KR20220125304A - 주형화된 편집을 위한 dna 폴리머라제의 동원 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열-특이적 DNA 결합 단백질, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및 DNA 코딩된 복구 주형, 임의로 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하거나, 또는 여기서 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 것인, 재조합 핵산 구축물, 및 세포 및 유기체에서 핵산을 변형시키기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
Description
서열 목록의 전자적 출원에 관한 진술
37 C.F.R. § 1.821 하에 제출되고, 명칭이 1499.14.WO_ST25.txt이고, 크기가 435,310 바이트이고, 2021년 1월 6일에 생성되고, EFS-웹을 통해 출원된 ASCII 텍스트 형식의 서열 목록은 종이 사본 대신 제공된다. 이 서열 목록은 그의 개시내용에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다.
우선권의 진술
본 출원은 2019년 1월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/957,542의 35 U.S.C. § 119 (e) 하의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 서열-특이적 DNA 결합 단백질, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및 DNA 코딩된 복구 주형, 임의로 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하거나, 또는 여기서 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 것인 재조합 핵산 구축물, 및 세포 및 유기체에서 핵산을 변형시키기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
정확한, 주형화된 편집은 전형적으로 표적 부위에 이중 가닥 파단 (DSB)을 도입하고, 혼입되는 목적하는 편집물을 갖는 주형을 제공하는 것을 수반한다. 편집 주형으로부터 표적 부위로의 서열의 혼입은 상동 재조합 경로를 통한 DSB의 주형화된 복구에 의존하며, 이는 대부분의 진핵생물 세포에서 DNA 복구를 위한 우세한 경로가 아니다. 또한, 내인성 상동 재조합 경로는 다중 단계를 갖는 복잡한 프로세스이며, 이의 각각은 고유한 장애물을 갖고, 조작하는데 곤란할 수 있다. 전체적으로, 상동 재조합 매개 주형화된 편집의 효율은 전형적으로 인간 세포에서 낮으며, 시약 전달의 낮은 효율 및 편집된 식물을 회수하는데 있어서의 곤란성으로 인해 식물 세포에서 심지어 더 낮다.
효모 이외의 진핵생물에서 가장 양호한 주형화된 편집 효율은 시약 (예를 들어, DNA 엔도뉴클레아제 또는 니카제, 복구 주형, NHEJ 억제제, HDR 자극제)의 칵테일의 전달이 용이하게 조직화될 수 있는 인간 세포 배양에서 및 높은 효율로 달성되었다. 구체적으로, 인간 세포에서, 정확한 주형화된 편집은 3가지 성분의 복합체를 사용하여 입증되었다: 1) 가이드 RNA에 의해 서열 특이적 부위에 동원될 수 있는 니카제; 2) 니킹된 DNA의 3'에 결합하고 목적하는 편집물을 갖는 복구 주형을 코딩하는 연장된 서열을 갖는 가이드 RNA; 및 3) 니킹된 DNA의 3' 단부 및 DNA를 합성하기 (예를 들어, 편집물을 혼입하기) 위한 프라이머를 사용하는, 니카제에 융합된 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 (리버스 트랜스크립타제). 특정 인간 세포 유형에서, 최대 50%의 정확한 주형화된 편집이 보고되었다 (Anzalone et al. Nature 576:149-157(2019)).
인간 세포에서와 달리, 식물에서, 상이한 조성물에서의 다중 시약 전달은 곤란할 수 있다. 또한, 세포에서 복구 주형의 이용가능성을 증가시킴으로써 주형화된 편집 효율을 개선시킬 수 있는 복구 주형의 높은 용량을 전달하는 것은 곤란할 수 있다. 지금까지, 식물에서 대다수의 주형화된 편집 성공은 DNA 발현 카세트 및 복구 주형의 입자 포격에 의해 달성되었다. 가장 양호한 편집 효율은 10% 미만의 범위이며, 많은 연구는 1% 미만이다. 보고된 가장 높은 효율은 종종 단지 게놈에서 특이적 복구 유전자좌에서이며, HDR의 보다 높은 효율을 초래할 수 있는 메커니즘의 이해는 없거나 빈약하다.
발명의 요약
본 발명의 한 측면은 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; 및 (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하는 제1 복합체를 제공한다.
본 발명의 제2 측면은 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있고, 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; 및 (c) 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 포함하는 제1 복합체를 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; (c) 제1 DNA 엔도뉴클레아제; 및 (d) 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 포함하는 제1 복합체를 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 (a) 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질; 및 (b) DNA-코딩된 복구 주형을 포함하는 제2 복합체를 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 펩티드 태그 또는 RNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 조작된 (변형된) DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 (a) CRISPR-Cas 이펙터 단백질과의 상호작용을 매개하는 핵산 서열; (b) DNA-RNA 상호작용을 통해 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 특이적 핵산 표적 부위에 지시하는 핵산 서열, 및 (c) 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있는 스템 루프 구조를 형성하는 핵산 서열을 포함하는 RNA 분자를 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 표적 핵산을 본 발명의 제1 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 표적 핵산을 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; (c) 제1 DNA 엔도뉴클레아제; 및 (d) 제1 DNA 코딩된 복구 주형과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제9 측면은 표적 핵산을 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있고, 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 니카제 활성 및/또는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; 및 (c) 제1 DNA 코딩된 복구 주형과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제10 측면은 (a) DNA 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합하고; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, (c) (i) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 표적 핵산 상의 제1 부위에 대해 실질적 상보성을 갖는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산 상의 제1 부위에 가이드하거나, 또는 (c) (ii) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있고, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인, 본 발명의 제1 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템을 제공한다.
본 발명의 제11 측면은 (a) 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합하고, (b) 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 가이드 핵산과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고; (c) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 가이드 핵산과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고; (d) (i) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 표적 핵산 상의 제1 부위에 대해 실질적 상보성을 갖는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산 상의 제1 부위에 가이드하거나, 또는 (d) (ii) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있고, 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인, 본 발명의 제1 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템을 제공한다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호(SEQ ID NO):1 내지 20은 본 발명에 유용한 예시 Cas12a 아미노산 서열이다.
서열식별번호:21 내지 22는 프로모터 및 인트론을 코딩하는 예시적인 조절 서열이다.
서열식별번호:23 내지 25는 예시 펩티드 태그 및 상응하는 친화성 폴리펩티드를 제공한다.
서열식별번호:26 내지 36은 예시 RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드를 제공한다.
서열식별번호:37 내지 39는 유형 V CRISPR-Cas12a 뉴클레아제에 대한 프로토스페이서 인접 모티프 위치의 예를 제공한다.
서열식별번호:40 내지 47은 예시 HUH-태그 및 상응하는 인식 서열을 제공한다.
서열식별번호:48 내지 58 및 88 내지 94는 다양한 상이한 유기체로부터의 예시 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 제공한다.
서열식별번호:59 내지 62는 예시 Cas9 서열을 제공한다.
서열식별번호:63 내지 70은 예시 레트론 리버스 트랜스크립타제 및 레트론 스캐폴드를 제공한다.
서열식별번호:71 내지 74는 예시 키메라 가이드 핵산 서열을 제공한다.
서열식별번호:75는 예시 Cas12a 리보핵단백질 (RNP)을 제공한다.
서열식별번호:76 내지 87은 실시예 11로부터의 표적 서열 및 crRNA 서열을 제공한다.
본 발명은 이제 본 발명의 실시양태가 나타내어진 첨부된 도면 및 실시예를 참고로 이하 기재될 것이다. 이 설명은 본 발명이 실행될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 첨가될 수 있는 모든 특색의 상세한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에 관하여 예시된 특색은 다른 실시양태에 포함될 수 있고, 특정 실시양태에 관하여 예시된 특색은 그 실시양태로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 또한, 본원에서 제안된 다양한 실시양태에 대한 다수의 변동 및 첨가는 본 발명으로부터 벗어나지 않는 본 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 설명은 본 발명의 일부 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도되며, 그의 모든 순열, 조합 및 변동을 철저하게 특정하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참고문헌이 제시된 문장 및/또는 단락에 관한 교시내용에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.
맥락이 달리 지시하지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특색은 임의의 조합으로 사용될 수 있음이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예시하기 위해, 본 명세서가 조성물이 성분 A, B 및 C를 포함한다고 진술하는 경우, 임의의 A, B 또는 C, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 청구배제될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
본 발명의 설명 및 첨부된 청구항에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
또한 본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
측정가능한 값, 예컨대 양 또는 농도 등을 언급하는 경우 본원에 사용된 용어 "약"은 특정된 값의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동 뿐만 아니라 특정된 값을 포괄하는 것으로 의미된다. 예를 들어, "약 X" (여기서 X는 측정가능한 값임)는 X 뿐만 아니라 X의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의미된다. 측정가능한 값에 대해 본원에서 제공된 범위는 임의의 다른 범위 및/또는 그 안의 개별적 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "X 내지 Y" 및 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미하고, "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 나열은 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 단지, 개별적으로 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 지칭하는 약칭 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 별개의 값은 그것이 본원에 개별적으로 나열된 것처럼 명세서에 포함된다. 예를 들어, 범위 10 내지 15가 개시되는 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.
본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 진술된 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 및/또는 성분의 존재를 특정하지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 성분, 및/또는 그의 군의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지 않는다.
본원에 사용된 전이적 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위가 청구항에 나열된 특정된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포괄하는 것으로 해석되어야 함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 청구항에 사용되는 경우 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "증가시키다", "증가시키는", "증진시키다", "증진시키는", "개선시키다" 및 "개선시키는" (및 그의 문법적 파생어)은 대조군과 비교하여 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 초과의 상승을 기재한다.
본원에 사용된 용어 "감소시키다(reduce)", "감소된", "감소시키는", "감소", "감소시키다(diminish)" 및 "감소시키다(decrease)" (및 그의 문법적 파생어)는 예를 들어, 대조군과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 감소를 기재한다. 특정 실시양태에서, 감소는 검출가능한 활성 또는 양이 없거나 본질적으로 없는 것 (즉, 비유의한 양, 예를 들어, 약 10% 또는 심지어 5% 미만)을 발생시킬 수 있다.
"이종" 또는 "재조합" 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 뉴클레오티드 서열의 비-천연 발생 다중 카피를 포함한, 그것이 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 연관되지 않은 뉴클레오티드 서열이다.
"천연" 또는 "야생형" 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 천연 발생 또는 내인성 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "야생형 mRNA"는 참조 유기체에서 천연 발생이거나 그에 대해 내인성인 mRNA이다. "상동" 핵산 서열은 그것이 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 연관된 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 그의 하이브리드인 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포괄한다. dsRNA가 합성적으로 생산되는 경우, 덜 통상적인 염기, 예컨대 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 히포크산틴 등은 또한 안티센스, dsRNA, 및 리보자임 쌍형성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 RNA에 높은 친화도로 결합하고, 유전자 발현의 강력한 안티센스 억제제인 것으로 나타났다. 다른 변형, 예컨대 포스포디에스테르 백본, 또는 RNA의 리보스 당 기에서 2'-히드록시에 대한 변형은 또한 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드의 이종중합체 또는 핵산 분자의 5'에서 3' 단부로 이들 뉴클레오티드의 서열을 지칭하며, cDNA, DNA 단편 또는 부분, 게놈 DNA, 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, 플라스미드 DNA, mRNA, 및 안티-센스 RNA (이들 중 임의의 것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있음)를 포함한 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 구축물", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 또한 뉴클레오티드의 이종중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 제공된 핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 5'에서 3' 방향으로, 좌측에서 우측으로 제시되며, 미국 서열 규칙, 37 CFR §§1.821 내지 1.825 및 국제 지적 재산권 기구 (WIPO) 표준 ST.25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 문자를 나타내기 위한 표준 부호를 사용하여 나타내어진다. 본원에 사용된 "5' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 5' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드에서 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다. 본원에 사용된 "3' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 3' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드에서 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, miRNA, 안티-마이크로RNA 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (AMO) 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능적 단백질 또는 유전자 생성물을 생산하는데 사용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 유전자는 코딩 및 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역) 둘 다를 포함할 수 있다. 유전자는 "단리될" 수 있으며, 이는 그의 자연 상태에서 핵산과 관련하여 통상적으로 발견되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 핵산을 의미한다. 이러한 성분은 세포 물질, 재조합 생산으로부터의 배양 배지, 및/또는 핵산을 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학물질을 포함한다.
용어 "돌연변이"는 점 돌연변이 (예를 들어, 미스센스, 또는 넌센스, 또는 격자 이동을 발생시키는 단일 염기 쌍의 삽입 또는 결실), 삽입, 결실, 및/또는 말단절단을 지칭한다. 돌연변이가 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입인 경우, 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기, 이어서 서열 내의 잔기의 위치 및 새롭게 치환된 잔기의 신원을 확인함으로써 기재된다.
본원에 사용된 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기-쌍형성에 의한 허용적인 염 및 온도 조건 하에서의 폴리뉴클레오티드의 천연 결합을 지칭한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T" (5'에서 3'로)는 상보적 서열 "T-C-A" (3'에서 5'로)에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자 사이의 상보성은 뉴클레오티드의 단지 일부가 결합하는 "부분적"일 수 있거나, 또는 이는 총 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재하는 경우 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대한 유의한 효과를 갖는다.
본원에 사용된 "상보체"는 비교자 뉴클레오티드 서열과의 100% 상보성을 의미할 수 있거나, 또는 이는 100% 미만의 상보성 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등의 상보성)을 의미할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열의 "부분" 또는 "단편"은 참조 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 비해 감소된 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드만큼 감소된) 길이의 및 참조 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일한 또는 거의 동일한 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 단편 또는 부분은, 적절한 경우, 그것이 구성요소인 보다 큰 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 예로서, 본 발명의 가이드 핵산의 반복 서열은 야생형 CRISPR-Cas 반복 서열 (예를 들어, 야생형 CRISPR-Cas 반복부, 예를 들어, Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 등의 CRISPR Cas 시스템으로부터의 반복부)의 부분을 포함할 수 있다.
상동성을 갖는 상이한 핵산 또는 단백질은 본원에서 "동족체"로 지칭된다. 용어 동족체는 동일한 및 다른 종으로부터의 상동 서열 및 동일한 및 다른 종으로부터의 이종상동 서열을 포함한다. "상동성"은 위치적 동일성 (즉, 서열 유사성 또는 동일성)의 퍼센트의 관점에서 2개 이상의 핵산 및/또는 아미노산 서열 사이의 유사성의 수준을 지칭한다. 상동성은 또한 상이한 핵산 또는 단백질 중에서 유사한 기능적 특성의 개념을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 대한 동족체를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "이종상동"은 종분화 동안 공통 조상 유전자로부터 발생한 상이한 종에서의 상동 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 동족체는 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열과 실질적 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%)을 갖는다.
본원에 사용된 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 성분, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 정렬의 창 전반에 걸쳐 불변하는 정도를 지칭한다. "동일성"은 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 [Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 경우 시험 ("대상") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)와 비교하여 참조 ("의문") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "퍼센트 동일성"은 참조 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열에서 동일한 아미노산의 백분율을 지칭할 수 있다.
2개의 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열의 맥락에서 본원에 사용된 어구 "실질적으로 동일한", 또는 "실질적 동일성"은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같은, 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬된 경우, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 실질적 동일성은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 60개의 뉴클레오티드, 약 70개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드, 약 90개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이, 및 그 안의 임의의 범위 내지 서열의 전장인 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 연속적 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 뉴클레오티드)에 걸쳐 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 또는 단백질 서열은 그것이 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 (또는 코딩된 단백질 서열)와 실질적으로 동일한 기능을 수행한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터 내로 들어가고, 하위서열 좌표가 필요에 따라 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열에 비해 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 스미스 및 와터만(Smith and Waterman)의 국소 상동성 알고리즘, 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 및 리프만(Pearson and Lipman)의 유사성에 대한 검색 방법과 같은 툴에 의해, 및 임의로 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행, 예컨대 GCG® 위스콘신 패키지(Wisconsin Package)® (악셀리스 인크.(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)의 일부로서 이용가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA에 의해 수행될 수 있다. 시험 서열 및 참조 서열의 정렬된 절편에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열에 의해 공유된 동일한 성분의 수 나누기 참조 서열 절편, 예를 들어 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작은 한정된 부분에서의 성분의 총 수이다. 퍼센트 서열 동일성은 동일성 분율 곱하기 100으로서 나타내어진다. 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분에 대한 것, 또는 보다 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "퍼센트 동일성"은 또한 번역된 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTX 버전 2.0 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열은 또한 2개의 서열이 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하는 경우 실질적으로 상보적인 것으로 간주될 수 있다. 일부 대표적인 실시양태에서, 실질적으로 상보적인 것으로 간주되는 2개의 뉴클레오티드 서열은 고도로 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화한다.
핵산 혼성화 실험, 예컨대 서던 및 노던 혼성화의 맥락에서 "엄격한 혼성화 조건" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경적 파라미터 하에서 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.
Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대해 Tm과 동등하도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 초과의 상보적 잔기를 갖는 상보적 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1 mg의 헤파린을 갖는 50% 포름아미드이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 고도로 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.1 5M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2x SSC 세척이다 (SSC 완충제의 설명에 대해서는, 상기 문헌 [Sambrook] 참조). 종종, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 저 염격성 세척은 고 염격성 세척에 선행한다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 두가닥에 대한 중간 엄격성 세척의 예는 45℃에서 15분 동안 1x SSC이다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 두가닥에 대한 저 염격성 세척의 예는 40℃에서 15분 동안 4 내지 6x SSC이다. 짧은 프로브 (예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 수반하고, 온도는 전형적으로 적어도 약 30℃이다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 일반적으로, 특정 혼성화 검정에서 비관련된 프로브에 대해 관찰된 것보다 2x (이상)의 신호 대 잡음 비는 특이적 혼성화의 검출을 지시한다. 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하지 않는 뉴클레오티드 서열은 이들이 코딩하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 카피가 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우 일어날 수 있다.
본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트 및/또는 벡터는 관심의 임의의 종에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 종-특이적 코돈 사용빈도 표를 사용한 코돈 사용빈도 편향에 대한 뉴클레오티드 서열의 변형을 수반한다. 코돈 사용빈도 표는 관심의 종에 대한 가장 고도로 발현된 유전자의 서열 분석에 기반하여 생성된다. 뉴클레오티드 서열이 핵에서 발현되는 경우, 코돈 사용빈도 표는 관심의 종에 대한 고도로 발현된 핵 유전자의 서열 분석에 기반하여 생성된다. 뉴클레오티드 서열의 변형은 종-특이적 코돈 사용빈도 표를 천연 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 코돈과 비교함으로써 결정된다. 관련 기술분야에 이해되어 있는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 천연 뉴클레오티드 서열과 100% 미만의 동일성 (예를 들어, 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등)을 갖지만, 원래 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것과 동일한 기능 (및 일부 실시양태에서, 동일한 구조)을 갖는 폴리펩티드를 여전히 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발생시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트, 및/또는 벡터 (예를 들어, 서열 특이적 DNA 결합 도메인, DNA-의존성 DNA 폴리머라제, DNA 엔도뉴클레아제 등을 포함함/코딩함)는 유기체 (예를 들어, 식물 (예를 들어, 특정 식물 종에서), 동물, 박테리아, 진균 등)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 코돈 최적화된 핵산 구축물, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터는 코돈 최적화되지 않은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트, 및/또는 벡터와 약 70% 내지 약 99.9% (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%) 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 식물 및/또는 식물의 세포에서의 발현을 위해 다양한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소와 작동적으로 회합될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 프로모터, 인트론, 인핸서, 및/또는 종결자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 인트론 (예를 들어, Ubi1 프로모터 및 인트론)과 작동가능하게 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론과 회합된 프로모터는 "프로모터 영역" (예를 들어, Ubi1 프로모터 및 인트론)으로 지칭될 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"이란, 지시된 요소가 서로와 기능적으로 관련되고, 또한 일반적으로 물리적으로 관련됨을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"은 기능적으로 연관된 단일 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 제2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열은 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 놓인 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 실행하는 경우 상기 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 회합된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)은, 제어 서열이 그의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 그것이 작동가능하게 회합된 뉴클레오티드 서열과 인접할 필요는 없음을 인정할 것이다. 따라서, 예를 들어, 개재하는 비번역된, 그러나 전사된 핵산 서열은 프로모터 및 뉴클레오티드 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터는 뉴클레오티드 서열과 "작동가능하게 연결된" 것으로 여전히 간주될 수 있다.
폴리펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "연결된"은 한 폴리펩티드의 또 다른 것에의 부착을 지칭한다. 폴리펩티드는 직접적으로 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) 또는 링커를 통해 (N-말단 또는 C-말단에서) 또 다른 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
용어 "링커"는 관련 기술분야에 인식되어 있으며, 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어, 융합 단백질의 2개의 도메인, 예컨대, 예를 들어, DNA 결합 폴리펩티드 또는 도메인 및 펩티드 태그 및/또는 리버스 트랜스크립타제 및 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드; 또는 DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인 및 펩티드 태그 및/또는 리버스 트랜스크립타제 및 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드를 연결하는 화학기, 또는 분자를 지칭한다. 링커는 단일 연결 분자로 구성될 수 있거나, 또는 1개 초과의 연결 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티, 예컨대 2가 유기 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산일 수 있거나, 또는 이는 펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 펩티드 링커는 약 2 내지 약 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이, 예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 60, 약 4 내지 약 40, 약 4 내지 약 50, 약 4 내지 약 60, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 50, 약 5 내지 약 60, 약 9 내지 약 40, 약 9 내지 약 50, 약 9 내지 약 60, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 60개, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개의 아미노산 내지 약 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 105, 110, 115, 120, 130, 140 150개 또는 그 초과의 아미노산의 길이)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 GS 링커일 수 있다.
"프로모터"는 프로모터와 작동가능하게 회합된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 코딩 서열)의 전사를 제어하거나 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터에 의해 제어되거나 조절되는 코딩 서열은 폴리펩티드 및/또는 기능적 RNA를 코딩할 수 있다. 전형적으로, "프로모터"는 RNA 폴리머라제 II에 대한 결합 부위를 함유하고 전사의 개시를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터는 상응하는 코딩 서열의 코딩 영역의 시작부에 비해 5', 또는 상류에서 발견된다. 프로모터는 유전자 발현의 조절제로서 작용하는 다른 요소; 예를 들어, 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이들은 TATA 박스 컨센서스 서열, 및 종종 CAAT 박스 컨센서스 서열을 포함한다 (Breathnach and Chambon, (1981) Annu. Rev. Biochem. 50:349). 식물에서, CAAT 박스는 AGGA 박스에 의해 치환될 수 있다 (Messing et al., (1983) in Genetic Engineering of Plants, T. Kosuge, C. Meredith and A. Hollaender (eds.), Plenum Press, pp. 211-227). 일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 적어도 1개의 인트론 (예를 들어, 서열식별번호:21 또는 서열식별번호:22)을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 프로모터는 예를 들어, 재조합 핵산 분자, 예를 들어, "합성 핵산 구축물" 또는 "단백질-RNA 복합체"의 제조에 사용하기 위한 구성적, 유도성, 시간적으로 조절된, 발달적으로 조절된, 화학적으로 조절된, 조직-바람직한 및/또는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 다양한 유형의 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
프로모터의 선택은 발현을 위한 시간적 및 공간적 요건에 따라 다양할 수 있으며, 또한 형질전환되는 숙주 세포에 기반하여 다양할 수 있다. 많은 상이한 유기체에 대한 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 관련 기술분야에 존재하는 광범위한 지식에 기반하여, 적절한 프로모터는 관심의 특정 숙주 유기체에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모델 유기체에서 고도로 구성적으로 발현된 유전자의 상류의 프로모터에 관하여 많은 것이 공지되어 있으며, 이러한 지식은 용이하게 접근되고, 적절한 경우 다른 시스템에서 실행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물에서 기능적인 프로모터는 본 발명의 구축물에 사용될 수 있다. 식물에서 발현을 유도하는데 유용한 프로모터의 비-제한적 예는 루비스코(RubisCo) 소형 서브유닛 유전자 1의 프로모터 (PrbcS1), 액틴 유전자의 프로모터 (팩틴(Pactin)), 니트레이트 리덕타제 유전자의 프로모터 (Pnr) 및 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1의 프로모터 (Pdca1)를 포함한다 (문헌 [Walker et al. Plant Cell Rep. 23:727-735 (2005)]; [Li et al. Gene 403:132-142 (2007)]; [Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)] 참조). PrbcS1 및 팩틴은 구성적 프로모터이고, Pnr 및 Pdca1은 유도성 프로모터이다. Pnr은 니트레이트에 의해 유도되고, 암모늄에 의해 억제되며 (Li et al. Gene 403:132-142 (2007)), Pdca1은 염에 의해 유도된다 (Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)). 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 RNA 폴리머라제 II (Pol II) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제아 마이스(Zea mays)로부터의 U6 프로모터 또는 7SL 프로모터는 본 발명의 구축물에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제아 마이스로부터의 U6c 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 가이드 핵산의 발현을 유도하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리시네 막스(Glycine max)로부터의 U6c 프로모터, U6i 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 본 발명의 구축물에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리시네 막스로부터의 U6c 프로모터, U6i 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 가이드 핵산의 발현을 유도하는데 유용할 수 있다.
식물에 유용한 구성적 프로모터의 예는 세스트룸 바이러스 프로모터 (cmp) (미국 특허 번호 7,166,770), 벼 액틴 1 프로모터 (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,641,876), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), CaMV 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), nos 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), Adh 프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), 수크로스 신타제 프로모터 (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), 및 유비퀴틴 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유비퀴틴으로부터 유래된 구성적 프로모터는 많은 세포 유형에서 축적된다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물에 사용하기 위한 몇몇 식물 종, 예를 들어, 해바라기 (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), 메이즈 (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), 및 아라비돕시스 (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906)로부터 클로닝되었다. 메이즈 유비퀴틴 프로모터 (UbiP)는 트랜스제닉 단자엽식물 시스템에서 개발되었으며, 그의 서열 및 단자엽식물 형질전환을 위해 구축된 벡터는 특허 공개 EP 0 342 926에 개시되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물, 특히 단자엽식물에서의 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합하다. 추가로, 문헌 [McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991))]에 의해 기재된 프로모터 발현 카세트는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 용이하게 변형될 수 있으며, 단자엽식물 숙주에 사용하는데 특히 적합하다.
일부 실시양태에서, 조직 특이적/조직 바람직한 프로모터는 식물 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드의 발현에 사용될 수 있다. 조직 특이적 또는 바람직한 발현 패턴은 녹색 조직 특이적 또는 바람직한, 뿌리 특이적 또는 바람직한, 줄기 특이적 또는 바람직한, 꽃 특이적 또는 바람직한 또는 화분 특이적 또는 바람직한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 녹색 조직에서의 발현에 적합한 프로모터는 광합성에 관여하는 유전자를 조절하는 많은 것을 포함하며, 이들 중 많은 것은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 다로부터 클로닝되었다. 한 실시양태에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 포스포에놀 카르복실라제 유전자로부터의 메이즈 PEPC 프로모터이다 (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예는 종자 저장 단백질 (예컨대 β-콘글리시닌, 크루시페린, 나핀 및 파세올린), 제인 또는 오일 바디 단백질 (예컨대 올레오신), 또는 지방산 생합성에 관여하는 단백질 (아실 운반체 단백질, 스테아로일-ACP 데사투라제 및 지방산 데사투라제 (fad 2-1)를 포함함)을 코딩하는 유전자, 및 배 발생 동안 발현되는 다른 핵산 (예컨대 Bce4, 예를 들어, 문헌 [Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219]; 뿐만 아니라 유럽 특허 번호 255378 참조)과 연관된 것들을 포함한다. 식물, 특히 메이즈에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 유용한 조직-특이적 또는 조직-우선적 프로모터는 뿌리, 중과피, 잎 또는 화분에서 발현을 지시하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 93/07278에 개시되어 있다. 본 발명에 유용한 조직 특이적 또는 조직 바람직한 프로모터의 다른 비-제한적 예는 미국 특허 6,040,504에 개시된 면화 루비스코 프로모터; 미국 특허 5,604,121에 개시된 벼 수크로스 신타제 프로모터; 문헌 [de Framond (FEBS 290:103-106 (1991)], 시바-가이기(Ciba-Geigy)의 EP 0 452 269)에 의해 기재된 뿌리 특이적 프로모터; 미국 특허 5,625,136 (시바-가이기)에 기재되고, 메이즈 trpA 유전자의 발현을 유도하는 줄기 특이적 프로모터; WO 01/73087에 개시된 세스트룸 황화 잎 말림 바이러스 프로모터; 및 벼로부터의 ProOsLPS10 및 ProOsLPS11 (Nguyen et al. Plant Biotechnol. Reports 9(5):297-306 (2015)), 메이즈로부터의 ZmSTK2_USP (Wang et al. Genome 60(6):485-495 (2017)), 토마토로부터의 LAT52 및 LAT59 (Twell et al. Development 109(3):705-713 (1990)), Zm13 (미국 특허 번호 10,421,972), 아라비돕시스로부터의 PLA2-δ 프로모터 (미국 특허 번호 7,141,424), 및/또는 메이즈로부터의 ZmC5 프로모터 (국제 PCT 공개 번호 WO1999/042587을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화분 특이적 또는 바람직한 프로모터를 포함한다.
식물 조직-특이적/조직 바람직한 프로모터의 추가의 예는 뿌리 털-특이적 시스 -요소 (RHE) (Kim et al. The Plant Cell 18:2958-2970 (2006)), 뿌리-특이적 프로모터 RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) 및 RB7 (미국 특허 번호 5459252), 렉틴 프로모터 (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167; 및 Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), 옥수수 알콜 데히드로게나제 1 프로모터 (Dennis et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000), S-아데노실-L-메티오닌 신테타제 (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8):1108-1115), 옥수수 광 수확 복합체 프로모터 (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), 옥수수 열 충격 단백질 프로모터 (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; 및 Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458), 완두콩 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 (Cashmore, "Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase" pp. 29-39 In: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; 및 Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:193-200), Ti 플라스미드 만노핀 신타제 프로모터 (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-3223), Ti 플라스미드 노팔린 신타제 프로모터 (Langridge et al. (1989), 상기 문헌), 페투니아 칼콘 이소머라제 프로모터 (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7:1257-1263), 콩 글리신 풍부 단백질 1 프로모터 (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646), 말단절단된 CaMV 35S 프로모터 (O'Dell et al. (1985) Nature 313:810-812), 감자 파타틴 프로모터 (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), 뿌리 세포 프로모터 (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), 메이즈 제인 프로모터 (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34:1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449; 및 Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), 글로불린-1 프로모터 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), α-튜불린 cab 프로모터 (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:431-440), PEPC아제 프로모터 (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), R 유전자 복합체-연관된 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), 및 칼콘 신타제 프로모터 (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
종자-특이적 발현에 유용한 것은 완두콩 비실린 프로모터 (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,625,136에 개시된 종자-특이적 프로모터이다. 성숙한 잎에서의 발현을 위한 유용한 프로모터는 노쇠의 개시에서 스위칭된 것들, 예컨대 아라비돕시스로부터의 SAG 프로모터 (Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988)이다.
또한, 엽록체에서 기능적인 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 비-제한적 예는 박테리오파지 T3 유전자 9 5' UTR 및 미국 특허 번호 7,579,516에 개시된 다른 프로모터를 포함한다. 본 발명에 유용한 다른 프로모터는 S-E9 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 및 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 유전자 프로모터 (Kti3)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 추가의 조절 요소는 인트론, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론은 식물에서 확인되고 그로부터 단리되며, 이어서 식물의 형질전환에 사용되도록 발현 카세트 내로 삽입된 인트론일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 인트론은 자기-삭제에 요구되는 서열을 포함할 수 있으며, 핵산 구축물/발현 카세트 내로 프레임 내에서 혼입된다. 인트론은 한 핵산 구축물에서 다수의 단백질-코딩 서열을 분리하는 스페이서로서 사용될 수 있거나, 또는 인트론은 한 단백질-코딩 서열 내부에서, 예를 들어, mRNA를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 이들이 단백질-코딩 서열 내에서 사용되는 경우, 이들은 포함된 삭제 부위와 "프레임 내에서" 삽입된다. 인트론은 또한 발현을 개선시키거나 변형시키기 위해 프로모터와 회합될 수 있다. 예로서, 본 발명에 유용한 프로모터/인트론 조합은 메이즈 Ubi1 프로모터 및 인트론의 그것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론의 비-제한적 예는 ADHI 유전자 (예를 들어, Adh1-S 인트론 1, 2 및 6), 유비퀴틴 유전자 (Ubi1), 루비스코 소형 서브유닛 (rbcS) 유전자, 루비스코 대형 서브유닛 (rbcL) 유전자, 액틴 유전자 (예를 들어, 액틴-1 인트론), 피루베이트 데히드로게나제 키나제 유전자 (pdk), 니트레이트 리덕타제 유전자 (nr), 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1 (Tdca1), psbA 유전자, atpA 유전자로부터의 인트론, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물은 "발현 카세트"일 수 있거나, 또는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 "발현 카세트"는 예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드 또는 도메인, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제), DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인, DNA 코딩된 복구 주형, 가이드 핵산, 제1 복합체, 제2 복합체, 제3 복합체 등)을 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하고, 여기서 핵산 구축물은 하나 이상의 제어 서열 (예를 들어, 프로모터, 종결자 등)과 작동가능하게 회합된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 예를 들어, 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 디자인된 발현 카세트를 제공한다. 발현 카세트가 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 모든 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다 (예를 들어, 3종의 폴리뉴클레오티드는 임의의 조합으로 1, 2 또는 3개의 프로모터에 의해 유도될 수 있음). 2개 이상의 별개의 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터는 동일한 프로모터일 수 있거나, 또는 이들은 상이한 프로모터일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 발현 카세트에 포함되는 경우, 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 폴리펩티드 또는 도메인, DNA 코딩된 복구 주형 및/또는 가이드 핵산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 각각 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 이들은 임의의 조합으로 2개 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트 및/또는 그 안에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 식물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 관하여 이종임을 의미한다 (예를 들어, 숙주 유기체에서 발현되는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주 유기체로부터의 프로모터, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주와는 상이한 유기체로부터의 것이거나, 또는 통상적으로 그 프로모터와 연관되어 발견되지 않음). 발현 카세트는 또한 천연 발생이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 얻어진 것일 수 있다.
발현 카세트는 임의로 선택된 숙주 세포에서 기능적인 전사 및/또는 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역) 및/또는 인핸서 영역을 포함할 수 있다. 다양한 전사 종결자 및 인핸서는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 발현 카세트에 사용하기 위해 이용가능하다. 전사 종결자는 전사의 종결 및 정확한 mRNA 폴리아데닐화를 담당한다. 종결 영역 및/또는 인핸서 영역은 전사 개시 영역에 대해 천연일 수 있거나, 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 등에 대해 천연일 수 있거나, 숙주 세포에 대해 천연일 수 있거나, 또 다른 공급원에 대해 천연 (예를 들어, 프로모터에 대해, 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 등에 대해, 숙주 세포에 대해 외래 또는 이종, 또는 이들의 임의의 조합)일 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 또한 형질전환된 숙주 세포를 선택하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "선택가능한 마커"는 발현되는 경우 마커를 발현하는 숙주 세포에 대해 별개의 표현형을 부여하고, 따라서 이러한 형질전환된 세포가 마커를 갖지 않는 것들로부터 구별되는 것을 허용하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 마커가 화학적 수단에 의해, 예컨대 선택적 작용제 (예를 들어, 항생제 등)를 사용함으로써 선택될 수 있는 소질을 부여하는지 여부, 또는 마커가 단순히 관찰 또는 시험을 통해, 예컨대 스크리닝 (예를 들어, 형광)에 의해 확인할 수 있는 소질인지 여부에 따라, 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커 중 어느 하나를 코딩할 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 많은 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 발현 카세트에 사용될 수 있다.
발현 카세트 외에도, 본원에 기재된 핵산 분자/구축물 및 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터와 관련되어 사용될 수 있다. 용어 "벡터"는 핵산 (또는 핵산들)을 세포 내로 전달하거나(transferring), 전달하거나(delivering), 도입하기 위한 조성물을 지칭한다. 벡터는 전달되거나, 전달되거나 도입되는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산 구축물을 포함한다. 숙주 유기체의 형질전환에 사용하기 위한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 벡터의 일반적 부류의 비-제한적 예는 자기 전파가능하거나 가동화가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 이중 또는 단일 가닥 선형 또는 원형 형태의 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터, 포스미드 벡터, 박테리오파지, 인공 염색체, 미니서클, 또는 아그로박테리움(Agrobacterium) 2성분 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된, 또는 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 정의된 바와 같은 벡터는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 원핵생물 또는 진핵생물 숙주를 형질전환시키거나, 염색체외적으로 존재할 수 있다 (예를 들어 복제 원점을 갖는 자율 복제 플라스미드). 추가로 포함되는 것은 셔틀 벡터이며, 이는 방선균류 및 관련된 종, 박테리아 및 진핵생물 (예를 들어 고등 식물, 포유동물, 효모 또는 진균 세포)로부터 선택될 수 있는 2종의 상이한 숙주 유기체에서 자연적으로 또는 디자인에 의해 복제 가능한 DNA 비히클을 의미한다. 일부 실시양태에서, 벡터 중의 핵산은 숙주 세포에서의 전사를 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있고, 그에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 다수의 숙주에서 기능하는 이중-기능적 발현 벡터일 수 있다. 게놈 DNA의 경우에, 이는 그 자신의 프로모터 및/또는 다른 조절 요소를 함유할 수 있고, cDNA의 경우에, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 구축물 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트는 본원에 기재된 바와 같은 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "접촉시키다", "접촉시키는", "접촉된", 및 그의 문법적 파생어는 바람직한 반응의 성분을 바람직한 반응 (예를 들어, 형질전환, 전사 제어, 게놈 편집, 니킹, 및/또는 절단)을 수행하는데 적합한 조건 하에서 함께 놓는 것을 지칭한다. 비-제한적 예로서, 표적 핵산은 서열 특이적 DNA 결합 단백질, DNA 엔도뉴클레아제, 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 발현되고, 서열 특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산에 결합하고, DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 융합되거나, 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 동원되고 (예를 들어, 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 융합된 펩티드 태그 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합된 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, 펩티드 태그에 결합할 수 있는 폴리펩티드)를 통해), 그에 의해 표적 핵산의 부근에서 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 동원함), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 조건 하에서, 서열 특이적 DNA 결합 도메인, DNA 엔도뉴클레아제, DNA-의존성 DNA 폴리머라제, DNA 코딩된 복구 주형, 가이드 핵산 및/또는 이를 코딩하는/포함하는 핵산 구축물/발현 카세트와 접촉될 수 있다.
표적 핵산에 관하여 본원에 사용된 "변형시키는" 또는 "변형"은 표적 핵산의 편집 (예를 들어, 돌연변이화), 공유 변형, 핵산/뉴클레오티드 염기의 교환/치환, 결실, 절단, 니킹, 및/또는 전사 제어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 임의의 크기의 인델 및/또는 임의의 유형의 단일 염기 변화 (SNP)를 포함할 수 있다.
관심의 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "도입하는", "도입하다", "도입된" (및 그의 문법적 파생어)은 뉴클레오티드 서열이 세포의 내부에의 접근을 얻도록 하는 방식으로 관심의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 가이드 핵산)을 숙주 유기체 또는 상기 유기체의 세포 (예를 들어, 숙주 세포; 예를 들어, 식물 세포, 동물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포)에 제시하는 것을 의미한다.
용어 "형질전환" 또는 "형질감염"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 본원에 사용된 바와 같이 세포 내로의 이종 핵산의 도입을 지칭한다. 세포의 형질전환은 안정하거나 일시적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자로 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 핵산 구축물로 일시적으로 형질전환될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "일시적 형질전환"은 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것을 의미한다.
세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "안정하게 도입하는" 또는 "안정하게 도입된"이란, 도입된 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입되고, 따라서 세포가 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "안정한 형질전환" 또는 "안정하게 형질전환된"은 핵산 분자가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 의미한다. 따라서, 통합된 핵산 분자는 그의 자손에 의해, 보다 특히, 다수의 연속적 세대의 자손에 의해 유전될 수 있다. 본원에 사용된 "게놈"은 핵 및 색소체 게놈을 포함하고, 따라서 예를 들어, 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈 내로의 핵산의 통합을 포함한다. 본원에 사용된 안정한 형질전환은 또한 염색체외적으로, 예를 들어, 미니염색체 또는 플라스미드로서 유지되는 트랜스진을 지칭할 수 있다.
일시적 형질전환은 예를 들어, 유기체 내로 도입된 1개 이상의 트랜스진에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 유기체 (예를 들어, 식물) 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 숙주 유기체 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 RNA의 노던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 또한 예를 들어, 표준 방법에 따라 검출될 수 있는 트랜스진의 표적 서열(들)과 혼성화하여, 트랜스진 서열의 증폭을 발생시키는 특이적 프라이머 서열을 채용하는, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 증폭 반응에 의해 검출될 수 있다. 형질전환은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 직접적 시퀀싱 및/또는 혼성화 프로토콜에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 발현 카세트는 일시적으로 발현될 수 있고/거나, 이들은 숙주 유기체의 게놈 내로 안정하게 혼입될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 예를 들어, 서열 특이적 DNA 결합 폴리펩티드 또는 도메인, DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 폴리펩티드 또는 도메인 등을 코딩하는 1종 이상의 발현 카세트)은 가이드 핵산과 함께 및 따라서 세포에서 유지된 DNA 없이 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포의 형질전환은 핵 형질전환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포의 형질전환은 색소체 형질전환 (예를 들어, 엽록체 형질전환)을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 구축물은 통상적인 육종 기술을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
진핵생물 및 원핵생물 유기체 둘 다를 형질전환시키는 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적이며, 문헌 전반에 걸쳐 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239]; [Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308 (2013)] 참조).
따라서 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수의 방식으로 숙주 유기체 또는 그의 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 이들이 유기체의 적어도 하나의 세포의 내부에의 접근을 얻는 한, 유기체 내로 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 1개 초과의 뉴클레오티드 서열이 도입되어야 하는 경우, 이들은 단일 핵산 구축물의 일부로서, 또는 별개의 핵산 구축물로서 어셈블리될 수 있고, 동일한 또는 상이한 핵산 구축물 상에 위치할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열은 단일 형질전환 사건에서, 및/또는 별개의 형질전환 사건에서 관심의 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는, 대안적으로, 관련되는 경우, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 육종 프로토콜의 일부로서 식물 내로 혼입될 수 있다.
상동 재조합을 통한 내인성 DSB 복구는 조작하기 곤란하고, 오류-유발 비-상동 단부 연결 경로로부터 경쟁에 직면한다. 본 발명에서, 주형화된 편집은 복구의 효율을 감소시키는 DSB의 개선된 우회 단계이다. 폴리펩티드 및 핵산 및 단백질-단백질 융합 및 비-공유 동원의 신규한 조합을 이용하여, 본 발명자들은 높은 충실도, 진행성 또는 분배성 DNA 폴리머라제 및 복구 주형을 표적 부위에 서열-특이적으로 전달하며, 이는 서열 특이적 DNA 결합 단백질과 조합으로 제공되는 DNA 엔도뉴클레아제 또는 니카제 활성을 포함하는 서열 특이적 DNA 결합 도메인에 의해 또는 엔도뉴클레아제 또는 니카제 활성을 갖는 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되거나 니킹된다. DNA 코딩된 복구 주형 및 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 갖는 표적 DNA를 프라이머로서 사용하여, DNA 의존성 DNA 폴리머라제는 DNA 합성을 즉시 개시하고, 목적하는 돌연변이 또는 대형 삽입 단편을 표적 부위 내로 카피할 수 있다. 본 발명은 단일 또는 소수의 염기의 특이적 변화, 한정된 게놈 서열의 결실, 또는 소형 또는 대형 단편의 삽입을 생성하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, HUH-태그, DNA 압타머, 박테리아 레트론의 msDNA 및/또는 T-DNA 동원을 포함하는 표적에의 복구 주형의 전달을 개선시키기 위한 다수의 DNA 동원 전략이 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 주형 이용가능성을 개선시키기 위한 한 구체적인 예는 HUH-태그의 유형인 PCV의 사용이다. PCV 도메인은 예를 들어, 표적 핵산에서 닉 또는 파단을 생성하는 니카제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 융합될 수 있다. PCV 인식 부위의 서열은 복구 주형에 포함되고, 따라서 복구 주형은 상응하는 PCV 도메인과 상호작용하는 그의 능력을 통해 표적 부위에 동원될 수 있다. 동원은 닉 또는 파단이 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 표적 핵산에서 생성되는 것과 대략 동시에 일어날 수 있다.
DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 상동 재조합을 수행하기 위한 중요한 성분이다. 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 포함하는 표적 핵산의 3' 단부는 DNA 코딩된 복구 주형에 어닐링할 수 있고, 가닥 합성을 개시하기 위한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 대한 프라이머로서 역할을 하고, 그에 의해 복구 주형으로부터 표적 부위로 유전 정보를 카피한다. 일부 실시양태에서, 이 프로세스에 사용하기 위한 DNA 폴리머라제는 오류를 방지하기 위해 높은 충실도를 가질 수 있고/거나, DNA 폴리머라제가 해리되기 전에 긴 주형이 카피되는 것을 보장하는 높은 진행성을 나타낼 수 있다. DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 표적 핵산에 결합하는 CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드/복합체의 회합의 맥락에서, 표적 내로의 주형 혼입의 효율을 최대화하는 분배 기능성을 갖는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 갖는 것은 유리할 수 있다. 이 단계를 가속화하기 위해, 높은 충실도 더하기 진행성 및 분배성 프로파일을 갖는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 예를 들어, 서열-특이적 DNA 결합 도메인 및 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질)와의 단백질 융합 또는 비-공유 상호작용에 의해 동원될 수 있다. 직접 융합은 최적화된 링커 아키텍쳐를 통해 수행될 수 있다. 비-공유 동원 전략은 가이드 핵산 (예를 들어, RNA 동원 모티프, 예를 들어, MS2 루프)을 통한 동원 또는 서열 특이적 DNA 결합 도메인 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질) 및/또는 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 펩티드 태그, 예를 들어, 항체/에피토프 상호작용, 예를 들어, 썬태그(SunTag)를 통한)을 통한 동원을 포함할 수 있다. 물론, 본 발명은 이들 구체적인 동원 기술에 의해 제한되지 않으며, 현재 공지되어 있거나 나중에 개발될 임의의 다른 공지된 또는 나중에 개발될 단백질-단백질 또는 핵산-단백질 동원 기술은 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 개선된 주형화된 편집을 제공하는 조성물 및 방법을 개발하였다. 단백질-단백질 융합 및 비-공유 동원의 조합을 사용하여, 높은 충실도, 진행성 또는 분배성 DNA 폴리머라제는 표적 부위에 서열-특이적으로 전달되며, 이 부위는 예를 들어, CRISPR 엔도뉴클레아제 또는 니카제에 의해 절단되거나 니킹될 수 있다. DNA 의존성 DNA 폴리머라제는 DNA 합성을 즉시 개시하고, DNA 코딩된 복구 주형과 조합으로 프라이머로서 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 갖는 표적 DNA를 사용함으로써 목적하는 돌연변이 또는 대형 삽입 단편을 표적 부위 내로 카피할 수 있다. 본원에 기재된 본 발명 및 그의 변동은 단일 또는 소수의 염기의 특이적 변화, 한정된 게놈 서열의 결실, 또는 소형 또는 대형 단편의 삽입을 생성하는데 이용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 표적 핵산 상의 부위 (예를 들어, 제1 부위)에 결합할 수 있는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질); 및 (b) DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)를 포함하는 복합체 (예를 들어, 제1 복합체)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 DNA 코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 DNA 코딩된 복구 주형)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체는 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제1 DNA 엔도뉴클레아제)를 포함할 수 있고, 여기서 DNA 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있거나, 또는 표적 핵산 상의 부위 (예를 들어, 제1 부위)에 결합할 수 있는 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 또한 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 표적 핵산 상의 부위 (예를 들어, 제1 부위)에 결합할 수 있고, 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질); (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; 및 (c) DNA 코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 DNA 코딩된 복구 주형)을 포함하는 복합체 (예를 들어, 제1 복합체)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 표적 핵산 상의 부위 (예를 들어, 제1 부위)에 결합할 수 있는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질); (b) DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제); (c) DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제1 DNA 엔도뉴클레아제); 및 (d) DNA 코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 DNA 코딩된 복구 주형)을 포함하는 복합체 (예를 들어, 제1 복합체)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 복합체 (예를 들어, 제1 복합체)의 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트(Argonaute) 단백질로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 CRISPR-Cas 폴리펩티드, 아연 핑거, 전사 활성화제-유사 이펙터 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 복합체 (예를 들어, 제1 복합체)에 유용한 DNA 엔도뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 활성은 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Fok1), 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)이거나 그로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 또는 니카제일 수 있거나, 또는 DNA 엔도뉴클레아제 활성은 뉴클레아제 활성 또는 니카제 활성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 임의로 링커를 통해 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 그의 N-말단에서 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 그의 C-말단에서 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합될 수 있다.
본 발명은 펩티드 태그 또는 RNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 조작된 (변형된) DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 서열 비-특이적 DNA 결합 도메인에 융합된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있고, 임의로 여기서 서열 비-특이적 DNA 결합 도메인은 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터의 Sso7d로부터의 서열-비특이적 dsDNA 결합 단백질일 수 있다. 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 본원에 기재된 바와 같이 조작되지 않은 동일한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 비교하여 증가된 진행성, 증가된 충실도, 증가된 친화도, 증가된 서열 특이성, 감소된 서열 특이성 및/또는 증가된 협동성을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 5'→3'-폴리머라제 활성, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성, 및/또는 5'→3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 중 적어도 하나를 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 5'→3'-폴리머라제 활성, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성, 및/또는 5'→3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 중 적어도 하나의 활성을 포함하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질)은 펩티드 태그에 융합될 수 있고, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 여기서 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 펩티드 태그에 융합된 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 (및 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합될 수 있는 표적 핵산에) 동원될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질)은 펩티드 태그에 융합될 수 있고, 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질)은 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 친화성 폴리펩티드에 융합된 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 및 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합되는 표적 핵산에 동원한다.
본 발명의 복합체는 가이드 핵산 (예를 들어, CRISPR 핵산, crRNA, crDNA)을 추가로 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 활성 또는 니카제 활성을 포함할 수 있는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질의 엔도뉴클레아제 또는 니카제 활성은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 RNA-동원 모티프에 연결될 수 있고, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프는 CRISPR 핵산 (예를 들어, 동원 crRNA, 동원 crDNA)의 5' 단부에 또는 3' 단부에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 코딩된 복구 주형은 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산에 대한 상보성을 갖는 스페이서를 포함하는 가이드 핵산에 연결시킴으로써 표적 핵산에 동원될 수 있다.
본 발명은 (a) 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질); 및 (b) DNA-코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 또는 제2 DNA-코딩된 복구 주형)을 포함하는 추가의 복합체 (예를 들어, 제2 복합체)를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체 (예를 들어, 제2 복합체)는 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제2 DNA 엔도뉴클레아제)를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 DNA 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 표적 핵산 내로 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 복합체의 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 표적 핵산에 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 활성을 추가로 포함하는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질)은 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)일 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA-코딩된 복구 주형은 DNA 동원 모티프에 연결될 수 있고, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 DNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 임의로 여기서 DNA 동원 모티프/친화성 폴리펩티드는 HUH-태그, DNA 압타머, 박테리아 레트론의 msDNA 또는 항체/에피토프 쌍 (예를 들어, T-DNA 동원)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 돼지 서코바이러스 2 (PCV) Rep 단백질에 융합될 수 있고, DNA 주형은 PCV 인식 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 그의 N-말단에서 PCV Rep 단백질에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 그의 C-말단에서 PCV Rep 단백질에 융합될 수 있다. 본 발명에 유용할 수 있는 HUH-태그 및 그들의 상응하는 인식 서열의 비-제한적 예는 표 1에 제공된다.
표 1. HUH-태그 및 인식 서열
일부 실시양태에서, DNA 코딩된 복구 주형은 DNA 코딩된 복구 주형을 아그로박테리움 이펙터 단백질 (예를 들어, 아그로박테리움 병독성 폴리펩티드, 임의로, virD2 및/또는 virE2)과 상호작용하는 T-DNA 서열 내로 통합함으로써 표적 핵산에 동원될 수 있고, 여기서 서열 특이적 DNA 결합 단백질은 예를 들어, 아그로박테리움 이펙터 단백질에 동원될 수 있고, 그에 의해 DNA 코딩된 복구 주형을 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 서열 특이적 DNA 결합 단백질이 결합하는 표적 핵산에 동원한다. 예로서, 1개 이상의 에피토프 태그는 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 융합될 수 있고, 에피토프 태그(들)를 인식하는 항체는 아그로박테리움 이펙터 단백질에 융합될 수 있고, 그에 의해 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및 아그로박테리움 이펙터 단백질이 식물 세포에서 상호작용하는 것을 가능하게 한다. 아그로박테리움 이펙터 단백질과 회합된 임의의 T-DNA 서열은 서열 특이적 DNA 결합 단백질의 작용에 의해 표적 핵산에 동원될 것이다.
일부 실시양태에서, DNA 코딩된 복구 주형은 DNA 코딩된 복구 주형에의 DNA 압타머의 부착에 의해 표적 핵산에 동원될 수 있다. DNA 압타머는 그의 고유한 2차 구조로 인해 높은 친화도로 특이적 표적에 결합할 수 있는 DNA의 서열이다. DNA 압타머 가이드된 유전자 표적화는 인간 및 효모 시스템에서 엔도뉴클레아제 I-SceI 매개 유전자 표적화에 대해 입증되었다. 후보 DNA 압타머의 풀은 모세관 전기영동에 의해 특이적 CRIPSR 단백질 (Cas9, Cpf1 등)과의 친화도에 대해 스크리닝될 수 있다. 선택된 CRISPR 뉴클레아제 단백질에 대한 가장 높은 친화도를 갖는 DNA 압타머는 단일 가닥 DNA 주형에 부착되어 DNA 주형을 CRISPR 단백질 표적 유전자좌에 가이드할 것이다.
일부 실시양태에서, 복구 주형은 가이드 RNA에 부착된 박테리아 레트론 스캐폴드로부터의 msDNA로서 발현될 수 있다. 박테리아 레트론은 전사된 레트론 게놈의 특이적 부분을 인식하고, 이를 주형으로서 사용하여 단일 가닥 DNA의 다중 카피 (msDNA)를 생성하는 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 박테리아 요소이다. msDNA는 RNA 주형에 결박되어 잔류한다. 레트론 RNA 스캐폴드 서열은 레트론 게놈의 일부가 유전자 편집을 위한 목적하는 복구 주형으로 대체된 연장으로서 CRISPR 가이드 RNA 스캐폴드에 첨가될 수 있다. 가이드 RNA 스캐폴드 연장에 결박된 msDNA로서의 주형의 발현은 파단이 생성된 것과 동시에 파단 부위에의 복구 주형의 다중 카피의 전달을 가능하게 한다. 이 시스템은 효모에서 입증되었지만, 포유동물 또는 식물 시스템에서는 그렇지 않다. 본 발명에 유용한 예시적인 박테리아 레트론은 표 2에 제공된다.
표 2. 박테리아 레트론의 예
인간 게놈 표적 FANCF01에 주형화된 편집을 도입하도록 디자인된 키메라 가이드 핵산 서열 (가이드 DNA)의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
ec67 레트론 스캐폴드에 포매된 복구 주형 (볼드체), 이어서 단일 가이드 핵산 (sg 핵산) (이탤릭체 소문자):
ec86 레트론 스캐폴드에 포매된 복구 주형 (볼드체), 이어서 단일 가이드 핵산 (sg 핵산) (이탤릭체 소문자):
ec107 레트론 스캐폴드에 포매된 복구 주형 (볼드체), 이어서 단일 가이드 핵산 (sg 핵산) (이탤릭체 소문자):
mx162 레트론 스캐폴드에 포매된 복구 주형 (볼드체), 이어서 단일 가이드 핵산 (sg 핵산) (이탤릭체 소문자):
일부 실시양태에서, 복합체 (예를 들어, 제2 복합체)는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합체 (예를 들어, 제2 복합체)는 가이드 핵산을 추가로 포함할 수 있고, 임의로 여기서 가이드 핵산은 DNA-코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 또는 제2 DNA-코딩된 복구 주형)에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 부위 및 제2 부위와는 상이한 가닥 상에 있는 표적 핵산 상의 부위 (예를 들어, 제3 부위)에 결합할 수 있는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질) 및 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제3 DNA 엔도뉴클레아제) (예를 들어, 단일 가닥 파단을 생성할 수 있는 니카제)를 포함하는 제3 복합체가 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산을 제3 복합체와 접촉시키는 것은 미스매치 복구를 개선시킴으로써 복구의 효율을 신장시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) CRISPR-Cas 이펙터 단백과의 상호작용을 매개하는 핵산 서열; (b) DNA-RNA 상호작용을 통해 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 특이적 핵산 표적 부위에 지시하는 핵산 서열, 및 (c) 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있는 스템 루프 구조 (예를 들어, RNA 동원 모티프)를 형성하는 핵산 서열을 포함하는 RNA 분자를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 (a) CRISPR-Cas 이펙터 단백질과의 상호작용을 매개하는 핵산 서열; (b) DNA-RNA 상호작용을 통해 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 특이적 핵산 표적 부위에 지시하는 핵산 서열, 및 (c) 스템 루프 구조를 형성하는 핵산 서열을 포함하는 RNA 분자와 복합체화된 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 복합체 (예를 들어, 제1 복합체, 제2 복합체, 및/또는 제3 복합체)를 코딩하는 및/또는 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 및/또는 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질), DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제), DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제1 DNA 엔도뉴클레아제, 제2 DNA 엔도뉴클레아제, 및/또는 제3 DNA 엔도뉴클레아제) 중 1종 이상을 코딩하는 또는 DNA 코딩된 복구 주형 중 1종 이상 (예를 들어, 제1 DNA 코딩된 복구 주형 및/또는 제2 DNA 코딩된 복구 주형) 또는 1종 이상의 가이드 핵산 (예를 들어, 제1 가이드 핵산, 제2 가이드 핵산, 및/또는 제3 가이드 핵산 등)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 추가로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 1종 이상의 발현 카세트 및/또는 벡터가 본원에서 제공된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 서열 특이적 DNA 결합 도메인, 서열 비-특이적 DNA 결합 단백질, DNA 엔도뉴클레아제, DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 세포 또는 유기체 (예를 들어, 예를 들어, 동물 (예를 들어, 포유동물, 곤충, 어류 등), 식물 (예를 들어, 쌍자엽 식물, 단자엽 식물), 박테리아, 고세균 등의 유기체 및/또는 세포)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는/본 발명의 복합체/폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트는 쌍자엽 식물에서의 발현을 위해 또는 단자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
본 발명은 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 발명의 조성물을 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 표적 핵산 또는 표적 핵산을 포함하는 세포를 본 발명의 복합체 또는 시스템, 이를 코딩하는/포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 복합체 또는 시스템, 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터의 성분 중 1종 이상과 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다. 방법은 생체내 시스템에서 (예를 들어, 세포에서 또는 유기체에서) 또는 시험관내 시스템 (예를 들어, 무세포)에서 수행될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 복합체, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드/발현 카세트/벡터는 본 발명의 1종 이상의 발현 카세트를 식물 또는 식물 세포 내로 도입하고, 그에 의해 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 세포를 생산하는 것을 포함하는, 예를 들어, 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 세포를 재생시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 본 발명의 복합체 (예를 들어, 제1 복합체)와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 핵산을 본 발명의 제2 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 본 발명의 제3 복합체와 추가로 접촉될 수 있고, 그에 의해 표적 핵산의 변형의 복구 효율을 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; (c) 제1 DNA 엔도뉴클레아제; 및 (d) 제1 DNA 코딩된 복구 주형과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, 제1 DNA 엔도뉴클레아제, 및 제1 DNA 코딩된 복구 주형은 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 복합체는 표적 핵산과 상호작용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (여기서 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 니카제 활성 또는 엔도뉴클레아제 활성을 포함함); (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; 및 (c) 제1 DNA 코딩된 복구 주형과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, 및 제1 DNA 코딩된 복구 주형은 표적 핵산과 상호작용할 수 있는 복합체를 형성할 수 있다. 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질의 엔도뉴클레아제 활성 및/또는 니카제 활성은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)일 수 있다. 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 임의로 링커를 통해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 그의 N-말단에서 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 그의 C-말단에서 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 펩티드 태그에 융합될 수 있고, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 펩티드 태그에 융합된 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 및 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합된 및/또는 결합할 수 있는 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 펩티드 태그에 융합될 수 있고, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 친화성 폴리펩티드에 융합된 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 및 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합된 및/또는 결합할 수 있는 표적 핵산에 동원한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 도메인 및/또는 제1 DNA 엔도뉴클레아제는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질일 수 있거나 그로부터의 것일 수 있고, 여기서 표적 핵산은 DNA-RNA 상호작용을 통해 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 특이적 핵산 표적 부위에 지시하는 가이드 핵산 (예를 들어, CRISPR 핵산, crRNA, crDNA) (예를 들어, 제1 가이드 핵산)과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 DNA 코딩된 복구 주형)은 가이드 핵산에 연결될 수 있고, 그에 의해 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산에 가이드한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 RNA-동원 모티프에 연결될 수 있고, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 표적 핵산에 동원한다. RNA 동원 모티프는 가이드 핵산 (예를 들어, 동원 crRNA, 동원 crDNA)의 5' 단부에 또는 3' 단부에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제1 복합체와 접촉된 표적 핵산은 (a) 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질; 및 (b) DNA-코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 DNA-코딩된 복구 주형 또는 제2 DNA-코딩된 복구 주형)을 포함하는 본 발명의 제2 복합체와 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기서 표적 핵산은 제2 DNA 엔도뉴클레아제와 추가로 접촉되거나, 또는 제2 복합체는 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하고, 여기서 제2 DNA 엔도뉴클레아제는 표적 핵산 내로 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제2 복합체의 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 표적 핵산 내로 도입할 수 있는 그 자체의 엔도뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제2 DNA-코딩된 복구 주형, 및 임의로 DNA 엔도뉴클레아제는 표적 핵산 상의 제2 부위와 상호작용할 수 있는 복합체를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 펩티드 태그에 융합될 수 있고, 제2 DNA 엔도뉴클레아제는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 펩티드 태그에 융합된 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 및 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합하고/거나 결합할 수 있는 표적 핵산 상의 제2 부위에 동원한다. 일부 실시양태에서, 제2 DNA 엔도뉴클레아제는 펩티드 태그에 융합될 수 있고, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 친화성 폴리펩티드에 융합된 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 및 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합하고/거나 결합할 수 있는 표적 핵산 상의 제2 부위에 동원한다.
일부 실시양태에서, 제2 복합체의 DNA-코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제1 DNA-코딩된 복구 주형 또는 제2 DNA-코딩된 복구 주형)은 DNA 동원 모티프에 연결될 수 있고, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 DNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 임의로 여기서 DNA 동원 모티프/친화성 폴리펩티드는 HUH-태그 (예를 들어, 표 1 참조), DNA 압타머, 박테리아 레트론의 msDNA 또는 T-DNA 동원을 포함하고, 그에 의해 제2 DNA-코딩된 복구 주형을 서열-특이적 DNA 결합 단백질 및 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 예를 들어, 돼지 서코바이러스 2 (PCV) Rep 단백질에 융합될 수 있고, DNA 코딩된 복구 주형은 PCV 인식 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것일 수 있고/거나 그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 DNA 결합 도메인 및/또는 제2 DNA 엔도뉴클레아제는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질로부터의 것일 수 있고/거나 그일 수 있고, 여기서 표적 핵산은 DNA-RNA 상호작용을 통해 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 특이적 핵산 표적 부위에 지시하는 가이드 핵산 (예를 들어, CRISPR 핵산, crRNA, crDNA) (예를 들어, 제2 가이드 핵산)과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 코딩된 복구 주형 (예를 들어, 제2 DNA 코딩된 복구 주형)은 가이드 핵산에 연결될 수 있고, 그에 의해 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산에 가이드한다. 일부 실시양태에서, 제2 가이드 핵산은 RNA-동원 모티프에 연결될 수 있고, 제2 DNA 엔도뉴클레아제는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합될 수 있고, 그에 의해 가이드 핵산은 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 표적 핵산에 가이드한다. RNA 동원 모티프는 가이드 핵산 (예를 들어, 동원 crRNA, 동원 crDNA)의 5' 단부에 또는 3' 단부에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 복합체와 접촉된 표적 핵산은 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)와 추가로 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 제2 복합체에 포함될 수 있다.
본 발명의 방법은 표적 핵산을 제1 부위 및 제2 부위와는 상이한 가닥 상에 있는 표적 핵산 상의 제3 부위에 결합할 수 있는 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하는 제3 복합체와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 또는 니카제 활성을 포함하고, 그에 의해 표적 핵산의 변형의 복구 효율을 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) DNA 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합하고; (b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, (c) (i) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 표적 핵산 상의 제1 부위에 대해 실질적 상보성을 갖는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산 상의 제1 부위에 가이드하거나, 또는 (c) (ii) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있고, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인, 본 발명의 제1 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, (a) 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합하고, (b) 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 가이드 핵산과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고; (c) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 가이드 핵산과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고; (d) (i) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 표적 핵산 상의 제1 부위에 대해 실질적 상보성을 갖는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산 상의 제1 부위에 가이드하거나, 또는 (d) (ii) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있고, 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인, 본 발명의 제1 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템이 제공된다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 변형시키기 위한 본 발명의 시스템은 본 발명의 제2 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제2 서열-특이적 DNA 결합 도메인은 표적 핵산 상의 제1 부위에 근위인 제2 부위에 결합하고, 제2 DNA-코딩된 복구 주형은 (공유 또는 비-공유 상호작용을 통해) 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시킨다.
본 발명에 유용한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)는 임의의 DNA 의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 그의 비-제한적 예는 폴베이스(Polbase) 웹사이트 (polbase.neb.com)에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 5'-3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및 5'-3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 중 하나 이상을 제거하도록 변형되거나 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개선된 전달 및/또는 활성을 갖는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)가 제공되고, 여기서 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 클레나우(Klenow) 단편 또는 그의 하위-단편을 포함한다. 예로서, 약 68 kDa의 크기 또는 전장 (109 kDa) DNA 폴리머라제 I의 62% 분자량인 이. 콜라이(E. coli) 클레나우 단편이 사용될 수 있다.
DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 DNA 결합 도메인에의 융합을 통해 온도-민감성, 진행성, 및 주형 친화도에 대해 개선될 수 있다. 따라서, 예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 및/또는 the 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)는 서열 비-특이적 DNA 결합 단백질에 융합되어 개선된 온도-민감성, 진행성, 및/또는 주형 친화도를 갖는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 비-특이적 DNA 결합 단백질은 술폴로부스 솔파타리쿠스로부터의 Sso7d를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 서열-비특이적 dsDNA 결합 단백질일 수 있다.
DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)는 인간, 효모, 박테리아, 또는 식물로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 ε (예를 들어, 인간 및 효모), DNA 폴리머라제 δ, 이. 콜라이 폴리머라제 I, 퓨전(Phusion)® DNA 폴리머라제, 벤트(Vent)® DNA 폴리머라제, 벤트 (엑소-)® DNA 폴리머라제, 딥 벤트(Deep Vent)® DNA 폴리머라제, 딥 벤트 (엑소-)® DNA 폴리머라제, 9°Nm™ DNA 폴리머라제, Q5® DNA 폴리머라제, Q5U® DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, 및/또는 파이어(Phire)™ DNA 폴리머라제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 인간 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε, 식물 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε 및/또는 효모 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε일 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호:48 내지 58 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 높은 충실도 및/또는 높은 진행성을 나타낼 수 있다. 진행성은 주형에의 폴리머라제의 단일 결합 사건에서 혼입되는 뉴클레오티드의 수와 관련된다. 일부 경우에, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 100kb 초과 (예를 들어, 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 kb 또는 그 초과, 및 그 안의 임의의 범위 또는 값)의 진행성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 높은 분배성 프로파일을 나타낼 수 있다. 따라서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 고-충실도 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 높은 진행성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 분배성 폴리머라제 (예를 들어, 낮은 진행성 폴리머라제)일 수 있거나, 높은 분배성 프로파일을 갖는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다.
본 발명에 유용한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제)는 본 발명의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질)은 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 엔도뉴클레아제 또는 니카제 활성을 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)일 수 있다.
DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제1 DNA 엔도뉴클레아제, 제2 DNA 엔도뉴클레아제, 및/또는 제3 DNA 엔도뉴클레아제)는 (각각 핵산에서 이중 가닥 파단 또는 단일 가닥을 생성할 수 있는) 뉴클레아제 및/또는 니카제일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제1 DNA 엔도뉴클레아제, 제2 DNA 엔도뉴클레아제, 및/또는 제3 DNA 엔도뉴클레아제)는 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Fok1, 또는 다른 유사한 엔도뉴클레아제 도메인), 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열-특이적 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질) 및/또는 DNA 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 제1 DNA 엔도뉴클레아제, 제2 DNA 엔도뉴클레아제 및/또는 제3 DNA 엔도뉴클레아제)는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질일 수 있고, 임의로 여기서 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 I CRISPR-Cas 시스템, 유형 II CRISPR-Cas 시스템, 유형 III CRISPR-Cas 시스템, 유형 IV CRISPR-Cas 시스템, 유형 V CRISPR-Cas 시스템, 또는 유형 VI CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II CRISPR-Cas 시스템 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 예를 들어, Cas9 이펙터 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 예를 들어, Cas12 이펙터 단백질일 수 있다.
CRISPR-Cas 이펙터 단백질의 비제한적 예는 Cas9, C2c1, C2c3, Cas12a (또한 Cpf1로 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csnl 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 (dinG), 및/또는 Csf5 뉴클레아제를 포함할 수 있고, 임의로 여기서 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 이펙터 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 그의 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, RuvC, HNH, 예를 들어, Cas12a 뉴클레아제 도메인의 RuvC 부위; 예를 들어, Cas9 뉴클레아제 도메인의 RuvC 부위 및/또는 HNH 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 돌연변이를 갖지 않는 동일한 CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 비교하여 손상된 활성 또는 감소된 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 활성 부위에서의 돌연변이는 니카제 활성을 갖는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas9n)을 발생시킨다.
본 발명에 유용한 CRISPR Cas9 이펙터 단백질 또는 CRISPR Cas9 이펙터 도메인은 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 Cas9 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR Cas9 폴리펩티드는 예를 들어, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종 (예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 써모필루스(S. thermophilus)), 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종, 칸들레리아(Kandleria) 종, 류코노스톡(Leuconostoc) 종, 오에노코쿠스(Oenococcus) 종, 페디오코쿠스(Pediococcus) 종, 웨이셀라(Weissella) 종, 및/또는 올세넬라(Olsenella) 종으로부터의 Cas9 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호:59 내지 62 참조).
Cas12a는 유형 V 군집화된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)-Cas 뉴클레아제이다. Cas12a는 보다 널리 공지된 유형 II CRISPR Cas9 뉴클레아제와는 몇몇 측면에서 상이하다. 예를 들어, Cas9는 그의 가이드 RNA (gRNA, sgRNA) 결합 부위 (프로토스페이서, 표적 핵산, 표적 DNA)에 3'인 G-풍부 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) (3'-NGG)를 인식하는 반면, Cas12a는 표적 핵산에 대해 5'에 위치한 T-풍부 PAM (5'-TTN, 5'-TTTN을 인식한다. 사실, Cas9 및 Cas12a가 그들의 가이드 RNA에 결합하는 배향은 그들의 N 및 C 말단에 관하여 아주 거의 반대이다. 더욱이, Cas12a 효소는 천연 Cas9 시스템에서 발견되는 이중 가이드 RNA (sgRNA (예를 들어, crRNA 및 tracrRNA))라기 보다는 단일 가이드 RNA (gRNA, CRISPR 어레이, crRNA)를 사용하고, Cas12a는 그 자신의 gRNA를 프로세싱한다. 추가로, Cas12a 뉴클레아제 활성은 Cas9 뉴클레아제 활성에 의해 생성된 블런트 단부 대신 엇갈린 DNA 이중 가닥 파단을 생성하고, Cas12a는 둘 다의 DNA 가닥을 절단하기 위해 단일 RuvC 도메인에 의존하는 반면, Cas9는 절단을 위해 HNH 도메인 및 RuvC 도메인을 이용한다.
본 발명에 유용한 CRISPR Cas12a 이펙터 단백질/도메인은 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 Cas12a 폴리펩티드 (이전에 Cpf1로 공지됨)일 수 있다 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a) 서열의 그의 개시내용에 대해 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,790,490 참조). 용어 "Cas12a", "Cas12a 폴리펩티드" 또는 "Cas12a 도메인"은 Cas12a의 가이드 핵산 결합 도메인 및/또는 Cas12a의 활성, 불활성, 또는 부분적으로 활성 DNA 절단 도메인을 포함하는 Cas12a 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 Cas12a는 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, Cas12a 도메인의 RuvC 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖고, 따라서, 더 이상 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 Cas12a 도메인 또는 Cas12a 폴리펩티드는 통상적으로 죽은Cas12a (예를 들어, dCas12a)로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖는 Cas12a 도메인 또는 Cas12a 폴리펩티드는 손상된 활성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 선택된 위치 (예를 들어, 표적 핵산, 표적 핵산 상의 부위)에 동원하기 위한 본 발명에 유용한 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프, 펩티드 반복 단위)는 펩티드 태그의 1 또는 2개 또는 그 초과의 카피 (에피토프, 다량체화된 에피토프) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 카피 (반복 단위)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 펩티드 태그는 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그) (예를 들어, 서열식별번호:23 내지 24 참조), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 GCN4 펩티드 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 펩티드 태그의 2개 이상의 카피 (펩티드 반복부; 예를 들어, 2개 이상의 탠덤 카피; 예를 들어, GCN4의 탠덤 카피)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드는 펩티드 태그 (예를 들어, GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 서열식별번호:25 참조), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프)에 결합할 수 있는 항체, 임의로 scFv 항체, 아피바디, 안티칼린, 모노바디, 및/또는 DARPin을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 이의 각각은 펩티드 태그 (예를 들어, GCN4 펩티드 태그, c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프)에 결합할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 가이드 핵산 (CRISPR 핵산, crRNA, crDNA)은 1개 또는 2개 이상의 RNA 동원 모티프 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 모티프; 예를 들어, 적어도 10 내지 약 25개의 모티프)에 연결될 수 있고, 임의로 여기서 2개 이상의 RNA 동원 모티프는 동일한 RNA 동원 모티프 또는 상이한 RNA 동원 모티프일 수 있고, 그에 의해 1개 이상의 RNA 동원 모티프에 연결된 가이드 핵산은 가이드에 연결된 RNA 동원 모티프와 상호작용할/그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 1종 이상의 폴리펩티드를 동원하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프 및 RNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, 상응하는 친화성 폴리펩티드)는 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 Ku (예를 들어, Ku 이종이량체), 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 Sm7, MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 PP7 코트 단백질 (PCP), SfMu 파지 Com 스템-루프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 Com RNA 결합 단백질 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 친화성 폴리펩티드로서 압타머 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 서열식별번호:26 내지 36 참조). 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 RNA 동원 모티프 및 그의 상응하는 친화성 폴리펩티드는 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), 및/또는 PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오(Pumilio)/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 서로에 연결된 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합은 링커를 통해서이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 펩티드 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 약 2 내지 약 100개의 아미노산 (잔기)의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 GS 링커일 수 있다.
본원에 사용된 "가이드 핵산", "가이드 RNA", "gRNA", "CRISPR RNA/DNA", "crRNA" 또는 "crDNA"는 표적 DNA에 상보적인 (및 그에 혼성화하는) 적어도 1개의 스페이서 서열 (예를 들어, 프로토스페이서), 및 적어도 1개의 반복 서열 (예를 들어, 유형 V Cas12a CRISPR-Cas 시스템의 반복부, 또는 그의 단편 또는 부분; 유형 II Cas9 CRISPR-Cas 시스템의 반복부, 또는 그의 단편; 유형 V C2c1 CRISPR Cas 시스템의 반복부, 또는 그의 단편; 예를 들어, C2c3, Cas12a (또한 Cpf1로 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csnl 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 (dinG), 및/또는 Csf5의 CRISPR-Cas 시스템의 반복부, 또는 그의 단편)을 포함하는 핵산을 의미하고, 여기서 반복 서열은 스페이서 서열의 5' 단부 및/또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 본 발명의 gRNA의 디자인은 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR-Cas 시스템에 기반할 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas12a gRNA는 5'에서 3'로, 반복 서열 (전장 또는 그의 부분 ("핸들"); 예를 들어, 슈도노트-유사 구조) 및 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 1개 초과의 반복 서열-스페이서 서열 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 반복부-스페이서 서열) (예를 들어, 반복부-스페이서-반복부, 예를 들어, 반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서 등)을 포함할 수 있다. 본 발명의 가이드 핵산은 합성, 인간-제조이고, 자연에서 발견되지 않는다. gRNA는 꽤 길 수 있고, 압타머 (MS2 동원 전략에서와 같이) 또는 스페이서를 늘어뜨린 다른 RNA 구조로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 가이드 RNA는 편집을 위한 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 편집 주형 (리버스 트랜스크립타제 주형)에 상보적인 그의 5' 단부 또는 3' 단부 상의 영역 또는 서열을 포함할 수 있고, 그에 의해 편집 주형을 표적 핵산에 동원한다.
본원에 사용된 "반복 서열"은 예를 들어, 야생형 CRISPR Cas 유전자좌 (예를 들어, Cas9 유전자좌, Cas12a 유전자좌, C2c1 유전자좌 등)의 임의의 반복 서열 또는 염기 편집제를 코딩하는 본 발명의 핵산 구축물에 의해 코딩되는 CRISPR-Cas 뉴클레아제와 함께 기능적인 합성 crRNA의 반복 서열을 지칭한다. 본 발명에 유용한 반복 서열은 CRISPR-Cas 유전자좌 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 유형 V 또는 유형 VI)의 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 반복 서열일 수 있거나, 또는 이는 유형 I, II, III, IV, V 또는 VI CRISPR-Cas 시스템에서 기능하도록 디자인된 합성 반복부일 수 있다. 반복 서열은 헤어핀 구조 및/또는 스템 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복 서열은 그의 5' 단부에서 슈도노트-유사 구조 (즉, "핸들")를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반복 서열은 야생형 유형 I CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 II CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 III CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 IV CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 V CRISPR-Cas 유전자좌 및/또는 유형 VI CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 야생형 CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열은 확립된 알고리즘을 통해, 예컨대 CRISPRdb를 통해 제공되는 CRISPR파인더를 사용하여 결정될 수 있다 (문헌 [Grissa et al. Nucleic Acids Res. 35(Web Server issue):W52-7] 참조). 일부 실시양태에서, 반복 서열 또는 그의 부분은 그의 3' 단부에서 스페이서 서열의 5' 단부에 연결되고, 그에 의해 반복부-스페이서 서열 (예를 들어, 가이드 RNA, crRNA)을 형성한다.
일부 실시양태에서, 반복 서열은 특정 반복부 및 반복부를 포함하는 가이드 RNA가 프로세싱되는지 비프로세싱되는지 여부에 따라 적어도 10개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 내지 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 값 또는 범위; 예를 들어, 약)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 반복 서열은 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 15 내지 약 50, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 50, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 80, 약 50 내지 약 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
스페이서 서열의 5' 단부에 연결된 반복 서열은 반복 서열의 부분 (예를 들어, 야생형 반복 서열의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 또는 그 초과의 인접한 뉴클레오티드)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 5' 단부에 연결된 반복 서열의 부분은 약 5 내지 약 10개의 연속적 뉴클레오티드의 길이 (예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드)일 수 있고, 야생형 CRISPR Cas 반복 뉴클레오티드 서열의 동일한 영역 (예를 들어, 5' 단부)과 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 반복 서열의 부분은 그의 5' 단부에 슈도노트-유사 구조 (예를 들어, "핸들")를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "스페이서 서열"은 표적 핵산 (예를 들어, 표적 DNA) (예를 들어, 프로토스페이서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있다 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과)). 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산과 비교하여 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 미스매치를 가질 수 있으며, 미스매치는 인접하거나 비인접할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산에 대해 70% 상보성을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 대해 80% 상보성을 가질 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 (프로토스페이서)에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 상보성 등을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산에 100% 상보적이다. 스페이서 서열은 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)의 길이를 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 적어도 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드의 길이인 표적 핵산 (예를 들어, 프로토스페이서)의 영역에 걸쳐 완전한 상보성 또는 실질적 상보성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 약 20개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 약 23개의 뉴클레오티드의 길이이다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 스페이서 서열의 5' 영역은 표적 DNA와 동일할 수 있는 반면, 스페이서의 3' 영역은 표적 DNA에 실질적으로 상보적일 수 있거나 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas), 또는 가이드 RNA의 스페이서 서열의 3' 영역은 표적 DNA와 동일할 수 있는 반면, 스페이서의 5' 영역은 표적 DNA에 실질적으로 상보적일 수 있고 (예를 들어, 유형 II CRISPR-Cas), 따라서, 표적 DNA에 대한 스페이서 서열의 전체 상보성은 100% 미만일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 대한 가이드에서, 예를 들어, 20 뉴클레오티드 스페이서 서열의 5' 영역 (즉, 시드 영역)에서 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 3' 영역에서 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 5' 단부의 처음 1 내지 8개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 뉴클레오티드, 및 그 안의 임의의 범위)는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 3' 영역에서 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50% 상보적 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과))이다.
추가의 예로서, 유형 II CRISPR-Cas 시스템에 대한 가이드에서, 예를 들어, 20 뉴클레오티드 스페이서 서열의 3' 영역 (즉, 시드 영역)에서 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 5' 영역에서 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 3' 단부의 처음 1 내지 10개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드, 및 그 안의 임의의 범위)는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 5' 영역에서 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50% 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값))이다.
일부 실시양태에서, 스페이서의 시드 영역은 약 8 내지 약 10개의 뉴클레오티드의 길이, 약 5 내지 약 6개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 6개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
본원에 사용된 "표적 핵산", "표적 DNA", "표적 뉴클레오티드 서열", "표적 영역", 또는 "게놈에서의 표적 영역"은 본 발명의 가이드 RNA에서의 스페이서 서열과 완전히 상보적 (100% 상보적)이거나 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 70% 상보적 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과))인 유기체의 게놈의 영역을 지칭한다. CRISPR-Cas 시스템에 유용한 표적 영역은 유기체의 게놈 (예를 들어, 식물 게놈, 동물 게놈, 박테리아 게놈, 진균 게놈 등)에서 PAM 서열에 대해 바로 3' (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 시스템) 또는 바로 5' (예를 들어, 유형 II CRISPR-Cas 시스템)에 위치할 수 있다. 표적 영역은 PAM 서열에 바로 인접하여 위치한 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드 (예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개의 뉴클레오티드 등)의 임의의 영역으로부터 선택될 수 있다.
"프로토스페이서 서열"은 CRISPR 반복부-스페이서 서열 (예를 들어, 가이드 RNA, CRISPR 어레이, crRNA)의 스페이서 서열에 완전히 또는 실질적으로 상보적인 (및 혼성화하는) 표적 이중 가닥 DNA 및 구체적으로 표적 DNA의 부분 (예를 들어, 또는 게놈에서의 표적 영역)을 지칭한다.
유형 V CRISPR-Cas (예를 들어, Cas12a) 시스템 및 유형 II CRISPR-Cas (Cas9) 시스템의 경우에, 프로토스페이서 서열은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 의해 플랭킹된다 (예를 들어, 그에 바로 인접함). 유형 IV CRISPR-Cas 시스템에 대해, PAM은 비-표적 가닥 상의 5' 단부에 및 표적 가닥의 3' 단부에 위치한다 (예로서, 하기 참조).
유형 II CRISPR-Cas (예를 들어, Cas9) 시스템의 경우에, PAM은 표적 영역의 바로 3'에 위치한다. 유형 I CRISPR-Cas 시스템에 대한 PAM은 표적 가닥의 5'에 위치한다. 유형 III CRISPR-Cas 시스템에 대해 공지된 PAM은 없다. 마카로바(Makarova) 등은 CRISPR 시스템의 모든 부류, 유형 및 하위유형에 대한 명명법을 기재한다 (Nature Reviews Microbiology 13:722-736 (2015)). 가이드 구조 및 PAM은 문헌 [R. Barrangou (Genome Biol. 16:247 (2015))]에 의해 기재되어 있다.
정준 Cas12a PAM은 T 풍부성이다. 일부 실시양태에서, 정준 Cas12a PAM 서열은 5'-TTN, 5'-TTTN, 또는 5'-TTTV일 수 있다. 일부 실시양태에서, 정준 Cas9 (예를 들어, 에스. 피오게네스) PAM은 5'-NGG-3'일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-정준 PAM은 사용될 수 있지만, 덜 효율적일 수 있다.
추가의 PAM 서열은 확립된 실험 및 컴퓨터적 접근법을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 실험적 접근법은 모든 가능한 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 서열을 표적화하고, 예컨대 표적 플라스미드 DNA의 형질전환을 통해, 표적화를 겪지 않은 서열 구성원을 확인하는 것을 포함한다 (Esvelt et al. 2013. Nat. Methods 10:1116-1121; Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239). 일부 측면에서, 컴퓨터적 접근법은 천연 스페이서의 BLAST 검색을 수행하여 박테리오파지 또는 플라스미드에서 원래 표적 DNA 서열을 확인하고, 이들 서열을 정렬하여 표적 서열에 인접한 보존된 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다 (Briner and Barrangou. 2014. Appl. Environ. Microbiol. 80:994-1001; Mojica et al. 2009. Microbiology 155:733-740).
일부 실시양태에서, 식물에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터는 동일한 것을 코딩하지만 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되지 않은 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터와 약 70% 내지 100% 동일할 수 있다 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%).
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드, 가이드 핵산, 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
가이드 핵산과 조합으로 사용되는 경우, 본 발명의 핵산 구축물은 표적 핵산을 변형시키는데 사용될 수 있다. 표적 핵산은 표적 핵산을 가이드 핵산과 접촉시키기 전에, 그와 공동으로 또는 후에 본 발명의 핵산 구축물과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및 가이드 핵산은 동일한 발현 카세트 또는 벡터에 포함될 수 있고, 따라서, 표적 핵산은 본 발명의 핵산 구축물 및 가이드 핵산과 공동으로 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및 가이드 핵산은 상이한 발현 카세트 또는 벡터에 있을 수 있고, 따라서, 표적 핵산은 가이드 핵산과의 접촉 전에, 그와 공동으로, 또는 후에 본 발명의 핵산 구축물과 접촉될 수 있다.
임의의 유기체 또는 그의 세포의 표적 핵산은 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 폴리펩티드 및 복합체 (예를 들어, 서열 특이적 DNA 결합 단백질, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제), DNA 엔도뉴클레아제, DNA 코딩된 복구 주형, 가이드 핵산 등) 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터)을 사용하여 변형될 (예를 들어, 돌연변이될, 예를 들어, 염기 편집될, 절단될, 니킹될 등) 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 식물 또는 식물 부분의 표적 핵산은 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 폴리펩티드 및 복합체 (예를 들어, 서열 특이적 DNA 결합 단백질, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제), DNA 엔도뉴클레아제, DNA 코딩된 복구 주형, 가이드 핵산 등) 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터)을 사용하여 변형될 (예를 들어, 돌연변이될, 예를 들어, 염기 편집될, 절단될, 니킹될 등) 수 있다. 피자식물, 나자식물, 단자엽식물, 쌍자엽식물, C3, C4, CAM 식물, 선태식물, 양치식물 및/또는 양치식물 동류, 미세조류, 및/또는 거대조류를 포함한 임의의 식물 (또는 예를 들어, 속 또는 보다 높은 목 분류로의 식물의 그룹핑)은 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 변형될 수 있다. 본 발명에 유용한 식물 및/또는 식물 부분은 임의의 식물 종/변종/품종의 식물 및/또는 식물 부분일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "식물 부분"은 배, 화분, 배주, 종자, 잎, 줄기, 순, 꽃, 가지, 과실, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 뿌리, 근단, 꽃밥, 식물 및/또는 식물의 부분에서 무손상인 식물 세포를 포함한 식물 세포, 식물 원형질체, 식물 조직, 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 무리 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "순"은 잎 및 줄기를 포함한 땅 위의 부분을 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 "식물 세포"는 세포벽을 포함하고 또한 원형질체로 지칭될 수 있는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 세포는 단리된 단일 세포의 형태일 수 있거나, 배양된 세포일 수 있거나, 또는 고등-유기체화된 단위, 예컨대, 예를 들어, 식물 조직 또는 식물 기관의 일부일 수 있다.
본 발명에 유용한 식물의 비-제한적 예는 잔디풀 (예를 들어, 블루그래스, 벤트그래스, 독보리, 김의털), 깃털 갈대풀, 좀새풀, 억새, 물대, 지팽이풀, 채소 작물, 예컨대 아티초크, 콜라비, 루콜라, 리크, 아스파라거스, 상추 (예를 들어, 결구, 잎, 로메인), 토란, 멜론 (예를 들어, 머스크멜론, 수박, 크렌쇼, 감로, 칸탈루프), 콜 작물 (예를 들어, 방울 양배추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 콜라드, 케일, 중국 양배추, 청경채), 카르도니, 당근, 나파, 오크라, 양파, 셀러리, 파슬리, 병아리콩, 파스닙, 치커리, 피망, 감자, 조롱박 (예를 들어, 매로우, 오이, 주키니, 스쿼시, 호박, 감로 멜론, 수박, 칸탈루프), 무, 건구식 양파, 루타바가, 가지, 서양우엉, 꽃상추, 샬롯, 엔다이브, 마늘, 시금치, 파, 스쿼시, 그린, 비트 (사탕무 및 사료용 비트), 고구마, 근대, 서양고추냉이, 토마토, 순무, 및 향신료; 과실 작물, 예컨대 사과, 살구, 체리, 천도복숭아, 복숭아, 배, 자두, 프룬, 체리, 마르멜로, 무화과, 너트 (예를 들어, 밤, 피칸, 피스타치오, 헤이즐넛, 피스타치오, 땅콩, 호두, 마카다미아 너트, 아몬드 등), 감귤류 (예를 들어, 귤, 금귤, 오렌지, 자몽, 탄제린, 만다린, 레몬, 라임 등), 블루베리, 블랙 라즈베리, 보이즌베리, 크랜베리, 커런트, 구스베리, 로건베리, 산딸기, 딸기, 블랙베리, 포도 (와인 및 테이블), 아보카도, 바나나, 키위, 감, 석류, 파인애플, 열대 과일, 인과, 멜론, 망고, 파파야, 및 리치, 필드 작물 식물, 예컨대 클로버, 알팔파, 티모시, 달맞이꽃, 메도우 폼, 옥수수/메이즈 (필드, 스위트, 팝콘), 홉, 호호바, 메밀, 홍화, 퀴노아, 밀, 벼, 보리, 호밀, 기장, 수수, 귀리, 라이밀, 수수, 담배, 케이폭, 콩과 식물 (콩 (예를 들어, 생두 및 건조된), 렌틸, 완두콩, 대두), 오일 식물 (유채, 카놀라, 머스타드, 퍼피, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자유 식물, 코코아 빈, 땅콩, 기름 야자), 좀개구리밥, 아라비돕시스, 섬유 식물 (면화, 아마, 대마, 황마), 칸나비스(Cannabis) (예를 들어, 칸나비스 사티바(Cannabis sativa), 칸나비스 인디카(Cannabis indica), 및 칸나비스 루데랄리스(Cannabis ruderalis)), 녹나무과 (계피, 장뇌), 또는 식물, 예컨대 커피, 사탕수수, 차, 및 천연 고무 식물; 및/또는 화초 식물, 예컨대 화훼 식물, 선인장, 다육식물 및/또는 장식용 식물 (예를 들어, 장미, 튤립, 제비꽃), 뿐만 아니라 나무, 예컨대 삼림수 (활엽수 및 상록수, 예컨대 침엽수; 예를 들어, 느릅나무, 물푸레나무, 떡갈나무, 단풍나무, 전나무, 가문비나무, 삼나무, 소나무, 자작나무, 사이프러스, 유칼립투스, 버드나무), 뿐만 아니라 관목 및 다른 묘목을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 코딩하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 메이즈, 대두, 밀, 카놀라, 벼, 토마토, 피망, 해바라기, 산딸기, 블랙베리, 블랙 라즈베리 및/또는 체리를 변형시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 코딩하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 루부스(Rubus) 종 (예를 들어, 블랙베리, 블랙 라즈베리, 보이즌베리, 로건베리, 산딸기, 예를 들어, 케인베리), 박시니움(Vaccinium) 종 (예를 들어, 크랜베리), 리베스(Ribes) 종 (예를 들어, 구스베리, 커런트 (예를 들어, 레드 커런트, 블랙 커런트)), 또는 프라가리아(Fragaria) 종 (예를 들어, 딸기)을 변형시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는 키트 또는 키트들을 추가로 포함한다. 본 발명의 키트는 시약, 완충제, 및 혼합, 측정, 분류, 표지화 등을 위한 장치, 뿐만 아니라 표적 핵산을 변형시키는데 적절할 것인 바와 같은 지시서 등을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 그의 사용을 위한 임의적 지시서와 함께, 본 발명의 1종 이상의 핵산 구축물 및/또는 이를 포함하는 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드/복합체를 포함하거나 코딩하는) 발현 카세트 및/또는 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 CRISPR-Cas 가이드 핵산 (본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CRISPR-Cas 뉴클레아제에 상응함) 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 본 발명의 핵산 구축물과 동일한 발현 카세트 및/또는 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 것과는 별개의 발현 카세트 또는 벡터 상에 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 가이드 핵산을 코딩하는 핵산 구축물을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 구축물은 가이드 핵산의 백본 내로의 표적 핵산 서열과 동일하거나 그에 상보적인 핵산 서열의 클로닝을 위한 클로닝 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 형질전환체 (예를 들어, 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자 등을 코딩하는 핵산)를 확인하는데 유용한 1종 이상의 선택가능한 마커를 추가로 코딩할 수 있다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참고로 기재될 것이다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도됨이 인정되어야 한다. 통상의 기술자에게 일어나는 예시화된 방법의 임의의 변동은 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1. 생체내 정확성 주형화된 편집
인간 세포에서 CRISPR 단백질에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 융합을 통한 정확성 주형화된 편집은 성분의 믹스를 인간 세포주 HEK293T 내로 공동-형질감염시킴으로써 입증될 수 있다. 성분의 믹스는 CMV 프로모터에 의해 유도된 돌연변이체 EGFP 유전자의 카피를 함유하는 수용자 플라스미드; 표적 부위에의 주형의 결합을 용이하게 하는 100 내지 200 nt의 상동 서열에 의해 플랭킹된 돌연변이체 EGFP에 대한 교정 서열을 함유하는 단일 가닥 DNA 복구 주형; CRISPR 단백질 (예를 들어, eCas9, nCas9 (D10A), 또는 nCas9 (H840A)) 및 관심의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 이. 콜라이로부터의 Pol I)의 융합 단백질을 발현하는 제2 플라스미드 (여기서 N- 또는 C- 말단 CRISPR 단백질에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 융합은 링커를 통함); 돌연변이체 EGFP 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드를 포함한다. 대조군으로서, 제2 플라스미드는 단지 상대적 CRISPR 단백질을 발현하는 플라스미드로 대체될 것이다. 목적하는 주형화된 편집 사건은 돌연변이체 EGFP가 EGFP의 기능적 카피에 교정되어 녹색 형광 표현형을 발생시키는 바와 같이, 유동 세포계측법으로 확인될 것이다.
대안적으로, DNA 복구 주형 및 가이드 RNA (또는 가이드 DNA)를 발현하는 제3 플라스미드는 복구 주형을 함유하는 레트론 스캐폴드를 갖는 레트론 리버스 트랜스크립타제 및 키메라 가이드 RNA (또는 키메라 가이드 DNA)를 발현하는 플라스미드에 의해 대체될 수 있다.
실시예 2. 시험관내에서의 CRISPR 단백질 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 통한 정확성 주형화된 편집.
시험관내에서의 CRISPR 단백질 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 통한 정확성 주형화된 편집. 상업적으로 입수가능한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 CRISPR 니카제 nCas9 (H840A)에 의해 도입된 닉으로부터 표적 DNA 서열의 주형화된 대체를 수행하는 그들의 잠재성에 대해 시험관내에서 평가한다. 평가를 위한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 비-제한적 예는 Q5 고-충실도 DNA 폴리머라제, 퓨전® 고-충실도 DNA 폴리머라제, 헤모 클렌 택(Hemo Klen Taq) DNA 폴리머라제, Bst 2.0 DNA 폴리머라제, Bsu DNA 폴리머라제, Phi29 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, 써미네이터(Therminator)™ DNA 폴리머라제, 클레나우 단편 (3'->5' 엑소-), 벤트 (엑소-)를 포함한다.
단편의 중심에 Cas9 결합 부위를 함유하는 2kb DNA 단편을 수용자로서 사용하고, ~100nt의 단일 가닥 DNA 복구 주형을 사용하여 Cas9 표적 부위에 인접한 수용자에 대한 미스매치를 도입한다. 수용자 DNA, 복구 주형, nCas9 (H840A) 단백질 및 가이드 RNA, 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 혼합물을 37℃ 또는 25℃에서 인큐베이션한다. 미스매치를 함유하는 목적하는 복구 생성물을 T7 엔도뉴클레아제 I에 의해 소화시키고, 다른 생성물로부터 분리하고, 겔 전기영동에 의해 정량화할 수 있다.
실시예 3. 표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 MS2 RNA 루프 동원을 통한 정확성 주형화된 편집.
표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 MS2 RNA 루프 동원을 통한 정확성 주형화된 편집은 성분의 믹스를 인간 세포주 HEK293T 내로 공동-형질감염시킴으로써 입증될 수 있다. 성분의 믹스는 CMV 프로모터에 의해 유도된 돌연변이체 EGFP 유전자의 카피를 함유하는 수용자 플라스미드; 표적 부위에의 주형의 결합을 용이하게 하는 100 내지 200 nt의 상동 서열에 의해 플랭킹된 돌연변이체 EGFP에 대한 교정 서열을 함유하는 단일 가닥 DNA 복구 주형; 링커를 통해 그의 N-말단에 융합된 MCP 도메인을 갖는 관심의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 이. 콜라이로부터의 Pol I)를 발현하는 제2 플라스미드; 돌연변이체 EGFP 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드 (여기서 가이드 핵산 스캐폴드는 MCP 도메인과 상호작용하는 MS2 스템 루프를 함유하도록 변형됨); 및 CRISPR 단백질 (예를 들어, eCas9, nCas9 (D10A), 또는 nCas9 (H840A))을 발현하는 제4 플라스미드를 포함한다. 대조군으로서, 제2 플라스미드는 형질감염 믹스로부터 생략된다. 목적하는 주형화된 편집 사건은 돌연변이체 EGFP가 EGFP의 기능적 카피에 대해 교정되는 바와 같이, 유동 세포계측법으로 확인된다. 대안적으로, DNA 복구 주형 및 MS2 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드는 복구 주형을 함유하는 레트론 스캐폴드를 갖는 레트론 리버스 트랜스크립타제 및 키메라 MS2 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드에 의해 대체될 수 있다.
실시예 4. 표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 PUF-결합 부위 (PBS) RNA 압타머 동원을 통한 정확성 주형화된 편집.
표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 PUF-결합 부위 (PBS) RNA 압타머 동원을 통한 정확성 주형화된 편집은 성분의 믹스를 인간 세포주 HEK293T 내로 공동-형질감염시킴으로써 입증될 수 있다. 성분의 미스는 CMV 프로모터에 의해 유도된 돌연변이체 EGFP 유전자의 카피를 함유하는 수용자 플라스미드; 표적 부위에의 주형의 결합을 용이하게 하는 100 내지 200 nt의 상동 서열에 의해 플랭킹된 돌연변이체 EGFP에 대한 교정 서열을 함유하는 단일 가닥 DNA 복구 주형; 링커를 통해 그의 N-말단에 융합된 PUF 도메인을 갖는 관심의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어 이. 콜라이로부터의 Pol I)를 발현하는 제2 플라스미드; 돌연변이체 EGFP 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드 (여기서 가이드 RNA 스캐폴드는 PUF 도메인과 상호작용하는 PUF-결합 부위를 함유하도록 변형됨); 및 CRISPR 단백질 (예를 들어 eCas9, nCas9 (D10A), 또는 nCas9 (H840A))을 발현하는 제4 플라스미드를 함유한다. 대조군으로서, 제2 플라스미드는 형질감염 믹스로부터 생략된다. 목적하는 주형화된 편집 사건은 돌연변이체 EGFP가 EGFP의 기능적 카피에 대해 교정되는 바와 같이, 유동 세포계측법으로 확인된다. 대안적으로, DNA 복구 주형 및 PBS를 갖는 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드는 PBS 및 복구 주형을 함유하는 레트론 스캐폴드를 갖는 레트론 리버스 트랜스크립타제 및 키메라 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드에 의해 대체될 수 있다.
실시예 5. 표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 PUF-결합 부위 (PBS) RNA 압타머 동원을 통한 정확성 주형화된 편집.
표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 항체/에피토프 동원을 통한 정확성 주형화된 편집은 성분의 믹스를 인간 세포주 HEK293T 내로 공동-형질감염시킴으로써 입증될 수 있다. 성분의 믹스는 CMV 프로모터에 의해 유도된 돌연변이체 EGFP 유전자의 카피를 함유하는 수용자 플라스미드; 표적 부위에의 주형의 결합을 용이하게 하는 100 내지 200 nt의 상동 서열에 의해 플랭킹된 돌연변이체 EGFP에 대한 교정 서열을 함유하는 단일 가닥 DNA 복구 주형; 링커를 통해 그의 N-말단에 융합된 scFV 도메인을 갖는 관심의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 이. 콜라이로부터의 Pol I)를 발현하는 제2 플라스미드; 돌연변이체 EGFP 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드; 및 그의 C-말단에 융합된 GCN4 태그의 8개의 카피를 갖는, CRISPR 단백질 (예를 들어 eCas9, nCas9 (D10A), 또는 nCas9 (H840A))을 발현하는 제4 플라스미드를 포함한다. 대조군으로서, 제2 플라스미드는 형질감염 믹스로부터 생략된다. 목적하는 주형화된 편집 사건은 돌연변이체 EGFP가 EGFP의 기능적 카피에 대해 교정되는 바와 같이, 유동 세포계측법으로 확인된다. 대안적으로, DNA 복구 주형 및 가이드 RNA를 발현하는 제3 플라스미드는 복구 주형을 함유하는 레트론 스캐폴드를 갖는 레트론 리버스 트랜스크립타제 및 키메라 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드에 의해 대체될 수 있다.
실시예 6. 표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 PUF-결합 부위 (PBS) RNA 압타머 동원을 통한 정확성 주형화된 편집.
식물에서 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 동원을 통한 정확성 주형화된 편집 및 긴 단편의 부위 지정 통합은 EGFP 유전자 (~700bp)를 프레임 내에서 고도로 발현된 유전자 (예를 들어, 액틴)의 엑손 내로 삽입함으로써 입증될 수 있다. 이 실험 디자인에서, 2개의 T-DNA가 식물 조직 내로 공동 형질전환될 것이다. 제1 T-DNA는 표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 효율적인 동원을 위한 정확한 아키텍쳐로 CRISPR 단백질 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 발현하는 툴 카세트, 및 단백질 동원을 위한 필수적인 배치로 액틴의 마지막 엑손을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 가이드 카세트를 함유한다. 제2 T-DNA는 EGFP의 전장 및 표적화된 엑손에서 정지 코돈의 프레임내 결실을 코딩하는 복구 주형을 함유한다. 이 복구 주형은 제1 T-DNA에서 발현되는 가이드 RNA에 의해 인식되는 표적 부위에 의해 플랭킹된다. EGFP의 목적하는 부위 지정 통합은 액틴 유전자의 프로모터에 의해 유도하는 EGFP의 발현을 발생시키는 반면, 무작위 통합은 프로모터의 결여로 인해 EGFP 발현을 생성하지 않는다. 부위 지정 통합의 빈도는 현미경검사에 의해 정량화될 수 있다. 대안적으로, 제1 T-DNA는 단지 툴 카세트를 발현할 것이고, 제2 T-DNA는 가이드 RNA 스캐폴드에 부착된 레트론 스캐폴드에서 복구 주형을 코딩하는 레트론 리버스 트랜스크립타제 카세트 및 키메라 가이드 RNA 카세트를 함유할 것이다.
실시예 7. DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 동원 및 최적화
상기 실시예에 및 본원에 보다 일반적으로 기재된 바와 같이, 많은 상이한 방법은 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 편집 부위에 동원하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 유연성 링커를 통해, 예컨대 염기 편집제의 아키텍쳐로 CRISPR 단백질의 C- 또는 N- 말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, DNA-의존성 DNA 폴리머라제는 가이드 RNA (예를 들어 MS2 루프) 또는 CRISPR 단백질 (예를 들어 썬태그)과의 상호작용을 통해 표적 파단된 또는 니킹된 DNA에 동원될 수 있다.
DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 기능은 3'-5' 엑소뉴클레아제, 5'-3' 엑소뉴클레아제 및/또는 5'-3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성의 제거에 의한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 방식으로 개선될/최적화될 수 있다. DNA 의존성 DNA 폴리머라제는 단백질의 클레나우 단편 또는 다른 하위-단편을 추가로 포함할 수 있다. 클레나우 단편 또는 다른 활성 단편은 전달 또는 활성 목적에 유용할 수 있다. 예로서, 이. 콜라이 클레나우 단편은 68 kDa 또는 전체 (109 kDa) DNA 폴리머라제 I의 62% 분자량이다.
DNA-의존성 DNA 폴리머라제 효소에의 단백질 도메인 융합은 편집 시스템의 온도-민감성 및 진행성에 대한 유의한 효과를 가질 수 있다. DNA-의존성 DNA 폴리머라제 효소는 DNA 결합 도메인 (DBD)에의 융합을 통해 온도-민감성, 진행성, 및 주형 친화도에 대해 개선될 수 있다. 이들 DBD는 서열 특이성, 비-특이성 또는 서열 선호성을 가질 수 있다. 다양한 친화도 분포는 상이한 세포 및 시험관내 환경에서 편집에 유익할 수 있다. 1개 이상의 DBD를 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 효소에 첨가하는 것은 증가된 친화도, 증가된 또는 감소된 서열 특이성을 발생시키고/거나 협동성을 촉진시킬 수 있다. DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 진행성을 증가시키는 것으로 공지된 한 특정 DBD는 술폴로부스 솔파타리쿠스로부터의 서열-비특이적 dsDNA 결합 단백질 Sso7d이다 (Wang, 2004). dsDNA 결합 단백질은 폴리머라제의 C-말단, N-말단 또는 유연성 루프 중 어느 하나에 융합될 수 있다. 증가된 진행성은 보다 큰 리포터 유전자, 예컨대 td토마토(tdTomato) (~1500bp)를 프레임 내에서 고도로 발현된 유전자 (예를 들어 액틴)의 엑손 내로 삽입함으로써 입증될 수 있다. 예를 들어, 2개의 T-DNA는 식물 조직 내로 공동 형질전환될 수 있다. 제1 T-DNA는 표적 부위에의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제::ssDBD의 효율적인 동원을 위한 정확한 아키텍쳐로 CRISPR 단백질 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제::ssDBD를 발현하는 툴 카세트, 및 단백질 동원을 위한 필수적인 배치로 액틴의 마지막 엑손을 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 가이드 카세트를 함유한다. 제2 T-DNA는 td토마토 (또는 다른 리포터)의 전장 및 표적화된 엑손에서 정지 코돈의 프레임내 결실을 코딩하는 복구 주형을 함유한다. 이 복구 주형은 제1 T-DNA에서 발현되는 가이드 RNA에 의해 인식되는 표적 부위에 의해 플랭킹된다. td토마토 (또는 다른 리포터)의 목적하는 부위 지정 통합은 액틴 유전자의 프로모터에 의해 유도하는 td토마토의 발현을 발생시키는 반면, 무작위 통합은 프로모터의 결여로 인해 td토마토 발현을 생성하지 않는다. 부위 지정 통합의 빈도는 현미경검사에 의해 정량화될 수 있다.
실시예 8. CRISPR 폴리펩티드
본 발명은 제공된 복구 주형에 어닐링된 파단된 또는 니킹된 표적 DNA의 3' 단부에 의해 프라이밍된 DNA 합성을 급속하게 개시하기 위해 높은 진행성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 이용한다. Cas9 뉴클레아제 및 니카제, 및 Cas12a 뉴클레아제 및 니카제 및 다른 CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드는 3'DNA 표적 단부를 생성하는데 사용될 수 있다. 복구 주형, 특히 큰 크기를 갖는 주형의 성공적인 혼입은 파단된 또는 닉 부위로부터 멀리 DNA 주형을 따라 이동하는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 능력에 의존할 수 있다. 절단된 또는 니킹된 DNA에 결합되어 잔류할 수 있는 Cas9 단백질에의 직접적 융합은 DNA-의존성 DNA 폴리머라제의 이동을 방해할 수 있다. 그 이유로, DNA에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 Cas9, 예컨대 eCas9 (3개의 아미노산 돌연변이 (K848A, K1003A, R1060A)4) 뉴클레아제 또는 니카제가 사용될 수 있다. 대안적으로, CRISPR 복합체에의 폴리머라제의 비-공유 동원은 폴리머라제가 입체적 억제 또는 이동성 제한 없이 기능하는 기회를 최대화하는데 사용될 수 있다. 몇몇 공유 및 비-공유 동원 전략은 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, Cpf1/Cas12a는 안정한 결합을 위한 보다 긴 시드 서열 (Cas9에 대해 17-bp 대 9 내지 10-bp)을 가지며, 이는 Cpf1로 발견되는 편집의 보다 낮은 오프-타겟 속도와 일치하게, 표적 DNA에 대한 보다 낮은 친화도를 지시한다 (Jeon et al., 2018). 표적 DNA에 대한, Cas9에 비해 Cpf1의 보다 낮은 친화도는 편집 툴의 이동성을 요구하는 폴리머라제 융합을 위한 이점일 수 있다.
실시예 9. 복구 주형 동원
인간 세포 실험에서, 복구 주형은 1) CRISPR 단백질에 융합된 PCV 도메인, 및 복구 주형에 포매된 PCV 인식 부위 사이의 상호작용; 및 2) 키메라 레트론-가이드 RNA 스캐폴드로부터 생성되고 가이드 RNA 스캐폴드에 결박된 msDNA 코딩 복구 주형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 전략을 통해 동원될 수 있다.
실시예 10. 식물에서의 게놈 편집
식물의 편집에서, 복구 주형 전달의 다양한 방법이 사용될 수 있고, 이들은 형질전환 방법에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 위해, VirD2 또는 VirE2 매개 T-DNA 동원이 사용될 수 있거나, msDNA, 및 입자 포격을 위해, HUH 태그부착 시스템 및 msDNA가 사용될 수 있다.
실시예 11. 인간 세포에서의 편집
진핵생물 HEK293T (ATCC CRL-3216) 세포를 10% (v/v) FBS (FBS)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 더하기 글루타맥스(GlutaMax) (써모피셔(ThermoFisher))에서 5% CO2를 갖는 37℃에서 배양하였다. HEK293T 세포를 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트(BioCoat) 플레이트 (코닝(Corning)) 상에 시딩하였다. 세포를 약 70% 전면생장률로 형질감염시켰다. DNA를 웰 당 1.5 μl의 리포펙타민(Lipofectamine) 3000 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. RNP를 웰 당 1.5 μl의 RNAiMAX (써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 3일 후에 얻고, 정확한 편집을 검출하고, 고-처리량 일루미나(Illumina) 앰플리콘 시퀀싱을 사용하여 정량화하였다.
DNA 주형의 DNA 폴리머라제-매개 신장을 시험하기 위해, 하기를 수행하였다. HEK293T 세포를 먼저 구성적 CMV 프로모터 하에서 클렌택(Klentaq), 써미네이터, Pfu-Ssod7, 클레나우, 이. 콜라이 polI, HU pol E (N-말단), 효모 pol E를 포함하는 다양한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 1 ug의 DNA로 형질감염시켰다 (예를 들어, 서열식별번호:48 내지 58, 88 내지 94 참조). 모든 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 핵 내로의 유입을 보장하기 위해 적어도 하나의 SV40 핵 국재화 서열로 증강시켰다. 4시간 후, 세포를 신선한 배지 하에 정치하였다. 이어서 다양한 합성 crRNA 연장 (예를 들어, 서열식별번호:78, 79, 82, 83, 86, 87 참조)을 함유하는 Cas12a RNP 복합체 (예를 들어, 서열식별번호:75 참조)를 세포 내로 형질감염시켰다. Cas12a 커팅 부위의 하류의 상동성 아암을 코딩하는 DNA 연장 및 목적하는 편집물을 코딩하는 주형 서열을 화학적 합성 (인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies))을 통해 crRNA에 접합시켰다. 2개의 상이한 상동성 길이를 시험하였으며 (PBS; 24bp 및 36bp), 목적하는 편집물 (RTT)을 함유하는 주형의 길이는 36 염기 쌍이었다 (표 2). 3개의 상이한 스페이서를 사용하여 시스템 (PWsp137 (서열식별번호:76), PWsp453 (서열식별번호:80), PWsp454 (서열식별번호:84)를 시험하였다 (표 2). 모든 구축물에 대해, 주형은 위치 -4, -3, -2, 및 -1에 상응하는 PAM 서열 (TTTV)을 갖는, 아데닌으로의 스페이서의 위치 -2 및 -3에서의 정확한 디뉴클레오티드 변화 (TT에서 AA로)를 함유하였다.
PWsp137 표적 서열:
PWsp137 crRNA - 연장 없음:
PWsp137 crRNA - PBS 24bp; RTT 36bp:
PWsp137 crRNA - PBS 36bp; RTT 36bp:
PWsp453 표적 서열:
PWsp453 crRNA - 연장 없음:
PWsp453 crRNA - PBS 24bp; RTT 36bp:
PWsp453 crRNA - PBS 36bp; RTT 36bp:
PWsp454 표적 서열:
PWsp454 crRNA - 연장 없음:
PWsp454 crRNA - PBS 24bp; RTT 36bp:
PWsp454 crRNA - PBS 36bp; RTT 36bp:
본 발명자들은 crRNA 상의 DNA 연장을 함유하는 Cas12a RNP와 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 임의의 부생성물 없이 정확한 편집을 검출하였다 (표 2). 정확한 편집은 시험된 모든 3개의 스페이서에서 검출되었다 (표 2). 인델 비율은 LbCas12a RNP로부터 효율적인 것으로 예상되기 때문에 (293T에서 5 내지 50% 편집 효율 - 예를 들어, 문헌 [Liu et al. Nucleic Acids Res. 47(8):4169-4180 (2019)] 참조), 본 발명자들의 낮은 (~1%) 인델 비율 (표 3)은 본 발명자들의 실험에서 형질감염의 2 라운드가 전달 시스템의 효율을 유의하게 감소시켰음을 시사한다. 본 발명자들의 실험에서 정확한 편집 비율은 인델 비율과 유사하였음을 고려하여 (표 3 및 표 4) DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 통한 정확한 편집은 정확한 편집을 위해 잠재적으로 매우 효율적임을 시사한다. 정확한 편집의 배경 수준을 차감하고, 정확한 편집을 인델 편집의 비율로 정규화하는 (형질감염 및 생존성 비율에 대해 정규화하는) 경우, DNA 폴리머라제 및 주형의 첨가는 대부분의 스페이서 부위 및 PBS 길이에서 DNA 폴리머라제 대조군에 비해 정확한 편집물의 실질적 증가를 초래함이 명백하다 (표 4).
표 2. 총 판독물의 %로서 표현된 처리된 샘플로부터의 NGS 앰플리콘 시퀀시에서 검출된 정확한 편집.
*N/D는 데이터 없음이다
표 3. 처리된 샘플로부터의 NGS 앰플리콘 시퀀싱에서의 총 판독물 당 퍼센트 인델. N/D는 데이터 없음이다
*N/D는 데이터 없음이다
표 4. 주형 연장 없는 정확한 편집의 배경 비율을 차감한 후의 각각의 샘플의 인델 편집 비율로 정규화된 정확한 편집 판독물 (인델 비율에 비해 배수 변화로서 표현됨). N/D는 데이터 없음이다
*N/D는 데이터 없음이다
상기는 본 발명을 예시하며, 그의 제한인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 청구항의 등가물이 그 안에 포함되는 하기 청구항에 의해 한정된다.
SEQUENCE LISTING
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Nie, Jingyi
Hummel, Aaron
Lawit, Shai Joshua
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 1228
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Lachnospiraceae bacterium
<400> 1
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Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys
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Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp
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Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe
340 345 350
Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp
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385 390 395 400
Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu
405 410 415
Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser
420 425 430
Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys
435 440 445
Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys
450 455 460
Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr
465 470 475 480
Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile
485 490 495
Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr
500 505 510
Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro
515 520 525
Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala
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Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys
545 550 555 560
Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly
565 570 575
Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met
580 585 590
Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro
595 600 605
Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly
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Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys
625 630 635 640
Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn
645 650 655
Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu
660 665 670
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675 680 685
Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile
690 695 700
Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His
705 710 715 720
Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile
725 730 735
Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys
740 745 750
Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys
755 760 765
Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr
770 775 780
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Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val
805 810 815
Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp
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Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly
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Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu
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885 890 895
Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys
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Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys
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Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile
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<213> Acidaminococcus sp.
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915 920 925
Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu
930 935 940
Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val
945 950 955 960
Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile
965 970 975
His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu
980 985 990
Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu
995 1000 1005
Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu
1010 1015 1020
Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly
1025 1030 1035
Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala
1040 1045 1050
Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro
1055 1060 1065
Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe
1070 1075 1080
Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu
1085 1090 1095
Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe
1100 1105 1110
Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly
1115 1120 1125
Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn
1130 1135 1140
Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys
1145 1150 1155
Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr
1160 1165 1170
Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu
1175 1180 1185
Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu
1190 1195 1200
Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu
1205 1210 1215
Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly
1220 1225 1230
Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys
1235 1240 1245
Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp
1250 1255 1260
Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu
1265 1270 1275
Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile
1280 1285 1290
Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1295 1300 1305
<210> 3
<211> 1241
<212> PRT
<213> Utyrivibrio proteoclasticus
<400> 3
Met Leu Leu Tyr Glu Asn Tyr Thr Lys Arg Asn Gln Ile Thr Lys Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Glu Leu Arg Pro Gln Gly Lys Thr Leu Arg Asn Ile Lys
20 25 30
Glu Leu Asn Leu Leu Glu Gln Asp Lys Ala Ile Tyr Ala Leu Leu Glu
35 40 45
Arg Leu Lys Pro Val Ile Asp Glu Gly Ile Lys Asp Ile Ala Arg Asp
50 55 60
Thr Leu Lys Asn Cys Glu Leu Ser Phe Glu Lys Leu Tyr Glu His Phe
65 70 75 80
Leu Ser Gly Asp Lys Lys Ala Tyr Ala Lys Glu Ser Glu Arg Leu Lys
85 90 95
Lys Glu Ile Val Lys Thr Leu Ile Lys Asn Leu Pro Glu Gly Ile Gly
100 105 110
Lys Ile Ser Glu Ile Asn Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Gly Val Leu Tyr
115 120 125
Asp Phe Ile Asp Lys Thr His Lys Asp Ser Glu Glu Lys Gln Asn Ile
130 135 140
Leu Ser Asp Ile Leu Glu Thr Lys Gly Tyr Leu Ala Leu Phe Ser Lys
145 150 155 160
Phe Leu Thr Ser Arg Ile Thr Thr Leu Glu Gln Ser Met Pro Lys Arg
165 170 175
Val Ile Glu Asn Phe Glu Ile Tyr Ala Ala Asn Ile Pro Lys Met Gln
180 185 190
Asp Ala Leu Glu Arg Gly Ala Val Ser Phe Ala Ile Glu Tyr Glu Ser
195 200 205
Ile Cys Ser Val Asp Tyr Tyr Asn Gln Ile Leu Ser Gln Glu Asp Ile
210 215 220
Asp Ser Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Gly Ile Met Asp Glu Asp Gly Ala
225 230 235 240
Lys Glu Lys Gly Ile Asn Gln Thr Ile Ser Glu Lys Asn Ile Lys Ile
245 250 255
Lys Ser Glu His Leu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Ile Leu Lys Gln Leu
260 265 270
His Lys Gln Ile Leu Glu Glu Arg Glu Lys Ala Phe Thr Ile Asp His
275 280 285
Ile Asp Ser Asp Glu Glu Val Val Gln Val Thr Lys Glu Ala Phe Glu
290 295 300
Gln Thr Lys Glu Gln Trp Glu Asn Ile Lys Lys Ile Asn Gly Phe Tyr
305 310 315 320
Ala Lys Asp Pro Gly Asp Ile Thr Leu Phe Ile Val Val Gly Pro Asn
325 330 335
Gln Thr His Val Leu Ser Gln Leu Ile Tyr Gly Glu His Asp Arg Ile
340 345 350
Arg Leu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu Lys Asn Thr Leu Glu Val Leu Pro
355 360 365
Arg Arg Thr Lys Ser Glu Asp Ala Arg Tyr Asp Lys Phe Val Asn Ala
370 375 380
Val Pro Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser His Thr Phe Asp Gly Leu Gln
385 390 395 400
Lys Met Thr Gly Asp Asp Arg Leu Phe Ile Leu Tyr Arg Asp Glu Leu
405 410 415
Ala Arg Asn Tyr Met Arg Ile Lys Glu Ala Tyr Gly Thr Phe Glu Arg
420 425 430
Asp Ile Leu Lys Ser Arg Arg Gly Ile Lys Gly Asn Arg Asp Val Gln
435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Phe Tyr Asp Glu Leu Thr Lys Phe Arg Ser Ala
450 455 460
Leu Arg Ile Ile Asn Ser Gly Asn Asp Glu Lys Ala Asp Pro Ile Phe
465 470 475 480
Tyr Asn Thr Phe Asp Gly Ile Phe Glu Lys Ala Asn Arg Thr Tyr Lys
485 490 495
Ala Glu Asn Leu Cys Arg Asn Tyr Val Thr Lys Ser Pro Ala Asp Asp
500 505 510
Ala Arg Ile Met Ala Ser Cys Leu Gly Thr Pro Ala Arg Leu Arg Thr
515 520 525
His Trp Trp Asn Gly Glu Glu Asn Phe Ala Ile Asn Asp Val Ala Met
530 535 540
Ile Arg Arg Gly Asp Glu Tyr Tyr Tyr Phe Val Leu Thr Pro Asp Val
545 550 555 560
Lys Pro Val Asp Leu Lys Thr Lys Asp Glu Thr Asp Ala Gln Ile Phe
565 570 575
Val Gln Arg Lys Gly Ala Lys Ser Phe Leu Gly Leu Pro Lys Ala Leu
580 585 590
Phe Lys Cys Ile Leu Glu Pro Tyr Phe Glu Ser Pro Glu His Lys Asn
595 600 605
Asp Lys Asn Cys Val Ile Glu Glu Tyr Val Ser Lys Pro Leu Thr Ile
610 615 620
Asp Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Phe Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Thr
625 630 635 640
Asn Ile Gly Ile Asp Gly Leu Thr Glu Glu Lys Phe Lys Asp Asp Cys
645 650 655
Arg Tyr Leu Ile Asp Val Tyr Lys Glu Phe Ile Ala Val Tyr Thr Arg
660 665 670
Tyr Ser Cys Phe Asn Met Ser Gly Leu Lys Arg Ala Asp Glu Tyr Asn
675 680 685
Asp Ile Gly Glu Phe Phe Ser Asp Val Asp Thr Arg Leu Cys Thr Met
690 695 700
Glu Trp Ile Pro Val Ser Phe Glu Arg Ile Asn Asp Met Val Asp Lys
705 710 715 720
Lys Glu Gly Leu Leu Phe Leu Val Arg Ser Met Phe Leu Tyr Asn Arg
725 730 735
Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Thr Phe Ile Gln Leu Phe Ser Asp Ser
740 745 750
Asn Met Glu His Thr Ser Met Leu Leu Asn Ser Arg Ala Met Ile Gln
755 760 765
Tyr Arg Ala Ala Ser Leu Pro Arg Arg Val Thr His Lys Lys Gly Ser
770 775 780
Ile Leu Val Ala Leu Arg Asp Ser Asn Gly Glu His Ile Pro Met His
785 790 795 800
Ile Arg Glu Ala Ile Tyr Lys Met Lys Asn Asn Phe Asp Ile Ser Ser
805 810 815
Glu Asp Phe Ile Met Ala Lys Ala Tyr Leu Ala Glu His Asp Val Ala
820 825 830
Ile Lys Lys Ala Asn Glu Asp Ile Ile Arg Asn Arg Arg Tyr Thr Glu
835 840 845
Asp Lys Phe Phe Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ser
850 855 860
Ala Arg Thr Leu Asp Tyr Ile Asn Asp Lys Val Glu Glu Asp Thr Gln
865 870 875 880
Asp Ser Arg Met Ala Val Ile Val Thr Arg Asn Leu Lys Asp Leu Thr
885 890 895
Tyr Val Ala Val Val Asp Glu Lys Asn Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser
900 905 910
Leu Asn Glu Ile Asp Gly Val Asn Tyr Arg Glu Leu Leu Lys Glu Arg
915 920 925
Thr Lys Ile Lys Tyr His Asp Lys Thr Arg Leu Trp Gln Tyr Asp Val
930 935 940
Ser Ser Lys Gly Leu Lys Glu Ala Tyr Val Glu Leu Ala Val Thr Gln
945 950 955 960
Ile Ser Lys Leu Ala Thr Lys Tyr Asn Ala Val Val Val Val Glu Ser
965 970 975
Met Ser Ser Thr Phe Lys Asp Lys Phe Ser Phe Leu Asp Glu Gln Ile
980 985 990
Phe Lys Ala Phe Glu Ala Arg Leu Cys Ala Arg Met Ser Asp Leu Ser
995 1000 1005
Phe Asn Thr Ile Lys Glu Gly Glu Ala Gly Ser Ile Ser Asn Pro
1010 1015 1020
Ile Gln Val Ser Asn Asn Asn Gly Asn Ser Tyr Gln Asp Gly Val
1025 1030 1035
Ile Tyr Phe Leu Asn Asn Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Cys Pro Asp
1040 1045 1050
Thr Gly Phe Val Asp Val Phe Asp Lys Thr Arg Leu Ile Thr Met
1055 1060 1065
Gln Ser Lys Arg Gln Phe Phe Ala Lys Met Lys Asp Ile Arg Ile
1070 1075 1080
Asp Asp Gly Glu Met Leu Phe Thr Phe Asn Leu Glu Glu Tyr Pro
1085 1090 1095
Thr Lys Arg Leu Leu Asp Arg Lys Glu Trp Thr Val Lys Ile Ala
1100 1105 1110
Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Lys Gly Glu Tyr Val Tyr
1115 1120 1125
Val Asn Asp Ile Val Arg Glu Gln Ile Ile Pro Ala Leu Leu Glu
1130 1135 1140
Asp Lys Ala Val Phe Asp Gly Asn Met Ala Glu Lys Phe Leu Asp
1145 1150 1155
Lys Thr Ala Ile Ser Gly Lys Ser Val Glu Leu Ile Tyr Lys Trp
1160 1165 1170
Phe Ala Asn Ala Leu Tyr Gly Ile Ile Thr Lys Lys Asp Gly Glu
1175 1180 1185
Lys Ile Tyr Arg Ser Pro Ile Thr Gly Thr Glu Ile Asp Val Ser
1190 1195 1200
Lys Asn Thr Thr Tyr Asn Phe Gly Lys Lys Phe Met Phe Lys Gln
1205 1210 1215
Glu Tyr Arg Gly Asp Gly Asp Phe Leu Asp Ala Phe Leu Asn Tyr
1220 1225 1230
Met Gln Ala Gln Asp Ile Ala Val
1235 1240
<210> 4
<211> 1238
<212> PRT
<213> Candidatus Methanoplasma termitum
<400> 4
Met Asn Asn Tyr Asp Glu Phe Thr Lys Leu Tyr Pro Ile Gln Lys Thr
1 5 10 15
Ile Arg Phe Glu Leu Lys Pro Gln Gly Arg Thr Met Glu His Leu Glu
20 25 30
Thr Phe Asn Phe Phe Glu Glu Asp Arg Asp Arg Ala Glu Lys Tyr Lys
35 40 45
Ile Leu Lys Glu Ala Ile Asp Glu Tyr His Lys Lys Phe Ile Asp Glu
50 55 60
His Leu Thr Asn Met Ser Leu Asp Trp Asn Ser Leu Lys Gln Ile Ser
65 70 75 80
Glu Lys Tyr Tyr Lys Ser Arg Glu Glu Lys Asp Lys Lys Val Phe Leu
85 90 95
Ser Glu Gln Lys Arg Met Arg Gln Glu Ile Val Ser Glu Phe Lys Lys
100 105 110
Asp Asp Arg Phe Lys Asp Leu Phe Ser Lys Lys Leu Phe Ser Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Glu Glu Ile Tyr Lys Lys Gly Asn His Gln Glu Ile Asp Ala
130 135 140
Leu Lys Ser Phe Asp Lys Phe Ser Gly Tyr Phe Ile Gly Leu His Glu
145 150 155 160
Asn Arg Lys Asn Met Tyr Ser Asp Gly Asp Glu Ile Thr Ala Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Ile Val Asn Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Leu Gln
180 185 190
Lys Tyr Gln Glu Ala Arg Lys Lys Tyr Pro Glu Trp Ile Ile Lys Ala
195 200 205
Glu Ser Ala Leu Val Ala His Asn Ile Lys Met Asp Ile Val Phe Ser
210 215 220
Leu Glu Tyr Phe Asn Lys Val Leu Asn Gln Glu Gly Ile Gln Arg Tyr
225 230 235 240
Asn Leu Ala Leu Gly Gly Tyr Val Thr Lys Ser Gly Glu Lys Met Met
245 250 255
Gly Leu Asn Asp Ala Leu Asn Leu Ala His Gln Ser Glu Lys Ser Ser
260 265 270
Lys Gly Arg Ile His Met Thr Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Glu
275 280 285
Lys Glu Ser Phe Ser Tyr Ile Pro Asp Val Phe Thr Glu Asp Ser Gln
290 295 300
Leu Leu Pro Ser Ile Gly Gly Phe Phe Ala Gln Ile Glu Asn Asp Lys
305 310 315 320
Asp Gly Asn Ile Phe Asp Arg Ala Leu Glu Leu Ile Ser Ser Tyr Ala
325 330 335
Glu Tyr Asp Thr Glu Arg Ile Tyr Ile Arg Gln Ala Asp Ile Asn Arg
340 345 350
Val Ser Asn Val Ile Phe Gly Glu Trp Gly Thr Leu Gly Gly Leu Met
355 360 365
Arg Glu Tyr Lys Ala Asp Ser Ile Asn Asp Ile Asn Leu Glu Arg Thr
370 375 380
Cys Lys Lys Val Asp Lys Trp Leu Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Ser
385 390 395 400
Asp Val Leu Glu Ala Ile Asp Arg Thr Gly Asn Asn Asp Ala Phe Asn
405 410 415
Glu Tyr Ile Ser Lys Met Arg Thr Ala Arg Glu Lys Ile Asp Ala Ala
420 425 430
Arg Lys Glu Met Lys Phe Ile Ser Glu Lys Ile Ser Gly Asp Glu Glu
435 440 445
Ser Ile His Ile Ile Lys Thr Leu Leu Asp Ser Val Gln Gln Phe Leu
450 455 460
His Phe Phe Asn Leu Phe Lys Ala Arg Gln Asp Ile Pro Leu Asp Gly
465 470 475 480
Ala Phe Tyr Ala Glu Phe Asp Glu Val His Ser Lys Leu Phe Ala Ile
485 490 495
Val Pro Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Asn Asn Leu
500 505 510
Asn Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Lys Asn Pro Thr Leu Ala Asn
515 520 525
Gly Trp Asp Gln Asn Lys Val Tyr Asp Tyr Ala Ser Leu Ile Phe Leu
530 535 540
Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Leu Gly Ile Ile Asn Pro Lys Arg Lys Lys
545 550 555 560
Asn Ile Lys Phe Glu Gln Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Tyr Arg Lys
565 570 575
Met Val Tyr Lys Gln Ile Pro Gly Pro Asn Lys Asn Leu Arg Pro Val
580 585 590
Phe Leu Thr Ser Thr Lys Gly Lys Lys Glu Tyr Lys Pro Ser Lys Glu
595 600 605
Ile Ile Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Lys His Ile Arg Gly Asp Lys Phe
610 615 620
Asp Leu Asp Phe Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile
625 630 635 640
Glu Lys His Lys Asp Trp Ser Lys Phe Asn Phe Tyr Phe Ser Pro Thr
645 650 655
Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Leu Asp Val Glu Lys Gln
660 665 670
Gly Tyr Arg Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ala Glu Thr Ile Asp Glu
675 680 685
Tyr Val Glu Lys Gly Asp Leu Phe Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp
690 695 700
Phe Val Lys Ala Ala Thr Gly Lys Lys Asp Met His Thr Ile Tyr Trp
705 710 715 720
Asn Ala Ala Phe Ser Pro Glu Asn Leu Gln Asp Val Val Val Lys Leu
725 730 735
Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Asp Lys Ser Asp Ile Lys Glu
740 745 750
Ile Val His Arg Glu Gly Glu Ile Leu Val Asn Arg Thr Tyr Asn Gly
755 760 765
Arg Thr Pro Val Pro Asp Lys Ile His Lys Lys Leu Thr Asp Tyr His
770 775 780
Asn Gly Arg Thr Lys Asp Leu Gly Glu Ala Lys Glu Tyr Leu Asp Lys
785 790 795 800
Val Arg Tyr Phe Lys Ala His Tyr Asp Ile Thr Lys Asp Arg Arg Tyr
805 810 815
Leu Asn Asp Lys Ile Tyr Phe His Val Pro Leu Thr Leu Asn Phe Lys
820 825 830
Ala Asn Gly Lys Lys Asn Leu Asn Lys Met Val Ile Glu Lys Phe Leu
835 840 845
Ser Asp Glu Lys Ala His Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn
850 855 860
Leu Leu Tyr Tyr Ser Ile Ile Asp Arg Ser Gly Lys Ile Ile Asp Gln
865 870 875 880
Gln Ser Leu Asn Val Ile Asp Gly Phe Asp Tyr Arg Glu Lys Leu Asn
885 890 895
Gln Arg Glu Ile Glu Met Lys Asp Ala Arg Gln Ser Trp Asn Ala Ile
900 905 910
Gly Lys Ile Lys Asp Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Lys Ala Val His
915 920 925
Glu Ile Thr Lys Met Ala Ile Gln Tyr Asn Ala Ile Val Val Met Glu
930 935 940
Glu Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln
945 950 955 960
Ile Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Met Leu Ile Asp Lys Met Asn Tyr Leu
965 970 975
Val Phe Lys Asp Ala Pro Asp Glu Ser Pro Gly Gly Val Leu Asn Ala
980 985 990
Tyr Gln Leu Thr Asn Pro Leu Glu Ser Phe Ala Lys Leu Gly Lys Gln
995 1000 1005
Thr Gly Ile Leu Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Lys Ile
1010 1015 1020
Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Leu Phe Asn Thr Ser Ser Lys
1025 1030 1035
Thr Asn Ala Gln Glu Arg Lys Glu Phe Leu Gln Lys Phe Glu Ser
1040 1045 1050
Ile Ser Tyr Ser Ala Lys Asp Gly Gly Ile Phe Ala Phe Ala Phe
1055 1060 1065
Asp Tyr Arg Lys Phe Gly Thr Ser Lys Thr Asp His Lys Asn Val
1070 1075 1080
Trp Thr Ala Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Met Arg Tyr Ile Lys Glu
1085 1090 1095
Lys Lys Arg Asn Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys Glu Ile Lys Glu
1100 1105 1110
Ala Leu Thr Ser Ser Gly Ile Lys Tyr Asp Gly Gly Gln Asn Ile
1115 1120 1125
Leu Pro Asp Ile Leu Arg Ser Asn Asn Asn Gly Leu Ile Tyr Thr
1130 1135 1140
Met Tyr Ser Ser Phe Ile Ala Ala Ile Gln Met Arg Val Tyr Asp
1145 1150 1155
Gly Lys Glu Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Ile Lys Asn Ser Lys Gly
1160 1165 1170
Glu Phe Phe Arg Thr Asp Pro Lys Arg Arg Glu Leu Pro Ile Asp
1175 1180 1185
Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Gly Glu Leu
1190 1195 1200
Thr Met Arg Ala Ile Ala Glu Lys Phe Asp Pro Asp Ser Glu Lys
1205 1210 1215
Met Ala Lys Leu Glu Leu Lys His Lys Asp Trp Phe Glu Phe Met
1220 1225 1230
Gln Thr Arg Gly Asp
1235
<210> 5
<211> 1281
<212> PRT
<213> Eubacterium eligens
<400> 5
Met Asn Gly Asn Arg Ser Ile Val Tyr Arg Glu Phe Val Gly Val Ile
1 5 10 15
Pro Val Ala Lys Thr Leu Arg Asn Glu Leu Arg Pro Val Gly His Thr
20 25 30
Gln Glu His Ile Ile Gln Asn Gly Leu Ile Gln Glu Asp Glu Leu Arg
35 40 45
Gln Glu Lys Ser Thr Glu Leu Lys Asn Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg
50 55 60
Glu Tyr Ile Asp Lys Ser Leu Ser Gly Val Thr Asp Leu Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Leu Phe Glu Leu Met Asn Leu Val Gln Ser Ser Pro Ser Lys Asp
85 90 95
Asn Lys Lys Ala Leu Glu Lys Glu Gln Ser Lys Met Arg Glu Gln Ile
100 105 110
Cys Thr His Leu Gln Ser Asp Ser Asn Tyr Lys Asn Ile Phe Asn Ala
115 120 125
Lys Leu Leu Lys Glu Ile Leu Pro Asp Phe Ile Lys Asn Tyr Asn Gln
130 135 140
Tyr Asp Val Lys Asp Lys Ala Gly Lys Leu Glu Thr Leu Ala Leu Phe
145 150 155 160
Asn Gly Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Asp Phe Phe Glu Lys Arg Lys Asn
165 170 175
Val Phe Thr Lys Glu Ala Val Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Ile Val
180 185 190
His Glu Asn Ser Leu Ile Phe Leu Ala Asn Met Thr Ser Tyr Lys Lys
195 200 205
Ile Ser Glu Lys Ala Leu Asp Glu Ile Glu Val Ile Glu Lys Asn Asn
210 215 220
Gln Asp Lys Met Gly Asp Trp Glu Leu Asn Gln Ile Phe Asn Pro Asp
225 230 235 240
Phe Tyr Asn Met Val Leu Ile Gln Ser Gly Ile Asp Phe Tyr Asn Glu
245 250 255
Ile Cys Gly Val Val Asn Ala His Met Asn Leu Tyr Cys Gln Gln Thr
260 265 270
Lys Asn Asn Tyr Asn Leu Phe Lys Met Arg Lys Leu His Lys Gln Ile
275 280 285
Leu Ala Tyr Thr Ser Thr Ser Phe Glu Val Pro Lys Met Phe Glu Asp
290 295 300
Asp Met Ser Val Tyr Asn Ala Val Asn Ala Phe Ile Asp Glu Thr Glu
305 310 315 320
Lys Gly Asn Ile Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Val Asn Lys Tyr Asp
325 330 335
Glu Leu Asp Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Ser Lys Asp Phe Tyr Glu Thr
340 345 350
Leu Ser Cys Phe Met Ser Gly Asn Trp Asn Leu Ile Thr Gly Cys Val
355 360 365
Glu Asn Phe Tyr Asp Glu Asn Ile His Ala Lys Gly Lys Ser Lys Glu
370 375 380
Glu Lys Val Lys Lys Ala Val Lys Glu Asp Lys Tyr Lys Ser Ile Asn
385 390 395 400
Asp Val Asn Asp Leu Val Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Lys Glu Arg Asn
405 410 415
Glu Phe Lys Asn Ser Asn Ala Lys Gln Tyr Ile Arg Glu Ile Ser Asn
420 425 430
Ile Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala His Leu Glu Tyr Asp Asp His Ile
435 440 445
Ser Leu Ile Glu Ser Glu Glu Lys Ala Asp Glu Met Lys Lys Arg Leu
450 455 460
Asp Met Tyr Met Asn Met Tyr His Trp Ala Lys Ala Phe Ile Val Asp
465 470 475 480
Glu Val Leu Asp Arg Asp Glu Met Phe Tyr Ser Asp Ile Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Ile Val Pro Leu Tyr Asn Arg Val Arg Asn
500 505 510
Tyr Val Thr Gln Lys Pro Tyr Asn Ser Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe
515 520 525
Gln Ser Pro Thr Leu Ala Asn Gly Trp Ser Gln Ser Lys Glu Phe Asp
530 535 540
Asn Asn Ala Ile Ile Leu Ile Arg Asp Asn Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile
545 550 555 560
Phe Asn Ala Lys Asn Lys Pro Asp Lys Lys Ile Ile Gln Gly Asn Ser
565 570 575
Asp Lys Lys Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Lys Met Val Tyr Asn Leu Leu
580 585 590
Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly
595 600 605
Ile Glu Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Gly Tyr Asn Ala
610 615 620
His Lys His Ile Lys Thr Ser Glu Asn Phe Asp Ile Ser Phe Cys Arg
625 630 635 640
Asp Leu Ile Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Ile Glu Lys His Ala Glu Trp
645 650 655
Arg Lys Tyr Glu Phe Lys Phe Ser Ala Thr Asp Ser Tyr Ser Asp Ile
660 665 670
Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Met Gln Gly Tyr Arg Ile Asp Trp
675 680 685
Thr Tyr Ile Ser Glu Ala Asp Ile Asn Lys Leu Asp Glu Glu Gly Lys
690 695 700
Ile Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Glu Asn Ser Thr
705 710 715 720
Gly Lys Glu Asn Leu His Thr Met Tyr Phe Lys Asn Ile Phe Ser Glu
725 730 735
Glu Asn Leu Asp Lys Ile Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe
740 745 750
Tyr Arg Arg Ala Ser Val Lys Asn Pro Val Lys His Lys Lys Asp Ser
755 760 765
Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Lys Asn Gln Leu Asp Asn Gly Asp Val
770 775 780
Val Arg Ile Pro Ile Pro Asp Asp Ile Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys Met
785 790 795 800
Tyr Asn Gly Tyr Ile Lys Glu Ser Asp Leu Ser Glu Ala Ala Lys Glu
805 810 815
Tyr Leu Asp Lys Val Glu Val Arg Thr Ala Gln Lys Asp Ile Val Lys
820 825 830
Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Asp Lys Tyr Phe Ile His Thr Pro Ile Thr
835 840 845
Ile Asn Tyr Lys Val Thr Ala Arg Asn Asn Val Asn Asp Met Val Val
850 855 860
Lys Tyr Ile Ala Gln Asn Asp Asp Ile His Val Ile Gly Ile Asp Arg
865 870 875 880
Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Ser Val Ile Asp Ser His Gly Asn
885 890 895
Ile Val Lys Gln Lys Ser Tyr Asn Ile Leu Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys
900 905 910
Lys Lys Leu Val Glu Lys Glu Lys Thr Arg Glu Tyr Ala Arg Lys Asn
915 920 925
Trp Lys Ser Ile Gly Asn Ile Lys Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Ser
930 935 940
Gly Val Val His Glu Ile Ala Met Leu Ile Val Glu Tyr Asn Ala Ile
945 950 955 960
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Leu Gln Leu Thr Asn Asn Phe Thr Asp Leu Lys Ser Ile Gly Lys
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Phe Ala Gln Asn Arg
1370
<210> 12
<211> 1352
<212> PRT
<213> Parcubacteria bacterium
<400> 12
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<213> Porphyromonas crevioricanis
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<211> 1324
<212> PRT
<213> Prevotella disiens
<400> 14
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Asn Ile Val Glu Gln Asp Ser Leu Asn Ile Ile Arg Asn Asn Asp Leu
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Glu Thr Asp Tyr His Asp Leu Leu Asp Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys
980 985 990
Ala Asn Arg Gln Asn Trp Glu Ala Val Glu Gly Ile Lys Asp Leu Lys
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Lys Gly Tyr Leu Ser Gln Ala Val His Gln Ile Ala Gln Leu Met
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Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala Leu Glu Asp Leu Gly Gln Met
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Phe Val Thr Arg Gly Gln Lys Ile Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln
1040 1045 1050
Phe Glu Lys Ser Leu Val Asp Lys Leu Ser Tyr Leu Val Asp Lys
1055 1060 1065
Lys Arg Pro Tyr Asn Glu Leu Gly Gly Ile Leu Lys Ala Tyr Gln
1070 1075 1080
Leu Ala Ser Ser Ile Thr Lys Asn Asn Ser Asp Lys Gln Asn Gly
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Lys
<210> 15
<211> 1484
<212> PRT
<213> Peregrinibacteria bacterium
<220>
<221> misc_feature
<222> (1073)..(1073)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 15
Met Ser Asn Phe Phe Lys Asn Phe Thr Asn Leu Tyr Glu Leu Ser Lys
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945 950 955 960
Lys Asn Gly Thr Trp Ile Ile Lys Asn Tyr Arg Phe Ser Lys Glu Lys
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<213> Porphyromonas macacae
<400> 16
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340 345 350
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595 600 605
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Asn Lys Lys Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Asp Phe Tyr Lys Glu Ala Leu
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Gln Tyr Arg Asn Ile Gly Glu Phe Phe Asp Glu Val Arg Glu Gln Ala
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Ile Lys Arg Gly Asp His Glu Ser Ile His Arg Ile Gly Arg Ala
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<211> 1250
<212> PRT
<213> Smithella sp.
<400> 17
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Met Lys Lys Glu Ala Pro Glu Leu Leu Ser Pro Phe Asn Gln Thr Leu
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595 600 605
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Lys Val Phe Phe Ser Gln Ser Arg Ile Gln Glu Phe Thr Pro Ser Ala
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645 650 655
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660 665 670
Ile Asn Lys His Glu Asp Trp Lys Asn Phe Asp Phe Arg Phe Ser Ala
675 680 685
Thr Ser Thr Tyr Ala Asp Leu Ser Gly Phe Tyr His Glu Val Glu His
690 695 700
Gln Gly Tyr Lys Ile Ser Phe Gln Ser Val Ala Asp Ser Phe Ile Asp
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Asp Phe Ser Pro Phe Ser Lys Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr
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Trp Lys Met Leu Phe Asp Glu Asn Asn Leu Lys Asp Val Val Tyr Lys
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Leu Asn Gly Glu Ala Glu Val Phe Tyr Arg Lys Lys Ser Ile Ala Glu
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atcgcgctca agggccagtt acttctgaac caccttaagg agtctaaaga tttgaaactc 3900
cagaacggga tctcgaacca ggactggctg gcctacatcc aagagttgcg gaacggcagc 3960
aagaagcggc ggattaagca agattag 3987
<210> 21
<211> 1592
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 21
actgttaata atttttaaac gtcagcgcac taaaaaaacg aaaagacgga cacgtgaaaa 60
taaaaaacac acactagttt atgacgcaat actattttac ttatgatttg ggtacattag 120
acaaaaccgt gaaagagatg tatcagctat gaaacctgta tacttcaata cagagactta 180
ctcatatcgg atacgtacgc acgaagtatc atattaatta ttttaatttt taataaatat 240
tttatcggat acttatgtga tactctacat atacacaagg atatttctaa gatactttat 300
agatacgtat cctagaaaaa catgaagagt aaaaaagtga gacaatgttg taaaaattca 360
ttataaatgt atatgattca attttagata tgcatcagta taattgattc tcgatgaaac 420
acttaaaatt atatttcttg tggaagaacg tagcgagaga ggtgattcag ttagacaaca 480
ttaaataaaa ttaatgttaa gttcttttaa tgatgtttct ctcaatatca catcatatga 540
aaatgtaata tgatttataa gaaaattttt aaaaaattta ttttaataat cacatgtact 600
attttttaaa aattgtatct tttataataa tacaataata aagagtaatc agtgttaatt 660
tttcttcaaa tataagtttt attataaatc attgttaacg tatcataagt cattaccgta 720
tcgtatctta attttttttt aaaaaccgct aattcacgta cccgtattgt attgtacccg 780
cacctgtatc acaatcgatc ttagttagaa gaattgtctc gaggcggtgc aagacagcat 840
ataatagacg tggactctct tataccaaac gttgtcgtat cacaaagggt taggtaacaa 900
gtcacagttt gtccacgtgt cacgttttaa ttggaagagg tgccgttggc gtaatataac 960
agccaatcga tttttgctat aaaagcaaat caggtaaact aaacttcttc attcttttct 1020
tccccatcgc tacaaaaccg gttcctttgg aaaagagatt cattcaaacc tagcacccaa 1080
ttccgtttca aggtataatc tactttctat tcttcgatta ttttattatt attagctact 1140
atcgtttaat cgatcttttc ttttgatccg tcaaatttaa attcaattag ggttttgttc 1200
ttttctttca tctgattgaa atccttctga attgaaccgt ttacttgatt ttactgttta 1260
ttgtatgatt taatcctttg tttttcaaag acagtcttta gattgtgatt aggggttcat 1320
ataaattttt agatttggat ttttgtattg tatgattcaa aaaatacgtc ctttaattag 1380
attagtacat ggatattttt tacccgattt attgattgtc agggagaatt tgatgagcaa 1440
gtttttttga tgtctgttgt aaattgaatt gattataatt gctgatctgc tgcttccagt 1500
tttcataacc catattcttt taaccttgtt gtacacacaa tgaaaaattg gtgattgatt 1560
catttgtttt tctttgtttt ggattataca gg 1592
<210> 22
<211> 2000
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 22
gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60
tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120
ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180
tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240
ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360
ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420
ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480
aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540
tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720
gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780
accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900
acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960
ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020
ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080
atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140
caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200
gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260
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ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560
acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620
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ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860
ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920
agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980
ctgttgtttg gtgatacttc 2000
<210> 23
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GCN4 sequence
<400> 23
Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg
1 5 10 15
Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly
20
<210> 24
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 10-mer GCN4 sequence
<400> 24
Glu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
50 55 60
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
65 70 75 80
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
100 105 110
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
115 120 125
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
145 150 155 160
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
165 170 175
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
195 200 205
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
210 215 220
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly
<210> 25
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ScFv antibody
<400> 25
Met Gly Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
20 25 30
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Leu Phe Lys Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu
85 90 95
Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp
180 185 190
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Lys Asp Asn Gly
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Asp Asp Thr
210 215 220
Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser
275
<210> 26
<211> 66
<212> DNA
<213> Saccharomyces bayanus
<400> 26
ttcttgtcgt acttatagat cgctacgtta tttcaatttt gaaaatctga gtcctgggag 60
tgcgga 66
<210> 27
<211> 605
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met
35 40 45
Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile
50 55 60
Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg
65 70 75 80
Asp Leu Leu Ala Trp Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser Val
85 90 95
Asn Phe Lys Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly Ala Lys
100 105 110
Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln Lys Arg
115 120 125
Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Val
130 135 140
Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys Met Ser
145 150 155 160
His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His Gly Asn
165 170 175
Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp Leu Arg
180 185 190
Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu His Leu Lys Lys Pro Gly Gly Phe
195 200 205
Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu
210 215 220
Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu Asp Leu Leu
225 230 235 240
Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu Ser Arg Leu
245 250 255
Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly Ile Tyr Asn
260 265 270
Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu Tyr Arg Glu
275 280 285
Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn Thr Ser Thr
290 295 300
Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Leu Lys Arg
325 330 335
Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro Leu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val Tyr Pro Glu
355 360 365
Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala Leu Leu Ile
370 375 380
Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr Thr Pro Arg
385 390 395 400
Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln Glu Glu Glu
405 410 415
Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe Gln Leu Val
420 425 430
Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe Thr Glu Lys
435 440 445
Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala Ile Val Glu
450 455 460
Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn Pro Val Leu
465 470 475 480
Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Met Glu
485 490 495
Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu Ala Met Asn
500 505 510
Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu Val Tyr Pro
515 520 525
Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys His Asp Asn
530 535 540
Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser Glu Glu Glu
545 550 555 560
Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe Thr Val Pro
565 570 575
Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Lys
580 585 590
Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln Asp
595 600 605
<210> 28
<211> 482
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polypeptide
<400> 28
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Trp Leu Cys Met Asp Val Gly
1 5 10 15
Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala Glu
35 40 45
Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr Asp
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His Arg
65 70 75 80
His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Lys
85 90 95
Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile Val
100 105 110
Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu Lys
115 120 125
Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser
130 135 140
Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser Glu
145 150 155 160
Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn Leu
165 170 175
Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val Lys
180 185 190
Lys Thr Thr Trp Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp Ile Gln Lys
195 200 205
Glu Thr Val Tyr Cys Leu Asn Asp Asp Asp Glu Thr Glu Val Leu Lys
210 215 220
Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile Val Pro Phe
225 230 235 240
Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Lys Cys
245 250 255
Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln Arg Arg Phe
260 265 270
Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg Asp Asp Glu
275 280 285
Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu Asp Asp Leu
290 295 300
Asp Ile Trp Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg Ala Asn Pro
305 310 315 320
Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr Glu Cys Leu
325 330 335
Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln Tyr Met Phe
340 345 350
Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu Ala Gln Leu
355 360 365
Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala Lys Lys Asp
370 375 380
Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr Lys Ile Pro
385 390 395 400
Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His Arg Ala Leu
405 410 415
His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile Trp Asn Met
420 425 430
Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile Pro Leu Ser
435 440 445
Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys Lys Asp Gln
450 455 460
Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp Gly Pro Thr
465 470 475 480
Ala Lys
<210> 29
<211> 10
<212> DNA
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum
<400> 29
aatttttgga 10
<210> 30
<211> 83
<212> PRT
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum
<400> 30
Gly Ser Val Ile Asp Val Ser Ser Gln Arg Val Asn Val Gln Arg Pro
1 5 10 15
Leu Asp Ala Leu Gly Asn Ser Leu Asn Ser Pro Val Ile Ile Lys Leu
20 25 30
Lys Gly Asp Arg Glu Phe Arg Gly Val Leu Lys Ser Phe Asp Leu His
35 40 45
Met Asn Leu Val Leu Asn Asp Ala Glu Glu Leu Glu Asp Gly Glu Val
50 55 60
Thr Arg Arg Leu Gly Thr Val Leu Ile Arg Gly Asp Asn Ile Val Tyr
65 70 75 80
Ile Ser Pro
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> Bacteriophage MS2
<400> 31
gcgcacatga ggatcaccca tgtgc 25
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> Bacteriophage MS2
<400> 32
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro
65 70 75 80
Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln
85 90 95
Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn
100 105 110
Ser Gly Ile Tyr
115
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> Bacteriophage PP7
<400> 33
ataaggagtt tatatggaaa ccctta 26
<210> 34
<211> 127
<212> PRT
<213> Bacteriophage PP7
<400> 34
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
20 25 30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
50 55 60
Trp Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg Tyr
65 70 75 80
Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr Glu
85 90 95
Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala Thr
100 105 110
Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
115 120 125
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Shigella phage
<400> 35
ctgaatgcct gcgagcatc 19
<210> 36
<211> 62
<212> PRT
<213> Shigella phage
<400> 36
Met Lys Ser Ile Arg Cys Lys Asn Cys Asn Lys Leu Leu Phe Lys Ala
1 5 10 15
Asp Ser Phe Asp His Ile Glu Ile Arg Cys Pro Arg Cys Lys Arg His
20 25 30
Ile Ile Met Leu Asn Ala Cys Glu His Pro Thr Glu Lys His Cys Gly
35 40 45
Lys Arg Glu Lys Ile Thr His Ser Asp Glu Thr Val Arg Tyr
50 55 60
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Spacer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> wherein n is A, C, T or G
<400> 37
nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Target strand
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> wherein n is A, C, T or G
<400> 38
aaannnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Non-target strand
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> wherein n is A, C, T or G
<400> 39
tttnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Porcine circovirus
<400> 40
aagtattacc agaaa 15
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Duck circovirus
<400> 41
aagtattacc agaaa 15
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> Fava bean necrosis yellows virus
<400> 42
aagtattacc agaaa 15
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Streptococcus agalactiae
<400> 43
tgcttccgta ctacgacccc cca 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> Fructobacillus tropaeoli
<400> 44
tgcttccgta ctacgacccc cca 23
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 45
tttgcgtggg gtgtggtgct tt 22
<210> 46
<211> 38
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 46
ccagtttctc gaagagaaac cggtaagtgc accctccc 38
<210> 47
<211> 45
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 47
acgcgaacgg aacgttcgca taagtgcgcc cttacgggat ttaac 45
<210> 48
<211> 2286
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Met Ser Leu Arg Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ala Asp Pro Gly Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ser Arg Asp Asp Gly Ala Thr Ser Ser Val Ser Ala Leu
20 25 30
Lys Arg Leu Glu Arg Ser Gln Trp Thr Asp Lys Met Asp Leu Arg Phe
35 40 45
Gly Phe Glu Arg Leu Lys Glu Pro Gly Glu Lys Thr Gly Trp Leu Ile
50 55 60
Asn Met His Pro Thr Glu Ile Leu Asp Glu Asp Lys Arg Leu Gly Ser
65 70 75 80
Ala Val Asp Tyr Tyr Phe Ile Gln Asp Asp Gly Ser Arg Phe Lys Val
85 90 95
Ala Leu Pro Tyr Lys Pro Tyr Phe Tyr Ile Ala Thr Arg Lys Gly Cys
100 105 110
Glu Arg Glu Val Ser Ser Phe Leu Ser Lys Lys Phe Gln Gly Lys Ile
115 120 125
Ala Lys Val Glu Thr Val Pro Lys Glu Asp Leu Asp Leu Pro Asn His
130 135 140
Leu Val Gly Leu Lys Arg Asn Tyr Ile Arg Leu Ser Phe His Thr Val
145 150 155 160
Glu Asp Leu Val Lys Val Arg Lys Glu Ile Ser Pro Ala Val Lys Lys
165 170 175
Asn Arg Glu Gln Asp His Ala Ser Asp Ala Tyr Thr Ala Leu Leu Ser
180 185 190
Ser Val Leu Gln Arg Gly Gly Val Ile Thr Asp Glu Glu Glu Thr Ser
195 200 205
Lys Lys Ile Ala Asp Gln Leu Asp Asn Ile Val Asp Met Arg Glu Tyr
210 215 220
Asp Val Pro Tyr His Ile Arg Leu Ser Ile Asp Leu Lys Ile His Val
225 230 235 240
Ala His Trp Tyr Asn Val Arg Tyr Arg Gly Asn Ala Phe Pro Val Glu
245 250 255
Ile Thr Arg Arg Asp Asp Leu Val Glu Arg Pro Asp Pro Val Val Leu
260 265 270
Ala Phe Asp Ile Glu Thr Thr Lys Leu Pro Leu Lys Phe Pro Asp Ala
275 280 285
Glu Thr Asp Gln Ile Met Met Ile Ser Tyr Met Ile Asp Gly Gln Gly
290 295 300
Tyr Leu Ile Thr Asn Arg Glu Ile Val Ser Glu Asp Ile Glu Asp Phe
305 310 315 320
Glu Phe Thr Pro Lys Pro Glu Tyr Glu Gly Pro Phe Cys Val Phe Asn
325 330 335
Glu Pro Asp Glu Ala His Leu Ile Gln Arg Trp Phe Glu His Val Gln
340 345 350
Glu Thr Lys Pro Thr Ile Met Val Thr Tyr Asn Gly Asp Phe Phe Asp
355 360 365
Trp Pro Phe Val Glu Ala Arg Ala Ala Val His Gly Leu Ser Met Gln
370 375 380
Gln Glu Ile Gly Phe Gln Lys Asp Ser Gln Gly Glu Tyr Lys Ala Pro
385 390 395 400
Gln Cys Ile His Met Asp Cys Leu Arg Trp Val Lys Arg Asp Ser Tyr
405 410 415
Leu Pro Val Gly Ser His Asn Leu Lys Ala Ala Ala Lys Ala Lys Leu
420 425 430
Gly Tyr Asp Pro Val Glu Leu Asp Pro Glu Asp Met Cys Arg Met Ala
435 440 445
Thr Glu Gln Pro Gln Thr Leu Ala Thr Tyr Ser Val Ser Asp Ala Val
450 455 460
Ala Thr Tyr Tyr Leu Tyr Met Lys Tyr Val His Pro Phe Ile Phe Ala
465 470 475 480
Leu Cys Thr Ile Ile Pro Met Glu Pro Asp Glu Val Leu Arg Lys Gly
485 490 495
Ser Gly Thr Leu Cys Glu Ala Leu Leu Met Val Gln Ala Phe His Ala
500 505 510
Asn Ile Ile Phe Pro Asn Lys Gln Glu Gln Glu Phe Asn Lys Leu Thr
515 520 525
Asp Asp Gly His Val Leu Asp Ser Glu Thr Tyr Val Gly Gly His Val
530 535 540
Glu Ala Leu Glu Ser Gly Val Phe Arg Ser Asp Ile Pro Cys Arg Phe
545 550 555 560
Arg Met Asn Pro Ala Ala Phe Asp Phe Leu Leu Gln Arg Val Glu Lys
565 570 575
Thr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Glu Glu Lys Val Pro Val Glu Gln
580 585 590
Val Thr Asn Phe Glu Glu Val Cys Asp Glu Ile Lys Ser Lys Leu Ala
595 600 605
Ser Leu Lys Asp Val Pro Ser Arg Ile Glu Cys Pro Leu Ile Tyr His
610 615 620
Leu Asp Val Gly Ala Met Tyr Pro Asn Ile Ile Leu Thr Asn Arg Leu
625 630 635 640
Gln Pro Ser Ala Met Val Asp Glu Ala Thr Cys Ala Ala Cys Asp Phe
645 650 655
Asn Lys Pro Gly Ala Asn Cys Gln Arg Lys Met Ala Trp Gln Trp Arg
660 665 670
Gly Glu Phe Met Pro Ala Ser Arg Ser Glu Tyr His Arg Ile Gln His
675 680 685
Gln Leu Glu Ser Glu Lys Phe Pro Pro Leu Phe Pro Glu Gly Pro Ala
690 695 700
Arg Ala Phe His Glu Leu Ser Arg Glu Glu Gln Ala Lys Tyr Glu Lys
705 710 715 720
Arg Arg Leu Ala Asp Tyr Cys Arg Lys Ala Tyr Lys Lys Ile His Ile
725 730 735
Thr Lys Val Glu Glu Arg Leu Thr Thr Ile Cys Gln Arg Glu Asn Ser
740 745 750
Phe Tyr Val Asp Thr Val Arg Ala Phe Arg Asp Arg Arg Tyr Glu Phe
755 760 765
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770 775 780
Val Gly Asp Ala Ala Glu Val Lys Arg Cys Lys Asn Met Glu Val Leu
785 790 795 800
Tyr Asp Ser Leu Gln Leu Ala His Lys Cys Ile Leu Asn Ser Phe Tyr
805 810 815
Gly Tyr Val Met Arg Lys Gly Ala Arg Trp Tyr Ser Met Glu Met Ala
820 825 830
Gly Ile Val Cys Phe Thr Gly Ala Asn Ile Ile Thr Gln Ala Arg Glu
835 840 845
Leu Ile Glu Gln Ile Gly Arg Pro Leu Glu Leu Asp Thr Asp Gly Ile
850 855 860
Trp Cys Val Leu Pro Asn Ser Phe Pro Glu Asn Phe Val Phe Lys Thr
865 870 875 880
Thr Asn Val Lys Lys Pro Lys Val Thr Ile Ser Tyr Pro Gly Ala Met
885 890 895
Leu Asn Ile Met Val Lys Glu Gly Phe Thr Asn Asp Gln Tyr Gln Glu
900 905 910
Leu Ala Glu Pro Ser Ser Leu Thr Tyr Val Thr Arg Ser Glu Asn Ser
915 920 925
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930 935 940
Ser Lys Glu Glu Gly Lys Lys Leu Lys Lys Arg Tyr Ala Val Phe Asn
945 950 955 960
Glu Asp Gly Ser Leu Ala Glu Leu Lys Gly Phe Glu Val Lys Arg Arg
965 970 975
Gly Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ile Phe Gln Ser Ser Val Phe Glu Ala
980 985 990
Phe Leu Lys Gly Ser Thr Leu Glu Glu Val Tyr Gly Ser Val Ala Lys
995 1000 1005
Val Ala Asp Tyr Trp Leu Asp Val Leu Tyr Ser Lys Ala Ala Asn
1010 1015 1020
Met Pro Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Ile Ser Glu Asn Arg Ser
1025 1030 1035
Met Ser Arg Lys Leu Glu Asp Tyr Gly Glu Gln Lys Ser Thr Ser
1040 1045 1050
Ile Ser Thr Ala Lys Arg Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gln Met
1055 1060 1065
Val Lys Asp Ala Gly Leu Ser Cys Arg Tyr Ile Ile Ser Arg Lys
1070 1075 1080
Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Glu Arg Ala Ile Pro Leu Ala Ile
1085 1090 1095
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Leu Lys Ser Ser Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ile Arg Ala Ile Leu
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Asp Trp Asp Tyr Tyr Ile Glu Arg Leu Gly Ser Ala Ile Gln Lys
1130 1135 1140
Ile Ile Thr Ile Pro Ala Ala Leu Gln Gln Val Lys Asn Pro Val
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Pro Arg Val Lys His Pro Asp Trp Leu His Lys Lys Leu Leu Glu
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1190 1195 1200
Ser Pro Arg Pro Ser Ala Pro Asp Met Glu Asp Phe Gly Leu Val
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Lys Leu Pro His Pro Ala Ala Pro Val Thr Val Lys Arg Lys Arg
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Val Leu Trp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Gln Asp Leu Thr Pro Thr
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Val Pro Trp Gln Glu Ile Leu Gly Gln Pro Pro Ala Leu Gly Thr
1250 1255 1260
Ser Gln Glu Glu Trp Leu Val Trp Leu Arg Phe His Lys Lys Lys
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Arg Leu Glu Ser Ala Glu Gly Val Leu Arg Pro Gly Ala Ile Arg
1295 1300 1305
Asp Gly Pro Ala Thr Gly Leu Gly Ser Phe Leu Arg Arg Thr Ala
1310 1315 1320
Arg Ser Ile Leu Asp Leu Pro Trp Gln Ile Val Gln Ile Ser Glu
1325 1330 1335
Thr Ser Gln Ala Gly Leu Phe Arg Leu Trp Ala Leu Val Gly Ser
1340 1345 1350
Asp Leu His Cys Ile Arg Leu Ser Ile Pro Arg Val Phe Tyr Val
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Ile Asn Ala Glu Leu Ser Ala Pro Asp Ile Glu Gly Val Tyr Glu
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Thr Gln Val Pro Leu Leu Phe Arg Ala Leu Val His Leu Gly Cys
1430 1435 1440
Val Cys Val Val Asn Lys Gln Leu Val Arg His Leu Ser Gly Trp
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Ile Pro Ser Gln Arg Arg Ala Ser Val Phe Val Leu Asp Thr Val
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His Gly Leu Leu Leu Glu Lys Val Gly Pro Glu Leu Leu Pro Pro
1535 1540 1545
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1550 1555 1560
Ile Cys Arg Ala Ile Gln Arg Phe Leu Leu Ala Tyr Lys Glu Glu
1565 1570 1575
Arg Arg Gly Pro Thr Leu Ile Ala Val Gln Ser Ser Trp Glu Leu
1580 1585 1590
Lys Arg Leu Ala Ser Glu Ile Pro Val Leu Glu Glu Phe Pro Leu
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Leu Asp Thr Cys Leu Ser Gln Ala Phe Glu Met Ser Arg Tyr Phe
1640 1645 1650
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1655 1660 1665
Ser Asp Leu Phe Phe Ala Arg His Leu Gln Arg His Asn His Leu
1670 1675 1680
Leu Trp Leu Ser Pro Thr Ala Arg Pro Asp Leu Gly Gly Lys Glu
1685 1690 1695
Ala Asp Asp Asn Cys Leu Val Met Glu Phe Asp Asp Gln Ala Thr
1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Leu Asp Leu Gln Asn Leu Ala Val Asn Thr Ile Leu Gln Ser His
1730 1735 1740
His Val Asn Asp Met Glu Gly Ala Asp Ser Met Gly Ile Ser Phe
1745 1750 1755
Asp Val Ile Gln Gln Ala Ser Leu Glu Asp Met Ile Thr Gly Gly
1760 1765 1770
Gln Ala Ala Ser Ala Pro Ala Ser Tyr Asp Glu Thr Ala Leu Cys
1775 1780 1785
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1790 1795 1800
Lys Glu Ile Thr Gln Tyr His Asn Ile Tyr Ala Asp Asn Gln Val
1805 1810 1815
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Asp Pro Ala Leu His Arg Thr Leu His Asn Met Met Lys Lys Leu
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1850 1855 1860
Ile Tyr Ala Asn Phe Asn Arg Ile Ile Leu Cys Thr Lys Lys Arg
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1880 1885 1890
Ile His Ser Lys Glu Thr Phe His Ser Leu Thr Ile Ser Phe Ser
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Arg Cys Trp Glu Phe Leu Leu Trp Met Asp Pro Ser Asn Tyr Gly
1910 1915 1920
Gly Ile Lys Gly Lys Val Ser Ser Arg Ile His Cys Gly Leu Gln
1925 1930 1935
Asp Ser Gln Lys Ala Gly Gly Ala Glu Asp Glu Gln Glu Asn Glu
1940 1945 1950
Asp Asp Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu
1955 1960 1965
Glu Ser Asn Val Glu Asp Leu Leu Glu Asn Asn Trp Asn Ile Leu
1970 1975 1980
Gln Phe Leu Pro Gln Ala Ala Ser Cys Gln Asn Tyr Phe Leu Met
1985 1990 1995
Ile Val Ser Ala Tyr Ile Val Ala Val Tyr His Cys Met Lys Asp
2000 2005 2010
Gly Leu Arg Arg Ser Ala Pro Gly Ser Thr Pro Val Arg Arg Arg
2015 2020 2025
Gly Ala Ser Gln Leu Ser Gln Glu Ala Glu Gly Ala Val Gly Ala
2030 2035 2040
Leu Pro Gly Met Ile Thr Phe Ser Gln Asp Tyr Val Ala Asn Glu
2045 2050 2055
Leu Thr Gln Ser Phe Phe Thr Ile Thr Gln Lys Ile Gln Lys Lys
2060 2065 2070
Val Thr Gly Ser Arg Asn Ser Thr Glu Leu Ser Glu Met Phe Pro
2075 2080 2085
Val Leu Pro Gly Ser His Leu Leu Leu Asn Asn Pro Ala Leu Glu
2090 2095 2100
Phe Ile Lys Tyr Val Cys Lys Val Leu Ser Leu Asp Thr Asn Ile
2105 2110 2115
Thr Asn Gln Val Asn Lys Leu Asn Arg Asp Leu Leu Arg Leu Val
2120 2125 2130
Asp Val Gly Glu Phe Ser Glu Glu Ala Gln Phe Arg Asp Pro Cys
2135 2140 2145
Arg Ser Tyr Val Leu Pro Glu Val Ile Cys Arg Ser Cys Asn Phe
2150 2155 2160
Cys Arg Asp Leu Asp Leu Cys Lys Asp Ser Ser Phe Ser Glu Asp
2165 2170 2175
Gly Ala Val Leu Pro Gln Trp Leu Cys Ser Asn Cys Gln Ala Pro
2180 2185 2190
Tyr Asp Ser Ser Ala Ile Glu Met Thr Leu Val Glu Val Leu Gln
2195 2200 2205
Lys Lys Leu Met Ala Phe Thr Leu Gln Asp Leu Val Cys Leu Lys
2210 2215 2220
Cys Arg Gly Val Lys Glu Thr Ser Met Pro Val Tyr Cys Ser Cys
2225 2230 2235
Ala Gly Asp Phe Ala Leu Thr Ile His Thr Gln Val Phe Met Glu
2240 2245 2250
Gln Ile Gly Ile Phe Arg Asn Ile Ala Gln His Tyr Gly Met Ser
2255 2260 2265
Tyr Leu Leu Glu Thr Leu Glu Trp Leu Leu Gln Lys Asn Pro Gln
2270 2275 2280
Leu Gly His
2285
<210> 49
<211> 1462
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Met Ala Pro Val His Gly Asp Asp Ser Leu Ser Asp Ser Gly Ser Phe
1 5 10 15
Val Ser Ser Arg Ala Arg Arg Glu Lys Lys Ser Lys Lys Gly Arg Gln
20 25 30
Glu Ala Leu Glu Arg Leu Lys Lys Ala Lys Ala Gly Glu Lys Tyr Lys
35 40 45
Tyr Glu Val Glu Asp Phe Thr Gly Val Tyr Glu Glu Val Asp Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Ser Lys Leu Val Gln Ala Arg Gln Asp Asp Asp Trp Ile Val
65 70 75 80
Asp Asp Asp Gly Ile Gly Tyr Val Glu Asp Gly Arg Glu Ile Phe Asp
85 90 95
Asp Asp Leu Glu Asp Asp Ala Leu Asp Ala Asp Glu Lys Gly Lys Asp
100 105 110
Gly Lys Ala Arg Asn Lys Asp Lys Arg Asn Val Lys Lys Leu Ala Val
115 120 125
Thr Lys Pro Asn Asn Ile Lys Ser Met Phe Ile Ala Cys Ala Gly Lys
130 135 140
Lys Thr Ala Asp Lys Ala Val Asp Leu Ser Lys Asp Gly Leu Leu Gly
145 150 155 160
Asp Ile Leu Gln Asp Leu Asn Thr Glu Thr Pro Gln Ile Thr Pro Pro
165 170 175
Pro Val Met Ile Leu Lys Lys Lys Arg Ser Ile Gly Ala Ser Pro Asn
180 185 190
Pro Phe Ser Val His Thr Ala Thr Ala Val Pro Ser Gly Lys Ile Ala
195 200 205
Ser Pro Val Ser Arg Lys Glu Pro Pro Leu Thr Pro Val Pro Leu Lys
210 215 220
Arg Ala Glu Phe Ala Gly Asp Asp Val Gln Val Glu Ser Thr Glu Glu
225 230 235 240
Glu Gln Glu Ser Gly Ala Met Glu Phe Glu Asp Gly Asp Phe Asp Glu
245 250 255
Pro Met Glu Val Glu Glu Val Asp Leu Glu Pro Met Ala Ala Lys Ala
260 265 270
Trp Asp Lys Glu Ser Glu Pro Ala Glu Glu Val Lys Gln Glu Ala Asp
275 280 285
Ser Gly Lys Gly Thr Val Ser Tyr Leu Gly Ser Phe Leu Pro Asp Val
290 295 300
Ser Cys Trp Asp Ile Asp Gln Glu Gly Asp Ser Ser Phe Ser Val Gln
305 310 315 320
Glu Val Gln Val Asp Ser Ser His Leu Pro Leu Val Lys Gly Ala Asp
325 330 335
Glu Glu Gln Val Phe His Phe Tyr Trp Leu Asp Ala Tyr Glu Asp Gln
340 345 350
Tyr Asn Gln Pro Gly Val Val Phe Leu Phe Gly Lys Val Trp Ile Glu
355 360 365
Ser Ala Glu Thr His Val Ser Cys Cys Val Met Val Lys Asn Ile Glu
370 375 380
Arg Thr Leu Tyr Phe Leu Pro Arg Glu Met Lys Ile Asp Leu Asn Thr
385 390 395 400
Gly Lys Glu Thr Gly Thr Pro Ile Ser Met Lys Asp Val Tyr Glu Glu
405 410 415
Phe Asp Glu Lys Ile Ala Thr Lys Tyr Lys Ile Met Lys Phe Lys Ser
420 425 430
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435 440 445
Lys Ser Glu Tyr Leu Glu Val Lys Tyr Ser Ala Glu Met Pro Gln Leu
450 455 460
Pro Gln Asp Leu Lys Gly Glu Thr Phe Ser His Val Phe Gly Thr Asn
465 470 475 480
Thr Ser Ser Leu Glu Leu Phe Leu Met Asn Arg Lys Ile Lys Gly Pro
485 490 495
Cys Trp Leu Glu Val Lys Ser Pro Gln Leu Leu Asn Gln Pro Val Ser
500 505 510
Trp Cys Lys Val Glu Ala Met Ala Leu Lys Pro Asp Leu Val Asn Val
515 520 525
Ile Lys Asp Val Ser Pro Pro Pro Leu Val Val Met Ala Phe Ser Met
530 535 540
Lys Thr Met Gln Asn Ala Lys Asn His Gln Asn Glu Ile Ile Ala Met
545 550 555 560
Ala Ala Leu Val His His Ser Phe Ala Leu Asp Lys Ala Ala Pro Lys
565 570 575
Pro Pro Phe Gln Ser His Phe Cys Val Val Ser Lys Pro Lys Asp Cys
580 585 590
Ile Phe Pro Tyr Ala Phe Lys Glu Val Ile Glu Lys Lys Asn Val Lys
595 600 605
Val Glu Val Ala Ala Thr Glu Arg Thr Leu Leu Gly Phe Phe Leu Ala
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Lys Val His Lys Ile Asp Pro Asp Ile Ile Val Gly His Asn Ile Tyr
625 630 635 640
Gly Phe Glu Leu Glu Val Leu Leu Gln Arg Ile Asn Val Cys Lys Ala
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Pro His Trp Ser Lys Ile Gly Arg Leu Lys Arg Ser Asn Met Pro Lys
660 665 670
Leu Gly Gly Arg Ser Gly Phe Gly Glu Arg Asn Ala Thr Cys Gly Arg
675 680 685
Met Ile Cys Asp Val Glu Ile Ser Ala Lys Glu Leu Ile Arg Cys Lys
690 695 700
Ser Tyr His Leu Ser Glu Leu Val Gln Gln Ile Leu Lys Thr Glu Arg
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Gly Asp Glu Asp Glu Glu Ile Asp Gly Asp Thr Asn Lys Tyr Lys Lys
820 825 830
Gly Arg Lys Lys Ala Ala Tyr Ala Gly Gly Leu Val Leu Asp Pro Lys
835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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1085 1090 1095
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1310 1315 1320
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1340 1345 1350
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1355 1360 1365
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1370 1375 1380
Ser Asp Lys Ser Leu Tyr Thr Gln Leu Cys Phe Tyr Arg Tyr Ile
1385 1390 1395
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1400 1405 1410
Lys Asp Lys Leu Lys Lys Gln Phe Phe Thr Pro Lys Val Leu Gln
1415 1420 1425
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Ala Val Lys Ser
1460
<210> 50
<211> 335
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Ser Lys Arg Lys Ala Pro Gln Glu Thr Leu Asn Gly Gly Ile Thr
1 5 10 15
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65 70 75 80
Lys Leu Arg Lys Leu Glu Lys Ile Arg Gln Asp Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95
Ile Asn Phe Leu Thr Arg Val Ser Gly Ile Gly Pro Ser Ala Ala Arg
100 105 110
Lys Phe Val Asp Glu Gly Ile Lys Thr Leu Glu Asp Leu Arg Lys Asn
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Glu Asp Lys Leu Asn His His Gln Arg Ile Gly Leu Lys Tyr Phe Gly
130 135 140
Asp Phe Glu Lys Arg Ile Pro Arg Glu Glu Met Leu Gln Met Gln Asp
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Ile Val Leu Asn Glu Val Lys Lys Val Asp Ser Glu Tyr Ile Ala Thr
165 170 175
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Val Leu Leu Thr His Pro Ser Phe Thr Ser Glu Ser Thr Lys Gln Pro
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210 215 220
Thr Asp Thr Leu Ser Lys Gly Glu Thr Lys Phe Met Gly Val Cys Gln
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Leu Pro Ser Lys Asn Asp Glu Lys Glu Tyr Pro His Arg Arg Ile Asp
245 250 255
Ile Arg Leu Ile Pro Lys Asp Gln Tyr Tyr Cys Gly Val Leu Tyr Phe
260 265 270
Thr Gly Ser Asp Ile Phe Asn Lys Asn Met Arg Ala His Ala Leu Glu
275 280 285
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<210> 51
<211> 1239
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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115 120 125
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165 170 175
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Arg Ala Leu Val Phe Asp Val Glu Val Cys Leu Ala Glu Gly Thr Cys
195 200 205
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210 215 220
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Pro Ala Asp Leu Ile Pro Leu Glu Val Pro Thr Gly Ala Ser Ser Pro
245 250 255
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Phe Asp Arg Ala His Ile Arg Glu Gln Tyr Leu Ile Gln Gly Ser Arg
275 280 285
Met Arg Phe Leu Asp Thr Met Ser Met His Met Ala Ile Ser Gly Leu
290 295 300
Ser Ser Phe Gln Arg Ser Leu Trp Ile Ala Ala Lys Gln Gly Lys His
305 310 315 320
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355 360 365
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<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 52
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755 760 765
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785 790 795 800
Ser Asp Lys His Ala Arg Asp Glu Ala Lys Lys Met Ile Val Leu Tyr
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820 825 830
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835 840 845
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Cys Ile Leu Pro Lys Ser Phe Pro Glu Thr Tyr Phe Phe Thr Leu Glu
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Asn Gly Lys Lys Leu Tyr Leu Ser Tyr Pro Cys Ser Met Leu Asn Tyr
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Ser Leu Ala Glu Leu Lys Gly Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Leu
980 985 990
Gln Leu Ile Lys Asn Phe Gln Ser Asp Ile Phe Lys Val Phe Leu Glu
995 1000 1005
Gly Asp Thr Leu Glu Gly Cys Tyr Ser Ala Val Ala Ser Val Cys
1010 1015 1020
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<210> 53
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<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 53
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340 345 350
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Leu Arg Gly Lys Ser Cys Asn Ser Ile Val Asp Cys Ile Ser Trp Leu
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435 440 445
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515 520 525
Ser Ala Gly Lys Glu Asp Glu Glu Lys Thr Thr Ser Ser Lys Ala Asp
530 535 540
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Leu Ser Glu Gly Leu Asn Gly Ala Glu Glu Ser Ser Lys Asn Leu Ser
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<210> 54
<211> 928
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 54
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180 185 190
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195 200 205
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420 425 430
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435 440 445
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Trp Pro Asp Leu Gln Lys His Lys Gly Pro Leu Asn Val Phe Glu Asn
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Leu Arg Leu Ala Glu Leu Glu Lys Lys Ala His Glu Ile Ala Gly Glu
565 570 575
Glu Phe Asn Leu Ser Ser Thr Lys Gln Leu Gln Thr Ile Leu Phe Glu
580 585 590
Lys Gln Gly Ile Lys Pro Leu Lys Lys Thr Pro Gly Gly Ala Pro Ser
595 600 605
Thr Ser Glu Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Leu Asp Tyr Pro Leu Pro
610 615 620
Lys Val Ile Leu Glu Tyr Arg Gly Leu Ala Lys Leu Lys Ser Thr Tyr
625 630 635 640
Thr Asp Lys Leu Pro Leu Met Ile Asn Pro Lys Thr Gly Arg Val His
645 650 655
Thr Ser Tyr His Gln Ala Val Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr
660 665 670
Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Asn Glu Glu Gly Arg Arg
675 680 685
Ile Arg Gln Ala Phe Ile Ala Pro Glu Asp Tyr Val Ile Val Ser Ala
690 695 700
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Met Ala His Leu Ser Arg Asp
705 710 715 720
Lys Gly Leu Leu Thr Ala Phe Ala Glu Gly Lys Asp Ile His Arg Ala
725 730 735
Thr Ala Ala Glu Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu Thr Val Thr Ser Glu
740 745 750
Gln Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly Met
755 760 765
Ser Ala Phe Gly Leu Ala Arg Gln Leu Asn Ile Pro Arg Lys Glu Ala
770 775 780
Gln Lys Tyr Met Asp Leu Tyr Phe Glu Arg Tyr Pro Gly Val Leu Glu
785 790 795 800
Tyr Met Glu Arg Thr Arg Ala Gln Ala Lys Glu Gln Gly Tyr Val Glu
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Thr Leu Asp Gly Arg Arg Leu Tyr Leu Pro Asp Ile Lys Ser Ser Asn
820 825 830
Gly Ala Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Ala Ala Ile Asn Ala Pro Met
835 840 845
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Arg Ala Met Ile Ala Val Asp
850 855 860
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865 870 875 880
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900 905 910
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<211> 783
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<213> Escherichia coli
<400> 55
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1 5 10 15
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20 25 30
Gln Val Thr Leu Ala Pro Gln Glu Ser Val Ala Phe Ile Pro Ala Asp
35 40 45
Gln Val Pro Arg Ala Gln His Ile Leu Gln Gly Glu Gln Gly Phe Arg
50 55 60
Leu Thr Pro Leu Ala Leu Lys Asp Phe His Arg Gln Pro Val Tyr Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Cys Arg Ala His Arg Gln Leu Met Asn Tyr Glu Lys Arg Leu
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg His Gly Glu Leu Tyr Cys Ile Gly Leu Glu Gly Cys Gly Gln Arg
165 170 175
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180 185 190
Phe Glu Leu Glu Tyr Val Ala Ser Arg Pro Gln Leu Leu Glu Lys Leu
195 200 205
Asn Ala Trp Phe Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Val Ile Ile Gly Trp Asn
210 215 220
Val Val Gln Phe Asp Leu Arg Met Leu Gln Lys His Ala Glu Arg Tyr
225 230 235 240
Arg Leu Pro Leu Arg Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Leu Glu Trp Arg
245 250 255
Glu His Gly Phe Lys Asn Gly Val Phe Phe Ala Gln Ala Lys Gly Arg
260 265 270
Leu Ile Ile Asp Gly Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Phe Trp Asn Phe
275 280 285
Ser Ser Phe Ser Leu Glu Thr Val Ala Gln Glu Leu Leu Gly Glu Gly
290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Tyr Val Ala Pro Asn Leu Gly Glu Val Pro Pro His Ala Ser Pro
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Ile Asp Pro Val Gly Leu Val Glu Gly Met Ala Gln Pro Asp Pro Glu
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Lys Arg Gln Gly Asn Lys Pro Leu Ser Gln Ala Leu Lys Ile Ile Met
485 490 495
Asn Ala Phe Tyr Gly Val Leu Gly Thr Thr Ala Cys Arg Phe Phe Asp
500 505 510
Pro Arg Leu Ala Ser Ser Ile Thr Met Arg Gly His Gln Ile Met Arg
515 520 525
Gln Thr Lys Ala Leu Ile Glu Ala Gln Gly Tyr Asp Val Ile Tyr Gly
530 535 540
Asp Thr Asp Ser Thr Phe Val Trp Leu Lys Gly Ala His Ser Glu Glu
545 550 555 560
Glu Ala Ala Lys Ile Gly Arg Ala Leu Val Gln His Val Asn Ala Trp
565 570 575
Trp Ala Glu Thr Leu Gln Lys Gln Arg Leu Thr Ser Ala Leu Glu Leu
580 585 590
Glu Tyr Glu Thr His Phe Cys Arg Phe Leu Met Pro Thr Ile Arg Gly
595 600 605
Ala Asp Thr Gly Ser Lys Lys Arg Tyr Ala Gly Leu Ile Gln Glu Gly
610 615 620
Asp Lys Gln Arg Met Val Phe Lys Gly Leu Glu Thr Val Arg Thr Asp
625 630 635 640
Trp Thr Pro Leu Ala Gln Gln Phe Gln Gln Glu Leu Tyr Leu Arg Ile
645 650 655
Phe Arg Asn Glu Pro Tyr Gln Glu Tyr Val Arg Glu Thr Ile Asp Lys
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Leu Met Ala Gly Glu Leu Asp Ala Arg Leu Val Tyr Arg Lys Arg Leu
675 680 685
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<213> Escherichia coli
<400> 56
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355 360 365
Leu Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ile Thr Asp Leu Asp Pro Leu Glu Phe
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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725 730 735
Asn Ala Glu Leu Ala Met Lys Ile Phe Asp Leu Val Glu Lys Phe Ala
740 745 750
Gly Tyr Gly Phe Asn Lys Ser His Ser Ala Ala Tyr Ala Leu Val Ser
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805 810 815
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820 825 830
Tyr Gly Ile Gly Ala Ile Lys Gly Val Gly Glu Gly Pro Ile Glu Ala
835 840 845
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850 855 860
Leu Cys Ala Arg Thr Asp Thr Lys Lys Leu Asn Arg Arg Val Leu Glu
865 870 875 880
Lys Leu Ile Met Ser Gly Ala Phe Asp Arg Leu Gly Pro His Arg Ala
885 890 895
Ala Leu Met Asn Ser Leu Gly Asp Ala Leu Lys Ala Ala Asp Gln His
900 905 910
Ala Lys Ala Glu Ala Ile Gly Gln Ala Asp Met Phe Gly Val Leu Ala
915 920 925
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980 985 990
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<213> Thermococcus guaymasensis
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
Lys Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala
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435 440 445
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450 455 460
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Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ile Arg Glu Ile
515 520 525
Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe
530 535 540
Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asn Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
545 550 555 560
Arg Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Ile Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp
660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
Arg Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe
705 710 715 720
Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln
725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Arg Lys
770 775
<210> 58
<211> 775
<212> PRT
<213> Pyrococcus furiosus
<400> 58
Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile
35 40 45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg
50 55 60
Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile
85 90 95
Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr
100 105 110
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115 120 125
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala
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405 410 415
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420 425 430
Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly
435 440 445
Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile
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Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu
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515 520 525
Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly
530 535 540
Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys
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Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys
580 585 590
Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly
595 600 605
Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln
610 615 620
Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala
625 630 635 640
Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile
645 650 655
Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His
660 665 670
Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala
675 680 685
Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val
690 695 700
Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu
705 710 715 720
Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn
725 730 735
Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg
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Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser
755 760 765
Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser
770 775
<210> 59
<211> 4101
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cas9
<400> 59
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aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggacgccatc 2520
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggtga c 4101
<210> 63
<211> 1761
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 63
atgacaaaaa catctaaact tgacgcactt agggctgcta cttcacgtga agacttggct 60
aaaattttag atattaagtt ggtattttta actaacgttc tatatagaat cggctcggat 120
aatcaataca ctcaatttac aataccgaag aaaggaaaag gggtaaggac tatttctgca 180
cctacagacc ggttgaagga catccaacga agaatatgtg acttactttc tgattgtaga 240
gatgagatct ttgctataag gaaaattagt aacaactatt cctttggttt tgagagggga 300
aaatcaataa tcctaaatgc ttataagcat agaggcaaac aaataatatt aaatatagat 360
cttaaggatt tttttgaaag ctttaatttt ggacgagtta gaggatattt tctttccaat 420
caggattttt tattaaatcc tgtggtggca acgacacttg caaaagctgc atgctataat 480
ggaaccctcc cccaaggaag tccatgttct cctattatct caaatctaat ttgcaatatt 540
atggatatga gattagctaa gctggctaaa aaatatggat gtacttatag cagatatgct 600
gatgatataa caatttctac aaataaaaat acatttccgt tagaaatggc tactgtgcaa 660
cctgaagggg ttgttttggg aaaagttttg gtaaaagaaa tagaaaactc tggattcgaa 720
ataaatgatt caaagactag gcttacgtat aagacatcaa ggcaagaagt aacgggactt 780
acagttaaca gaatcgttaa tattgataga tgttattata aaaaaactcg ggcgttggca 840
catgctttgt atcgtacagg tgaatataaa gtgccagatg aaaatggtgt tttagtttca 900
ggaggtctgg ataaacttga ggggatgttt ggttttattg atcaagttga taagtttaac 960
aatataaaga aaaaactgaa caagcaacct gatagatatg tattgactaa tgcgactttg 1020
catggtttta aattaaagtt gaatgcgcga gaaaaagcat atagtaaatt tatttactat 1080
aaattttttc atggcaacac ctgtcctacg ataattacag aagggaagac tgatcggata 1140
tatttgaagg ctgctttgca ttctttggag acatcatatc ctgagttgtt tagagaaaaa 1200
acagatagta aaaagaaaga aataaatctt aatatattta aatctaatga aaagaccaaa 1260
tattttttag atctttctgg gggaactgca gatctgaaaa aatttgtaga gcgttataaa 1320
aataattatg cttcttatta tggttctgtt ccaaaacagc cagtgattat ggttcttgat 1380
aatgatacag gtccaagcga tttacttaat tttctgcgca ataaagttaa aagctgccca 1440
gacgatgtaa ctgaaatgag aaagatgaaa tatattcatg ttttctataa tttatatata 1500
gttctcacac cattgagtcc ttccggcgaa caaacttcaa tggaggatct tttccctaaa 1560
gatattttag atatcaagat tgatggtaag aaattcaaca aaaataatga tggagactca 1620
aaaacggaat atgggaagca tattttttcc atgagggttg ttagagataa aaagcggaaa 1680
atagatttta aggcattttg ttgtattttt gatgctataa aagatataaa ggaacattat 1740
aaattaatgt taaatagcta a 1761
<210> 64
<211> 132
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 64
cacgcatgta ggcagatttg ttggttgtga atcgcaacca gtggccttaa tggcaggagg 60
aatcgcctcc ctaaaatcct tgattcagag ctatacggca ggtgtgctgt gcgaaggagt 120
gcctgcatgc gt 132
<210> 65
<211> 99
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 65
atgaaatcgc atgatcgatt gaggatcgtc tttgctcaga tccgccagaa ctggcggctt 60
ttgctcatgt tatgcatgtg catgaaaacc actgcataa 99
<210> 66
<211> 170
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 66
atgcgcaccc ttagcgagag gtttatcatt aaggtcaacc tctggatgtt gtttcggcat 60
cctgcattga atctgagtta ctgtctgttt tccttgttgg aacggagagc atcgcctgat 120
gctctccgag ccaaccagga aacccgtttt ttctgacgta agggtgcgca 170
<210> 67
<211> 960
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 67
atggatgcta cccggacaac ccttctggcg ctcgatttgt tcggctcgcc gggctggagc 60
gccgataaag aaatacagcg actgcatgcg ctcagtaatc atgccggacg ccattaccga 120
cgcattattc tttctaaacg ccacggtggt cagcggctgg tgttagcccc tgattacttg 180
ctcaaaaccg tacagcgcaa cattcttaag aacgtccttt cacaatttcc gctttcccct 240
tttgctacag cctaccgacc aggttgccca atcgtcagca acgcgcagcc acactgccaa 300
cagccgcaga tcctgaaact cgatatcgaa aactttttcg atagcattag ctggttacag 360
gtctggcgtg tgtttcgcca ggcccagttg ccacgtaatg tggtaaccat gctgacctgg 420
atttgttgtt ataacgacgc gttaccgcag ggggcaccaa cttcgccagc catttccaat 480
cttgtgatgc gccgttttga tgaacgcata ggggaatggt gtcaggctcg gggaattacc 540
tacacccgct actgcgatga catgaccttt tcaggtcact tcaatgcccg ccaggttaaa 600
aataaagtgt gcggattgtt agcggagctg ggcctgagcc tcaataaacg caaaggctgc 660
ctgatagctg cctgtaagcg ccagcaagta accgggattg ttgttaatca caagccacag 720
cttgcccgtg aagcgcgccg ggcgctgcgt caggaggtgc atttgtgcca aaaatatggc 780
gttatttcgc atcttagtca tcgtggtgaa cttgatcctt ctggcgatct ccacgcacag 840
gcaacggcgt atctttatgc tttgcaggga agaataaact ggttattgca aatcaaccct 900
gaggatgagg cctttcaaca ggcgagagag agtgtaaagc gaatgctggt tgcatggtaa 960
<210> 68
<211> 176
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 68
cgccagcagt ggcaatagcg tttccggcct tttgtgccgg gagggtcggc gagtcgctga 60
cttaacgcca gtagtatgtc catataccca aagtcgcttc attgtacctg agtacgcttc 120
gcgtacgtcg cgctgacgcg ctcagtacag ttacgcgcct tcgggatggt ttaatg 176
<210> 69
<211> 1458
<212> DNA
<213> Myxococcus xanthus
<400> 69
atgaccgcca ggctggaccc gttcgtcccc gcagcttcgc cgcaggccgt gcccacgccc 60
gagctcaccg ctccgtcgtc agacgcggcc gcgaagcgtg aagcccgccg gctcgcgcac 120
gaagcgttgc tcgtccgcgc gaaggccatc gacgaagcgg gcggcgccga cgactgggtg 180
caggcgcagc tcgtctccaa gggcctcgcg gtggaggacc tggacttctc cagcgcctcc 240
gagaaggaca agaaggcctg gaaggagaag aagaaggccg aggccaccga gcgccgcgcg 300
ctgaagcgtc aggcgcacga ggcgtggaag gccacgcacg tgggccacct gggcgcgggc 360
gtgcactggg cggaggaccg cctggccgac gcgttcgacg tgccccaccg cgaggagcgc 420
gcccgggcca acggcctgac ggagctggac tcggcggagg cgctggccaa ggcgctgggg 480
ctgagcgtgt ccaagctgcg ctggttcgcg ttccaccgcg aggtggacac ggccacgcac 540
tacgtgagct ggacgattcc gaagcgggac ggcagcaagc gcacgattac gtcccccaag 600
cctgagctga aggcagcgca gcgctgggtg ctgtccaacg tcgtggagcg gctgccggtg 660
cacggcgcgg cgcacggctt cgtggcggga cgctccatcc tcaccaacgc gctggcccac 720
cagggcgcgg acgtggtggt gaaggtggac ctcaaggact tcttcccctc cgtcacctgg 780
cgccgggtga agggcctgtt gcgcaagggc ggcctgcggg agggcacgtc cacgctgctg 840
tcgctgctct ccacggaagc gccgcgggag gcggtgcagt tccggggcaa gctgctgcac 900
gtggccaagg gcccgcgcgc gctgccccag ggcgcgccca cgtcgccggg catcaccaac 960
gcgctgtgcc tgaagctgga caagcggctg tccgcgctcg cgaagcggct gggcttcacg 1020
tacacgcgct acgcggacga cctgaccttc tcgtggacga aggcgaagca gcccaagccg 1080
cggcggacgc agcgtccccc ggtggcggtg ctgctgtctc gcgtgcagga agtggtggag 1140
gcggagggct tccgcgtgca cccggacaag acgcgcgtgg cgcgcaaggg cacgcggcag 1200
cgggtgacgg ggctggtcgt gaatgcggcg ggcaaggacg cgccggcggc ccgagtcccg 1260
cgcgacgtgg tgcgccagct ccgcgccgcc atccacaacc ggaagaaggg caagccgggc 1320
cgcgagggcg agtcgctgga gcagctcaag ggcatggccg ccttcatcca catgacggac 1380
ccggccaagg gccgcgcctt cctggctcag ctcacggagc tggagtccac ggcgagcgcg 1440
gctccgcagg cggagtga 1458
<210> 70
<211> 231
<212> DNA
<213> Myxococcus xanthus
<400> 70
agaggtccgg agtgcatcag cctgagcgcc tcgagcggcg gagcggcgtt gcgccgctcc 60
ggttggaatg caggacactc tccgcaaggt agcctgttct tggctctctc cctcctaggc 120
actacggcca gggtgggtag cggagccaac gacgcgaccg ccgtttaccc accccggccg 180
tagtgcctag gaggggagag ccggtgaggc taccgtgccc caggtaagat g 231
<210> 71
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Chimeric guide nucleic acid sequences (guide DNA)
<400> 71
cacgcatgta ggcagatttg ttggttgtga atcgcaacca gtggccttaa tggcaggagg 60
aatcgcctcc agagtcgccg tctccaaggt gaaagcggaa gtagggcctt cgcgcacctc 120
atggaatccc ttctgcagca cctagatcgc ttttctgaac tcctagcagt atctagcact 180
acctacgtca gcacctggga ccccgcggtg tgctgtgcga aggagtgcct gcatgcgtgg 240
aatcccttct gcagcaccgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 300
ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgc 334
<210> 72
<211> 361
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Chimeric guide nucleic acid sequences (guide DNA)
<400> 72
atgcgcaccc ttagcgagag gtttatcatt aaggtcaacc tctggatgtt gtttcggcat 60
cctgcattga atctgagtta ctgtctgttt tcctagagtc gccgtctcca aggtgaaagc 120
ggaagtaggg ccttcgcgca cctcatggaa tcccttctgc agcacctaga tcgcttttct 180
gaactcctag cagtatctag cactacctac gtcagcacct gggaccccgc caggaaaccc 240
gttttttctg acgtaagggt gcgcaggaat cccttctgca gcaccgtttt agagctagaa 300
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 360
c 361
<210> 73
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Chimeric guide nucleic acid sequences (guide DNA)
<400> 73
gccagcagtg gcaatagcgt ttccggcctt ttgtgccggg agggtcggcg agtcgctgac 60
ttaacgccag tagtatgtcc atatacccaa gagtcgccgt ctccaaggtg aaagcggaag 120
tagggccttc gcgcacctca tggaatccct tctgcagcac ctagatcgct tttctgaact 180
cctagcagta tctagcacta cctacgtcag cacctgggac cccgcgggat ggtttaatgg 240
tattgccgcg gaatcccttc tgcagcaccg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 300
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgc 345
<210> 74
<211> 364
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Chimeric guide nucleic acid sequences (guide DNA)
<400> 74
agaggtccgg agtgcatcag cctgagcgcc tcgagcggcg gagcggcgtt gcgccgctcc 60
ggttggaatg caggacactc tccgcaaggt agagtcgccg tctccaaggt gaaagcggaa 120
gtagggcctt cgcgcacctc atggaatccc ttctgcagca cctagatcgc ttttctgaac 180
tcctagcagt atctagcact acctacgtca gcacctggga ccccgctgag gctaccgtgc 240
cccaggtaag atggtggtgc tttcccgggg aatcccttct gcagcaccgt tttagagcta 300
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 360
gtgc 364
<210> 75
<211> 1244
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Cas12a RNP protein sequence
<400> 75
Met Gly Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile
20 25 30
Asp Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr
35 40 45
Lys Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn
50 55 60
Asp Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser
65 70 75 80
Leu Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu
85 90 95
Asn Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly
100 105 110
Asn Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser
130 135 140
Phe Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu
145 150 155 160
Asn Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys
165 170 175
Ile Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu
180 185 190
Lys Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu
195 200 205
Lys Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu
210 215 220
Phe Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala
225 230 235 240
Ile Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu
245 250 255
Asn Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro
260 265 270
Lys Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val
290 295 300
Phe Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys
305 310 315 320
Lys Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly
325 330 335
Ile Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile
340 345 350
Phe Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp
355 360 365
Asp Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp
370 375 380
Asp Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln
385 390 395 400
Leu Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys
405 410 415
Glu Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser
420 425 430
Ser Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys
435 440 445
Lys Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val
450 455 460
Lys Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu
465 470 475 480
Thr Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp
485 490 495
Ile Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val
500 505 510
Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn
515 520 525
Pro Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg
530 535 540
Ala Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp
545 550 555 560
Lys Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn
565 570 575
Gly Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys
580 585 590
Met Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn
595 600 605
Pro Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys
610 615 620
Gly Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe
625 630 635 640
Lys Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe
645 650 655
Asn Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg
660 665 670
Glu Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys
675 680 685
Lys Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln
690 695 700
Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu
705 710 715 720
His Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln
725 730 735
Ile Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu
740 745 750
Lys Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn
755 760 765
Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val
770 775 780
Tyr Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro
785 790 795 800
Ile Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu
805 810 815
Val Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile
820 825 830
Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys
835 840 845
Gly Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe
850 855 860
Asn Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys
865 870 875 880
Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn
885 890 895
Ile Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile
900 905 910
Cys Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu
915 920 925
Asn Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr
930 935 940
Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp
945 950 955 960
Lys Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln
965 970 975
Ile Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly
980 985 990
Phe Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser
995 1000 1005
Thr Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala
1010 1015 1020
Asp Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val
1025 1030 1035
Pro Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe
1040 1045 1050
Ser Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser
1055 1060 1065
Tyr Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn
1070 1075 1080
Val Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu
1085 1090 1095
Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg
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130 135 140
Glu Ala Glu Lys Ala Gly Arg Pro Val Leu Ile Ser Thr Gly Asp Lys
145 150 155 160
Asp Met Ala Gln Leu Val Thr Pro Asn Ile Thr Leu Ile Asn Thr Met
165 170 175
Thr Asn Thr Ile Leu Gly Pro Glu Glu Val Val Asn Lys Tyr Gly Val
180 185 190
Pro Pro Glu Leu Ile Ile Asp Phe Leu Ala Leu Met Gly Asp Ser Ser
195 200 205
Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Gly Val Gly Glu Lys Thr Ala Gln Ala
210 215 220
Leu Leu Gln Gly Leu Gly Gly Leu Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Pro Glu
225 230 235 240
Lys Ile Ala Gly Leu Ser Phe Arg Gly Ala Lys Thr Met Ala Ala Lys
245 250 255
Leu Glu Gln Asn Lys Glu Val Ala Tyr Leu Ser Tyr Gln Leu Ala Thr
260 265 270
Ile Lys Thr Asp Val Glu Leu Glu Leu Thr Cys Glu Gln Leu Glu Val
275 280 285
Gln Gln Pro Ala Ala Glu Glu Leu Leu Gly Leu Phe Lys Lys Tyr Glu
290 295 300
Phe Lys Arg Trp Thr Ala Asp Val Glu Ala Gly Lys Trp Leu Gln Ala
305 310 315 320
Lys Gly Ala Lys Pro Ala Ala Lys Pro Gln Glu Thr Ser Val Ala Asp
325 330 335
Glu Ala Pro Glu Val Thr Ala Thr Val Ile Ser Tyr Asp Asn Tyr Val
340 345 350
Thr Ile Leu Asp Glu Glu Thr Leu Lys Ala Trp Ile Ala Lys Leu Glu
355 360 365
Lys Ala Pro Val Phe Ala Phe Asp Thr Glu Thr Asp Ser Leu Asp Asn
370 375 380
Ile Ser Ala Asn Leu Val Gly Leu Ser Phe Ala Ile Glu Pro Gly Val
385 390 395 400
Ala Ala Tyr Ile Pro Val Ala His Asp Tyr Leu Asp Ala Pro Asp Gln
405 410 415
Ile Ser Arg Glu Arg Ala Leu Glu Leu Leu Lys Pro Leu Leu Glu Asp
420 425 430
Glu Lys Ala Leu Lys Val Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Asp Arg Gly Ile
435 440 445
Leu Ala Asn Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Gly Ile Ala Phe Asp Thr Met
450 455 460
Leu Glu Ser Tyr Ile Leu Asn Ser Val Ala Gly Arg His Asp Met Asp
465 470 475 480
Ser Leu Ala Glu Arg Trp Leu Lys His Lys Thr Ile Thr Phe Glu Glu
485 490 495
Ile Ala Gly Lys Gly Lys Asn Gln Leu Thr Phe Asn Gln Ile Ala Leu
500 505 510
Glu Glu Ala Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Asp Ala Asp Val Thr Leu Gln
515 520 525
Leu His Leu Lys Met Trp Pro Asp Leu Gln Lys His Lys Gly Pro Leu
530 535 540
Asn Val Phe Glu Asn Ile Glu Met Pro Leu Val Pro Val Leu Ser Arg
545 550 555 560
Ile Glu Arg Asn Gly Val Lys Ile Asp Pro Lys Val Leu His Asn His
565 570 575
Ser Glu Glu Leu Thr Leu Arg Leu Ala Glu Leu Glu Lys Lys Ala His
580 585 590
Glu Ile Ala Gly Glu Glu Phe Asn Leu Ser Ser Thr Lys Gln Leu Gln
595 600 605
Thr Ile Leu Phe Glu Lys Gln Gly Ile Lys Pro Leu Lys Lys Thr Pro
610 615 620
Gly Gly Ala Pro Ser Thr Ser Glu Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Leu
625 630 635 640
Asp Tyr Pro Leu Pro Lys Val Ile Leu Glu Tyr Arg Gly Leu Ala Lys
645 650 655
Leu Lys Ser Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Pro Leu Met Ile Asn Pro Lys
660 665 670
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675 680 685
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Glu Glu Gly Arg Arg Ile Arg Gln Ala Phe Ile Ala Pro Glu Asp Tyr
705 710 715 720
Val Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Met Ala
725 730 735
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740 745 750
Asp Ile His Arg Ala Thr Ala Ala Glu Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu
755 760 765
Thr Val Thr Ser Glu Gln Arg Arg Ser Ala Lys Ala Ile Asn Phe Gly
770 775 780
Leu Ile Tyr Gly Met Ser Ala Phe Gly Leu Ala Arg Gln Leu Asn Ile
785 790 795 800
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805 810 815
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835 840 845
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
Thr Arg Leu Asp Val Pro Leu Leu Val Glu Val Gly Ser Gly Glu Asn
930 935 940
Trp Asp Gln Ala His Ser Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser
945 950 955 960
Glu Phe Glu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
965 970
<210> 93
<211> 1654
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val Gly Arg Ser Arg Leu Leu Glu Asp Phe Arg Asn Asn Arg
20 25 30
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100 105 110
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115 120 125
Val Ile Glu Lys Ala Leu Glu Phe Ile Pro Ser Asp Gln Gln Asn Glu
130 135 140
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Ser Leu Gln Phe Ile Ile Asp Ala Phe Lys Gly Gln Val Phe Ala Leu
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210 215 220
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ile Asp Val Ala Glu Pro Gly Gln Arg Lys Ile Val Met His Lys Ile
325 330 335
Arg Pro His Ile Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Thr Tyr Gly Lys His Ile
340 345 350
Leu Ala Lys Leu Glu Lys Tyr Tyr Met Lys Asn Gly Val Asp Leu Gly
355 360 365
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370 375 380
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Met Ser Leu Arg Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ala Asp Pro Gly Ala Asp
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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580 585 590
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690 695 700
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
Trp Pro Phe Val Glu Ala Arg Ala Ala Val His Gly Leu Ser Met Gln
770 775 780
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785 790 795 800
Gln Cys Ile His Met Asp Cys Leu Arg Trp Val Lys Arg Asp Ser Tyr
805 810 815
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835 840 845
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850 855 860
Ala Thr Tyr Tyr Leu Tyr Met Lys Tyr Val His Pro Phe Ile Phe Ala
865 870 875 880
Leu Cys Thr Ile Ile Pro Met Glu Pro Asp Glu Val Leu Arg Lys Gly
885 890 895
Ser Gly Thr Leu Cys Glu Ala Leu Leu Met Val Gln Ala Phe His Ala
900 905 910
Asn Ile Ile Phe Pro Asn Lys Gln Glu Gln Glu Phe Asn Lys Leu Thr
915 920 925
Asp Asp Gly His Val Leu Asp Ser Glu Thr Tyr Val Gly Gly His Val
930 935 940
Glu Ala Leu Glu Ser Gly Val Phe Arg Ser Asp Ile Pro Cys Arg Phe
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Arg Met Asn Pro Ala Ala Phe Asp Phe Leu Leu Gln Arg Val Glu Lys
965 970 975
Thr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Glu Glu Lys Val Pro Val Glu Gln
980 985 990
Val Thr Asn Phe Glu Glu Val Cys Asp Glu Ile Lys Ser Lys Leu Ala
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Ser Leu Lys Asp Val Pro Ser Arg Ile Glu Cys Pro Leu Ile Tyr
1010 1015 1020
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Arg Leu Gln Pro Ser Ala Met Val Asp Glu Ala Thr Cys Ala Ala
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
His Arg Ile Gln His Gln Leu Glu Ser Glu Lys Phe Pro Pro Leu
1085 1090 1095
Phe Pro Glu Gly Pro Ala Arg Ala Phe His Glu Leu Ser Arg Glu
1100 1105 1110
Glu Gln Ala Lys Tyr Glu Lys Arg Arg Leu Ala Asp Tyr Cys Arg
1115 1120 1125
Lys Ala Tyr Lys Lys Ile His Ile Thr Lys Val Glu Glu Arg Leu
1130 1135 1140
Thr Thr Ile Cys Gln Arg Glu Asn Ser Phe Tyr Val Asp Thr Val
1145 1150 1155
Arg Ala Phe Arg Asp Arg Arg Tyr Glu Phe Lys Gly Leu His Lys
1160 1165 1170
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1175 1180 1185
Ala Glu Val Lys Arg Cys Lys Asn Met Glu Val Leu Tyr Asp Ser
1190 1195 1200
Leu Gln Leu Ala His Lys Cys Ile Leu Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
1205 1210 1215
Val Met Arg Lys Gly Ala Arg Trp Tyr Ser Met Glu Met Ala Gly
1220 1225 1230
Ile Val Cys Phe Thr Gly Ala Asn Ile Ile Thr Gln Ala Arg Glu
1235 1240 1245
Leu Ile Glu Gln Ile Gly Arg Pro Leu Glu Leu Asp Thr Asp Gly
1250 1255 1260
Ile Trp Cys Val Leu Pro Asn Ser Phe Pro Glu Asn Phe Val Phe
1265 1270 1275
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Arg Ser Glu Asn Ser Ile Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Tyr Leu
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Lys Arg Tyr Ala Val Phe Asn Glu Asp Gly Ser Leu Ala Glu Leu
1355 1360 1365
Lys Gly Phe Glu Val Lys Arg Arg Gly Glu Leu Gln Leu Ile Lys
1370 1375 1380
Ile Phe Gln Ser Ser Val Phe Glu Ala Phe Leu Lys Gly Ser Thr
1385 1390 1395
Leu Glu Glu Val Tyr Gly Ser Val Ala Lys Val Ala Asp Tyr Trp
1400 1405 1410
Leu Asp Val Leu Tyr Ser Lys Ala Ala Asn Met Pro Asp Ser Glu
1415 1420 1425
Leu Phe Glu Leu Ile Ser Glu Asn Arg Ser Met Ser Arg Lys Leu
1430 1435 1440
Glu Asp Tyr Gly Glu Gln Lys Ser Thr Ser Ile Ser Thr Ala Lys
1445 1450 1455
Arg Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gln Met Val Lys Asp Ala Gly
1460 1465 1470
Leu Ser Cys Arg Tyr Ile Ile Ser Arg Lys Pro Glu Gly Ser Pro
1475 1480 1485
Val Thr Glu Arg Ala Ile Pro Leu Ala Ile Phe Gln Ala Glu Pro
1490 1495 1500
Thr Val Arg Lys His Phe Leu Arg Lys Trp Leu Lys Ser Ser Ser
1505 1510 1515
Leu Gln Asp Phe Asp Ile Arg Ala Ile Leu Asp Trp Asp Tyr Tyr
1520 1525 1530
Ile Glu Arg Leu Gly Ser Ala Ile Gln Lys Ile Ile Thr Ile Pro
1535 1540 1545
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1550 1555 1560
Pro Asp Trp Leu His Lys Lys Leu Leu Glu Lys Asn Asp Val Tyr
1565 1570 1575
Lys Gln Lys Lys Ile Ser Glu Leu Phe Thr Leu Glu Gly Arg Arg
1580 1585 1590
Gln Val Thr Met Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala
1595 1600 1605
Asp Gly Ser Glu Phe Glu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser
1610 1615 1620
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
1625 1630 1635
Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1640 1645 1650
Val
<210> 94
<211> 1233
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 94
Met Ser Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Ser Gly Met Phe Gly Lys Lys Lys
20 25 30
Asn Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ala Arg Tyr Ser Ala Gly Asn Lys Tyr
35 40 45
Asn Thr Leu Ser Asn Asn Tyr Ala Leu Ser Ala Gln Gln Leu Leu Asn
50 55 60
Ala Ser Lys Ile Asp Asp Ile Asp Ser Met Met Gly Phe Glu Arg Tyr
65 70 75 80
Val Pro Pro Gln Tyr Asn Gly Arg Phe Asp Ala Lys Asp Ile Asp Gln
85 90 95
Ile Pro Gly Arg Val Gly Trp Leu Thr Asn Met His Ala Thr Leu Val
100 105 110
Ser Gln Glu Thr Leu Ser Ser Gly Ser Asn Gly Gly Gly Asn Ser Asn
115 120 125
Asp Gly Glu Arg Val Thr Thr Asn Gln Gly Ile Ser Gly Val Asp Phe
130 135 140
Tyr Phe Leu Asp Glu Glu Gly Gly Ser Phe Lys Ser Thr Val Val Tyr
145 150 155 160
Asp Pro Tyr Phe Phe Ile Ala Cys Asn Asp Glu Ser Arg Val Asn Asp
165 170 175
Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Glu Ser Cys Leu Lys Ser Leu
180 185 190
Gln Ile Ile Arg Lys Glu Asp Leu Thr Met Asp Asn His Leu Leu Gly
195 200 205
Leu Gln Lys Thr Leu Ile Lys Leu Ser Phe Val Asn Ser Asn Gln Leu
210 215 220
Phe Glu Ala Arg Lys Leu Leu Arg Pro Ile Leu Gln Asp Asn Ala Asn
225 230 235 240
Asn Asn Val Gln Arg Asn Ile Tyr Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Glu
245 250 255
Lys Val Asp Ala Lys His Leu Ile Glu Asp Ile Arg Glu Tyr Asp Val
260 265 270
Pro Tyr His Val Arg Val Ser Ile Asp Lys Asp Ile Arg Val Gly Lys
275 280 285
Trp Tyr Lys Val Thr Gln Gln Gly Phe Ile Glu Asp Thr Arg Lys Ile
290 295 300
Ala Phe Ala Asp Pro Val Val Met Ala Phe Asp Ile Glu Thr Thr Lys
305 310 315 320
Pro Pro Leu Lys Phe Pro Asp Ser Ala Val Asp Gln Ile Met Met Ile
325 330 335
Ser Tyr Met Ile Asp Gly Glu Gly Phe Leu Ile Thr Asn Arg Glu Ile
340 345 350
Ile Ser Glu Asp Ile Glu Asp Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Pro Glu Tyr
355 360 365
Pro Gly Phe Phe Thr Ile Phe Asn Glu Asn Asp Glu Val Ala Leu Leu
370 375 380
Gln Arg Phe Phe Glu His Ile Arg Asp Val Arg Pro Thr Val Ile Ser
385 390 395 400
Thr Phe Asn Gly Asp Phe Phe Asp Trp Pro Phe Ile His Asn Arg Ser
405 410 415
Lys Ile His Gly Leu Asp Met Phe Asp Glu Ile Gly Phe Ala Pro Asp
420 425 430
Ala Glu Gly Glu Tyr Lys Ser Ser Tyr Cys Ser His Met Asp Cys Phe
435 440 445
Arg Trp Val Lys Arg Asp Ser Tyr Leu Pro Gln Gly Ser Gln Gly Leu
450 455 460
Lys Ala Val Thr Gln Ser Lys Leu Gly Tyr Asn Pro Ile Glu Leu Asp
465 470 475 480
Pro Glu Leu Met Thr Pro Tyr Ala Phe Glu Lys Pro Gln His Leu Ser
485 490 495
Glu Tyr Ser Val Ser Asp Ala Val Ala Thr Tyr Tyr Leu Tyr Met Lys
500 505 510
Tyr Val His Pro Phe Ile Phe Ser Leu Cys Thr Ile Ile Pro Leu Asn
515 520 525
Pro Asp Glu Thr Leu Arg Lys Gly Thr Gly Thr Leu Cys Glu Met Leu
530 535 540
Leu Met Val Gln Ala Tyr Gln His Asn Ile Leu Leu Pro Asn Lys His
545 550 555 560
Thr Asp Pro Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Gly His Leu Leu Glu Ser Glu
565 570 575
Thr Tyr Val Gly Gly His Val Glu Ser Leu Glu Ala Gly Val Phe Arg
580 585 590
Ser Asp Leu Lys Asn Glu Phe Lys Ile Asp Pro Ser Ala Ile Asp Glu
595 600 605
Leu Leu Gln Glu Leu Pro Glu Ala Leu Lys Phe Ser Val Glu Val Glu
610 615 620
Asn Lys Ser Ser Val Asp Lys Val Thr Asn Phe Glu Glu Ile Lys Asn
625 630 635 640
Gln Ile Thr Gln Lys Leu Leu Glu Leu Lys Glu Asn Asn Ile Arg Asn
645 650 655
Glu Leu Pro Leu Ile Tyr His Val Asp Val Ala Ser Met Tyr Pro Asn
660 665 670
Ile Met Thr Thr Asn Arg Leu Gln Pro Asp Ser Ile Lys Ala Glu Arg
675 680 685
Asp Cys Ala Ser Cys Asp Phe Asn Arg Pro Gly Lys Thr Cys Ala Arg
690 695 700
Lys Leu Lys Trp Ala Trp Arg Gly Glu Phe Phe Pro Ser Lys Met Asp
705 710 715 720
Glu Tyr Asn Met Ile Lys Arg Ala Leu Gln Asn Glu Thr Phe Pro Asn
725 730 735
Lys Asn Lys Phe Ser Lys Lys Lys Val Leu Thr Phe Asp Glu Leu Ser
740 745 750
Tyr Ala Asp Gln Val Ile His Ile Lys Lys Arg Leu Thr Glu Tyr Ser
755 760 765
Arg Lys Val Tyr His Arg Val Lys Val Ser Glu Ile Val Glu Arg Glu
770 775 780
Ala Ile Val Cys Gln Arg Glu Asn Pro Phe Tyr Val Asp Thr Val Lys
785 790 795 800
Ser Phe Arg Asp Arg Arg Tyr Glu Phe Lys Gly Leu Ala Lys Thr Trp
805 810 815
Lys Gly Asn Leu Ser Lys Ile Asp Pro Ser Asp Lys His Ala Arg Asp
820 825 830
Glu Ala Lys Lys Met Ile Val Leu Tyr Asp Ser Leu Gln Leu Ala His
835 840 845
Lys Val Ile Leu Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr Val Met Arg Lys Gly Ser
850 855 860
Arg Trp Tyr Ser Met Glu Met Ala Gly Ile Thr Cys Leu Thr Gly Ala
865 870 875 880
Thr Ile Ile Gln Met Ala Arg Ala Leu Val Glu Arg Val Gly Arg Pro
885 890 895
Leu Glu Leu Asp Thr Asp Gly Ile Trp Cys Ile Leu Pro Lys Ser Phe
900 905 910
Pro Glu Thr Tyr Phe Phe Thr Leu Glu Asn Gly Lys Lys Leu Tyr Leu
915 920 925
Ser Tyr Pro Cys Ser Met Leu Asn Tyr Arg Val His Gln Lys Phe Thr
930 935 940
Asn His Gln Tyr Gln Glu Leu Lys Asp Pro Leu Asn Tyr Ile Tyr Glu
945 950 955 960
Thr His Ser Glu Asn Thr Ile Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Tyr Lys
965 970 975
Ala Met Ile Leu Pro Ser Ser Lys Glu Glu Gly Lys Gly Ile Lys Lys
980 985 990
Arg Tyr Ala Val Phe Asn Glu Asp Gly Ser Leu Ala Glu Leu Lys Gly
995 1000 1005
Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Leu Gln Leu Ile Lys Asn Phe
1010 1015 1020
Gln Ser Asp Ile Phe Lys Val Phe Leu Glu Gly Asp Thr Leu Glu
1025 1030 1035
Gly Cys Tyr Ser Ala Val Ala Ser Val Cys Asn Arg Trp Leu Asp
1040 1045 1050
Val Leu Asp Ser His Gly Leu Met Leu Glu Asp Glu Asp Leu Val
1055 1060 1065
Ser Leu Ile Cys Glu Asn Arg Ser Met Ser Lys Thr Leu Lys Glu
1070 1075 1080
Tyr Glu Gly Gln Lys Ser Thr Ser Ile Thr Thr Ala Arg Arg Leu
1085 1090 1095
Gly Asp Phe Leu Gly Glu Asp Met Val Lys Asp Lys Gly Leu Gln
1100 1105 1110
Cys Lys Tyr Ile Ile Ser Ser Lys Pro Phe Asn Ala Pro Val Thr
1115 1120 1125
Glu Arg Ala Ile Pro Val Ala Ile Phe Ser Ala Asp Ile Pro Ile
1130 1135 1140
Lys Arg Ser Phe Leu Arg Arg Trp Thr Leu Asp Pro Ser Leu Glu
1145 1150 1155
Asp Leu Asp Ile Arg Thr Ile Ile Asp Trp Gly Tyr Tyr Arg Glu
1160 1165 1170
Arg Leu Gly Ser Ala Ile Gln Lys Ile Ile Thr Ile Pro Ala Ala
1175 1180 1185
Leu Gln Gly Val Ser Asn Pro Val Pro Arg Val Glu His Pro Asp
1190 1195 1200
Trp Leu Lys Arg Lys Ile Ala Thr Lys Ser Gly Gly Ser Lys Arg
1205 1210 1215
Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1220 1225 1230
Claims (120)
- (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질; 및
(b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제
를 포함하는 제1 복합체. - 제1항에 있어서, 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 추가로 포함하는 제1 복합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 DNA 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하고, 여기서 DNA 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있거나, 또는 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 추가로 포함하는 것인 제1 복합체.
- (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있고, 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질;
(b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; 및
(c) 제1 DNA 코딩된 복구 주형
을 포함하는 제1 복합체. - (a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질;
(b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제;
(c) 제1 DNA 엔도뉴클레아제; 및
(d) 제1 DNA 코딩된 복구 주형
을 포함하는 제1 복합체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트(Argonaute) 단백질로부터의 것인 제1 복합체.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Fok1), 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)인 제1 복합체.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 뉴클레아제 또는 니카제인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산 (예를 들어, crRNA, crDNA)을 추가로 포함하는 제1 복합체.
- 제1항, 제2항, 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 엔도뉴클레아제 또는 니카제 활성을 포함하는 것인 제1 복합체.
- 제10항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질의 엔도뉴클레아제 또는 니카제 활성이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 임의로 링커를 통해 (그의 N-말단 또는 C-말단에서) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합된 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 높은 충실도 및/또는 높은 진행성을 나타내는 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 높은 분배성 프로파일을 나타내는 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 5'-3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 것인 제1 복합체.
- 제15항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및 5'-3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 중 하나 이상을 제거하도록 변형된 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 클레나우(Klenow) 단편 또는 그의 하위-단편을 포함하는 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 서열 비-특이적 DNA 결합 단백질에 융합된 것인 제1 복합체.
- 제18항에 있어서, 서열-비특이적 dsDNA 결합 단백질이 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터의 Sso7d로부터의 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 인간, 효모, 박테리아, 또는 식물로부터의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 ε (예를 들어, 인간 및 효모), DNA 폴리머라제 δ, 이. 콜라이(E. coli) 폴리머라제 I, 퓨전(Phusion)® DNA 폴리머라제, 벤트(Vent)® DNA 폴리머라제, 벤트 (엑소-)® DNA 폴리머라제, 딥 벤트(Deep Vent)® DNA 폴리머라제, 딥 벤트 (엑소-)® DNA 폴리머라제, 9°Nm™ DNA 폴리머라제, Q5® DNA 폴리머라제, Q5U® DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, 및/또는 파이어(Phire)™ DNA 폴리머라제인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 폴리머라제가 인간 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε, 식물 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε 및/또는 효모 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 분배성 폴리머라제인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 펩티드 태그에 융합되고, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 펩티드 태그에 융합된 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원하는 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 펩티드 태그에 융합되고, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 친화성 폴리펩티드에 융합된 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원하는 것인 제1 복합체.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 펩티드 태그가 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그(Sun-Tag)), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함하는 것인 제1 복합체.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 폴리펩티드가 항체, 임의로 scFv 항체, 아피바디, 안티칼린, 모노바디 및/또는 DARPin인 제1 복합체.
- 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산이 RNA-동원 모티프에 연결되고, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 것인 제1 복합체.
- 제28항에 있어서, RNA 동원 모티프가 CRISPR 핵산 (예를 들어, 동원 crRNA, 동원 crDNA)의 5' 단부에 또는 3' 단부에 연결된 것인 제1 복합체.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 Ku의 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, Ku 이종이량체); 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7의 친화성 폴리펩티드; MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 PP7 코트 단백질 (PCP); SfMu 파지 Com 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 Com RNA 결합 단백질; PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오(Pumilio)/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF); 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 압타머 리간드인 제1 복합체.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), 및/또는 PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)인 제1 복합체.
- 제9항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 가이드 핵산에 연결된 것인 제1 복합체.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 결합 도메인 및/또는 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 CRISPR-Cas 이펙터 단백질인 제1 복합체.
- 제33항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 유형 I CRISPR-Cas 시스템, 유형 II CRISPR-Cas 시스템, 유형 III CRISPR-Cas 시스템, 유형 IV CRISPR-Cas 시스템 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것인 제1 복합체.
- 제33항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 유형 II CRISPR-Cas 시스템 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것인 제1 복합체.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a, Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c인 제1 복합체.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas9 이펙터 단백질 또는 Cas12 이펙터 단백질인 제1 복합체.
- (a) 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질; 및
(b) DNA-코딩된 복구 주형
을 포함하는 제2 복합체. - 제38항에 있어서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것인 제2 복합체.
- 제39항에 있어서, 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하고, 여기서 제2 DNA 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 것인 제2 복합체.
- 제40항에 있어서, 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것인 제2 복합체.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 추가로 포함하는 것인 제2 복합체.
- 제42항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성을 추가로 포함하는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN))인 제2 복합체.
- 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 추가로 포함하는 제2 복합체.
- 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DNA-코딩된 복구 주형이 DNA 동원 모티프에 연결되고, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 DNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 임의로 DNA 동원 모티프/친화성 폴리펩티드가 HUH-태그, DNA 압타머, 박테리아 레트론의 msDNA 또는 T-DNA 동원을 포함하는 것인 제2 복합체.
- 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 (그의 N-말단 또는 C-말단에서) 돼지 서코바이러스 2 (PCV) Rep 단백질에 융합되고, DNA 주형이 PCV 인식 부위를 포함하는 것인 제2 복합체.
- 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DNA-코딩된 복구 주형이 가이드 핵산에 연결된 것인 제2 복합체.
- 펩티드 태그 또는 RNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 조작된 (변형된) DNA-의존성 DNA 폴리머라제.
- 제48항에 있어서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 서열 비-특이적 DNA 결합 도메인에 융합된 것인 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제.
- 제49항에 있어서, 서열-비특이적 dsDNA 결합 단백질이 술폴로부스 솔파타리쿠스로부터의 Sso7d로부터의 것인 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제.
- 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 [본원에 기재된 바와 같이 조작되지 않은 동일한 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 비교하여] 증가된 진행성, 증가된 충실도, 증가된 친화도, 증가된 서열 특이성, 감소된 서열 특이성 및/또는 증가된 협동성을 나타내는 것인 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제.
- 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 5'→3'-폴리머라제 활성, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성, 및/또는 5'→3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 중 적어도 하나를 포함하지 않는 것인 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제.
- 제1 부위 및 제2 부위와는 상이한 가닥 상에 있는 표적 핵산 상의 제3 부위에 결합할 수 있는 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질 및 제3 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하고, 그에 의해 미스매치 복구를 개선시키고, 복구의 효율을 신장시키는 것인 제3 복합체.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 제1 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제2 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제53항의 제3 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 중 1종 이상을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
- (a) CRISPR-Cas 이펙터 단백질과의 상호작용을 매개하는 핵산 서열; (b) DNA-RNA 상호작용을 통해 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 특이적 핵산 표적 부위에 지시하는 핵산 서열, 및 (c) 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있는 스템 루프 구조를 형성하는 핵산 서열을 포함하는 RNA 분자.
- 표적 핵산을 제4항 내지 제37항 중 어느 한 항의 제1 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법.
- 제60항에 있어서, 표적 핵산을 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제2 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제61항에 있어서, 표적 핵산을 제53항의 제3 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산의 변형의 복구 효율을 개선시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 표적 핵산을
(a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질;
(b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제;
(c) 제1 DNA 엔도뉴클레아제; 및
(d) 제1 DNA 코딩된 복구 주형과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법. - 제63항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, 제1 DNA 엔도뉴클레아제, 및 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 (표적 핵산과 상호작용하는) 복합체를 형성하는 것인 방법.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것인 방법.
- 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Fok1), 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)인 방법.
- 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 뉴클레아제 또는 니카제인 방법.
- 표적 핵산을
(a) 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합할 수 있고, 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 니카제 활성 및/또는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질;
(b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제; 및
(c) 제1 DNA 코딩된 복구 주형과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법. - 제68항에 있어서, 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, 및 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 (표적 핵산과 상호작용하는) 복합체를 형성하는 것인 방법.
- 제68항 또는 제69항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질의 엔도뉴클레아제 활성 및/또는 니카제 활성이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 및/또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것인 방법.
- 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 임의로 링커를 통해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 융합된 것인 방법.
- 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 펩티드 태그에 융합되고, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 펩티드 태그에 융합된 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원하는 것인 방법.
- 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 펩티드 태그에 융합되고, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 친화성 폴리펩티드에 융합된 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원하는 것인 방법.
- 제72항 또는 제73항에 있어서, 펩티드 태그가 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함하는 것인 방법.
- 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 폴리펩티드가 항체, 임의로 scFv 항체, 아피바디, 안티칼린, 모노바디, 및/또는 DARPin인 방법.
- 제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA 결합 도메인 및/또는 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 CRISPR-Cas 이펙터 단백질인 방법.
- 제76항에 있어서, 표적 핵산을 제1 가이드 핵산 (예를 들어, crRNA, crDNA)과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제77항에 있어서, 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산에 가이드하는 것인 방법.
- 제77항 또는 제78항에 있어서, 제1 가이드 핵산이 RNA-동원 모티프에 연결되고, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 표적 핵산에 가이드하는 것인 방법.
- 제79항에 있어서, RNA 동원 모티프가 CRISPR 핵산 (예를 들어, 동원 crRNA, 동원 crDNA)의 5' 단부에 또는 3' 단부에 연결된 것인 방법.
- 제79항 또는 제80항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 Ku의 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, Ku 이종이량체); 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7의 친화성 폴리펩티드; MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 PP7 코트 단백질 (PCP); SfMu 파지 Com 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 Com RNA 결합 단백질; PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF); 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 압타머 리간드인 방법.
- 제79항 또는 제80항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), 및/또는 PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)인 방법.
- 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 유형 I CRISPR-Cas 시스템, 유형 II CRISPR-Cas 시스템, 유형 III CRISPR-Cas 시스템, 유형 IV CRISPR-Cas 시스템 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것인 방법.
- 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 유형 II CRISPR-Cas 시스템 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것인 방법.
- 제84항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a, Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c1, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c인 방법.
- 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas9 이펙터 단백질 또는 Cas12 이펙터 단백질인 방법.
- 제63항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을
(a) 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질; 및
(b) DNA-코딩된 복구 주형
을 포함하는 제2 복합체와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법. - 제87항에 있어서, 표적 핵산이 제2 DNA 엔도뉴클레아제와 추가로 접촉되고, 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있거나, 또는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 단일 가닥 닉 또는 이중 가닥 파단을 도입할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 것인 방법.
- 제88항에 있어서, 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질), 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로부터의 것이거나, 또는 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)인 방법.
- 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 상의 제2 부위에 결합할 수 있는 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 제2 DNA-코딩된 복구 주형, 및 임의로 DNA 엔도뉴클레아제가 표적 핵산 상의 제2 부위와 상호작용하는 복합체를 형성하는 것인 방법.
- 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 펩티드 태그에 융합되고, 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 펩티드 태그에 융합된 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원하는 것인 방법.
- 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 펩티드 태그에 융합되고, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 친화성 폴리펩티드에 융합된 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원하는 것인 방법.
- 제87항 또는 제92항에 있어서, 펩티드 태그가 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함하는 것인 방법.
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 폴리펩티드가 항체, 임의로 scFv 항체, 아피바디, 안티칼린, 모노바디, 및/또는 DARPin인 방법.
- 제87항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DNA-코딩된 복구 주형이 DNA 동원 모티프에 연결되고, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 DNA 동원 모티프와 상호작용할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 임의로 DNA 동원 모티프/친화성 폴리펩티드가 HUH-태그, DNA 압타머, 박테리아 레트론의 msDNA 또는 T-DNA 동원을 포함하는 것인 방법.
- 제87항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 돼지 서코바이러스 2 (PCV) Rep 단백질에 융합되고, DNA 코딩된 복구 주형이 PCV 인식 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 단백질-가이드된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 아르고노트 단백질로부터의 것인 방법.
- 제89항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 DNA 결합 도메인 및/또는 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 CRISPR-Cas 이펙터 단백질인 방법.
- 제98항에 있어서, 표적 핵산을 제2 가이드 핵산 (예를 들어, crRNA, crDNA)과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제99항에 있어서, 제2 DNA 코딩된 복구 주형이 제2 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제2 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산에 가이드하는 것인 방법.
- 제99항 또는 제100항에 있어서, 제2 가이드 핵산이 RNA-동원 모티프에 연결되고, 제2 DNA 엔도뉴클레아제가 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합되고, 그에 의해 제2 DNA 엔도뉴클레아제를 표적 핵산에 가이드하는 것인 방법.
- 제101항에 있어서, RNA 동원 모티프가 가이드 핵산 (예를 들어, 동원 crRNA, 동원 crDNA)의 5' 단부에 또는 3' 단부에 연결된 것인 방법.
- 제101항 또는 제102항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 Ku의 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, Ku 이종이량체); 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7의 친화성 폴리펩티드; MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 PP7 코트 단백질 (PCP); SfMu 파지 Com 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 Com RNA 결합 단백질; PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF); 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 압타머 리간드인 방법.
- 제101항 또는 제102항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), 및/또는 PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)인 방법.
- 제87항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제87항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을 제3 복합체와 접촉시키고, 여기서 제3 복합체는 제1 부위 및 제2 부위와는 상이한 가닥 상에 있는 표적 핵산 상의 제3 부위에 결합할 수 있는 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하고, 제3 서열-특이적 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 또는 니카제 활성을 포함하고, 그에 의해 표적 핵산의 변형의 복구 효율을 개선시키는 것을 포함하는 방법.
- 제63항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및 5'-3' RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 중 하나 이상을 제거하도록 변형된 것인 방법.
- 제63항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 클레나우 단편 또는 그의 하위-단편을 포함하는 것인 방법.
- 제63항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 서열 비-특이적 DNA 결합 단백질에 융합된 것인 방법.
- 제109항에 있어서, 서열-비특이적 dsDNA 결합 단백질이 술폴로부스 솔파타리쿠스로부터의 Sso7d로부터의 것인 방법.
- 제63항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 인간, 효모, 박테리아, 또는 식물로부터의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제인 방법.
- 제63항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 ε (예를 들어, 인간 및 효모), DNA 폴리머라제 δ, 이. 콜라이 폴리머라제 I, 퓨전® DNA 폴리머라제, 벤트® DNA 폴리머라제, 벤트 (엑소-)® DNA 폴리머라제, 딥 벤트® DNA 폴리머라제, 딥 벤트 (엑소-)® DNA 폴리머라제, 9°Nm™ DNA 폴리머라제, Q5® DNA 폴리머라제, Q5U® DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, 및/또는 파이어™ DNA 폴리머라제인 방법.
- 제63항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 인간 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε, 식물 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε 및/또는 효모 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 ε인 방법.
- 제63항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 높은 충실도 및/또는 높은 진행성을 나타내는 것인 방법.
- 제63항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 높은 분배성 프로파일을 나타내는 것인 방법.
- 제63항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 및/또는 제2 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 DNA-의존성 DNA 폴리머라제인 방법.
- 제4항, 제6항 내지 제9항 및 제12항 내지 제37항 중 어느 한 항의 제1 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템이며, 여기서
(a) DNA 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합하고;
(b) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고,
(c) (i) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 표적 핵산 상의 제1 부위에 대해 실질적 상보성을 갖는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산 상의 제1 부위에 가이드하거나, 또는
(c) (ii) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있고, 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템. - 제5항 내지 제9항 및 제12항 내지 제37항 중 어느 한 항의 제1 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템이며, 여기서
(a) 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질이 표적 핵산 상의 제1 부위에 결합하고,
(b) 제1 DNA 엔도뉴클레아제가 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 가이드 핵산과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고;
(c) 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질 및/또는 가이드 핵산과 상호작용할 수 있고, 제1 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고;
(d) (i) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 표적 핵산 상의 제1 부위에 대해 실질적 상보성을 갖는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 핵산에 연결되고, 그에 의해 제1 DNA 코딩된 복구 주형을 표적 핵산 상의 제1 부위에 가이드하거나, 또는
(d) (ii) 제1 DNA 코딩된 복구 주형이 제1 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제와 상호작용할 수 있고, 서열-특이적 DNA 결합 단백질 또는 제1 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 및 표적 핵산 상의 제1 부위에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인, 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템. - 제117항 또는 제118항에 있어서, 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제2 복합체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 서열-특이적 DNA 결합 도메인이 표적 핵산 상의 제1 부위에 근위인 제2 부위에 결합하고, 제2 DNA-코딩된 복구 주형이 (공유 또는 비-공유 상호작용을 통해) 제2 서열-특이적 DNA 결합 단백질에 동원되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것인 표적 핵산을 변형시키기 위한 시스템.
- 표적 핵산을 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항의 복합체와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법.
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