄기 특이적 또는 바람직한, 꽃 특이적 또는 바람직한 또는 화분 특이적 또는 바람직한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 녹색 조직에서의 발현에 적합한 프로모터는 광합성에 관여하는 유전자를 조절하는 많은 것을 포함하며, 이들 중 많은 것은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 다로부터 클로닝되었다. 한 실시양태에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 포스포에놀 카르복실라제 유전자로부터의 메이즈 PEPC 프로모터이다 (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예는 종자 저장 단백질 (예컨대 β-콘글리시닌, 크루시페린, 나핀 및 파세올린), 제인 또는 오일 바디 단백질 (예컨대 올레오신), 또는 지방산 생합성에 관여하는 단백질 (아실 운반체 단백질, 스테아로일-ACP 데사투라제 및 지방산 데사투라제 (fad 2-1)를 포함함)을 코딩하는 유전자, 및 배 발생 동안 발현되는 다른 핵산 (예컨대 Bce4, 예를 들어, 문헌 [Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219]; 뿐만 아니라 유럽 특허 번호 255378 참조)과 연관된 것들을 포함한다. 식물, 특히 메이즈에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 유용한 조직-특이적 또는 조직-우선적 프로모터는 뿌리, 중과피, 잎 또는 화분에서 발현을 지정하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 프로모터의 그의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함되는 WO 93/07278에 개시되어 있다. 본 발명에 유용한 조직 특이적 또는 조직 바람직한 프로모터의 다른 비-제한적 예는 미국 특허 6,040,504에 개시된 면화 루비스코 프로모터; 미국 특허 5,604,121에 개시된 벼 수크로스 신타제 프로모터; 문헌 [de Framond (FEBS 290:103-106 (1991)], 시바-가이기(Ciba-Geigy)의 유럽 특허 EP0452269에 의해 기재된 뿌리 특이적 프로모터; 미국 특허 5,625,136 (시바-가이기)에 기재되고, 메이즈 trpA 유전자의 발현을 유도하는 줄기 특이적 프로모터; WO 01/73087에 개시된 세스트룸 황화 잎 말림 바이러스 프로모터; 및 벼로부터의 ProOsLPS10 및 ProOsLPS11 (Nguyen et al. Plant Biotechnol. Reports 9(5):297-306 (2015)), 메이즈로부터의 ZmSTK2_USP (Wang et al. Genome 60(6):485-495 (2017)), 토마토로부터의 LAT52 및 LAT59 (Twell et al. Development 109(3):705-713 (1990)), Zm13 (미국 특허 번호 10,421,972), 아라비돕시스로부터의 PLA2-δ 프로모터 (미국 특허 번호 7,141,424), 및/또는 메이즈로부터의 ZmC5 프로모터 (국제 PCT 공개 번호 WO1999/042587을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화분 특이적 또는 바람직한 프로모터를 포함한다.
식물 조직-특이적/조직 바람직한 프로모터의 추가의 예는 뿌리 털-특이적 시스 -요소 (RHE) (Kim et al. The Plant Cell 18:2958-2970 (2006)), 뿌리-특이적 프로모터 RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) 및 RB7 (미국 특허 번호 5459252), 렉틴 프로모터 (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167; 및 Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), 옥수수 알콜 데히드로게나제 1 프로모터 (Dennis et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000), S-아데노실-L-메티오닌 신테타제 (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8):1108-1115), 옥수수 광 수확 복합체 프로모터 (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), 옥수수 열 충격 단백질 프로모터 (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; 및 Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458), 완두콩 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 (Cashmore, "Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase" pp. 29-39 In: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; 및 Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:193-200), Ti 플라스미드 만노핀 신타제 프로모터 (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-3223), Ti 플라스미드 노팔린 신타제 프로모터 (Langridge et al. (1989), 상기 문헌), 페투니아 칼콘 이소머라제 프로모터 (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7:1257-1263), 콩 글리신 풍부 단백질 1 프로모터 (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646), 말단절단된 CaMV 35S 프로모터 (O'Dell et al. (1985) Nature 313:810-812), 감자 파타틴 프로모터 (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), 뿌리 세포 프로모터 (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), 메이즈 제인 프로모터 (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34:1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449; 및 Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), 글로불린-1 프로모터 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), α-튜불린 cab 프로모터 (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:431-440), PEPC아제 프로모터 (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), R 유전자 복합체-연관된 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), 및 칼콘 신타제 프로모터 (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
종자-특이적 발현에 유용한 것은 완두콩 비실린 프로모터 (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,625,136에 개시된 종자-특이적 프로모터이다. 성숙한 잎에서의 발현을 위한 유용한 프로모터는 노쇠의 개시에서 스위칭된 것들, 예컨대 아라비돕시스로부터의 SAG 프로모터 (Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988)이다.
또한, 엽록체에서 기능적인 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 비-제한적 예는 박테리오파지 T3 유전자 9 5' UTR 및 미국 특허 번호 7,579,516에 개시된 다른 프로모터를 포함한다. 본 발명에 유용한 다른 프로모터는 S-E9 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 및 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 유전자 프로모터 (Kti3)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 추가의 조절 요소는 인트론, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론은 식물에서 확인되고 그로부터 단리되며, 이어서 식물의 형질전환에 사용되도록 발현 카세트 내로 삽입된 인트론일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 인트론은 자기-삭제에 요구되는 서열을 포함할 수 있으며, 핵산 구축물/발현 카세트 내로 프레임 내에서 혼입된다. 인트론은 한 핵산 구축물에서 다수의 단백질-코딩 서열을 분리하는 스페이서로서 사용될 수 있거나, 또는 인트론은 한 단백질-코딩 서열 내부에서, 예를 들어, mRNA를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 이들이 단백질-코딩 서열 내에서 사용되는 경우, 이들은 포함된 삭제 부위와 "프레임 내에서" 삽입된다. 인트론은 또한 발현을 개선시키거나 변형시키기 위해 프로모터와 회합될 수 있다. 예로서, 본 발명에 유용한 프로모터/인트론 조합은 메이즈 Ubi1 프로모터 및 인트론의 그것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론의 비-제한적 예는 ADHI 유전자 (예를 들어, Adh1-S 인트론 1, 2 및 6), 유비퀴틴 유전자 (Ubi1), 루비스코 소형 서브유닛 (rbcS) 유전자, 루비스코 대형 서브유닛 (rbcL) 유전자, 액틴 유전자 (예를 들어, 액틴-1 인트론), 피루베이트 데히드로게나제 키나제 유전자 (pdk), 니트레이트 리덕타제 유전자 (nr), 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1 (Tdca1), psbA 유전자, atpA 유전자로부터의 인트론, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물은 "발현 카세트"일 수 있거나, 또는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 "발현 카세트"는 예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 (예를 들어, 시토신 데아미나제 및/또는 아데닌 데아미나제)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 펩티드 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 친화성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 동원 가이드 핵산 및/또는 가이드 핵산)을 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하고, 여기서 핵산 구축물은 적어도 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)과 작동가능하게 회합된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물을 발현하도록 디자인된 발현 카세트를 제공한다. 발현 카세트가 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 모든 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다 (예를 들어, 3종의 폴리뉴클레오티드는 임의의 조합으로 1, 2 또는 3개의 프로모터에 의해 유도될 수 있음). 따라서, 예를 들어, 발현 카세트에 포함되는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 가이드 핵산은 각각 단일 프로모터와 작동가능하게 회합될 수 있거나, 또는 이들은 임의의 조합으로 별개의 프로모터 (예를 들어, 2 또는 3개의 프로모터)와 작동가능하게 회합될 수 있다. 또 다른 예로서, 발현 카세트에 포함되는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 동원 가이드 핵산은 각각 단일 프로모터와 작동가능하게 회합될 수 있거나, 또는 이들은 임의의 조합으로 별개의 프로모터 (예를 들어, 2 또는 3개의 프로모터)와 작동가능하게 회합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 구축물을 포함하는 발현 카세트는 유기체 (예를 들어, 동물, 식물, 박테리아 등)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 관하여 이종임을 의미한다 (예를 들어, 숙주 유기체에서 발현되는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주 유기체로부터의 프로모터, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주와는 상이한 유기체로부터의 것이거나, 또는 통상적으로 그 프로모터와 연관되어 발견되지 않음). 발현 카세트는 또한 천연 발생이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 얻어진 것일 수 있다.
발현 카세트는 임의로 선택된 숙주 세포에서 기능적인 전사 및/또는 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역) 및/또는 인핸서 영역을 포함할 수 있다. 다양한 전사 종결자 및 인핸서는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 발현 카세트에 사용하기 위해 이용가능하다. 전사 종결자는 전사의 종결 및 정확한 mRNA 폴리아데닐화를 담당한다. 종결 영역 및/또는 인핸서 영역은 전사 개시 영역에 대해 천연일 수 있거나, CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 유전자 또는 데아미나제를 코딩하는 유전자에 대해 천연일 수 있거나, 숙주 세포에 대해 천연일 수 있거나, 또는 또 다른 공급원에 대해 천연일 수 있다 (예를 들어, 프로모터에 대해, CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 유전자 또는 데아미나제를 코딩하는 유전자에 대해, 숙주 세포에 대해 외래 또는 이종, 또는 이들의 임의의 조합).
본 발명의 발현 카세트는 또한 형질전환된 숙주 세포를 선택하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "선택가능한 마커"는 발현되는 경우 마커를 발현하는 숙주 세포에 대해 별개의 표현형을 부여하고, 따라서 이러한 형질전환된 세포가 마커를 갖지 않는 것들로부터 구별되는 것을 허용하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 마커가 화학적 수단에 의해, 예컨대 선택적 작용제 (예를 들어, 항생제 등)를 사용함으로써 선택될 수 있는 소질을 부여하는지 여부, 또는 마커가 단순히 관찰 또는 시험을 통해, 예컨대 스크리닝 (예를 들어, 형광)에 의해 확인할 수 있는 소질인지 여부에 따라, 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커 중 어느 하나를 코딩할 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 많은 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 발현 카세트에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 발현 카세트, 핵산 분자/구축물 및 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터와 관련되어 사용될 수 있다. 용어 "벡터"는 핵산 (또는 핵산들)을 세포 내로 전달하거나(transferring), 전달하거나(delivering), 도입하기 위한 조성물을 지칭한다. 벡터는 전달되거나, 전달되거나 도입되는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산 구축물을 포함한다. 숙주 유기체의 형질전환에 사용하기 위한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 벡터의 일반적 부류의 비-제한적 예는 자기 전파가능하거나 동원가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 이중 또는 단일 가닥 선형 또는 원형 형태의 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터, 포스미드 벡터, 박테리오파지, 인공 염색체, 미니서클, 또는 아그로박테리움(Agrobacterium) 2성분 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된, 또는 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 정의된 바와 같은 벡터는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 원핵생물 또는 진핵생물 숙주를 형질전환시키거나, 염색체외적으로 존재할 수 있다 (예를 들어 복제 원점을 갖는 자율 복제 플라스미드). 추가로 포함되는 것은 셔틀 벡터이며, 이는 방선균류 및 관련된 종, 박테리아 및 진핵생물 (예를 들어 고등 식물, 포유동물, 효모 또는 진균 세포)로부터 선택될 수 있는 2종의 상이한 숙주 유기체에서 자연적으로 또는 디자인에 의해 복제 가능한 DNA 비히클을 의미한다. 일부 실시양태에서, 벡터 중의 핵산은 숙주 세포에서의 전사를 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있고, 그에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 다수의 숙주에서 기능하는 이중-기능적 발현 벡터일 수 있다. 게놈 DNA의 경우에, 이는 그 자신의 프로모터 및/또는 다른 조절 요소를 함유할 수 있고, cDNA의 경우에, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트는 본원에 기재된 바와 같은 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "접촉시키다", "접촉시키는", "접촉된", 및 그의 문법적 파생어는 바람직한 반응의 성분을 바람직한 반응 (예를 들어, 형질전환, 전사 제어, 게놈 편집, 니킹, 및/또는 절단)을 수행하는데 적합한 조건 하에서 함께 놓는 것을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 표적 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질이 발현되고, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질이 가이드 핵산과 복합체를 형성하고, 복합체가 표적 핵산에 혼성화하고, 데아미나제 융합 단백질이 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 (및 따라서, 표적 핵산에) 동원되는 조건 하에서 예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산을 코딩하는 본 발명의 핵산 구축물과 접촉되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 단백질 (임의로 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질), 가이드 핵산, 및 데아미나제 (임의로 데아미나제 융합 단백질)는 표적 핵산에 접촉하고 그에 의해 핵산을 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 단백질, 가이드 핵산, 및/또는 데아미나제는 복합체 (예를 들어, 리보핵단백질, 예컨대 어셈블리된 리보핵단백질 복합체)의 형태일 수 있고, 복합체는 표적 핵산에 접촉한다. 일부 실시양태에서, 복합체 또는 그의 성분 (예를 들어, 가이드 핵산)은 표적 핵산에 혼성화하고, 그에 의해 표적 핵산은 변형된다 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 단백질 및/또는 데아미나제의 작용을 통해). 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 융합 단백질 및 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 임의로 공유 및/또는 비-공유 상호작용을 통해 표적 핵산에 국재화한다.
표적 핵산에 관하여 본원에 사용된 "변형시키는" 또는 "변형"은 표적 핵산의 편집 (예를 들어, 돌연변이화), 공유 변형, 핵산/뉴클레오티드 염기의 교환/치환, 결실, 절단, 니킹, 및/또는 전사 제어를 포함한다.
본원에 사용된 "동원하다", "동원하는" 또는 "동원"은 단백질-단백질 상호작용, RNA-단백질 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 사용하여 1종 이상의 폴리펩티드(들) 또는 폴리뉴클레오티드(들)를 또 다른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 (예를 들어, 게놈에서의 특정 위치에) 유인하는 것을 지칭한다. 단백질-단백질 상호작용은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프, 다량체화된 에피토프) 및 상응하는 친화성 폴리펩티드, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드, 및/또는 화학적 상호작용을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 동원의 목적을 위해 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 유용할 수 있는 예시 화학적 상호작용은 FRB - FKBP의 라파마이신-유도성 이량체화; 비오틴-스트렙타비딘 상호작용; SNAP 태그 (Hussain et al. Curr Pharm Des.19(30):5437-42 (2013)); 할로 태그 (Los et al. ACS Chem Biol. 3(6):373-82 (2008)); CLIP 태그 (Gautier et al. Chemistry & Biology 15:128-136 (2008)); 화합물에 의해 유도된 DmrA-DmrC 이종이량체 (Tak et al. Nat Methods 14(12):1163-1166 (2017)); 이관능성 리간드 접근법 (2종의 단백질-결합 화학물질을 함께 융합함) (Voβ et al. Curr Opin Chemical Biology 28:194-201 (2015)) (예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (Kopyteck et al. Cell Cehm Biol 7(5):313-321 (2000))을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
관심의 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "도입하는", "도입하다", "도입된" (및 그의 문법적 파생어)은 뉴클레오티드 서열이 세포의 내부에의 접근을 얻도록 하는 방식으로 관심의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 가이드 핵산)을 숙주 유기체 또는 상기 유기체의 세포 (예를 들어, 숙주 세포; 예를 들어, 식물 세포)에 제시하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질 및 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산을 코딩하는 본 발명의 핵산 구축물은 유기체의 세포 내로 도입되고, 그에 의해 세포를 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산으로 형질전환시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 세포 내로의 이종 핵산의 도입을 지칭한다. 세포의 형질전환은 안정하거나 일시적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자로 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 핵산 구축물로 일시적으로 형질전환될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "일시적 형질전환"은 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것을 의미한다.
세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "안정하게 도입하는" 또는 "안정하게 도입된"이란, 도입된 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입되고, 따라서 세포가 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "안정한 형질전환" 또는 "안정하게 형질전환된"은 핵산 분자가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 의미한다. 따라서, 통합된 핵산 분자는 그의 자손에 의해, 보다 특히, 다수의 연속적 세대의 자손에 의해 유전될 수 있다. 본원에 사용된 "게놈"은 핵 및 색소체 게놈을 포함하고, 따라서 예를 들어, 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈 내로의 핵산의 통합을 포함한다. 본원에 사용된 안정한 형질전환은 또한 염색체외적으로, 예를 들어, 미니염색체 또는 플라스미드로서 유지되는 트랜스진을 지칭할 수 있다.
일시적 형질전환은 예를 들어, 유기체 내로 도입된 1개 이상의 트랜스진에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 유기체 (예를 들어, 식물) 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 숙주 유기체 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 RNA의 노던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 또한 예를 들어, 표준 방법에 따라 검출될 수 있는 트랜스진의 표적 서열(들)과 혼성화하여, 트랜스진 서열의 증폭을 발생시키는 특이적 프라이머 서열을 채용하는, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 증폭 반응에 의해 검출될 수 있다. 형질전환은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 직접적 시퀀싱 및/또는 혼성화 프로토콜에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 발현 카세트는 일시적으로 발현될 수 있고/거나, 이들은 숙주 유기체의 게놈 내로 안정하게 혼입될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 가이드 핵산과 함께 및 따라서 세포에서 유지된 DNA 없이 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포의 형질전환은 핵 형질전환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포의 형질전환은 색소체 형질전환 (예를 들어, 엽록체 형질전환)을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 구축물은 통상적인 육종 기술을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
진핵생물 및 원핵생물 유기체 둘 다를 형질전환시키는 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적이며, 문헌 전반에 걸쳐 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239]; [Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308 (2013)] 참조).
따라서 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수의 방식으로 숙주 유기체 또는 그의 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 이들이 유기체의 적어도 하나의 세포의 내부에의 접근을 얻는 한, 유기체 내로 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 1개 초과의 뉴클레오티드 서열이 도입되어야 하는 경우, 이들은 단일 핵산 구축물의 일부로서, 또는 별개의 핵산 구축물로서 어셈블리될 수 있고, 동일한 또는 상이한 핵산 구축물 상에 위치할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열은 단일 형질전환 사건에서, 및/또는 별개의 형질전환 사건에서 관심의 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는, 대안적으로, 관련되는 경우, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 육종 프로토콜의 일부로서 식물 내로 혼입될 수 있다.
본 발명은 개선된 염기 편집 핵산 구축물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 펩티드 태그에 융합된 Cas12a 이펙터 단백질을 포함하는 Cas12a 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다.
일부 실시양태에서, Cas12a (Cpf1) 이펙터 단백질은 LbCpf1 [라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 박테리아], AsCpf1 [악시드아미노코쿠스(Acidaminococcus) 종], BpCpf1 [부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus)], CMtCpf1 [칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum)], EeCpf1 [유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens)], FnCpf1 (프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) U112), Lb2Cpf1 [라크노스피라세아에 박테리아], >Lb3Cpf1 [라크노스피라세아에 박테리아], LiCpf1 [렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai)], MbCpf1 [모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi) 237], PbCpf1 [파르쿠박테리아(Parcubacteria) 박테리아 GWC2011_GWC2_44_17], PcCpf1 [포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis)], PdCpf1 [프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens)], PeCpf1 [페레그리니박테리아(Peregrinibacteria) 박테리아 GW2011_GWA_33_10], PmCpf1 [포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae)], 및/또는 SsCpf1 [스미텔라(Smithella) 종 SC_K08D17] (예를 들어, 서열식별번호:3 내지 22 중 어느 하나의 서열을 가짐)일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12a 이펙터 단백질은 라크노스피라세아에 박테리아 ND2006 Cas12a (LbCas12a)(LbCpf1) (예를 들어, 서열식별번호:3 및 9 내지 11 중 어느 하나의 서열을 가짐), 악시드아미노코쿠스 종 Cpf1 (AsCas12a) (AsCpf1) (예를 들어, 서열식별번호:4 중 어느 하나의 서열을 가짐) 및/또는 enAsCas12a (예를 들어, 서열식별번호:20 내지 22 중 어느 하나의 서열을 가짐)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 Cas12a 이펙터 단백질을 포함하는 Cas12a 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공한다.
일부 실시양태에서, (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 ; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산; 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하는 핵산 구축물이 제공된다. 일부 실시양태에서, (a) Cas12a 이펙터 단백질 ; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산; 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하는 핵산 구축물이 제공된다.
일부 실시양태에서, (a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하는 가이드 핵산을 포함하고, 여기서 가이드 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질의 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질에 융합된 펩티드 태그에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V CRISPR-Cas 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템이 제공된다. 일부 실시양태에서, (a) 펩티드 태그에 융합된 Cas12a 이펙터 단백질을 포함하는 Cas12a 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하는 가이드 핵산을 포함하고, 여기서 가이드 핵산은 Cas12a 융합 단백질의 Cas12a 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 Cas12a 융합 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 Cas12a 융합 단백질에 융합된 펩티드 태그에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 Cas12a 융합 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산, 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하고, 여기서 동원 가이드 핵산은 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하고, 가이드 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 동원 가이드 핵산에 융합된 RNA 동원 모티프에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V CRISPR-Cas 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) Cas12a 이펙터 단백질; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산, 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하고, 여기서 동원 가이드 핵산은 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하고, 가이드 핵산은 Cas12a 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 Cas12a 이펙터 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 동원 가이드 핵산에 융합된 RNA 동원 모티프에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 Cas12a 이펙터 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 펩티드 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 친화성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, RNA 동원 모티프, 동원 가이드 핵산 및/또는 가이드 핵산 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터)은 적어도 1개의 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 임의로, 여기서 적어도 1개의 조절 서열은 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 오페론, 종결자, 또는 인핸서일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 인트론일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 예를 들어, 인트론과 작동가능하게 회합된 프로모터 또는 인트론을 포함하는 프로모터 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 및 그의 연관된 인트론 (예를 들어, 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula) 및/또는 제아 메이스(Zea mays) 및 그들의 연관된 인트론)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 종결자 뉴클레오티드 서열 및/또는 인핸서 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 프로모터 영역과 작동가능하게 회합될 수 있고, 여기서 프로모터 영역은 인트론을 포함하고, 임의로 프로모터 영역은 유비퀴틴 프로모터 및 인트론 (예를 들어, 메디카고 또는 메이즈 유비퀴틴 프로모터 및 인트론, 예를 들어, 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:2)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론을 포함하는 프로모터 영역과 작동가능하게 회합된 본 발명의 핵산 구축물은 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 1종 이상의 관심의 폴리펩티드를 추가로 코딩할 수 있고, 임의로 여기서 1종 이상의 관심의 폴리펩티드는 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
본 발명에 유용한 관심의 폴리펩티드는 데아미나제 활성, 니카제 활성, 리콤비나제 활성, 트랜스포사제 활성, 메틸라제 활성, 글리코실라제 (DNA 글리코실라제) 활성, 글리코실라제 억제제 활성 (예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)), 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, 뉴클레아제 활성, 단일-가닥 RNA 절단 활성, 이중-가닥 RNA 절단 활성, 제한 엔도뉴클레아제 활성 (예를 들어, Fok1), 핵산 결합 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, DNA 복구 활성, DNA 손상 활성, 디스뮤타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 폴리머라제 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 핵 국재화 서열 또는 활성, 및/또는 포토리아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리펩티드는 Fok1 뉴클레아제, 또는 우라실-DNA 글리코실라제 억제제이다. 핵산 (폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터)에서 코딩되는 경우, 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질 도메인은 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리펩티드는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 연결되어 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 관심의 폴리펩티드를 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그 또는 친화성 폴리펩티드에 연결된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질은 또한 관심의 폴리펩티드에 연결될 수 있다 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 예를 들어, 펩티드 태그 (또는 친화성 폴리펩티드), 및 예를 들어, 관심의 폴리펩티드, 예를 들어, UGI 둘 다에 연결될 수 있음). 일부 실시양태에서, 관심의 폴리펩티드는 우라실 글리코실라제 억제제 (예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI))일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하고 가이드 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 구축물은 관심의 폴리펩티드를 추가로 코딩할 수 있고, 임의로 여기서 관심의 폴리펩티드는 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하고, 동원 가이드 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 구축물은 관심의 폴리펩티드를 추가로 코딩할 수 있고, 임의로 여기서 관심의 폴리펩티드는 유기체 (예를 들어, 식물)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
본원에 사용된 "유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질" 또는 "유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) 이펙터 단백질"은 핵산을 절단하거나, 커팅하거나, 니킹하고/거나, 핵산 (예를 들어, 표적 핵산 및/또는 가이드 핵산)에 결합하고/거나, 본원에서 정의된 바와 같은 가이드 핵산을 확인하거나, 인식하거나, 결합하는 유형 V CRISPR-Cas 시스템의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 도메인이다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 엔도뉴클레아제, 니카제 등) 또는 그의 부분일 수 있고/거나, 효소로서 기능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 뉴클레아제 활성을 포함하거나 뉴클레아제 활성이 감소되거나 제거된, 및/또는 니카제 활성을 포함하거나 니카제가 감소되거나 제거된, 및/또는 단일 가닥 DNA 절단 활성 (ss DN아제 활성)을 포함하거나 ss DN아제 활성이 감소되거나 제거된, 및/또는 자기-프로세싱 RN아제 활성을 포함하거나 자기-프로세싱 RN아제 활성이 감소되거나 제거된 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 지칭한다. 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 표적 핵산에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas12 이펙터 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 그의 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, Cas12a 뉴클레아제 도메인의 RuvC, HNH, 예를 들어, RuvC 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖고, 따라서, 더 이상 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 통상적으로 "죽은", 예를 들어, dCas12a로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 돌연변이를 갖지 않는 동일한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 예를 들어, 니카제, 예컨대 Cas12a 니카제와 비교하여 손상된 활성 또는 감소된 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 실시양태에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 임의의 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제일 수 있다. 이펙터 단백질로서 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제는 Cas12a (Cpf1), Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 뉴클레아제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인은 Cas12a 폴리펩티드 또는 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제, 임의로, Cas12a 니카제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas12a 이펙터 단백질일 수 있다. Cas12a는 보다 널리 공지된 유형 II CRISPR Cas9와는 몇몇 측면에서 상이하다. 예를 들어, Cas9는 그의 가이드 RNA (gRNA, sgRNA, crRNA, crDNA, CRISPR 어레이) 결합 부위 (프로토스페이서, 표적 핵산, 표적 DNA)에 3'인 G-풍부 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) (3'-NGG)를 인식하는 반면, Cas12a는 표적 핵산에 대해 5'에 위치한 T-풍부 PAM (5'-TTN, 5'-TTTN을 인식한다. 사실, Cas9 및 Cas12a가 그들의 가이드 RNA에 결합하는 배향은 그들의 N 및 C 말단에 관하여 아주 거의 반대이다. 더욱이, Cas12a 효소는 천연 Cas9 시스템에서 발견되는 이중 가이드 RNA (sgRNA (예를 들어, crRNA 및 tracrRNA))라기 보다는 단일 가이드 RNA (gRNA, CRISPR 어레이, crRNA)를 사용하고, Cas12a는 그 자신의 gRNA를 프로세싱한다. 추가로, Cas12a 뉴클레아제 활성은 Cas9 뉴클레아제 활성에 의해 생성된 블런트 단부 대신 엇갈린 DNA 이중 가닥 파단을 생성하고, Cas12a는 둘 다의 DNA 가닥을 절단하기 위해 단일 RuvC 도메인에 의존하는 반면, Cas9는 절단을 위해 HNH 도메인 및 RuvC 도메인을 이용한다.
유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 Cas12a (이전에 Cpf1로 공지됨)로부터 얻어진 CRISPR-Cas12a 폴리펩티드 또는 CRISPR-Cas12a 도메인일 수 있다 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a) 서열의 그의 개시내용에 대해 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,790,490 참조). 용어 "Cas12a", "Cas12a 폴리펩티드" 또는 "Cas12a 도메인"은 Cas12a의 가이드 핵산 결합 도메인 및/또는 Cas12a의 활성, 불활성, 또는 부분적으로 활성 DNA 절단 도메인을 포함하는 Cas12a 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 지칭하고/거나, RNA-가이드된 폴리펩티드는 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 Cas12a는 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, Cas12a 도메인의 RuvC 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖고, 따라서, 더 이상 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 Cas12a 도메인 또는 Cas12a 폴리펩티드는 통상적으로 죽은Cas12a (예를 들어, dCas12a)로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖는 Cas12a 도메인 또는 Cas12a 폴리펩티드는 손상된 활성을 가질 수 있다 (예를 들어, 손상된 니카제 활성을 가질 수 있음).
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas12a 폴리펩티드)은 유기체에서의, 예를 들어, 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas12a 폴리펩티드)은 식물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
염기 편집에 유용한 임의의 데아미나제 또는 그의 도메인 또는 폴리펩티드는 본 발명에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "시토신 데아미나제" 및 "시티딘 데아미나제"는 폴리펩티드 또는 도메인이 시토신 염기로부터의 아민 기의 제거를 촉매하거나 촉매할 수 있다는 점에서, 시토신 탈아미노화를 촉매하거나 촉매할 수 있는 폴리펩티드 또는 그의 도메인을 지칭한다. 따라서, 시토신 데아미나제는 시토신의 티미딘으로의 전환 (우라실 중간체를 통해)을 발생시켜, 게놈의 상보적 가닥에서 C의 T로의 전환, 또는 G의 A로의 전환을 유발할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 시토신 데아미나제는 표적 핵산의 센스 (예를 들어, "+"; 주형) 가닥에서 C→T 전환 또는 표적 핵산의 안티센스 (예를 들어, "-", 상보적) 가닥에서 G→A 전환을 생성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 시토신 데아미나제는 게놈에서의 상보적 가닥에서 C에서 T, G, 또는 A로의 전환을 생성한다.
본 발명에 유용한 시토신 데아미나제는 임의의 유기체로부터의 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 시토신 데아미나제일 수 있다 (예를 들어, 그의 각각이 시토신 데아미나제의 그의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 10,167,457 및 문헌 [Thuronyi et al. Nat. Biotechnol. 37:1070-1079 (2019)] 참조). 시토신 데아미나제는 시티딘 또는 데옥시시티딘의 각각 우리딘 또는 데옥시우리딘으로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 시토신의 우라실로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매할 수 있는 시티딘 데아미나제 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이, 침팬지, 고릴라), 개, 소, 래트 또는 마우스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 천연-발생 시토신 데아미나제의 변이체일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 시토신 데아미나제는 야생형 시토신 데아미나제와 약 70% 내지 약 100% 동일할 수 있다 (예를 들어, 천연 발생 시토신 데아미나제와 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일함, 및 그 안의 임의의 범위 또는 값).
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 시토신 데아미나제는 아포지질단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제, APOBEC2 데아미나제, APOBEC3A 데아미나제, APOBEC3B 데아미나제, APOBEC3C 데아미나제, APOBEC3D 데아미나제, APOBEC3F 데아미나제, APOBEC3G 데아미나제, APOBEC3H 데아미나제, APOBEC4 데아미나제, 인간 활성화 유도된 데아미나제 (hAID), rAPOBEC1, FERNY, 및/또는 CDA1, 임의로 pmCDA1, atCDA1 (예를 들어, At2g19570), 및 이의 진화된 버전일 수 있다. 진화된 데아미나제는 예를 들어, 미국 특허 번호 10,113,163, 문헌 [Gaudelli et al. Nature 551(7681):464-471 (2017))] 및 [Thuronyi et al. (Nature Biotechnology 37: 1070-1079 (2019))]에 개시되어 있으며, 그의 각각은 데아미나제 및 진화된 데아미나제의 그들의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제, 임의로 서열식별번호:23의 아미노산 서열을 갖는 APOBEC1 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제, 임의로 서열식별번호:24의 아미노산 서열을 갖는 APOBEC3A 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 CDA1 데아미나제, 임의로 서열식별번호:25의 아미노산 서열을 갖는 CDA1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 FERNY 데아미나제, 임의로 서열식별번호:26의 아미노산 서열을 갖는 FERNY일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 rAPOBEC1 데아미나제, 임의로 서열식별번호:27의 아미노산 서열을 갖는 rAPOBEC1 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 hAID 데아미나제, 임의로 서열식별번호:28 또는 서열식별번호:29의 아미노산 서열을 갖는 hAID일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 시토신 데아미나제는 천연 발생 시토신 데아미나제 (예를 들어, "진화된 데아미나제") (예를 들어, 서열식별번호:30, 서열식별번호:31, 서열식별번호:32 참조)의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 100% 동일할 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일할) 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 시토신 데아미나제는 서열식별번호:23 내지 32 중 어느 하나의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 99.5% 동일할 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일할) (예를 들어, 서열식별번호:23 내지 32의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할) 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유기체 (예를 들어, 식물)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있고, 코돈 최적화된 폴리펩티드는 참조 폴리뉴클레오티드와 약 70% 내지 99.5% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 "아데닌 데아미나제" 및 "아데노신 데아미나제"는 아데닌 또는 아데노신의 가수분해적 탈아미노화 (예를 들어, 아데닌으로부터의 아민 기의 제거)를 촉매하거나 촉매할 수 있는 폴리펩티드 또는 그의 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 아데노신 또는 데옥시아데노신의 각각 이노신 또는 데옥시이노신으로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 DNA에서의 아데닌 또는 아데노신의 가수분해적 탈아미노화를 촉매할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물에 의해 코딩되는 아데닌 데아미나제는 표적 핵산의 센스 (예를 들어, "+"; 주형) 가닥에서의 A→G 전환 또는 표적 핵산의 안티센스 (예를 들어, "-", 상보적) 가닥에서의 T→C 전환을 생성할 수 있다. 본 발명에 유용한 아데닌 데아미나제는 임의의 유기체로부터의 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 아데닌 데아미나제일 수 있다 (예를 들어, 아데닌 데아미나제의 그의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 10,113,163 참조).
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 천연-발생 아데닌 데아미나제의 변이체일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 야생형 아데닌 데아미나제와 약 70% 내지 100% 동일할 수 있다 (예를 들어, 천연 발생 아데닌 데아미나제와 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일함, 및 그 안의 임의의 범위 또는 값). 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제는 자연에서 발생하지 않으며, 조작된, 돌연변이된 또는 진화된 아데노신 데아미나제로 지칭될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조작된, 돌연변이된 또는 진화된 아데닌 데아미나제 폴리펩티드 또는 아데닌 데아미나제는 천연 발생 아데닌 데아미나제 폴리펩티드와 약 70% 내지 99.9% 동일할 수 있다 (예를 들어, 천연 발생 아데닌 데아미나제 폴리펩티드 또는 아데닌 데아미나제 도메인과 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일함, 및 그 안의 임의의 범위 또는 값). 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 박테리아 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus) 등)로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제 도메인은 야생형 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제 도메인, 예를 들어, tRNA-특이적 아데노신 데아미나제 (TadA) 및/또는 돌연변이된/진화된 아데노신 데아미나제, 예를 들어, 돌연변이된/진화된 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제 (TadA*)일 수 있다. 일부 실시양태에서, TadA는 이. 콜라이로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, TadA는 변형될, 예를 들어, 말단절단될, 전장 TadA에 비해 1개 이상의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산을 소실할 수 있다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 또는 20개의 N-말단 및/또는 C 말단 아미노산 잔기는 전장 TadA에 비해 소실될 수 있다. 일부 실시양태에서, TadA 폴리펩티드 또는 TadA 도메인은 N-말단 메티오닌을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 야생형 이. 콜라이 TadA는 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이된/진화된 이. 콜라이 TadA*는 서열식별번호: 34 내지 37 (예를 들어, 서열식별번호: 34, 35, 36, 또는 37)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TadA/TadA*를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 서열식별번호:33 내지 43 중 어느 하나의 아미노산 서열의 전부 또는 부분을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 "우라실 글리코실라제 억제제" 또는 "UGI"는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-삭제 복구 효소를 억제할 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, UGI는 야생형 UGI 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 UGI는 천연 발생 UGI의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 100% 동일할 수 있다 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일함 및 그 안의 임의의 범위 또는 값). 일부 실시양태에서, UGI는 서열식별번호:44의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:44의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 99.5% 동일성을 갖는 (예를 들어, 서열식별번호:44의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, UGI는 서열식별번호:44의 아미노산 서열의 연속적 뉴클레오티드 (예를 들어, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개의 연속적 뉴클레오티드; 예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45개, 내지 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개의 연속적 뉴클레오티드)의 부분과 100% 동일한 서열식별번호:44의 아미노산 서열의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, UGI는 공지된 UGI와 약 70% 내지 약 99.5% 동일성 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 동일성, 및 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 갖는 공지된 UGI (예를 들어, 서열식별번호:44)의 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, UGI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물 (예를 들어, 식물)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있고, 코돈 최적화된 폴리펩티드는 참조 폴리뉴클레오티드와 약 70% 내지 약 99.5% 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 펩티드 태그에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질, 및 가이드 핵산; 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산 및 RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 핵산 구축물은 관심의 폴리펩티드를 추가로 포함할/코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리펩티드는 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) (예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제) 폴리펩티드 또는 도메인일 수 있고, 임의로 여기서 UGI는 유기체 (예를 들어, 식물)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실라제 억제제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실라제 억제제는 단백질-단백질 동원, 단백질-RNA 동원, 및/또는 화학적 동원에 대해 본원에 개시된 방법 및 구축물을 통해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 동원될 수 있다. 따라서, 예로서 글리코실라제 억제제는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 태그/친화성 폴리펩티드, RNA 동원 모티프/친화성 폴리펩티드 및/또는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용 (또는 다른 화학적 상호작용)을 이용하여 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 동원될 수 있다.
유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 그의 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 핵산 구축물은 표적 핵산을 변형시키도록 코딩된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 함께 기능하도록 디자인된 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA, CRISPR 어레이, CRISPR RNA, crRNA) 또는 동원 가이드 핵산과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산은 적어도 1개의 스페이서 서열 및 적어도 1개의 반복 서열을 포함할 수 있다. 가이드 핵산 및 동원 가이드 핵산은 본 발명의 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물에 의해 코딩되고 발현되는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질)과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 복합체를 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 표적 핵산에) 가이드하고, 그에 의해 표적 핵산은 임의로 데아미나제 (예를 들어, 임의로 복합체에 존재하고/거나 그에 동원된 시토신 데아미나제 및/또는 아데닌 데아미나제)에 의해 변형될 (예를 들어, 절단되거나 편집될) 및/또는 조정될 (예를 들어, 전사를 조정함) 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 태그에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c) (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 융합 단백질), 및 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구축물은 유형 V CRISPR-Cas 가이드 핵산과 조합으로 사용되어 표적 핵산을 변형시킬 수 있고, 여기서 가이드 핵산은 표적 핵산에 결합하고, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질의 펩티드 태그에의 데아미나제의 친화성 폴리펩티드의 결합을 통해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 및 표적 핵산에 동원되고, 그에 의해 데아미나제 융합 단백질의 데아미나제는 이어서 표적 핵산에서 시토신 염기를 탈아미노화하고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 편집할) 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c), 및 RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구축물은 RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산을 포함하는 동원 가이드 핵산과 조합으로 사용되어 표적 핵산을 변형시킬 수 있고, 여기서 동원 가이드 핵산은 표적 핵산에 결합하고, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 동원 가이드 핵산의 RNA 동원 모티프에의 친화성 폴리펩티드의 결합을 통해 표적 핵산에 동원되고, 그에 의해 데아미나제 융합 단백질의 데아미나제는 이어서 표적 핵산에서 시토신 염기를 탈아미노화하고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 편집할) 수 있다.
본원에 사용된 "가이드 핵산", "가이드 RNA", "gRNA", "CRISPR RNA/DNA", "crRNA" 또는 "crDNA"는 표적 DNA (예를 들어, 프로토스페이서)에 상보적인 (및 그에 혼성화하는) 적어도 1개의 스페이서 서열, 및 적어도 1개의 반복 서열 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c, 또는 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 유형 V CRISPR-Cas 시스템의 반복부, 또는 그의 단편 또는 부분)을 포함하는 핵산을 지칭하고, 여기서 반복 서열은 스페이서 서열의 5' 단부 및/또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 본 발명의 gRNA의 디자인은 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 기반한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 예를 들어, Cas12a gRNA는 5'에서 3'로, 반복 서열 (예를 들어, 전장 반복 서열 또는 그의 부분 ("핸들"); 예를 들어, 슈도노트-유사 구조) 및 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "동원 가이드 핵산" 또는 "동원 가이드 RNA"는 RNA 동원 모티프를 포함하는 본원에서 정의된 바와 같은 가이드 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프는 동원 가이드 핵산의 3' 단부 또는 5' 단부에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프는 동원 가이드 핵산 내로 (예를 들어, 헤어핀 루프 내의) 삽입될 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 동원 모티프는 친화성 폴리펩티드에 의해 인식될 수 있는 임의의 RNA 모티프일 수 있고, 예를 들어, RNA 동원 모티프는 친화성 폴리펩티드에 의해 결합될 수 있다. RNA 동원 모티프 및 그의 상응하는 친화성 폴리펩티드는 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 Ku의 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, Ku 이종이량체); 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7의 친화성 폴리펩티드; MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 MS2 코트 단백질 (MCP)의 친화성 폴리펩티드, PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 PP7 코트 단백질 (PCP)의 친화성 폴리펩티드; SfMu 파지 Com 스템-루프 및 Com RNA 결합 단백질의 친화성 폴리펩티드; PUF 결합 부위 (PBS) 및 상응하는 푸밀리오(Pumilio)/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF); 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 압타머 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, WO2018/129129 및 미국 특허 출원 공개 번호 20190218261 및 20180094257을 참조하며, 그의 각각은 RNA 동원 모티프의 그들의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 동원 가이드 핵산은 1개의 RNA 동원 모티프에 또는 2개 이상의 RNA 동원 모티프 (예를 들어, RNA 동원 모티프의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 카피; 예를 들어, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 8, 약 5 내지 약 8, 약 5 내지 약 10개 등의 동원 모티프)에 연결될 수 있고, 임의로 여기서 2개 이상의 RNA 동원 모티프는 동일한 RNA 동원 모티프일 수 있거나, 또는 상이한 RNA 동원 모티프일 수 있다. 본 발명에 유용할 수 있는 예시적인 RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드는 서열식별번호:45 내지 55를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산은 1개 초과의 반복 서열-스페이서 서열 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 반복부-스페이서 서열) (예를 들어, 반복부-스페이서-반복부, 예를 들어, 반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서 등)을 포함할 수 있다. 본 발명의 가이드 핵산 또는 동원 가이드 핵산은 합성, 인간-제조이며, 자연에서 발견되지 않는다. gRNA는 매우 길 수 있고, 압타머 (MS2 동원 전략에서와 같이) 또는 스페이서, 예를 들어, 동원 가이드 핵산을 늘어뜨린 다른 RNA 구조로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "반복 서열"은 예를 들어, 야생형 유형 V CRISPR Cas 유전자좌 (예를 들어, Cas12a 유전자좌, Cas12b 유전자좌, Cas12c 유전자좌 (C2c3), Cas12d 유전자좌 (CasY), Cas12e 유전자좌 (CasX), Cas12g 유전자좌, Cas12h 유전자좌, Cas12i 유전자좌, C2c1 유전자좌, C2c4 유전자좌, C2c5 유전자좌, C2c8 유전자좌, C2c9 유전자좌, C2c10 유전자좌, Cas14a 유전자좌, Cas14b 유전자좌, 및/또는 Cas14c 유전자좌, 또는 그의 단편)의 임의의 반복 서열 또는 본 발명의 핵산 구축물에 의해 코딩되는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 함께 기능적인 합성 crRNA의 반복 서열을 지칭한다. 본 발명에 유용한 반복 서열은 유형 V CRISPR-Cas 유전자좌의 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 반복 서열일 수 있거나, 또는 이는 유형 V CRISPR-Cas 시스템에서 기능하도록 디자인된 합성 반복부일 수 있다. 반복 서열은 헤어핀 구조 및/또는 스템 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복 서열은 그의 5' 단부에서 슈도노트-유사 구조 (즉, "핸들")를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반복 서열은 야생형 유형 V CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 야생형 CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열은 확립된 알고리즘을 통해, 예컨대 CRISPRdb를 통해 제공되는 CRISPR파인더를 사용하여 결정될 수 있다 (문헌 [Grissa et al. Nucleic Acids Res. 35(Web Server issue):W52-7] 참조). 일부 실시양태에서, 반복 서열, 또는 그의 부분은 그의 3' 단부에서 스페이서 서열의 5' 단부에 연결되고, 그에 의해 반복부-스페이서 서열 (예를 들어, 가이드 RNA, crRNA)을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 반복 서열은 특정 반복부 및 반복부를 포함하는 가이드 핵산이 프로세싱되는지 비프로세싱되는지 여부에 따라 적어도 10개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 내지 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값; 예를 들어, 약)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 반복 서열은 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 100, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 15 내지 약 50, 약 50 내지 약 100, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 50, 약 20 내지 약 100, 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 100, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 100, 약 50 내지 약 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
스페이서 서열의 5' 단부에 연결된 반복 서열은 반복 서열의 부분 (예를 들어, 야생형 반복 서열의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 또는 그 초과의 인접한 뉴클레오티드)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 5' 단부에 연결된 반복 서열의 부분은 약 5 내지 약 10개의 연속적 뉴클레오티드의 길이 (예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드)일 수 있고, 야생형 CRISPR Cas 반복 뉴클레오티드 서열의 동일한 영역 (예를 들어, 5' 단부)과 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 반복 서열의 부분은 그의 5' 단부에 슈도노트-유사 구조 (예를 들어, "핸들")를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "스페이서 서열"은 표적 핵산 (예를 들어, 표적 DNA) (예를 들어, 프로토스페이서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있다 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과)). 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산과 비교하여 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 미스매치를 가질 수 있으며, 미스매치는 인접하거나 비인접할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산에 70% 상보성을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 80% 상보성을 가질 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 (프로토스페이서)에 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 상보성 등을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산에 100% 상보적이다. 스페이서 서열은 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)의 길이를 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 적어도 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드의 길이인 표적 핵산 (예를 들어, 프로토스페이서)의 영역에 걸쳐 완전한 상보성 또는 실질적 상보성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 약 20개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 약 21, 22, 또는 23개의 뉴클레오티드의 길이이다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산의 스페이서 서열의 5' 영역은 표적 DNA와 동일할 수 있는 반면, 스페이서의 3' 영역은 표적 DNA에 실질적으로 상보적일 수 있거나 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas), 또는 가이드 핵산의 스페이서 서열의 3' 영역은 표적 DNA와 동일할 수 있고, 따라서, 표적 DNA에 대한 스페이서 서열의 전체적 상보성은 100% 미만일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 대한 가이드에서, 예를 들어, 20 뉴클레오티드 스페이서 서열의 5' 영역 (즉, 시드 영역)의 최초 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 3' 영역에서 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 5' 단부의 최초 1 내지 8개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 최초 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 뉴클레오티드, 및 그 안의 임의의 범위)는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 3' 영역에서의 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50% 상보적 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과))이다. 동원 가이드 핵산은 가이드 핵산의 5' 단부에 연결될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 동원 모티프를 추가로 포함하고, 가이드 핵산 또는 1개 이상의 RNA 동원 모티프(들)의 3' 단부는 동원 가이드 핵산 내로 (예를 들어, 헤어핀 루프 내의) 삽입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스페이서의 시드 영역은 약 8 내지 약 10개의 뉴클레오티드의 길이, 약 5 내지 약 6개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 6개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
본원에 사용된 "표적 핵산", "표적 DNA", "표적 뉴클레오티드 서열", "표적 영역", 또는 "게놈에서의 표적 영역"은 본 발명의 가이드 핵산에서의 스페이서 서열과 완전히 상보적 (100% 상보적)이거나 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 70% 상보적 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과))인 유기체의 게놈의 영역을 지칭한다. 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)로 공지된 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 유용한 표적 영역은 스페이서 (또는 표적) 서열에 인접하여 위치할 수 있다. 이들 PAM DNA 서열은 전형적으로 CRISPR 복합체의 비-표적 가닥에 관하여 그들의 서열 및 위치를 언급함으로써 기재된다. 이들 PAM 서열은 프로토스페이서 서열의 단부에 대해 3' (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 시스템) 또는 5' (예를 들어, 유형 II CRISPR-Cas 시스템)일 수 있다. 표적 영역 (또한 프로토스페이서로 지칭됨)은 PAM 서열에 바로 인접하여 위치한 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드 (예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 등)의 임의의 영역으로부터 선택될 수 있다.
"프로토스페이서 서열"은 CRISPR 반복부-스페이서 서열 (예를 들어, 가이드 핵산, CRISPR 어레이, crRNA)의 스페이서 서열에 완전히 또는 실질적으로 상보적인 (및 혼성화하는) 표적 이중 가닥 DNA 및 구체적으로 표적 DNA의 부분 (예를 들어, 또는 게놈에서의 표적 영역)을 지칭한다.
유형 V CRISPR-Cas (예를 들어, Cas12a) 시스템의 경우에, 프로토스페이서 서열은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 의해 플랭킹된다 (예를 들어, 그에 바로 인접함). 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 대해, PAM은 비-표적 가닥 상의 5' 단부에 및 표적 가닥의 3' 단부에 위치한다 (예로서, 하기 참조).
가이드 구조 및 PAM은 문헌 [R. Barrangou (Genome Biol. 16:247 (2015))]에 의해 기재되어 있다.
정준 유형 V CRISPR-Cas12a PAM은 T 풍부성이다. 일부 실시양태에서, 정준 Cas12a PAM 서열은 5'-TTN, 5'-TTTN, 또는 5'-TTTV일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-정준 PAM은 사용될 수 있지만, 덜 효율적일 수 있다.
추가의 PAM 서열은 확립된 실험 및 컴퓨터적 접근법을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 실험적 접근법은 모든 가능한 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 서열을 표적화하고, 예컨대 표적 플라스미드 DNA의 형질전환을 통해, 표적화를 겪지 않은 서열 구성원을 확인하는 것을 포함한다 (Esvelt et al. 2013. Nat. Methods 10:1116-1121; Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239). 일부 측면에서, 컴퓨터적 접근법은 천연 스페이서의 BLAST 검색을 수행하여 박테리오파지 또는 플라스미드에서 원래 표적 DNA 서열을 확인하고, 이들 서열을 정렬하여 표적 서열에 인접한 보존된 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다 (Briner and Barrangou. 2014. Appl. Environ. Microbiol. 80:994-1001; Mojica et al. 2009. Microbiology 155:733-740).
본원에 기재된 바와 같이, "펩티드 태그"는 1종 이상의 폴리펩티드를 동원하기 위해 채용될 수 있다. 펩티드 태그는 상응하는 친화성 폴리펩티드에 의해 결합될 수 있는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드 태그는 또한 "에피토프", 및 다중 카피로 제공되는 경우, "다량체화된 에피토프"로 지칭될 수 있다. 예시 펩티드 태그는 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그(Sun-Tag)), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 또한 SH2 도메인에 의해 인식되는 특이적 서열 맥락에서 인산화된 티로신, 14-3-3 단백질에 의해 인식되는 포스포세린을 함유하는 특징적인 컨센서스 서열, SH3 도메인에 의해 인식되는 프롤린 풍부 펩티드 모티프, PDZ 단백질 상호작용 도메인 또는 PDZ 신호 서열, 및 식물로부터의 AGO 후크 모티프를 포함할 수 있다. 펩티드 태그는 WO2018/136783 및 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0219596에 개시되어 있으며, 이는 펩티드 태그의 그들의 개시내용에 대해 참조로 포함된다. 본 발명에 유용할 수 있는 펩티드 태그는 서열식별번호:59 및 서열식별번호:60을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 펩티드 태그에 유용한 친화성 폴리펩티드는 서열식별번호:61을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
폴리펩티드에 연결될 수 있고 또 다른 폴리펩티드에 연결될 수 있는 상응하는 친화성 폴리펩티드가 있는 임의의 에피토프는 펩티드 태그로서 본 발명에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 펩티드 태그의 1 또는 2개 이상의 카피 (예를 들어, 펩티드 반복 단위, 다량체화된 에피토프 (예를 들어, 탠덤 반복부)) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 펩티드 태그(들))를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그와 상호작용하는/그에 결합하는 친화성 폴리펩티드는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 scFv 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드는 아피바디, 안티칼린, 모노바디 및/또는 DARPin을 포함하나 이에 제한되지는 않는 합성일 (예를 들어, 친화성 상호작용을 위해 진화될) 수 있다 (예를 들어, 그의 각각은 아피바디, 안티칼린, 모노바디 및/또는 DARPin에 관한 교시내용에 대해 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Sha et al., Protein Sci. 26(5):910-924 (2017))]; [Gilbreth (Curr Opin Struc Biol 22(4):413-420 (2013))], 미국 특허 번호 9,982,053 참조.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 RNA 동원 모티프에 연결될 수 있고, 동원되는 폴리펩티드 (예를 들어, 데아미나제)는 RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 여기서 가이드 핵산은 표적 핵산에 결합하고, RNA 동원 모티프는 친화성 폴리펩티드에 결합하고, 그에 의해 폴리펩티드를 가이드 핵산에 동원하고, 표적 핵산을 폴리펩티드 (예를 들어, 데아미나제)와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 폴리펩티드는 가이드 핵산에 동원될 수 있고, 그에 의해 표적 핵산을 2종 이상의 폴리펩티드 (예를 들어, 데아미나제)와 접촉시킨다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 및 핵산을 동원하기 위핸 성분은 FRB - FKBP의 라파마이신-유도성 이량체화; 비오틴-스트렙타비딘; SNAP 태그; 할로 태그; CLIP 태그; 화합물에 의해 유도된 DmrA-DmrC 이종이량체; 및/또는 이관능성 리간드 (예를 들어, 함께 2종의 단백질-결합 화학물질의 융합; 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 화학적 상호작용을 통해 기능하는 것들을 포함할 수 있다.
펩티드 태그는 펩티드 태그 (예를 들어, 다량체화된 펩티드 태그 또는 다량체화된 에피토프) (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 9, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 또는 그 초과의 펩티드 태그) 의 1개의 카피 또는 2개 이상의 카피를 포함하거나 이에 존재할 수 있다. 다량체화되는 경우, 펩티드 태그는 서로에 직접적으로 융합될 수 있거나, 또는 이들은 1개 이상의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 아미노산, 임의로 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 5 내지 약 15, 또는 약 5 내지 약 20개의 아미노산 등, 및 그 안의 임의의 값 또는 범위를 통해 서로에 연결될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질은 1종의 펩티드 태그에 또는 2종 이상의 펩티드 태그에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함할 수 있고, 임의로 여기서 2종 이상의 펩티드 태그는 1개 이상의 아미노산 잔기를 통해 서로에 융합된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 펩티드 태그는 GCN4 펩티드 태그 또는 에피토프의 단일 카피일 수 있거나, 또는 펩티드 태그의 약 2 내지 약 25개 또는 그 초과의 카피 (예를 들어, GCN4 에피토프의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 카피 또는 그 안의 임의의 범위)를 포함하는 다량체화된 GCN4 에피토프일 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 유형 V CRISPR-Cas 단백질에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질의 C-말단에 융합되거나 연결되어 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질의 N-말단에 융합되거나 연결되어 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 태그가 1종 초과의 펩티드 태그를 포함하는 경우, 에피토프의 양 및/또는 간격은 펩티드 태그의 점유를 최대화하고, 예를 들어, 서로와의 데아미나제 도메인의 입체 간섭을 최소화하도록 펩티드 태그 내에서 최적화될 수 있다.
"친화성 폴리펩티드" (예를 들어, "동원 폴리펩티드")는 그의 상응하는 펩티드 태그 또는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 펩티드 태그에 대한 친화성 폴리펩티드는 예를 들어, 펩티드 태그에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 단일 쇄 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그에 대한 항체는 scFv 항체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 친화성 폴리펩티드는 임의로 데아미나제를 동원 가이드 핵산 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원하기 위해 데아미나제 (예를 들어, 시토신 데아미나제 또는 아데닌 데아미나제)의 N-말단에 융합되거나 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화성 폴리펩티드는 세포 또는 세포 추출물의 환원 조건 하에서 안정하다.
본 발명의 핵산 구축물 및/ 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산을 포함하는 것과 동일한 또는 별개의 발현 카세트 또는 벡터에 포함될 수 있다.
가이드 핵산 및 동원 가이드 핵산과 조합으로 사용되는 경우, 본 발명의 핵산 구축물 (및 이를 포함하는 발현 카세트 및 벡터)은 표적 핵산 및/또는 그의 발현을 변형시키는데 사용될 수 있다. 표적 핵산은 표적 핵산을 가이드 핵산/동원 가이드 핵산 (및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및 벡터와 접촉시키기 전에, 그와 공동으로 또는 후에 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터와 접촉될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조성물, 복합체 (예를 들어, 리보핵복합체), 시스템, 핵산 구축물, 발현 카세트 및/또는 벡터를 사용하여 표적 핵산을 변형시키는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 생체내 시스템에서 (예를 들어, 세포에서 또는 유기체에서) 또는 시험관내 시스템 (예를 들어, 무세포)에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 데아미나제; 및 (c) 가이드 핵산과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제와 접촉되고, 여기서 데아미나제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원되고 (예를 들어, 단백질 대 단백질 상호작용, RNA 대 단백질 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 통해 동원되고), 임의로 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 및 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 (a) 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질; (b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및 (c) 가이드 핵산과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고, 임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 태그의 1개의 카피, 또는 펩티드 태그의 2개 이상의 카피 (예를 들어, 2개 이상의 에피토프)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 예를 들어, 1 내지 약 25개의 반복 단위를 포함하는 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화성 폴리펩티드는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 데아미나제는 표적 핵산과 접촉되고, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질에 의해 동원될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 서로와 동일한 또는 상이한 스페이서 및/또는 반복부를 포함할 수 있는 1종 초과의 가이드 핵산과 접촉되고, 그에 의해 표적 핵산 상의 상이한 부위의 표적화 및/또는 상이한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas12a, Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c)과의 상호작용을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 RNA를 포함하는 동원 가이드 핵산, 및 (c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질과 접촉시키고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉될 수 있고, 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 동원 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 RNA 동원 모티프(들)는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 데아미나제는 표적 핵산과 접촉될 수 있고, 동원 가이드 핵산에 의해 동원될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 서로와 동일한 또는 상이한 RNA 동원 모티프 및/또는 스페이서 및/또는 반복부를 포함할 수 있는 1종 초과의 동원 가이드 핵산과 접촉되고, 그에 의해 표적 핵산 상의 상이한 부위 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 상이한 부위)의 표적화를 허용하고, 상이한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과의 상호작용 및 다수의 폴리펩티드의 동원을 허용할 수 있고, 폴리펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 변형시키는데 유용한 데아미나제는 본원에 기재된 바와 같은 시토신 데아미나제 및/또는 아데닌 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 아포지질단백질 B mRNA 편집 촉매 폴리펩티드-유사 (APOBEC) 도메인, 인간 활성화 유도된 데아미나제 (hAID), FERNY 데아미나제, 및/또는 CDA1 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, APOBEC 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 TadA (tRNA-특이적 아데노신 데아미나제) 및/또는 TadA* (진화된 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 글리코실라제 억제제 및/또는 글리코실라제 억제제 (예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI))를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는/발현시키는 것을 추가로 포함할 수 있고, 임의로 여기서 방법은 2종 이상의 글리코실라제 억제제를 도입하거나 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실라제 억제제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코실라제 억제제는 단백질-단백질 동원, 단백질-RNA 동원, 및/또는 화학적 동원에 대해 본원에 개시된 방법 및 구축물을 통해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 동원될 수 있다. 따라서, 예로서 글리코실라제 억제제는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 태그/친화성 폴리펩티드, RNA 동원 모티프/친화성 폴리펩티드 및/또는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용 (또는 다른 화학적 상호작용)을 이용하여 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 동원될 수 있다.
본 발명의 방법은 표적 핵산을 본 발명의 CRISPR Cas 이펙터 단백질, 데아미나제, 및/또는 그의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함할 수 있거나, 또는 표적 핵산은 본 발명의 CRISPR Cas 이펙터 단백질, 데아미나제, 및 그의 융합 단백질 및/또는 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 접촉될 수 있고, 폴리펩티드는 임의로 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 발현 카세트 및/또는 벡터에 포함될 수 있고, 상기 발현 카세트 및/또는 벡터는 임의로 1종 이상의 가이드 핵산/동원 가이드 핵산을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 핵산 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 본 발명에 유용한 유기체는 핵산 변형이 유용할 수 있는 임의의 유기체 또는 그의 세포일 수 있다. 유기체는 임의의 동물, 임의의 식물, 임의의 진균, 임의의 고세균, 또는 임의의 박테리아를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 유기체는 식물 또는 그의 세포일 수 있다.
임의의 식물 또는 식물 부분의 표적 핵산은 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 변형될 수 있다. 피자식물, 나자식물, 단자엽식물, 쌍자엽식물, C3, C4, CAM 식물, 선태식물, 양치식물 및/또는 양치식물 동류, 미세조류, 및/또는 거대조류를 포함한 임의의 식물 (또는 예를 들어, 속 또는 보다 높은 목 분류로의 식물의 그룹핑)은 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 변형될 수 있다. 본 발명에 유용한 식물 및/또는 식물 부분은 임의의 식물 종/변종/품종의 식물 및/또는 식물 부분일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "식물 부분"은 배, 화분, 배주, 종자, 잎, 줄기, 순, 꽃, 가지, 과실, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 뿌리, 근단, 꽃밥, 식물 및/또는 식물의 부분에서 무손상인 식물 세포를 포함한 식물 세포, 식물 원형질체, 식물 조직, 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 무리 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "순"은 잎 및 줄기를 포함한 땅 위의 부분을 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 "식물 세포"는 세포벽을 포함하고 또한 원형질체로 지칭될 수 있는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 세포는 단리된 단일 세포의 형태일 수 있거나, 배양된 세포일 수 있거나, 또는 고등-유기체화된 단위, 예컨대, 예를 들어, 식물 조직 또는 식물 기관의 일부일 수 있다.
본 발명에 유용한 식물의 비-제한적 예는 잔디풀 (예를 들어, 블루그래스, 벤트그래스, 독보리, 김의털), 깃털 갈대풀, 좀새풀, 억새, 물대, 지팽이풀, 채소 작물, 예컨대 아티초크, 콜라비, 루콜라, 리크, 아스파라거스, 상추 (예를 들어, 결구, 잎, 로메인), 토란, 멜론 (예를 들어, 머스크멜론, 수박, 크렌쇼, 감로, 칸탈루프), 콜 작물 (예를 들어, 방울 양배추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 콜라드, 케일, 중국 양배추, 청경채), 카르도니, 당근, 나파, 오크라, 양파, 셀러리, 파슬리, 병아리콩, 파스닙, 치커리, 피망, 감자, 조롱박 (예를 들어, 매로우, 오이, 주키니, 스쿼시, 호박, 감로 멜론, 수박, 칸탈루프), 무, 건구식 양파, 루타바가, 가지, 서양우엉, 꽃상추, 샬롯, 엔다이브, 마늘, 시금치, 파, 스쿼시, 그린, 비트 (사탕무 및 사료용 비트), 고구마, 근대, 서양고추냉이, 토마토, 순무, 및 향신료; 과실 작물, 예컨대 사과, 살구, 체리, 천도복숭아, 복숭아, 배, 자두, 프룬, 체리, 마르멜로, 무화과, 너트 (예를 들어, 밤, 피칸, 피스타치오, 헤이즐넛, 피스타치오, 땅콩, 호두, 마카다미아 너트, 아몬드 등), 감귤류 (예를 들어, 귤, 금귤, 오렌지, 자몽, 탄제린, 만다린, 레몬, 라임 등), 블루베리, 블랙 라즈베리, 보이즌베리, 크랜베리, 커런트, 구스베리, 로건베리, 산딸기, 딸기, 블랙베리, 포도 (와인 및 테이블), 아보카도, 바나나, 키위, 감, 석류, 파인애플, 열대 과일, 인과, 멜론, 망고, 파파야, 및 리치, 필드 작물 식물, 예컨대 클로버, 알팔파, 티모시, 달맞이꽃, 메도우 폼, 옥수수/메이즈 (필드, 스위트, 팝콘), 홉, 호호바, 메밀, 홍화, 퀴노아, 밀, 벼, 보리, 호밀, 기장, 수수, 귀리, 라이밀, 수수, 담배, 케이폭, 콩과 식물 (콩 (예를 들어, 생두 및 건조된), 렌틸, 완두콩, 대두), 오일 식물 (유채, 카놀라, 머스타드, 퍼피, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자유 식물, 코코아 빈, 땅콩, 기름 야자), 좀개구리밥, 아라비돕시스, 섬유 식물 (면화, 아마, 대마, 황마), 칸나비스(Cannabis) (예를 들어, 칸나비스 사티바(Cannabis sativa), 칸나비스 인디카(Cannabis indica), 및 칸나비스 루데랄리스(Cannabis ruderalis)), 녹나무과 (계피, 장뇌), 또는 식물, 예컨대 커피, 사탕수수, 차, 및 천연 고무 식물; 및/또는 화초 식물, 예컨대 화훼 식물, 선인장, 다육식물 및/또는 장식용 식물 (예를 들어, 장미, 튤립, 제비꽃), 뿐만 아니라 나무, 예컨대 삼림수 (활엽수 및 상록수, 예컨대 침엽수; 예를 들어, 느릅나무, 물푸레나무, 떡갈나무, 단풍나무, 전나무, 가문비나무, 삼나무, 소나무, 자작나무, 사이프러스, 유칼립투스, 버드나무), 뿐만 아니라 관목 및 다른 묘목을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 코딩하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 메이즈, 대두, 밀, 카놀라, 벼, 토마토, 피망, 해바라기, 산딸기, 블랙베리, 블랙 라즈베리 및/또는 체리를 변형시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 세포 (예를 들어, 식물 세포, 동물 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포 등)를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는 키트 또는 키트들을 추가로 포함한다. 본 발명의 키트는 시약, 완충제, 및/또는 혼합, 측정, 분류, 표지화 등을 위한 장치, 뿐만 아니라 표적 핵산을 변형시키는데 적절할 것인 바와 같은 지시서 등을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 1종 이상의 핵산 구축물, 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터 및/또는 세포를 그의 사용을 위한 임의적 지시서와 함께 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 CRISPR-Cas 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산 (본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 상응함) 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터 및 또는 세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산은 본 발명의 1종 이상의 핵산 구축물과 동일한 발현 카세트 및/또는 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산은 본 발명의 1종 이상의 핵산 구축물을 포함하는 것과는 별개의 발현 카세트 또는 벡터 상에 제공될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, (a) 본원에서 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(들) 및 (b) (a)의 폴리뉴클레오티드(들)의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산을 코딩하는 핵산 구축물을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 구축물은 가이드 핵산 및/또는 동원 가이드 핵산의 백본 내로의 표적 핵산 서열과 동일하거나 그에 상보적인 핵산 서열의 클로닝을 위한 클로닝 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 코딩된 폴리뉴클레오티드(들) 내의 1개 이상의 인트론을 코딩할 수 있는 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물, 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 형질전환체 (예를 들어, 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자 등을 코딩하는 핵산)를 확인하는데 유용한 1종 이상의 선택가능한 마커를 추가로 코딩할 수 있다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참고로 기재될 것이다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도됨이 인정되어야 한다. 통상의 기술자에게 일어나는 예시화된 방법의 임의의 변동은 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1.
C에서 T로의 염기 편집을 위한 썬태그-융합된 dCpf1
GCN4 에피토프의 8개의 카피를 서열식별번호:62의 서열이 제공되도록 촉매 불활성화된 LbCpf1 (dLbCpf1)(dLbCas12a)의 C-말단에 융합시켰다. 별개의 플라스미드에서, GCN4 에피토프에 대해 표적화된 항체를 rAPOBEC1, hAPOBEC3A, hAPOBEC3B, hAID, 및 pmCDA1 (서열식별번호:63 내지 67)을 포함한 다양한 데아미나제 (scFv-데아미나제)에 융합시켰다.
dLbCpf1-썬태그, scFv-데아미나제, UGI, 및 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드를 HEK293T 세포에서 형질감염시켰다. UGI를 염기 편집 사건 동안 염기 삭제 복구를 일시적으로 억제하도록 공동-발현시켰으며, 이는 효율 및 생성물 순도를 개선시킨다 (Nishida et al. Science 353(6305) (2016) (DOI: 10.1126/science.aaf8729)). 내인성 유전자를 표적화하는 총 4개의 상이한 가이드 RNA를 사용하여 C에서 T로의 염기 편집을 탐색하였다 (표 1). 3일 후, 게놈 편집을 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 정량화하였다. 시험된 대부분의 데아미나제는 다양하고 일반적으로 낮은 C에서 T로의 편집 효율을 나타내었지만, APOBEC3A는 처리된 세포 집단 (형질감염된 세포에 대해 분류되지 않음)의 ~7% 내지 ~19%의 범위의 일관되게 높은 C에서 T로의 편집율을 나타내었다 (도 1 내지 4). Cpf1에의 썬태그 융합은 썬태그 융합이 비융합된 dCpf1에 비해 최대 5배 더 높은 편집 효율을 제공하기 때문에 또한 APOBEC3A를 동원하는데 있어서 기능적이다 (도 1 내지 4). 효율적인 편집은 대략 위치 6 내지 15 (위치 -4,-3,-2,-1은 PAM (TTTV)으로서 지정됨) 내에서 관찰된다 (도 1 내지 4)
표 1: 표적화된 유전자좌 및 상응하는 스페이서 서열.
도 1 내지 4는 썬태그-융합된 dCpf1이 세포에서 공동-발현된 데아미나제 도메인을 효율적으로 동원할 수 있고, 이는 C에서 T로의 염기 편집의 유의한 수준을 실행하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이는 융합 아키텍처의 사용 없이 Cpf1을 사용한 염기 편집의 첫번째 입증이다. 본원에 기재된 바와 같은 다수의 추가의 성분은 단독으로 공동-발현되거나, 단일 프로모터 하에서 발현되거나, 또는 임의의 조합일 수 있다.
실시예 2.
A에서 G로의 염기 편집을 위한 썬태그-융합된 dCpf1
GCN4 에피토프의 8개의 카피를 서열식별번호:62의 서열이 제공되도록 촉매 불활성화된 LbCpf1 (dLbCpf1)(dLbCas12a)의 C-말단에 융합시켰다. 별개의 플라스미드에서, GCN4 에피토프에 대해 표적화된 항체를 서열식별번호:72의 서열이 제공되도록 진화된 아데닌 데아미나제 (TadA8e) (scFv-데아미나제)에 융합시켰다.
dLbCpf1-썬태그, scFv-TadA8e (Richter et al. Nat Biotechnol. 2020, 38(7):883-891) 및 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드를 HEK293T 세포에서 형질감염시켰다. 서열식별번호:73 내지 77 중 하나의 스페이서 서열을 포함하는 총 5개의 상이한 가이드 RNA를 사용하여 내인성 유전자 (부위 1 내지 5)를 표적화하여 A에서 G로의 염기 편집을 탐색하였다 (도 5). 3일 후, 게놈 편집을 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 정량화하였다.
유의한 아데닌 탈아미노화가 위치 8 내지 10 (위치 -4,-3,-2,-1은 PAM (TTTV)으로서 지정됨) 주위의 예상된 표적화 창에서 관찰되었다.
본 발명의 구축물 및 방법은 시험관내 및 생체내 시스템을 포함한 많은 상이한 유형의 시스템에 폭넓게 적용가능하며, 다수의 상이한 유형 V CRISPR Cas 이펙터 단백질 및 다수의 상이한 데아미나제를, 및 동물 (예를 들어, 포유동물) 및 식물 시스템을 포함한 다수의 유형의 유기체에서 이용할 수 있다. 가이드를 다중화함으로써, 편집은 게놈 내의 다수의 상이한 유전자좌에 대해 동시에 표적화될 수 있었다.
실시예 3. 대두 식물에서의 C에서 T로의 염기 편집을 위한 썬태그-융합된 dCpf1
GCN4 에피토프-태그부착된 dCpf1 (LbCpf1 및 EnAsCpf1), 단일-쇄 항체-융합된 APOBEC3A (scFv-A3A), 및 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)에 대한 발현 카세트를 함유한 T-DNA 벡터를 구축하였다. 이들 성분을 단일 프로모터를 통해, 융합 및 P2A 링커를 이용하여, 또는 개별적 성분의 발현을 유도하는 다수의 프로모터를 통해 발현시켰다 (표 2). 구체적으로, DaMV 프로모터를 사용하여 CRISPR-썬태그 성분을 발현시키고, Mt.Ubq2 프로모터를 사용하여 데아미나제 및 UGI 성분을 발현시켰다 (표 2). TDNA 벡터는 또한 표적 대두 유전자에서 표적 #1 또는 표적 #2 중 어느 하나를 표적화하는 서열을 포함하는 U6 프로모터에 의해 유도된 항생제 선택 카세트 및 가이드 RNA 카세트를 포함하였다. T-DNA 벡터를 아그로박테리움 내로 형질전환시키고, 대두 건조된 절제된 배로 처리하여 식물 형질전환을 유도하였다. 항생제 선택 배지에서 성장된 잎을 형질전환 후 대략 4주에 샘플링하였다. DNA를 추출한 후, 그들의 유전자 조성을 일루미나(Illumina) 고-처리량 앰플리콘 시퀀싱을 사용하여 분석하였다.
염기 편집 활성 (표적 스페이서 서열에서 C에서 T로의 변화)은 20% 내지 88%의 다양한 비율로 시험된 모든 구축물에서 검출되었다 (표 2). 각각의 구축물에 대해 편집된 식물 중에서, 고-처리량 시퀀싱 분석은 각각의 식물 샘플이 평균적으로 식물 당 0.77% 내지 17.48% 편집된 DNA를 함유하였음을 나타내었다 (표 2). 편집은 시험된 둘 다의 표적 유전자 (표적 #1 및 표적 #2)에 대해, 및 시험된 둘 다의 CRISPR 효소 (LbCpf1 및 EnAsCpf1)에 대해 관찰되었다 (표 2). 이들 결과는 염기 편집을 위한 이 접근법이 다른 표적 유전자 및 다른 유형 V CRISPR 시스템에 적합함을 입증한다.
표 2: 발현 구축물 및 그들의 편집 결과.
상기는 본 발명을 예시하며, 그의 제한인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 청구항의 등가물이 그 안에 포함되는 하기 청구항에 의해 한정된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Pairwise Plants Services, Inc.
Kim, Yongjoo
<120> TYPE V CRISPR-CAS BASE EDITORS AND METHODS OF USE THEREOF
<130> 1499.10.WO
<150> US 62/927,914
<151> 2019-10-30
<160> 77
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1592
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 1
actgttaata atttttaaac gtcagcgcac taaaaaaacg aaaagacgga cacgtgaaaa 60
taaaaaacac acactagttt atgacgcaat actattttac ttatgatttg ggtacattag 120
acaaaaccgt gaaagagatg tatcagctat gaaacctgta tacttcaata cagagactta 180
ctcatatcgg atacgtacgc acgaagtatc atattaatta ttttaatttt taataaatat 240
tttatcggat acttatgtga tactctacat atacacaagg atatttctaa gatactttat 300
agatacgtat cctagaaaaa catgaagagt aaaaaagtga gacaatgttg taaaaattca 360
ttataaatgt atatgattca attttagata tgcatcagta taattgattc tcgatgaaac 420
acttaaaatt atatttcttg tggaagaacg tagcgagaga ggtgattcag ttagacaaca 480
ttaaataaaa ttaatgttaa gttcttttaa tgatgtttct ctcaatatca catcatatga 540
aaatgtaata tgatttataa gaaaattttt aaaaaattta ttttaataat cacatgtact 600
attttttaaa aattgtatct tttataataa tacaataata aagagtaatc agtgttaatt 660
tttcttcaaa tataagtttt attataaatc attgttaacg tatcataagt cattaccgta 720
tcgtatctta attttttttt aaaaaccgct aattcacgta cccgtattgt attgtacccg 780
cacctgtatc acaatcgatc ttagttagaa gaattgtctc gaggcggtgc aagacagcat 840
ataatagacg tggactctct tataccaaac gttgtcgtat cacaaagggt taggtaacaa 900
gtcacagttt gtccacgtgt cacgttttaa ttggaagagg tgccgttggc gtaatataac 960
agccaatcga tttttgctat aaaagcaaat caggtaaact aaacttcttc attcttttct 1020
tccccatcgc tacaaaaccg gttcctttgg aaaagagatt cattcaaacc tagcacccaa 1080
ttccgtttca aggtataatc tactttctat tcttcgatta ttttattatt attagctact 1140
atcgtttaat cgatcttttc ttttgatccg tcaaatttaa attcaattag ggttttgttc 1200
ttttctttca tctgattgaa atccttctga attgaaccgt ttacttgatt ttactgttta 1260
ttgtatgatt taatcctttg tttttcaaag acagtcttta gattgtgatt aggggttcat 1320
ataaattttt agatttggat ttttgtattg tatgattcaa aaaatacgtc ctttaattag 1380
attagtacat ggatattttt tacccgattt attgattgtc agggagaatt tgatgagcaa 1440
gtttttttga tgtctgttgt aaattgaatt gattataatt gctgatctgc tgcttccagt 1500
tttcataacc catattcttt taaccttgtt gtacacacaa tgaaaaattg gtgattgatt 1560
catttgtttt tctttgtttt ggattataca gg 1592
<210> 2
<211> 2000
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2
gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60
tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120
ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180
tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240
ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360
ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420
ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480
aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540
tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720
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ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080
atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140
caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200
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attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440
atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500
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ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860
ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920
agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980
ctgttgtttg gtgatacttc 2000
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<211> 1228
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Lachnospiraceae bacterium
<400> 3
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1 5 10 15
Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
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Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys
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Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu
65 70 75 80
Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
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Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
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<211> 1307
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<213> Acidaminococcus sp.
<400> 4
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1 5 10 15
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Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu
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Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
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355 360 365
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370 375 380
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Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu
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435 440 445
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Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe
485 490 495
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500 505 510
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595 600 605
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690 695 700
Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His
705 710 715 720
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740 745 750
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755 760 765
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1100 1105 1110
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Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn
1130 1135 1140
Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys
1145 1150 1155
Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr
1160 1165 1170
Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu
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Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu
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Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly
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Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1295 1300 1305
<210> 5
<211> 1241
<212> PRT
<213> Butyrivibrio proteoclasticus
<400> 5
Met Leu Leu Tyr Glu Asn Tyr Thr Lys Arg Asn Gln Ile Thr Lys Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Glu Leu Arg Pro Gln Gly Lys Thr Leu Arg Asn Ile Lys
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Arg Leu Lys Pro Val Ile Asp Glu Gly Ile Lys Asp Ile Ala Arg Asp
50 55 60
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Leu Ser Gly Asp Lys Lys Ala Tyr Ala Lys Glu Ser Glu Arg Leu Lys
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Lys Ile Ser Glu Ile Asn Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Gly Val Leu Tyr
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130 135 140
Leu Ser Asp Ile Leu Glu Thr Lys Gly Tyr Leu Ala Leu Phe Ser Lys
145 150 155 160
Phe Leu Thr Ser Arg Ile Thr Thr Leu Glu Gln Ser Met Pro Lys Arg
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Val Ile Glu Asn Phe Glu Ile Tyr Ala Ala Asn Ile Pro Lys Met Gln
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Lys Glu Lys Gly Ile Asn Gln Thr Ile Ser Glu Lys Asn Ile Lys Ile
245 250 255
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565 570 575
Val Gln Arg Lys Gly Ala Lys Ser Phe Leu Gly Leu Pro Lys Ala Leu
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Phe Lys Cys Ile Leu Glu Pro Tyr Phe Glu Ser Pro Glu His Lys Asn
595 600 605
Asp Lys Asn Cys Val Ile Glu Glu Tyr Val Ser Lys Pro Leu Thr Ile
610 615 620
Asp Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Phe Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Thr
625 630 635 640
Asn Ile Gly Ile Asp Gly Leu Thr Glu Glu Lys Phe Lys Asp Asp Cys
645 650 655
Arg Tyr Leu Ile Asp Val Tyr Lys Glu Phe Ile Ala Val Tyr Thr Arg
660 665 670
Tyr Ser Cys Phe Asn Met Ser Gly Leu Lys Arg Ala Asp Glu Tyr Asn
675 680 685
Asp Ile Gly Glu Phe Phe Ser Asp Val Asp Thr Arg Leu Cys Thr Met
690 695 700
Glu Trp Ile Pro Val Ser Phe Glu Arg Ile Asn Asp Met Val Asp Lys
705 710 715 720
Lys Glu Gly Leu Leu Phe Leu Val Arg Ser Met Phe Leu Tyr Asn Arg
725 730 735
Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Thr Phe Ile Gln Leu Phe Ser Asp Ser
740 745 750
Asn Met Glu His Thr Ser Met Leu Leu Asn Ser Arg Ala Met Ile Gln
755 760 765
Tyr Arg Ala Ala Ser Leu Pro Arg Arg Val Thr His Lys Lys Gly Ser
770 775 780
Ile Leu Val Ala Leu Arg Asp Ser Asn Gly Glu His Ile Pro Met His
785 790 795 800
Ile Arg Glu Ala Ile Tyr Lys Met Lys Asn Asn Phe Asp Ile Ser Ser
805 810 815
Glu Asp Phe Ile Met Ala Lys Ala Tyr Leu Ala Glu His Asp Val Ala
820 825 830
Ile Lys Lys Ala Asn Glu Asp Ile Ile Arg Asn Arg Arg Tyr Thr Glu
835 840 845
Asp Lys Phe Phe Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ser
850 855 860
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Asp Ser Arg Met Ala Val Ile Val Thr Arg Asn Leu Lys Asp Leu Thr
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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945 950 955 960
Ile Ser Lys Leu Ala Thr Lys Tyr Asn Ala Val Val Val Val Glu Ser
965 970 975
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980 985 990
Phe Lys Ala Phe Glu Ala Arg Leu Cys Ala Arg Met Ser Asp Leu Ser
995 1000 1005
Phe Asn Thr Ile Lys Glu Gly Glu Ala Gly Ser Ile Ser Asn Pro
1010 1015 1020
Ile Gln Val Ser Asn Asn Asn Gly Asn Ser Tyr Gln Asp Gly Val
1025 1030 1035
Ile Tyr Phe Leu Asn Asn Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Cys Pro Asp
1040 1045 1050
Thr Gly Phe Val Asp Val Phe Asp Lys Thr Arg Leu Ile Thr Met
1055 1060 1065
Gln Ser Lys Arg Gln Phe Phe Ala Lys Met Lys Asp Ile Arg Ile
1070 1075 1080
Asp Asp Gly Glu Met Leu Phe Thr Phe Asn Leu Glu Glu Tyr Pro
1085 1090 1095
Thr Lys Arg Leu Leu Asp Arg Lys Glu Trp Thr Val Lys Ile Ala
1100 1105 1110
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Phe Ala Asn Ala Leu Tyr Gly Ile Ile Thr Lys Lys Asp Gly Glu
1175 1180 1185
Lys Ile Tyr Arg Ser Pro Ile Thr Gly Thr Glu Ile Asp Val Ser
1190 1195 1200
Lys Asn Thr Thr Tyr Asn Phe Gly Lys Lys Phe Met Phe Lys Gln
1205 1210 1215
Glu Tyr Arg Gly Asp Gly Asp Phe Leu Asp Ala Phe Leu Asn Tyr
1220 1225 1230
Met Gln Ala Gln Asp Ile Ala Val
1235 1240
<210> 6
<211> 1238
<212> PRT
<213> Candidatus Methanoplasma termitum
<400> 6
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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Ser Glu Gln Lys Arg Met Arg Gln Glu Ile Val Ser Glu Phe Lys Lys
100 105 110
Asp Asp Arg Phe Lys Asp Leu Phe Ser Lys Lys Leu Phe Ser Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Glu Glu Ile Tyr Lys Lys Gly Asn His Gln Glu Ile Asp Ala
130 135 140
Leu Lys Ser Phe Asp Lys Phe Ser Gly Tyr Phe Ile Gly Leu His Glu
145 150 155 160
Asn Arg Lys Asn Met Tyr Ser Asp Gly Asp Glu Ile Thr Ala Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Ile Val Asn Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Leu Gln
180 185 190
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210 215 220
Leu Glu Tyr Phe Asn Lys Val Leu Asn Gln Glu Gly Ile Gln Arg Tyr
225 230 235 240
Asn Leu Ala Leu Gly Gly Tyr Val Thr Lys Ser Gly Glu Lys Met Met
245 250 255
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260 265 270
Lys Gly Arg Ile His Met Thr Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Glu
275 280 285
Lys Glu Ser Phe Ser Tyr Ile Pro Asp Val Phe Thr Glu Asp Ser Gln
290 295 300
Leu Leu Pro Ser Ile Gly Gly Phe Phe Ala Gln Ile Glu Asn Asp Lys
305 310 315 320
Asp Gly Asn Ile Phe Asp Arg Ala Leu Glu Leu Ile Ser Ser Tyr Ala
325 330 335
Glu Tyr Asp Thr Glu Arg Ile Tyr Ile Arg Gln Ala Asp Ile Asn Arg
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Asn Ile Lys Phe Glu Gln Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Tyr Arg Lys
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580 585 590
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595 600 605
Ile Ile Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Lys His Ile Arg Gly Asp Lys Phe
610 615 620
Asp Leu Asp Phe Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile
625 630 635 640
Glu Lys His Lys Asp Trp Ser Lys Phe Asn Phe Tyr Phe Ser Pro Thr
645 650 655
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660 665 670
Gly Tyr Arg Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ala Glu Thr Ile Asp Glu
675 680 685
Tyr Val Glu Lys Gly Asp Leu Phe Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp
690 695 700
Phe Val Lys Ala Ala Thr Gly Lys Lys Asp Met His Thr Ile Tyr Trp
705 710 715 720
Asn Ala Ala Phe Ser Pro Glu Asn Leu Gln Asp Val Val Val Lys Leu
725 730 735
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755 760 765
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805 810 815
Leu Asn Asp Lys Ile Tyr Phe His Val Pro Leu Thr Leu Asn Phe Lys
820 825 830
Ala Asn Gly Lys Lys Asn Leu Asn Lys Met Val Ile Glu Lys Phe Leu
835 840 845
Ser Asp Glu Lys Ala His Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn
850 855 860
Leu Leu Tyr Tyr Ser Ile Ile Asp Arg Ser Gly Lys Ile Ile Asp Gln
865 870 875 880
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885 890 895
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915 920 925
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980 985 990
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Ala Leu Thr Ser Ser Gly Ile Lys Tyr Asp Gly Gly Gln Asn Ile
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1130 1135 1140
Met Tyr Ser Ser Phe Ile Ala Ala Ile Gln Met Arg Val Tyr Asp
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1160 1165 1170
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1190 1195 1200
Thr Met Arg Ala Ile Ala Glu Lys Phe Asp Pro Asp Ser Glu Lys
1205 1210 1215
Met Ala Lys Leu Glu Leu Lys His Lys Asp Trp Phe Glu Phe Met
1220 1225 1230
Gln Thr Arg Gly Asp
1235
<210> 7
<211> 1281
<212> PRT
<213> Eubacterium eligens
<400> 7
Met Asn Gly Asn Arg Ser Ile Val Tyr Arg Glu Phe Val Gly Val Ile
1 5 10 15
Pro Val Ala Lys Thr Leu Arg Asn Glu Leu Arg Pro Val Gly His Thr
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35 40 45
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50 55 60
Glu Tyr Ile Asp Lys Ser Leu Ser Gly Val Thr Asp Leu Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Leu Phe Glu Leu Met Asn Leu Val Gln Ser Ser Pro Ser Lys Asp
85 90 95
Asn Lys Lys Ala Leu Glu Lys Glu Gln Ser Lys Met Arg Glu Gln Ile
100 105 110
Cys Thr His Leu Gln Ser Asp Ser Asn Tyr Lys Asn Ile Phe Asn Ala
115 120 125
Lys Leu Leu Lys Glu Ile Leu Pro Asp Phe Ile Lys Asn Tyr Asn Gln
130 135 140
Tyr Asp Val Lys Asp Lys Ala Gly Lys Leu Glu Thr Leu Ala Leu Phe
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His Glu Asn Ser Leu Ile Phe Leu Ala Asn Met Thr Ser Tyr Lys Lys
195 200 205
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Gln Asp Lys Met Gly Asp Trp Glu Leu Asn Gln Ile Phe Asn Pro Asp
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Phe Tyr Asn Met Val Leu Ile Gln Ser Gly Ile Asp Phe Tyr Asn Glu
245 250 255
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260 265 270
Lys Asn Asn Tyr Asn Leu Phe Lys Met Arg Lys Leu His Lys Gln Ile
275 280 285
Leu Ala Tyr Thr Ser Thr Ser Phe Glu Val Pro Lys Met Phe Glu Asp
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Asp Met Ser Val Tyr Asn Ala Val Asn Ala Phe Ile Asp Glu Thr Glu
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Lys Gly Asn Ile Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Val Asn Lys Tyr Asp
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Glu Asn Phe Tyr Asp Glu Asn Ile His Ala Lys Gly Lys Ser Lys Glu
370 375 380
Glu Lys Val Lys Lys Ala Val Lys Glu Asp Lys Tyr Lys Ser Ile Asn
385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Tyr Val Thr Gln Lys Pro Tyr Asn Ser Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe
515 520 525
Gln Ser Pro Thr Leu Ala Asn Gly Trp Ser Gln Ser Lys Glu Phe Asp
530 535 540
Asn Asn Ala Ile Ile Leu Ile Arg Asp Asn Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile
545 550 555 560
Phe Asn Ala Lys Asn Lys Pro Asp Lys Lys Ile Ile Gln Gly Asn Ser
565 570 575
Asp Lys Lys Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Lys Met Val Tyr Asn Leu Leu
580 585 590
Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly
595 600 605
Ile Glu Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Gly Tyr Asn Ala
610 615 620
His Lys His Ile Lys Thr Ser Glu Asn Phe Asp Ile Ser Phe Cys Arg
625 630 635 640
Asp Leu Ile Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Ile Glu Lys His Ala Glu Trp
645 650 655
Arg Lys Tyr Glu Phe Lys Phe Ser Ala Thr Asp Ser Tyr Ser Asp Ile
660 665 670
Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Met Gln Gly Tyr Arg Ile Asp Trp
675 680 685
Thr Tyr Ile Ser Glu Ala Asp Ile Asn Lys Leu Asp Glu Glu Gly Lys
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Ile Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Glu Asn Ser Thr
705 710 715 720
Gly Lys Glu Asn Leu His Thr Met Tyr Phe Lys Asn Ile Phe Ser Glu
725 730 735
Glu Asn Leu Asp Lys Ile Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe
740 745 750
Tyr Arg Arg Ala Ser Val Lys Asn Pro Val Lys His Lys Lys Asp Ser
755 760 765
Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Lys Asn Gln Leu Asp Asn Gly Asp Val
770 775 780
Val Arg Ile Pro Ile Pro Asp Asp Ile Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys Met
785 790 795 800
Tyr Asn Gly Tyr Ile Lys Glu Ser Asp Leu Ser Glu Ala Ala Lys Glu
805 810 815
Tyr Leu Asp Lys Val Glu Val Arg Thr Ala Gln Lys Asp Ile Val Lys
820 825 830
Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Asp Lys Tyr Phe Ile His Thr Pro Ile Thr
835 840 845
Ile Asn Tyr Lys Val Thr Ala Arg Asn Asn Val Asn Asp Met Val Val
850 855 860
Lys Tyr Ile Ala Gln Asn Asp Asp Ile His Val Ile Gly Ile Asp Arg
865 870 875 880
Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Ser Val Ile Asp Ser His Gly Asn
885 890 895
Ile Val Lys Gln Lys Ser Tyr Asn Ile Leu Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys
900 905 910
Lys Lys Leu Val Glu Lys Glu Lys Thr Arg Glu Tyr Ala Arg Lys Asn
915 920 925
Trp Lys Ser Ile Gly Asn Ile Lys Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Ser
930 935 940
Gly Val Val His Glu Ile Ala Met Leu Ile Val Glu Tyr Asn Ala Ile
945 950 955 960
Ile Ala Met Glu Asp Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys
965 970 975
Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Ser Met Leu Ile Asn Lys
980 985 990
Leu Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Glu Lys Ser Val Asp Glu Pro Gly Gly
995 1000 1005
Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Val Pro Asp Asn Ile Lys
1010 1015 1020
Asn Leu Gly Lys Gln Cys Gly Val Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala
1025 1030 1035
Phe Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr Gly Phe Ile Ser Ala Phe
1040 1045 1050
Asn Phe Lys Ser Ile Ser Thr Asn Ala Ser Arg Lys Gln Phe Phe
1055 1060 1065
Met Gln Phe Asp Glu Ile Arg Tyr Cys Ala Glu Lys Asp Met Phe
1070 1075 1080
Ser Phe Gly Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Asp Thr Tyr Asn Ile Thr
1085 1090 1095
Met Gly Lys Thr Gln Trp Thr Val Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Leu
1100 1105 1110
Gln Ser Glu Phe Asn Asn Ala Arg Arg Thr Gly Lys Thr Lys Ser
1115 1120 1125
Ile Asn Leu Thr Glu Thr Ile Lys Leu Leu Leu Glu Asp Asn Glu
1130 1135 1140
Ile Asn Tyr Ala Asp Gly His Asp Ile Arg Ile Asp Met Glu Lys
1145 1150 1155
Met Asp Glu Asp Lys Lys Ser Glu Phe Phe Ala Gln Leu Leu Ser
1160 1165 1170
Leu Tyr Lys Leu Thr Val Gln Met Arg Asn Ser Tyr Thr Glu Ala
1175 1180 1185
Glu Glu Gln Glu Asn Gly Ile Ser Tyr Asp Lys Ile Ile Ser Pro
1190 1195 1200
Val Ile Asn Asp Glu Gly Glu Phe Phe Asp Ser Asp Asn Tyr Lys
1205 1210 1215
Glu Ser Asp Asp Lys Glu Cys Lys Met Pro Lys Asp Ala Asp Ala
1220 1225 1230
Asn Gly Ala Tyr Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Val Leu
1235 1240 1245
Lys Ile Lys Ser Glu Trp Thr Glu Asp Gly Phe Asp Arg Asn Cys
1250 1255 1260
Leu Lys Leu Pro His Ala Glu Trp Leu Asp Phe Ile Gln Asn Lys
1265 1270 1275
Arg Tyr Glu
1280
<210> 8
<211> 1300
<212> PRT
<213> Francisella novicida
<400> 8
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
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Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Val Asn Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu
195 200 205
Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln
370 375 380
Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr
385 390 395 400
Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn
420 425 430
Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn
450 455 460
Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
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485 490 495
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Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
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Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly
595 600 605
Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys
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Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
625 630 635 640
Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys
645 650 655
Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val
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<213> Leptospira inadai
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<213> Moraxella bovoculi
<400> 13
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<213> Unknown
<220>
<223> Parcubacteria bacterium
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Lys Asn Phe Ser Leu Arg Asp Leu His Ala Leu Ile Glu Tyr Tyr Arg
725 730 735
Asn Cys Ile Pro Gln Tyr Ser Asn Trp Ser Phe Tyr Asp Phe Gln Phe
740 745 750
Gln Asp Thr Gly Lys Tyr Gln Asn Ile Lys Glu Phe Thr Asp Asp Val
755 760 765
Gln Lys Tyr Gly Tyr Lys Ile Ser Phe Arg Asp Ile Asp Asp Glu Tyr
770 775 780
Ile Asn Gln Ala Leu Asn Glu Gly Lys Met Tyr Leu Phe Glu Val Val
785 790 795 800
Asn Lys Asp Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Gly Ser Lys Asn Leu His Thr
805 810 815
Leu Tyr Phe Glu His Ile Leu Ser Ala Glu Asn Leu Asn Asp Pro Val
820 825 830
Phe Lys Leu Ser Gly Met Ala Glu Ile Phe Gln Arg Gln Pro Ser Val
835 840 845
Asn Glu Arg Glu Lys Ile Thr Thr Gln Lys Asn Gln Cys Ile Leu Asp
850 855 860
Lys Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Tyr Arg Arg Tyr Thr Glu Lys Lys Ile
865 870 875 880
Met Phe His Met Ser Leu Val Leu Asn Thr Gly Lys Gly Glu Ile Lys
885 890 895
Gln Val Gln Phe Asn Lys Ile Ile Asn Gln Arg Ile Ser Ser Ser Asp
900 905 910
Asn Glu Met Arg Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Lys Asn
915 920 925
Leu Leu Tyr Tyr Ser Val Val Lys Gln Asn Gly Glu Ile Ile Glu Gln
930 935 940
Ala Ser Leu Asn Glu Ile Asn Gly Val Asn Tyr Arg Asp Lys Leu Ile
945 950 955 960
Glu Arg Glu Lys Glu Arg Leu Lys Asn Arg Gln Ser Trp Lys Pro Val
965 970 975
Val Lys Ile Lys Asp Leu Lys Lys Gly Tyr Ile Ser His Val Ile His
980 985 990
Lys Ile Cys Gln Leu Ile Glu Lys Tyr Ser Ala Ile Val Val Leu Glu
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Asp Leu Asn Met Arg Phe Lys Gln Ile Arg Gly Gly Ile Glu Arg
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1070 1075 1080
Tyr Thr Ser Lys Thr Asp Pro Ile Thr Gly Phe Arg Lys Asn Val
1085 1090 1095
Tyr Ile Ser Asn Ser Ala Ser Leu Asp Lys Ile Lys Glu Ala Val
1100 1105 1110
Lys Lys Phe Asp Ala Ile Gly Trp Asp Gly Lys Glu Gln Ser Tyr
1115 1120 1125
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1130 1135 1140
Asn Ser Thr Val Ser Lys Glu Trp Ala Ile Phe Ala Ser Ala Pro
1145 1150 1155
Arg Ile Arg Arg Gln Lys Gly Glu Asp Gly Tyr Trp Lys Tyr Asp
1160 1165 1170
Arg Val Lys Val Asn Glu Glu Phe Glu Lys Leu Leu Lys Val Trp
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Asn Phe Val Asn Pro Lys Ala Thr Asp Ile Lys Gln Glu Ile Ile
1190 1195 1200
Lys Lys Ile Lys Ala Gly Asp Leu Gln Gly Glu Lys Glu Leu Asp
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Leu Val Leu Glu Leu Arg Asn Ser Phe Ser Leu Gln Ile Lys Ile
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1265 1270 1275
Pro Ser Asn Leu Cys Trp Leu Ala Val Glu Asn Ala Asp Ala Asn
1280 1285 1290
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1310 1315 1320
Asn Leu Phe Ile Ser Asn Ala Glu Trp Asp Glu Ala Ala Arg Asp
1325 1330 1335
Trp Gly Lys Tyr Ala Gly Thr Thr Ala Leu Asn Leu Asp His
1340 1345 1350
<210> 15
<211> 1260
<212> PRT
<213> Porphyromonas crevioricanis
<400> 15
Met Asp Ser Leu Lys Asp Phe Thr Asn Leu Tyr Pro Val Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Glu
20 25 30
Lys Ala Gly Ile Leu Lys Glu Asp Glu His Arg Ala Glu Ser Tyr Arg
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Leu Gln Ser Phe Cys Glu Leu Tyr Lys Lys Asp His Arg Thr Glu
85 90 95
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100 105 110
Ile Val Gly Ala Phe Thr Gly Val Cys Gly Arg Arg Glu Asn Thr Val
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Val Glu Glu Ala Thr Arg Ser Leu Lys Glu Phe Asp Ser Phe Thr
165 170 175
Ser Tyr Phe Ala Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Ile Tyr Ser Thr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ile Ala Lys Glu Leu Glu His Ile Arg Ala Asp Phe Ser Ala Gly Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Lys Lys Asp Glu Arg Leu Glu Asp Ile Phe Ser Leu Asn Tyr
245 250 255
Tyr Ile His Val Leu Ser Gln Ala Gly Ile Glu Lys Tyr Asn Ala Leu
260 265 270
Ile Gly Lys Ile Val Thr Glu Gly Asp Gly Glu Met Lys Gly Leu Asn
275 280 285
Glu His Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Gln Arg Gly Arg Glu Asp Arg Leu
290 295 300
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305 310 315 320
Leu Ser Tyr Leu Pro Glu Ser Phe Glu Lys Asp Glu Glu Leu Leu Arg
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Ala Leu Lys Glu Phe Tyr Asp His Ile Ala Glu Asp Ile Leu Gly Arg
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Glu Gln Ala Pro Lys Arg Ile Thr Ala Lys Tyr Glu Arg Asp Arg Ile
405 410 415
Lys Ala Leu Lys Gly Glu Glu Ser Ile Ser Leu Ala Asn Leu Asn Ser
420 425 430
Cys Ile Ala Phe Leu Asp Asn Val Arg Asp Cys Arg Val Asp Thr Tyr
435 440 445
Leu Ser Thr Leu Gly Gln Lys Glu Gly Pro His Gly Leu Ser Asn Leu
450 455 460
Val Glu Asn Val Phe Ala Ser Tyr His Glu Ala Glu Gln Leu Leu Ser
465 470 475 480
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485 490 495
Val Leu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Asn Ile Ser Asp Leu Gln Arg Phe
500 505 510
Leu Lys Pro Leu Trp Gly Met Gly Asp Glu Pro Asp Lys Asp Glu Arg
515 520 525
Phe Tyr Gly Glu Tyr Asn Tyr Ile Arg Gly Ala Leu Asp Gln Val Ile
530 535 540
Pro Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Ser
545 550 555 560
Thr Arg Lys Val Lys Leu Asn Phe Gly Asn Ser Gln Leu Leu Ser Gly
565 570 575
Trp Asp Arg Asn Lys Glu Lys Asp Asn Ser Cys Val Ile Leu Arg Lys
580 585 590
Gly Gln Asn Phe Tyr Leu Ala Ile Met Asn Asn Arg His Lys Arg Ser
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly Ile Glu Ile Tyr Lys Pro Ser Pro
645 650 655
Lys Leu Leu Glu Gln Tyr Gly His Gly Thr His Lys Lys Gly Asp Thr
660 665 670
Phe Ser Met Asp Asp Leu His Glu Leu Ile Asp Phe Phe Lys His Ser
675 680 685
Ile Glu Ala His Glu Asp Trp Lys Gln Phe Gly Phe Lys Phe Ser Asp
690 695 700
Thr Ala Thr Tyr Glu Asn Val Ser Ser Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asp
705 710 715 720
Gln Gly Tyr Lys Leu Ser Phe Arg Lys Val Ser Glu Ser Tyr Val Tyr
725 730 735
Ser Leu Ile Asp Gln Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys
740 745 750
Asp Phe Ser Pro Cys Ser Lys Gly Thr Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr
755 760 765
Trp Arg Met Leu Phe Asp Glu Arg Asn Leu Ala Asp Val Ile Tyr Lys
770 775 780
Leu Asp Gly Lys Ala Glu Ile Phe Phe Arg Glu Lys Ser Leu Lys Asn
785 790 795 800
Asp His Pro Thr His Pro Ala Gly Lys Pro Ile Lys Lys Lys Ser Arg
805 810 815
Gln Lys Lys Gly Glu Glu Ser Leu Phe Glu Tyr Asp Leu Val Lys Asp
820 825 830
Arg Arg Tyr Thr Met Asp Lys Phe Gln Phe His Val Pro Ile Thr Met
835 840 845
Asn Phe Lys Cys Ser Ala Gly Ser Lys Val Asn Asp Met Val Asn Ala
850 855 860
His Ile Arg Glu Ala Lys Asp Met His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly
865 870 875 880
Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Cys Val Ile Asp Ser Arg Gly Thr Ile
885 890 895
Leu Asp Gln Ile Ser Leu Asn Thr Ile Asn Asp Ile Asp Tyr His Asp
900 905 910
Leu Leu Glu Ser Arg Asp Lys Asp Arg Gln Gln Glu His Arg Asn Trp
915 920 925
Gln Thr Ile Glu Gly Ile Lys Glu Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln
930 935 940
Ala Val His Arg Ile Ala Glu Leu Met Val Ala Tyr Lys Ala Val Val
945 950 955 960
Ala Leu Glu Asp Leu Asn Met Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val
965 970 975
Glu Ser Ser Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Gln Leu Ile Asp Lys Leu
980 985 990
Asn Tyr Leu Val Asp Lys Lys Lys Arg Pro Glu Asp Ile Gly Gly Leu
995 1000 1005
Leu Arg Ala Tyr Gln Phe Thr Ala Pro Phe Lys Ser Phe Lys Glu
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Phe Asp Ser Ile Ser Tyr Asn Pro Lys Lys Asp Trp Phe Glu Phe
1070 1075 1080
Ala Phe Asp Tyr Lys Asn Phe Thr Lys Lys Ala Glu Gly Ser Arg
1085 1090 1095
Ser Met Trp Ile Leu Cys Thr His Gly Ser Arg Ile Lys Asn Phe
1100 1105 1110
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1115 1120 1125
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1130 1135 1140
Tyr Thr Ala Asp Leu Lys Thr Ala Ile Val Asp Glu Lys Gln Lys
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Met Arg Asn Ser Trp Lys Glu Lys Asp Leu Asp Tyr Leu Ile Ser
1175 1180 1185
Pro Val Ala Gly Ala Asp Gly Arg Phe Phe Asp Thr Arg Glu Gly
1190 1195 1200
Asn Lys Ser Leu Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn
1205 1210 1215
Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Ala Leu Arg Gln Ile Arg Gln Thr
1220 1225 1230
Ser Glu Gly Gly Lys Leu Lys Leu Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp
1235 1240 1245
Leu Gln Phe Val Gln Glu Arg Ser Tyr Glu Lys Asp
1250 1255 1260
<210> 16
<211> 1324
<212> PRT
<213> Prevotella disiens
<400> 16
Met Glu Asn Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Leu Phe Gln Leu Asn Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Cys Glu Leu Leu Glu
20 25 30
Glu Gly Lys Ile Phe Ala Ser Gly Ser Phe Leu Glu Lys Asp Lys Val
35 40 45
Arg Ala Asp Asn Val Ser Tyr Val Lys Lys Glu Ile Asp Lys Lys His
50 55 60
Lys Ile Phe Ile Glu Glu Thr Leu Ser Ser Phe Ser Ile Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Asp Cys Tyr Asn Glu Leu Lys Ala Phe Lys
85 90 95
Lys Asp Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu Val Lys Lys Thr Ala Leu Arg
100 105 110
Asn Lys Cys Thr Ser Ile Gln Arg Ala Met Arg Glu Ala Ile Ser Gln
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Phe Ser Gly Phe Glu Thr Asn Arg Glu Asn Phe Tyr
165 170 175
Ser Asp Glu Glu Lys Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Leu Val His Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Ile Phe Ile Lys Asn Ile Tyr Ile Phe Glu Lys Leu Lys
195 200 205
Glu Gln Phe Asp Ala Lys Thr Leu Ser Glu Ile Phe Glu Asn Tyr Lys
210 215 220
Leu Tyr Val Ala Gly Ser Ser Leu Asp Glu Val Phe Ser Leu Glu Tyr
225 230 235 240
Phe Asn Asn Thr Leu Thr Gln Lys Gly Ile Asp Asn Tyr Asn Ala Val
245 250 255
Ile Gly Lys Ile Val Lys Glu Asp Lys Gln Glu Ile Gln Gly Leu Asn
260 265 270
Glu His Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys His Lys Asp Arg Arg Leu Pro
275 280 285
Phe Phe Ile Ser Leu Lys Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Ala Leu
290 295 300
Ser Trp Leu Pro Asp Met Phe Lys Asn Asp Ser Glu Val Ile Asp Ala
305 310 315 320
Leu Lys Gly Phe Tyr Ile Glu Asp Gly Phe Glu Asn Asn Val Leu Thr
325 330 335
Pro Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Leu Asn Gly
340 345 350
Ile Phe Ile Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ser Ser Leu Ser Gln Asn Val
355 360 365
Tyr Arg Asn Phe Ser Ile Asp Glu Ala Ile Asp Ala Gln Asn Ala Glu
370 375 380
Leu Gln Thr Phe Asn Asn Tyr Glu Leu Ile Ala Asn Ala Leu Arg Ala
385 390 395 400
Lys Ile Lys Lys Glu Thr Lys Gln Gly Arg Lys Ser Phe Glu Lys Tyr
405 410 415
Glu Glu Tyr Ile Asp Lys Lys Val Lys Ala Ile Asp Ser Leu Ser Ile
420 425 430
Gln Glu Ile Asn Glu Leu Val Glu Asn Tyr Val Ser Glu Phe Asn Ser
435 440 445
Asn Ser Gly Asn Met Pro Arg Lys Val Glu Asp Tyr Phe Ser Leu Met
450 455 460
Arg Lys Gly Asp Phe Gly Ser Asn Asp Leu Ile Glu Asn Ile Lys Thr
465 470 475 480
Lys Leu Ser Ala Ala Glu Lys Leu Leu Gly Thr Lys Tyr Gln Glu Thr
485 490 495
Ala Lys Asp Ile Phe Lys Lys Asp Glu Asn Ser Lys Leu Ile Lys Glu
500 505 510
Leu Leu Asp Ala Thr Lys Gln Phe Gln His Phe Ile Lys Pro Leu Leu
515 520 525
Gly Thr Gly Glu Glu Ala Asp Arg Asp Leu Val Phe Tyr Gly Asp Phe
530 535 540
Leu Pro Leu Tyr Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Leu Leu Tyr Asn Lys
545 550 555 560
Val Arg Asn Arg Leu Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Ile Arg
565 570 575
Leu Cys Phe Asn Lys Pro Lys Leu Met Thr Gly Trp Val Asp Ser Lys
580 585 590
Thr Glu Lys Ser Asp Asn Gly Thr Gln Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Arg
595 600 605
Lys Lys Asn Glu Ile Gly Glu Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Ile Ser Ser
610 615 620
Lys Ala Gln Leu Phe Arg Lys Asn Glu Ala Val Ile Gly Asp Tyr Glu
625 630 635 640
Arg Leu Asp Tyr Tyr Gln Pro Lys Ala Asn Thr Ile Tyr Gly Ser Ala
645 650 655
Tyr Glu Gly Glu Asn Ser Tyr Lys Glu Asp Lys Lys Arg Leu Asn Lys
660 665 670
Val Ile Ile Ala Tyr Ile Glu Gln Ile Lys Gln Thr Asn Ile Lys Lys
675 680 685
Ser Ile Ile Glu Ser Ile Ser Lys Tyr Pro Asn Ile Ser Asp Asp Asp
690 695 700
Lys Val Thr Pro Ser Ser Leu Leu Glu Lys Ile Lys Lys Val Ser Ile
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Asn Gly Ile Leu Ser Phe Lys Ser Phe Gln Ser Val Asn
725 730 735
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740 745 750
Lys Ala Glu Phe Leu Asp Leu Ile Asn Lys Asp Tyr Gln Ile Phe Thr
755 760 765
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770 775 780
Tyr Phe Pro Ile Ser Asn Val Glu Leu Glu Lys Glu Met Gly Asp Lys
785 790 795 800
Asp Lys Pro Leu Cys Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Asp Leu Ser Phe
805 810 815
Ala Lys Thr Phe Ser Ala Asn Leu Arg Lys Lys Arg Gly Ala Glu Asn
820 825 830
Leu His Thr Met Leu Phe Lys Ala Leu Met Glu Gly Asn Gln Asp Asn
835 840 845
Leu Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ile Phe Tyr Arg Ala Lys Ser Leu Asp
850 855 860
Gly Asn Lys Pro Thr His Pro Ala Asn Glu Ala Ile Lys Cys Arg Asn
865 870 875 880
Val Ala Asn Lys Asp Lys Val Ser Leu Phe Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys
885 890 895
Asn Arg Arg Tyr Met Glu Asn Lys Phe Leu Phe His Leu Ser Ile Val
900 905 910
Gln Asn Tyr Lys Ala Ala Asn Asp Ser Ala Gln Leu Asn Ser Ser Ala
915 920 925
Thr Glu Tyr Ile Arg Lys Ala Asp Asp Leu His Ile Ile Gly Ile Asp
930 935 940
Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Tyr Ser Val Ile Asp Met Lys Gly
945 950 955 960
Asn Ile Val Glu Gln Asp Ser Leu Asn Ile Ile Arg Asn Asn Asp Leu
965 970 975
Glu Thr Asp Tyr His Asp Leu Leu Asp Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys
980 985 990
Ala Asn Arg Gln Asn Trp Glu Ala Val Glu Gly Ile Lys Asp Leu Lys
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala Leu Glu Asp Leu Gly Gln Met
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Lys Arg Pro Tyr Asn Glu Leu Gly Gly Ile Leu Lys Ala Tyr Gln
1070 1075 1080
Leu Ala Ser Ser Ile Thr Lys Asn Asn Ser Asp Lys Gln Asn Gly
1085 1090 1095
Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Trp Asn Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1100 1105 1110
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1115 1120 1125
Lys Glu Ala Gln Asp Phe Phe Gly Ala Phe Asp Asn Ile Ser Tyr
1130 1135 1140
Asn Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Glu Thr Asn Tyr Asp Lys Phe
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Phe Gly Asn Arg Ile Lys Arg Lys Lys Asp Lys Asn Tyr Trp Asn
1175 1180 1185
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Gln Asn Lys Asp Asn Arg Lys Phe Phe Asp Asp Leu Ile Lys Leu
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1250 1255 1260
Asp Ser Arg Asn Gly Asp Lys Lys Leu Pro Leu Asp Ala Asp Ala
1265 1270 1275
Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Gly Leu Trp Asn Ile Arg
1280 1285 1290
Gln Ile Lys Gln Thr Lys Asn Lys Asp Asp Leu Asn Leu Ser Ile
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Ser Ser Thr Glu Trp Leu Asp Phe Val Arg Glu Lys Pro Tyr Leu
1310 1315 1320
Lys
<210> 17
<211> 1484
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Peregrinibacteria bacterium
<220>
<221> misc_feature
<222> (1073)..(1073)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 17
Met Ser Asn Phe Phe Lys Asn Phe Thr Asn Leu Tyr Glu Leu Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Asp Thr Leu Thr Asn Met
20 25 30
Lys Asp His Leu Glu Tyr Asp Glu Lys Leu Gln Thr Phe Leu Lys Asp
35 40 45
Gln Asn Ile Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Leu Lys Pro Gln Phe Asp Glu
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65 70 75 80
Glu Ile Asp Phe Ser Glu Tyr Leu Asp Leu Phe Gln Glu Lys Lys Glu
85 90 95
Leu Asn Asp Ser Glu Lys Lys Leu Arg Asn Lys Ile Gly Glu Thr Phe
100 105 110
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115 120 125
Trp Lys Lys Gly Ser Lys Ile Ala Asn Gly Ala Asp Ile Leu Ser Cys
130 135 140
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145 150 155 160
Ile Lys Asn Tyr Ile Asp Asp Thr Leu Lys Gly Phe Phe Thr Tyr Phe
165 170 175
Gly Gly Phe Asn Gln Asn Arg Ala Asn Tyr Tyr Glu Thr Lys Lys Glu
180 185 190
Ala Ser Thr Ala Val Ala Thr Arg Ile Val His Glu Asn Leu Pro Lys
195 200 205
Phe Cys Asp Asn Val Ile Gln Phe Lys His Ile Ile Lys Arg Lys Lys
210 215 220
Asp Gly Thr Val Glu Lys Thr Glu Arg Lys Thr Glu Tyr Leu Asn Ala
225 230 235 240
Tyr Gln Tyr Leu Lys Asn Asn Asn Lys Ile Thr Gln Ile Lys Asp Ala
245 250 255
Glu Thr Glu Lys Met Ile Glu Ser Thr Pro Ile Ala Glu Lys Ile Phe
260 265 270
Asp Val Tyr Tyr Phe Ser Ser Cys Leu Ser Gln Lys Gln Ile Glu Glu
275 280 285
Tyr Asn Arg Ile Ile Gly His Tyr Asn Leu Leu Ile Asn Leu Tyr Asn
290 295 300
Gln Ala Lys Arg Ser Glu Gly Lys His Leu Ser Ala Asn Glu Lys Lys
305 310 315 320
Tyr Lys Asp Leu Pro Lys Phe Lys Thr Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Cys
325 330 335
Gly Lys Lys Lys Asp Leu Phe Tyr Thr Ile Lys Cys Asp Thr Glu Glu
340 345 350
Glu Ala Asn Lys Ser Arg Asn Glu Gly Lys Glu Ser His Ser Val Glu
355 360 365
Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gln Glu Ala Ile Asn Lys Tyr Phe Lys Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Ile Leu Thr Lys Glu Asn Tyr Glu Gly Val Tyr Trp Ser Lys Ala Ala
405 410 415
Met Asn Thr Ile Ser Asp Lys Tyr Phe Ala Asn Tyr His Asp Leu Gln
420 425 430
Asp Arg Leu Lys Glu Ala Lys Val Phe Gln Lys Ala Asp Lys Lys Ser
435 440 445
Glu Asp Asp Ile Lys Ile Pro Glu Ala Ile Glu Leu Ser Gly Leu Phe
450 455 460
Gly Val Leu Asp Ser Leu Ala Asp Trp Gln Thr Thr Leu Phe Lys Ser
465 470 475 480
Ser Ile Leu Ser Asn Glu Lys Leu Lys Ile Ile Thr Asp Ser Gln Thr
485 490 495
Pro Ser Glu Ala Leu Leu Lys Met Ile Phe Asn Asp Ile Glu Lys Asn
500 505 510
Met Glu Ser Phe Leu Lys Glu Thr Asn Asp Ile Ile Thr Leu Lys Lys
515 520 525
Tyr Lys Gly Asn Lys Glu Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gln Trp Phe Asp
530 535 540
Tyr Thr Leu Ala Ile Asn Arg Met Leu Lys Tyr Phe Leu Val Lys Glu
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Asn Lys Ile Lys Gly Asn Ser Leu Asp Thr Asn Ile Ser Glu Ala Leu
565 570 575
Lys Thr Leu Ile Tyr Ser Asp Asp Ala Glu Trp Phe Lys Trp Tyr Asp
580 585 590
Ala Leu Arg Asn Tyr Leu Thr Gln Lys Pro Gln Asp Glu Ala Lys Glu
595 600 605
Asn Lys Leu Lys Leu Asn Phe Asp Asn Pro Ser Leu Ala Gly Gly Trp
610 615 620
Asp Val Asn Lys Glu Cys Ser Asn Phe Cys Val Ile Leu Lys Asp Lys
625 630 635 640
Asn Glu Lys Lys Tyr Leu Ala Met Ile Lys Lys Gly Glu Asn Thr Leu
645 650 655
Phe Gln Lys Glu Trp Thr Glu Gly Arg Gly Lys Asn Leu Thr Lys Lys
660 665 670
Ser Asn Pro Leu Phe Glu Ile Asn Asn Cys Glu Ile Leu Ser Lys Met
675 680 685
Glu Tyr Asp Phe Trp Ala Asp Val Ser Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser
690 695 700
Thr Gln Leu Lys Ala Val Val Asn His Phe Lys Gln Ser Asp Asn Glu
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Phe Ile Phe Pro Ile Gly Tyr Lys Val Thr Ser Gly Glu Lys Phe Arg
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Glu Glu Cys Lys Ile Ser Lys Gln Asp Phe Glu Leu Asn Asn Lys Val
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Phe Asn Lys Asn Glu Leu Ser Val Thr Ala Met Arg Tyr Asp Leu Ser
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Asn Phe Cys Lys Tyr Phe Leu Ser Lys Tyr Pro Lys Thr Thr Leu Phe
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Asn Tyr Ser Phe Lys Glu Ser Glu Asn Tyr Asn Ser Leu Asp Glu Phe
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865 870 875 880
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885 890 895
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Lys Lys Gln Leu Asn Ile Phe Ser Ser Arg Lys Ala Met Ala Lys
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<210> 18
<211> 1245
<212> PRT
<213> Porphyromonas macacae
<400> 18
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580 585 590
Phe Lys Thr Leu Pro Lys Leu Gly Ala Glu Glu Met Phe Tyr Glu Lys
595 600 605
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610 615 620
Phe Phe Pro Lys Lys Thr Lys Pro Ala Phe Ala Pro Asp Gln Ser Val
625 630 635 640
Val Asp Ile Tyr Asn Lys Lys Thr Phe Lys Thr Gly Gln Lys Gly Phe
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Asn Lys Lys Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Asp Phe Tyr Lys Glu Ala Leu
660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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820 825 830
Lys Asn Lys Lys Ile Thr Asn Val Asn Gln Met Val Arg Asp Tyr Ile
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850 855 860
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885 890 895
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<213> Smithella sp.
<400> 19
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Lys Ser Leu Asn Gly Leu Lys Leu Asp Gly Leu Glu Lys Tyr Lys Thr
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Leu Tyr Leu Lys Gln Glu Lys Asp Asp Lys Asp Lys Lys Ala Phe Asp
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Met Tyr Val Ala Asp Glu Lys Arg Thr Ala Ile Ala Ser Arg Leu Ile
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Met Lys Lys Glu Ala Pro Glu Leu Leu Ser Pro Phe Asn Gln Thr Leu
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Tyr Asn Ser Val Ile Gly Gly Arg Thr Pro Glu Glu Gly Lys Thr Lys
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Ile Lys Gly Leu Asn Glu Tyr Ile Asn Thr Asp Phe Asn Gln Lys Gln
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Leu Leu His Phe Ser Asn Glu Gly Lys Ser Thr Asn Val Leu Asp Ala
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Ile Lys Asn Ala Val Ser Asn Leu Glu Ser Phe Asn Leu Thr Lys Met
340 345 350
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355 360 365
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Lys Val Ile Ala Asp Tyr Phe Ala Lys Phe Cys Asp Asp Lys Glu Thr
435 440 445
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Thr Ile Ala Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Gln Lys Pro
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595 600 605
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980 985 990
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Asp Gly Gly Arg Thr Lys Trp Thr Val Cys Thr Thr Asn Glu Asp
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1160 1165 1170
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1175 1180 1185
Arg Phe Phe Asp Ser Arg Lys Ala Asp Asp Asp Met Pro Lys Asn
1190 1195 1200
Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp
1205 1210 1215
Cys Leu Glu Gln Ile Ser Lys Thr Asp Asp Leu Lys Lys Val Lys
1220 1225 1230
Leu Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp Leu Glu Phe Val Gln Thr Leu
1235 1240 1245
Lys Gly
1250
<210> 20
<211> 3987
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cas12a polynucleotide
<400> 20
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cacatccagg aacaaggttt catcgaggag gacaaggccc gcaacgacca ctacaaggag 180
ctcaagccca taatcgatcg gatctacaag acgtacgccg accagtgcct ccaactggtg 240
cagctcgact gggagaacct gagcgccgcc attgacagct accgcaagga aaagacggag 300
gagacgcgca acgcccttat tgaggagcaa gccacctacc gcaacgccat ccacgactac 360
ttcatcgggc gcaccgacaa cctgacggac gcgatcaaca agcgccacgc ggaaatctac 420
aagggccttt tcaaggccga gctcttcaac gggaaggtcc taaaacagct cgggactgtc 480
acgacaaccg agcatgagaa cgccctcctt cgcagcttcg acaagttcac cacatacttc 540
tcgggcttct accggaaccg caagaacgtt ttcagcgccg aggacatctc caccgccatc 600
ccgcacagga tcgtccagga caacttcccc aagttcaagg agaactgcca catcttcacg 660
cgcctgatta cagccgtacc ttcacttcgt gagcacttcg agaacgtcaa aaaggccatc 720
gggatcttcg tctccacgtc catcgaggag gtattctctt tcccgttcta taaccagctc 780
ctgacccaga cgcagatcga cctctacaac cagctactgg gcggcatcag ccgggaggcc 840
gggaccgaga aaataaaggg cctcaacgaa gttctcaacc tggccatcca gaagaacgac 900
gagaccgcgc atatcatcgc atccctgccg catcgcttca ttcctttgtt caagcagata 960
ttgagcgacc ggaacaccct ctcgttcatc ctcgaagaat tcaagagcga cgaggaggtc 1020
attcagtctt tctgcaagta caagacgctc ctacggaatg agaatgtgct ggagaccgcg 1080
gaggcactct tcaatgagct gaactccatt gacctgaccc acatcttcat tagccacaag 1140
aaactggaga cgatctccag cgccctgtgc gaccactggg acactctccg caacgccctc 1200
tacgaacgcc ggatctccga acttaccggc aagataacta agtcggctaa ggagaaggtg 1260
caacggagcc tcaagcacga ggacatcaac cttcaggaaa tcatctcagc cgcgggcaag 1320
gagctgagcg aggcgtttaa gcagaaaaca tcggagatac tgagccacgc gcacgcggcc 1380
ctggatcaac cgctgccgac gactctcaag aagcaagagg agaaggaaat ccttaagtcc 1440
cagctcgact cgctgctcgg cctctatcac ttgctcgact ggttcgcggt tgatgagtcc 1500
aacgaggtgg acccggagtt ctccgcgcgc ctcacgggta ttaagctgga gatggagcca 1560
agcttaagct tctacaacaa ggcccgcaac tacgcgacca aaaaaccgta ctcagtcgag 1620
aaattcaagc tgaatttcca gatgcctaca ttggcgaggg ggtgggacgt gaaccgcgag 1680
aagaacaatg gagccatcct gttcgtcaaa aatgggttgt actacctggg catcatgccc 1740
aagcagaagg gccgttacaa ggccctgtca ttcgagccta ccgagaagac ctcggagggc 1800
ttcgacaaga tgtactacga ctatttcccg gacgccgcca agatgatccc gaagtgctcc 1860
acgcagctca aagccgtcac ggcccacttc cagacgcata ccacgccgat acttctgagc 1920
aacaacttca ttgagccgct agagatcacg aaggagatat acgacctaaa caaccccgaa 1980
aaggagccca agaagttcca gacagcctac gctaagaaga caggtgatca gaagggatat 2040
agggaggcac tctgcaagtg gatcgacttc acgcgcgact tcctgtcgaa atatacaaag 2100
acgaccagca ttgacctaag ttctctccgc ccatcctccc agtacaagga tctgggcgag 2160
tattatgcgg agctgaaccc attgctgtac cacatcagct tccagaggat cgccgagaag 2220
gagattatgg acgcggtgga gacggggaaa ctatacctgt tccaaatata taacaaggac 2280
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tcgccagaaa atttggccaa gacttcgatc aagctcaacg gccaggcgga gttgttttac 2400
cgtcccaagt ctcgcatgaa gcgcatggcg catcgcctcg gagagaaaat gcttaacaag 2460
aagctcaagg atcagaagac gcccatacct gatacgttgt accaggaatt gtacgactac 2520
gtgaaccacc gcctatcgca cgacctctca gacgaggccc gcgccctcct cccaaacgtg 2580
attactaagg aggtttccca tgaaataatc aaggaccgac ggttcaccag cgacaaattt 2640
tttttccacg tgcctatcac gctcaattac caggcggcca actccccatc gaagttcaac 2700
cagcgcgtga acgcctacct taaggagcac ccggagaccc caatcatcgg gatcgaccgt 2760
ggcgagcgga acctgatcta tattacggtg atcgatagca ccgggaagat cctggagcag 2820
cgctccctga acacaatcca gcagtttgac taccagaaga aactcgacaa ccgggagaag 2880
gagcgcgtcg cagcccggca agcatggagt gtggtcggca ccataaagga cctgaaacag 2940
ggttacctaa gtcaagttat ccacgagatc gttgacctga tgatacacta tcaagccgta 3000
gtcgtgctgg agaacctcaa cttcgggttt aagtccaagc gcaccggcat cgcggagaag 3060
gcggtgtacc agcagttcga gaagatgctg atcgacaagc tgaactgcct ggtgctcaag 3120
gactaccctg cggagaaggt cggcggggtc ttgaacccgt accagctaac cgaccagttc 3180
acgagcttcg ccaaaatggg cacgcagtcc ggattcttgt tttatgtccc ggctccatat 3240
acaagtaaga tcgacccgct gacagggttt gttgacccat tcgtgtggaa gaccatcaag 3300
aaccacgaga gcaggaaaca cttcttagag ggcttcgact tcctgcatta cgacgttaag 3360
acaggcgact tcatcctgca cttcaagatg aaccgcaacc tgtcgttcca gaggggcctg 3420
cccggcttca tgcccgcctg ggatatcgtc tttgagaaga atgagacgca gttcgacgcg 3480
aaggggacgc cgttcatcgc tggaaagcgg atcgtgccgg tcatcgagaa ccaccgcttc 3540
acgggtcgct accgagattt ataccccgcc aacgaactaa ttgcgctgct ggaggagaag 3600
gggatcgtgt tccgagatgg cagcaacatt ctcccgaagc tgctggagaa cgacgactcg 3660
cacgctattg acacgatggt cgccctcata cggagcgtgc ttcagatgcg gaacagtaac 3720
gctgccacgg gcgaggacta cattaactcc cccgtccgcg acctcaacgg ggtctgcttc 3780
gatagccgct tccagaaccc ggagtggcct atggatgcgg acgcgaacgg ggcctaccac 3840
atcgccctca agggccaact cctgctcaac cacttgaagg aaagcaaaga cctcaaattg 3900
cagaatggca tcagtaacca ggactggctc gcgtacatcc aggaactgag aaacgggtcc 3960
aagaagcggc gtatcaagca agattga 3987
<210> 21
<211> 3987
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cas12a polynucleotide
<400> 21
atggcgggaa gcaaaaagcg ccggattaag caagacacgc agttcgaggg cttcacgaac 60
ctctaccaag tcagcaagac cctccggttc gagctgatac cacagggaaa gacgctcaag 120
cacatccagg aacagggctt catcgaggag gacaaggcgc gcaacgacca ctacaaggag 180
ttgaaaccga tcatcgaccg catctacaag acgtacgccg accagtgcct ccagctcgtg 240
cagctcgact gggagaacct ctccgccgcc attgactcgt accggaagga gaagactgag 300
gagacccgca acgccctgat cgaggagcaa gcaacctacc ggaacgccat ccacgactac 360
ttcatcggcc gcaccgacaa cctcaccgac gcgatcaaca agcggcacgc ggagatatac 420
aaagggctgt tcaaggcgga gctgttcaac ggcaaggtgc tcaagcagct agggacggtg 480
accacgaccg agcacgagaa cgcgctcctc cgcagcttcg acaagttcac cacctacttc 540
agcggcttct accggaaccg caagaatgtg ttcagcgcgg aggacatcag cacggccatc 600
ccgcaccgca tcgtccagga caacttcccg aagttcaagg agaactgcca catcttcacc 660
cgcctgataa ccgccgtccc ctccctgcgg gagcacttcg agaacgtcaa aaaggcaatt 720
gggatcttcg tctcgaccag cattgaggag gtgttcagct tccccttcta caaccagctc 780
ctcacccaga cgcagatcga cctgtacaat cagttgctcg gcgggataag ccgcgaggcg 840
ggaaccgaaa aaatcaaggg gctgaacgaa gtgttgaacc tcgccatcca gaagaacgac 900
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ctctctgacc ggaacaccct gtccttcatt cttgaggagt tcaagtcgga cgaggaggtc 1020
atccagagct tctgcaagta caagacgctg ctacggaacg agaacgtgct ggagacggcg 1080
gaggcactgt tcaacgagct aaacagcatc gacctcacgc acatcttcat cagtcacaag 1140
aaactggaga ccatctcctc cgcgctgtgc gaccactggg acacgctcag gaacgcgctc 1200
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cagcggtccc tcaagcacga ggacatcaac ctccaggaga tcatctcagc ggctgggaaa 1320
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ctggatcagc ctctgccgac gaccctcaag aaacaagaag aaaaggaaat cctcaagtcg 1440
cagctcgact cgctgctggg cctgtaccat ctcctcgact ggttcgccgt ggacgagagc 1500
aacgaggtgg accccgagtt ctccgcgcgg cttacgggga tcaagctgga gatggagccc 1560
agcctgtcct tctacaacaa ggcgcgcaac tacgccacca agaagcccta cagcgtggag 1620
aagttcaagc tcaacttcca gatgcccact ctcgcacgtg ggtgggacgt caaccgcgaa 1680
aaaaataatg gggcgatcct gttcgtcaag aacggcctgt actacttggg catcatgccg 1740
aaacagaagg gccgctacaa ggccctgagc ttcgaaccga ccgagaaaac gagcgagggg 1800
ttcgacaaga tgtactacga ctacttcccc gacgccgcga agatgattcc aaagtgctcc 1860
acgcagctta aggccgtgac ggcccacttc cagacgcaca cgaccccgat cctcctcagc 1920
aacaacttca tcgagcccct ggagatcacg aaggagatat acgacctgaa caacccggag 1980
aaggagccca agaaattcca gaccgcctac gccaagaaga caggcgacca aaagggttac 2040
agggaggccc tctgcaagtg gatcgacttc actagggact tcctgtccaa gtacaccaag 2100
actacctcta tcgacctgtc cagcctccgc ccgtcgtccc agtacaaaga tttgggcgag 2160
tattacgcgg agctgaaccc actgctctac cacatcagct tccagcgcat cgcggagaag 2220
gagatcatgg acgcagtgga gacgggcaag ctatacctat ttcagatata caacaaagac 2280
ttcgctaagg gacaccacgg caagcctaac ctgcacaccc tctactggac ggggctcttc 2340
agcccggaga acctcgccaa gacctcgatc aagctcaacg gccaggccga gctgttctac 2400
cggcccaagt cccgcatgaa gcggatggcc caccggctcg gggagaaaat gctcaacaag 2460
aaattgaagg accaaaaaac gccgataccc gacaccctat accaggagct gtacgactat 2520
gtgaaccacc gcctgagcca cgacctcagc gacgaggcgc gggccctcct gccgaacgtc 2580
atcacaaagg aggtcagcca cgagatcatc aaggaccggc gcttcacctc cgacaagttt 2640
ttctttcacg tgcccatcac gctcaactac caggccgcca actcgccgtc caagttcaac 2700
cagcgcgtga acgcctacct caaggagcac cccgagaccc cgatcatcgg gattgaccga 2760
ggggagcgga acctcatcta catcaccgtc atcgacagca ccgggaagat ccttgaacag 2820
cggtcgctca acaccatcca gcagttcgac taccagaaga aactcgacaa ccgggagaag 2880
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gtggtcctgg agaacctcaa cttcggcttc aagagcaaac gaaccggcat cgcggagaag 3060
gccgtgtacc agcagttcga aaaaatgctg atcgacaagc tgaactgcct cgtgctcaag 3120
gactaccccg ctgagaaggt cggcggggtg ctgaacccgt accagctcac tgaccagttc 3180
accagcttcg caaagatggg cacccagtcc ggcttcctgt tctacgtgcc tgcgccatac 3240
acctcgaaga tcgacccgct caccgggttc gtggacccct tcgtctggaa gaccatcaag 3300
aaccacgaga gccgcaagca cttcctggag ggcttcgact tcctccacta cgacgtcaag 3360
accggggact tcatcctgca cttcaagatg aaccgcaacc tcagtttcca gcgcggcctg 3420
ccggggttca tgcccgcttg ggatatagtc ttcgagaaga atgagacgca gttcgacgcg 3480
aagggcaccc cgttcatcgc cgggaagcgc atcgtgccgg tcatcgagaa ccaccggttc 3540
accgggcgct accgcgacct atacccggcg aacgagttga tcgccctcct ggaggagaag 3600
ggcatcgtgt tccgcgacgg ctccaacatc ctcccgaagc tgctcgaaaa cgacgactcc 3660
cacgccatcg acacgatggt cgcgctgatc cggtcggtgc tccagatgcg gaactccaac 3720
gccgcgacgg gcgaggacta catcaacagt ccggtccgcg atctgaacgg cgtctgcttc 3780
gactcccggt tccagaaccc cgagtggccg atggacgcgg acgcgaacgg cgcataccac 3840
atcgccctaa aagggcaatt gctgctcaac cacctcaagg aatccaaaga cctaaagctc 3900
cagaacggca tctccaacca ggactggctg gcgtacatcc aggaactgcg gaacgggagc 3960
aaaaaacgtc ggatcaagca agattga 3987
<210> 22
<211> 3987
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cas12a polynucleotide
<400> 22
atggcgggct ccaagaaacg ccggattaag caagataccc agttcgaggg gttcacgaac 60
ctctaccaag tgagcaagac cctccgattc gaactgattc ctcaggggaa gaccctcaag 120
cacatccagg agcaagggtt catcgaggag gacaaggcgc ggaacgacca ctacaaggaa 180
ctcaaaccca tcatcgaccg catctacaag acctacgccg atcagtgcct ccagctcgtg 240
cagttggact gggagaacct cagcgcggcc attgactcct accggaagga gaaaacggag 300
gagacgcgca acgcgctcat cgaggaacag gcaacctatc gcaacgccat ccacgactac 360
ttcatcggga ggactgacaa cctcactgac gcgattaaca agcgccacgc ggagatatac 420
aagggactct tcaaagcgga gctgtttaac ggcaaggttc tcaagcaact cggcactgtg 480
accacgaccg agcatgagaa cgccctgctc cgctccttcg acaagttcac cacctacttc 540
tccgggttct accgcaaccg caagaatgtc ttcagcgcgg aggacatcag cacggccatt 600
ccacatcgaa tcgtccaaga taacttcccg aagttcaagg agaactgcca catcttcacc 660
cgactcatta ctgctgtacc gtcgttacgc gaacacttcg agaacgtcaa gaaggcaatt 720
ggaatcttcg tctctacgtc aatagaggag gtgttcagct tccctttcta caaccagctc 780
cttacgcaga cccagataga cctgtacaat cagctcctcg gtgggatcag ccgggaggcg 840
gggactgaga agattaaagg gctcaacgag gtcttgaacc tggccatcca aaaaaacgat 900
gagacggcgc acatcatcgc ctcgctgccc caccggttca tcccgctgtt caagcagatc 960
ctcagtgaca ggaacacctt gagctttatc ctagaggagt tcaagagcga cgaggaggtg 1020
atccagagct tctgcaagta caaaaccctg ctgaggaacg agaacgtcct ggagacggcg 1080
gaggcgctgt tcaacgagct gaactctatc gacttaactc acatattcat ctcgcacaag 1140
aagctggaga ctattagctc tgcactctgc gaccactggg acaccctccg caacgcgctc 1200
tacgagcgcc gcatctcgga gctgaccggg aagatcacca aatccgcgaa ggaaaaggtc 1260
cagcgttccc tcaaacacga ggatattaac ttacaggaga ttatctcagc ggctgggaag 1320
gagttgtcag aggcgttcaa gcagaaaact tccgagatcc tgagccacgc gcacgcagcg 1380
ctcgaccagc ctctgcccac caccctcaaa aagcaggaag aaaaagagat cctcaagagc 1440
cagttggact ccctgctggg gctctatcac cttctcgact ggttcgccgt cgatgagtcg 1500
aacgaggtgg accccgagtt ctccgcccgg ctgaccggca tcaagctaga gatggagccg 1560
tccctcagct tctacaataa ggcccgcaac tacgcgacca aaaaacccta cagcgtggag 1620
aagttcaagc tgaacttcca gatgccgacc ttagcacgcg gttgggacgt aaacagggag 1680
aagaacaatg gagccatcct gttcgtcaag aacgggcttt actacctcgg gataatgccc 1740
aagcagaagg gccgctacaa ggccctttcc ttcgagccga cggagaaaac ctccgagggg 1800
ttcgacaaga tgtactacga ctacttcccc gacgccgcca agatgatccc gaagtgctca 1860
acgcagctaa aagccgtgac cgcccacttc cagacccaca cgacgccgat cctgctgagc 1920
aacaacttca tcgagcccct tgagatcact aaggagatat acgacctgaa caaccccgag 1980
aaggagccca agaagtttca aaccgcctac gccaaaaaaa ctggcgacca aaagggctac 2040
agggaggcgc tgtgtaagtg gatcgacttc acacgcgact tcctttcgaa gtatacgaag 2100
acaacctcta ttgacctgag cagcctgcgt cctagctccc agtacaaaga tttgggcgag 2160
tactacgcgg agcttaatcc actactctac cacatctcat tccagcgcat cgctgagaag 2220
gaaatcatgg acgcggtgga gacaggcaaa ctgtacctct tccagatata caacaaagac 2280
ttcgctaagg ggcaccacgg gaagcccaac cttcatacgc tctactggac gggcctattc 2340
agccccgaaa atctggccaa gacctccatc aagctgaacg gccaagcgga gctgttctac 2400
agacccaaga gccggatgaa gcggatggcc cacaggctcg gcgagaaaat gcttaacaaa 2460
aagttgaagg accagaaaac ccctatcccc gacaccctct accaggaact gtacgactac 2520
gtgaaccaca ggctctcgca cgacctttcc gacgaggccc gtgccctact cccgaacgtc 2580
attaccaaag aggtttcgca cgagatcatc aaggaccggc ggttcacgag cgacaagttt 2640
ttctttcacg tccccatcac ccttaactac caggcggcca actccccatc caagttcaac 2700
cagcgtgtga atgcctacct caaggagcac ccagagaccc cgatcattgg gatcgaccgg 2760
ggcgagcgga acctgatcta catcaccgtc atcgactcga cgggcaagat tcttgagcag 2820
agatcgttga ataccataca gcagttcgac taccagaaga aactcgacaa ccgcgagaag 2880
gagcgcgtgg cggcccgcca ggcgtggtcc gtcgttggga cgattaagga cttgaaacaa 2940
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gtggtgctgg agaatctcaa cttcggcttc aagagtaagc ggacgggaat cgccgagaag 3060
gccgtgtacc agcagttcga gaagatgctg atcgacaagc tcaactgcct tgtgctgaaa 3120
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acctccttcg ccaagatggg cactcagtcc gggttcttgt tctacgtccc cgcaccttac 3240
acctctaaga tcgaccctct gactggcttc gtagatccat tcgtgtggaa gaccattaag 3300
aaccacgaga gccgcaagca cttcctggag ggcttcgact tcctgcacta cgacgtgaag 3360
accggggact tcatccttca cttcaagatg aaccggaacc tcagcttcca gcggggcctg 3420
ccggggttca tgcccgcctg ggacatcgtg ttcgagaaga acgagaccca gttcgacgcg 3480
aagggcacgc ccttcatcgc cgggaagcgt atcgtgccgg tgatcgagaa ccatcgtttc 3540
acgggtcgct accgtgacct ctacccggcg aacgagctta tcgcactcct ggaggagaag 3600
ggcatcgtct tccgggacgg ctccaacatc ctcccgaaac tgctggaaaa cgacgactct 3660
cacgccatcg acacgatggt ggccctcatc cggtccgtgc tccaaatgcg gaacagcaac 3720
gccgccaccg gtgaggacta catcaacagc ccggtccggg atctgaacgg ggtgtgcttc 3780
gattcgcggt tccagaatcc tgagtggccg atggacgcgg atgcaaacgg ggcgtaccac 3840
atcgcgctca agggccagtt acttctgaac caccttaagg agtctaaaga tttgaaactc 3900
cagaacggga tctcgaacca ggactggctg gcctacatcc aagagttgcg gaacggcagc 3960
aagaagcggc ggattaagca agattag 3987
<210> 23
<211> 228
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 23
Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu Arg
20 25 30
Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His Ser
35 40 45
Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val Asn
50 55 60
Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr Arg
65 70 75 80
Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys Ser
85 90 95
Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu Phe
100 105 110
Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His His Ala Asp Pro Arg Asn Arg Gln
115 120 125
Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met Thr
130 135 140
Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asn Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg Leu
165 170 175
Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys Leu
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile Ala
195 200 205
Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp Ala
210 215 220
Thr Gly Leu Lys
225
<210> 24
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His
1 5 10 15
Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr
20 25 30
Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met
35 40 45
Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys
50 55 60
Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile
85 90 95
Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala
100 105 110
Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg
115 120 125
Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg
130 135 140
Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His
145 150 155 160
Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn
195
<210> 25
<211> 621
<212> DNA
<213> Petromyzon marinus
<400> 25
acagatgcag agtatgtgag aattcacgaa aagctggaca tctatacctt caagaagcag 60
ttctttaaca ataagaagtc tgtgagccat aggtgctacg tgctgttcga gctgaagaga 120
aggggtgaaa gaagggcatg tttttggggg tatgctgtga acaagcccca gtctggaact 180
gagagaggca ttcacgccga aattttcagc atcagaaagg tggaggaata cctgagggat 240
aaccctggac agtttacaat taattggtat tctagctggt ctccatgcgc tgactgtgcc 300
gagaagatcc tggaatggta caaccaggag ctgagaggaa atggccatac cctgaagatt 360
tgggcctgca agctgtacta tgaaaagaac gcaagaaatc agatcggact gtggaacctg 420
agggataatg gtgtggggct gaacgtgatg gtgtccgagc actatcagtg ctgtagaaag 480
attttcattc agtcctcaca taatcagctg aacgagaata gatggctgga aaagactctg 540
aagagggctg agaagagaag gtccgaactg tcaattatga tccaggtgaa gatcctgcac 600
accactaagt cacctgccgt g 621
<210> 26
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 26
Phe Glu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Glu Leu Arg Lys Glu Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Lys Ser Gly Lys Leu Trp Arg His Trp
20 25 30
Cys Gln Asn Asn Arg Thr Gln His Ala Glu Val Tyr Phe Leu Glu Asn
35 40 45
Ile Phe Asn Ala Arg Arg Phe Asn Pro Ser Thr His Cys Ser Ile Thr
50 55 60
Trp Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys Ala Glu Cys Ser Gln Lys Ile Val
65 70 75 80
Asp Phe Leu Lys Glu His Pro Asn Val Leu Glu Ile Tyr Val Ala Arg
85 90 95
Leu Tyr Tyr His Glu Asp Glu Arg Asn Arg Gln Gly Leu Arg Asp Leu
100 105 110
Val Asn Ser Gly Val Thr Ile Arg Ile Met Asp Leu Pro Asp Tyr Asn
115 120 125
Tyr Cys Trp Lys Thr Phe Val Ser Asp Gln Gly Gly Asp Glu Asp Tyr
130 135 140
Trp Pro Gly His Phe Ala Pro Trp Ile Lys Gln Tyr Ser Leu Lys Leu
145 150 155 160
<210> 27
<211> 229
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 27
Met Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg
1 5 10 15
Arg Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu
20 25 30
Arg Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His
35 40 45
Ser Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val
50 55 60
Asn Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr
65 70 75 80
Arg Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys
85 90 95
Ser Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu
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<400> 43
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn
165
<210> 44
<211> 83
<212> PRT
<213> Bacillus phage AR9
<400> 44
Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val
1 5 10 15
Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile
20 25 30
Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu
35 40 45
Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr
50 55 60
Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Lys Met Leu
<210> 45
<211> 66
<212> DNA
<213> Saccharomyces bayanus
<400> 45
ttcttgtcgt acttatagat cgctacgtta tttcaatttt gaaaatctga gtcctgggag 60
tgcgga 66
<210> 46
<211> 609
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met
35 40 45
Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile
50 55 60
Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg
65 70 75 80
Asp Leu Leu Ala Val Val Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser
85 90 95
Val Asn Phe Lys Asn Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly
100 105 110
Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Lys Arg Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser
130 135 140
Glu Val Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys
145 150 155 160
Met Ser His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His
165 170 175
Gly Asn Asp Ser Thr Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp
180 185 190
Leu Arg Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu Met His Leu Lys Lys Pro
195 200 205
Gly Gly Phe Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu
225 230 235 240
Asp Leu Leu Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu
245 250 255
Ser Arg Leu Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly
260 265 270
Ile Tyr Asn Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu
275 280 285
Tyr Arg Glu Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn
290 295 300
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305 310 315 320
Ile Tyr Gly Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu
325 330 335
Leu Lys Arg Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro
340 345 350
Leu Val Leu Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val
355 360 365
Tyr Pro Glu Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Glu Glu Glu Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe
420 425 430
Gln Leu Val Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe
435 440 445
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450 455 460
Ile Val Glu Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn
465 470 475 480
Pro Val Leu Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp
485 490 495
Leu Met Glu Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu
500 505 510
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515 520 525
Val Tyr Pro Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys
530 535 540
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545 550 555 560
Glu Glu Glu Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe
565 570 575
Thr Val Pro Met Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Leu Lys Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln
595 600 605
Asp
<210> 47
<211> 482
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polypeptide
<400> 47
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Trp Leu Cys Met Asp Val Gly
1 5 10 15
Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala Glu
35 40 45
Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr Asp
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His Arg
65 70 75 80
His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Lys
85 90 95
Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile Val
100 105 110
Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu Lys
115 120 125
Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser
130 135 140
Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser Glu
145 150 155 160
Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn Leu
165 170 175
Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val Lys
180 185 190
Lys Thr Thr Trp Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp Ile Gln Lys
195 200 205
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210 215 220
Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile Val Pro Phe
225 230 235 240
Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Lys Cys
245 250 255
Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln Arg Arg Phe
260 265 270
Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg Asp Asp Glu
275 280 285
Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu Asp Asp Leu
290 295 300
Asp Ile Trp Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg Ala Asn Pro
305 310 315 320
Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr Glu Cys Leu
325 330 335
Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln Tyr Met Phe
340 345 350
Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu Ala Gln Leu
355 360 365
Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala Lys Lys Asp
370 375 380
Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr Lys Ile Pro
385 390 395 400
Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His Arg Ala Leu
405 410 415
His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile Trp Asn Met
420 425 430
Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile Pro Leu Ser
435 440 445
Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys Lys Asp Gln
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Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp Gly Pro Thr
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Ala Lys
<210> 48
<211> 10
<212> DNA
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum
<400> 48
aatttttgga 10
<210> 49
<211> 83
<212> PRT
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum
<400> 49
Gly Ser Val Ile Asp Val Ser Ser Gln Arg Val Asn Val Gln Arg Pro
1 5 10 15
Leu Asp Ala Leu Gly Asn Ser Leu Asn Ser Pro Val Ile Ile Lys Leu
20 25 30
Lys Gly Asp Arg Glu Phe Arg Gly Val Leu Lys Ser Phe Asp Leu His
35 40 45
Met Asn Leu Val Leu Asn Asp Ala Glu Glu Leu Glu Asp Gly Glu Val
50 55 60
Thr Arg Arg Leu Gly Thr Val Leu Ile Arg Gly Asp Asn Ile Val Tyr
65 70 75 80
Ile Ser Pro
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Bacteriophage MS2
<400> 50
gcgcacatga ggatcaccca tgtgc 25
<210> 51
<211> 116
<212> PRT
<213> Bacteriophage MS2
<400> 51
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro
65 70 75 80
Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln
85 90 95
Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn
100 105 110
Ser Gly Ile Tyr
115
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Bacteriophage PP7
<400> 52
ataaggagtt tatatggaaa ccctta 26
<210> 53
<211> 127
<212> PRT
<213> Bacteriophage PP7
<400> 53
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
20 25 30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
50 55 60
Trp Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg Tyr
65 70 75 80
Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu
85 90 95
Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala Thr
100 105 110
Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
115 120 125
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> Shigella flexneri
<400> 54
ctgaatgcct gcgagcatc 19
<210> 55
<211> 62
<212> PRT
<213> Shigella phage
<400> 55
Met Lys Ser Ile Arg Cys Lys Asn Cys Asn Lys Leu Leu Phe Lys Ala
1 5 10 15
Asp Ser Phe Asp His Ile Glu Ile Arg Cys Pro Arg Cys Lys Arg His
20 25 30
Ile Ile Met Leu Asn Ala Cys Glu His Pro Thr Glu Lys His Cys Gly
35 40 45
Lys Arg Glu Lys Ile Thr His Ser Asp Glu Thr Val Arg Tyr
50 55 60
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RNA Spacer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> wherein n is A, C, T or G
<400> 56
nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target strand
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> wherein n is A, C, T or G
<400> 57
aaannnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Non-target strand
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> wherein n is A, C, T or G
<400> 58
tttnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 59
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GCN4 sequence
<400> 59
Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg
1 5 10 15
Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly
20
<210> 60
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GCN4 sequence
<400> 60
Glu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
50 55 60
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
65 70 75 80
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
100 105 110
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
115 120 125
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
145 150 155 160
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
165 170 175
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
195 200 205
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
210 215 220
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly
<210> 61
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ScFv antibody
<400> 61
Met Gly Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
20 25 30
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Leu Phe Lys Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu
85 90 95
Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp
180 185 190
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Lys Asp Asn Gly
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Asp Asp Thr
210 215 220
Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser
275
<210> 62
<211> 1636
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dLbCpf1-8xGCN4
<400> 62
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser
20 25 30
Lys Thr Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn
35 40 45
Ile Asp Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp
50 55 60
Tyr Lys Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile
65 70 75 80
Asn Asp Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile
85 90 95
Ser Leu Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu
100 105 110
Glu Asn Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys
115 120 125
Gly Asn Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr
130 135 140
Ile Leu Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn
145 150 155 160
Ser Phe Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg
165 170 175
Glu Asn Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg
180 185 190
Cys Ile Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe
195 200 205
Glu Lys Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys
210 215 220
Glu Lys Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly
225 230 235 240
Glu Phe Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn
245 250 255
Ala Ile Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly
260 265 270
Leu Asn Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu
275 280 285
Pro Lys Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser
290 295 300
Leu Ser Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu
305 310 315 320
Val Phe Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile
325 330 335
Lys Lys Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala
340 345 350
Gly Ile Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp
355 360 365
Ile Phe Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr
370 375 380
Asp Asp Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu
385 390 395 400
Asp Asp Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu
405 410 415
Gln Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu
420 425 430
Lys Glu Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly
435 440 445
Ser Ser Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu
450 455 460
Lys Lys Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser
465 470 475 480
Val Lys Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys
485 490 495
Glu Thr Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr
500 505 510
Asp Ile Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr
515 520 525
Val Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln
530 535 540
Asn Pro Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr
545 550 555 560
Arg Ala Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met
565 570 575
Asp Lys Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val
580 585 590
Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn
595 600 605
Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr
610 615 620
Asn Pro Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys
625 630 635 640
Lys Gly Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe
645 650 655
Phe Lys Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp
660 665 670
Phe Asn Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr
675 680 685
Arg Glu Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser
690 695 700
Lys Lys Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe
705 710 715 720
Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn
725 730 735
Leu His Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly
740 745 750
Gln Ile Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser
755 760 765
Leu Lys Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala
770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Pro Ile Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr
820 825 830
Glu Val Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly
835 840 845
Ile Ala Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly
850 855 860
Lys Gly Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn
865 870 875 880
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885 890 895
Lys Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu
900 905 910
Asn Ile Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys
915 920 925
Ile Cys Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp
930 935 940
Leu Asn Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val
945 950 955 960
Tyr Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val
965 970 975
Asp Lys Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr
980 985 990
Gln Ile Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn
995 1000 1005
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<400> 72
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val Gly Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr
35 40 45
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro
50 55 60
Gly Lys Leu Phe Lys Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val
165 170 175
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala
180 185 190
Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile
195 200 205
Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Lys Asp
210 215 220
Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Asp
225 230 235 240
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
260 265 270
Tyr Ala Gly Ser Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
275 280 285
Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His
290 295 300
Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp
305 310 315 320
Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val
325 330 335
Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala
340 345 350
His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn
355 360 365
Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val
370 375 380
Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe
385 390 395 400
Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val
405 410 415
Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile
420 425 430
Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro
435 440 445
Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn Ser
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly
465 470 475 480
Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr
485 490 495
Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
500 505 510
Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Pro Lys Lys
530 535 540
Lys Arg Lys Val
545
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
tatgagttac aacgaacacc tca 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 74
cagctattca ggctggcccg ccc 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
ccttcagcta aaataaagga gga 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 76
gctgaaggga aataaaagga aaa 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
gctcagcagg cacctgcctc agc 23
Claims (44)
- 표적 핵산을
(a) 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질;
(b) 데아미나제; 및
(c) 가이드 핵산
과 접촉시키고,
임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제와 접촉되고,
여기서 데아미나제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원되고 (예를 들어, 단백질 대 단백질 상호작용, RNA 대 단백질 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 통해 동원되고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하며,
임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 및 가이드 핵산은 공동-발현되는 것인,
표적 핵산을 변형시키는 방법. - 표적 핵산을
(a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질;
(b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및
(c) 가이드 핵산
과 접촉시키고,
임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고;
임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는,
표적 핵산을 변형시키는 방법. - 표적 핵산을
(a) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질;
(b) 펩티드 태그에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및
(c) 가이드 핵산
과 접촉시키고,
임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고;
임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는,
표적 핵산을 변형시키는 방법. - 표적 핵산을
(a) 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질;
(b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 RNA를 포함하는 동원 가이드 핵산, 및
(c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질
과 접촉시키고,
임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질과 접촉되고;
임의로 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 데아미나제 융합 단백질 및 동원 가이드 핵산은 공동-발현되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는,
표적 핵산을 변형시키는 방법. - 제2항 또는 제3항에 있어서, 펩티드 태그가 펩티드 태그의 2개 이상의 카피 (예를 들어, 2개 이상의 에피토프)를 포함하는 것인 방법.
- 제2항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 태그가 GCN4 펩티드 반복 단위 (예를 들어, 썬-태그(Sun-Tag)), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프인 방법.
- 제2항, 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 폴리펩티드가 항체인 방법.
- 제7항에 있어서, 항체가 scFv 항체인 방법.
- 제4항에 있어서, 동원 가이드 핵산이 2개 이상의 RNA 동원 모티프에 연결되고, 임의로 2개 이상의 RNA 동원 모티프가 동일한 RNA 동원 모티프 또는 상이한 RNA 동원 모티프인 방법.
- 제4항 또는 제9항에 있어서, RNA 동원 모티프가 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀)이고, 친화성 폴리펩티드가 Ku 폴리펩티드 (예를 들어, Ku 이종이량체)이고/거나; RNA 동원 모티프가 텔로머라제 Sm7 결합 모티프이고, 친화성 폴리펩티드가 Sm7 폴리펩티드이고/거나; RNA 동원 모티프가 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프이고, 친화성 폴리펩티드가 MS2 코트 단백질 (MCP)이고/거나; RNA 동원 모티프가 PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프이고, 친화성 폴리펩티드가 PP7 코트 단백질 (PCP)이고/거나; RNA 동원 모티프가 SfMu 파지 Com 스템-루프이고, 친화성 폴리펩티드가 Com RNA 결합 단백질이고/거나; RNA 동원 모티프가 푸밀리오(Pumilio)/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)이고, 친화성 폴리펩티드가 PUF 결합 부위 (PBS) 폴리펩티드이고/거나; RNA 동원 모티프가 합성 RNA-압타머이고, 친화성 폴리펩티드가 상응하는 압타머 리간드인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 데아미나제가 시토신 데아미나제 및/또는 아데닌 데아미나제인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질이 동일한 또는 상이한 데아미나제를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질의 제1 데아미나제 융합 단백질이 시토신 데아미나제를 포함하고, 2종 이상의 데아미나제 융합 단백질의 제2 데아미나제 융합 단백질이 아데닌 데아미나제를 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 시토신 데아미나제가 아포지질단백질 B mRNA 편집 촉매 폴리펩티드-유사 (APOBEC), 인간 활성화 유도된 데아미나제 (hAID), FERNY 데아미나제, 및/또는 CDA1 데아미나제이고, 임의로 시토신 데아미나제가 서열식별번호:23 내지 32 중 어느 하나의 서열이거나 이를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 시토신 데아미나제가 APOBEC3A이고, 임의로 APOBEC3A가 (예를 들어, 서열식별번호:24)의 서열이거나 이를 포함하는 것인 방법.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 아데닌 데아미나제가 TadA (tRNA-특이적 아데노신 데아미나제) 및/또는 TadA* (진화된 tRNA-특이적 아데노신 데아미나제)이고, 임의로 아데닌 데아미나제가 서열식별번호:33 내지 43 중 어느 하나의 서열이거나 이를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실라제 억제제를 도입하고, 임의로 2종 이상의 글리코실라제 억제제를 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제18항에 있어서, 글리코실라제 억제제가 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)이고, 임의로 UGI가 서열식별번호:44의 서열이거나 이를 포함하는 것인 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 글리코실라제 억제제가 임의로 단백질-단백질 상호작용, RNA-단백질 상호작용, 또는 화학적 상호작용을 통해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 동원되는 것인 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실라제 억제제가 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 데아미나제에 융합되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 데아미나제, 및/또는 데아미나제 융합 단백질이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실라제 억제제가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 가이드 핵산이 1종 이상의 발현 카세트(들) 및/또는 벡터(들)에 포함되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 가이드 핵산이 1종 이상의 발현 카세트(들) 및/또는 벡터(들)에 포함되는 것인 방법.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 동원 가이드 핵산이 1종 이상의 발현 카세트(들) 및/또는 벡터(들)에 포함되는 것인 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실라제 억제제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트 또는 벡터에, 임의로 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 가이드 핵산 중 1종 이상을 포함하는 동일한 발현 카세트 또는 벡터에, 임의로 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 가이드 핵산 중 1종 이상을 포함하는 동일한 발현 카세트 또는 벡터에, 및/또는 임의로 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 동원 가이드 핵산 중 1종 이상을 포함하는 동일한 발현 카세트 또는 벡터에 포함되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 관심의 폴리펩티드에 연결되는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 관심의 폴리펩티드가 니카제 활성, 리콤비나제 활성, 트랜스포사제 활성, 메틸라제 활성, 글리코실라제 (DNA 글리코실라제) 활성, 글리코실라제 억제제 활성 (예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)), 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, 뉴클레아제 활성, 단일-가닥 RNA 절단 활성, 이중-가닥 RNA 절단 활성, 제한 엔도뉴클레아제 활성 (예를 들어, Fok1), 핵산 결합 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, DNA 복구 활성, DNA 손상 활성, 디스뮤타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 폴리머라제 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 및/또는 포토리아제 활성을 갖는 적어도 1종의 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 관심의 폴리펩티드가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a (Cpf1) 폴리펩티드, Cas12b 폴리펩티드, Cas12c (C2c3) 폴리펩티드, Cas12d (CasY) 폴리펩티드, Cas12e (CasX) 폴리펩티드, Cas12g 폴리펩티드, Cas12h 폴리펩티드, Cas12i 폴리펩티드, C2c4 폴리펩티드, C2c5 폴리펩티드, C2c8 폴리펩티드, C2c9 폴리펩티드, C2c10 폴리펩티드, Cas14a 폴리펩티드, Cas14b 폴리펩티드, 및/또는 Cas14c 폴리펩티드인 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a (Cpf1) 폴리펩티드이고, 임의로 Cas12a (Cpf1) 폴리펩티드가 서열식별번호:3 내지 19 중 어느 하나의 또는 서열식별번호:20 내지 22 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 서열을 갖고, 임의로 Cas12a 폴리펩티드가 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 박테리아 ND2006 Cas12a (LbCas12a)(LbCpf1) 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:3 또는 9 내지 11 중 어느 하나의 서열을 가짐), 악시드아미노코쿠스(Acidaminococcus) 종 Cpf1 (AsCas12a) (AsCpf1) 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:4의 서열을 가짐) 및/또는 enAsCas12a 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:20 내지 22 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨)인 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 유기체, 임의로 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아에 있는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 데아미나제 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 글리코실라제 억제제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 표적 핵산을 포함하는 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 방법.
- (a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질;
(b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및
(c) 가이드 핵산
을 포함하는 핵산 구축물. - (a) 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질;
(b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 RNA를 포함하는 동원 가이드 핵산; 및
(c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질
을 포함하는 핵산 구축물. - (a) 펩티드 태그에 융합된 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질;
(b) 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질; 및
(c) 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하는 가이드 핵산
을 포함하고, 여기서 가이드 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질의 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 스페이서 서열은 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질에 융합된 펩티드 태그에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V CRISPR-Cas 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템. - (a) 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (Cas) (CRISPR-Cas) 이펙터 단백질;
(b) RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 RNA를 포함하는 동원 가이드 핵산, 및
(c) RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 데아미나제를 포함하는 데아미나제 융합 단백질
을 포함하고, 여기서 동원 가이드 핵산은 스페이서 서열 및 반복 서열을 포함하고, 동원 가이드 핵산은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 가이드 RNA는 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 그에 의해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 표적 핵산에 가이드하고, 데아미나제 융합 단백질은 동원 가이드 핵산에 융합된 RNA 동원 모티프에의 친화성 폴리펩티드의 결합에 의해 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 표적 핵산에 동원되는 것인 유형 V CRISPR-Cas 시스템이며, 그에 의해 시스템은 표적 핵산을 변형시킬 (예를 들어, 절단하거나 편집할) 수 있는 것인 시스템. - 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a (Cpf1) 폴리펩티드, Cas12b 폴리펩티드, Cas12c (C2c3) 폴리펩티드, Cas12d (CasY) 폴리펩티드, Cas12e (CasX) 폴리펩티드, Cas12g 폴리펩티드, Cas12h 폴리펩티드, Cas12i 폴리펩티드, C2c4 폴리펩티드, C2c5 폴리펩티드, C2c8 폴리펩티드, C2c9 폴리펩티드, C2c10 폴리펩티드, Cas14a 폴리펩티드, Cas14b 폴리펩티드, 및/또는 Cas14c 폴리펩티드인 핵산 구축물, 또는 CRISPR-Cas 시스템.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a (Cpf1) 폴리펩티드이고, 임의로 Cas12a (Cpf1) 폴리펩티드가 서열식별번호:3 내지 19 중 어느 하나의 또는 서열식별번호:20 내지 22 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 서열을 갖고, 임의로 Cas12a 폴리펩티드가 라크노스피라세아에 박테리아 ND2006 Cas12a (LbCas12a)(LbCpf1) 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:3 또는 9 내지 11 중 어느 하나의 서열을 가짐), 악시드아미노코쿠스 종 Cpf1 (AsCas12a) (AsCpf1) 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:4의 서열을 가짐) 및/또는 enAsCas12a 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호:20 내지 22 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨)인 핵산 구축물, 또는 CRISPR-Cas 시스템.
- 제35항, 제36항, 제39항 및 제40항 중 어느 한 항의 핵산 구축물을 포함하는 발현 카세트.
- 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 발현 카세트.
- 제35항, 제36항, 제39항 및 제40항 중 어느 한 항의 핵산 구축물, 또는 제41항의 발현 카세트를 포함하는 세포.
- 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 CRISPR-Cas 시스템 또는 제42항의 발현 카세트를 포함하는 세포.
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