CN105039339B - 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA。本发明首先提供了一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA，为序列表的序列4自5’末端第1至20位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第1至20位核苷酸的RNA。采用本发明提供的sgRNA和Cas9mRNA，可以借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术在绵羊胚胎上对FecB基因进行定向修饰和改造，大大缩短育种时间，加快育种进程，提高绵羊繁殖力，为下一步通过受精卵注射和胚胎移植开展绵羊基因组编辑育种奠定基础，同时为今后利用含有高繁殖力FecB基因的杂种母羊和杂种公羊建立肉用多胎绵羊核心群，加速绵羊多胎品系的选育步伐有深远意义。

Description

一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用 sgRNA

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，涉及CRISPR-Cas9技术，具体涉及一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA。

背景技术

基因组操作技术是基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。随着近几年ZFN、TALEN及CRISPR/Cas 9等新型基因组定点编辑技术的出现，可以在不改变基因组组成情况下，只在特定的位点删除或插入研究人员感兴趣的基因，具有很高的基因编辑效率。相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas 9介导的基因组编辑其靶标序列的特异性决定于一段小的与靶标序列互补的RNA(sgRNA)。这种基于碱基互补配对原则的识别，相比较于蛋白质与DNA之间的相互作用要更加稳定和简单，因其构建方法简单快捷、效率高、脱靶效应低等优点目前已经成为基因组编辑的最主流技术。

CRISPR/Cas 9主要由两部分组成：具有核酸内切酶作用的Cas9蛋白和sgRNA嵌合体，进行基因编辑大致的作用过程主要为：Cas9蛋白与sgRNA相结合组成蛋白质RNA复合体，通过核酸sgRNA(RNA)对靶点基因核酸(DNA)碱基的互补完成配对识别(靶基因尚需存在一个序列为NGG的原间区毗邻序列PAM)，随后Cas9蛋白则通过其具有的两个作用域(RUVC)和(HNH)分别将该段DNA的双链切断降解，最终引入DNA双链断裂(DSB)，然后激活细胞内的非同源末端连接修复机制或者同源重组修复机制，利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。CRISPR/Cas9系统打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换20-30bp的核苷酸，相当于合成一对引物，相对于ZFN和TALEN构建过程更加简单快捷，适合规模化、高通量的组装。而且，该系统还可以同时针对同一细胞中的多个位点进行研究，故而更为简便和经济。此外，该技术还具有独特的优势：构建简单、方便、快捷；用于基因组的点突变编辑优于ZFN或TALEN；精确的切口酶活性用于基因治疗安全性高于ZFN或TALEN。利用CRISPR/Cas9对基因组修饰培育转基因动物，可高效的造成突变，缩短动物新品种培育的时间。

FecB基因位于绵羊的常染色体上，具有提高排卵率和产羔数等生物学作用。研究表明，FecB基因是由BMPR-IB基因A746G碱基突变而来，而BMPR-IB基因是控制BooroolaMerino羊高繁特性的主效基因。绵羊FecB基因被定位于6号染色体6q23～q31的狭窄区域内，编码区由10个外显子组成，共1509bp，编码502个氨基酸。2001年，Mulsant和Souza等发现绵羊FecB基因实际由BMPR-IB基因(骨骼形成蛋白IB型受体基因)突变而来，由于该基因A746G碱基突变导致第249位的谷氨酰胺变为精氨酸，因而出现了FecB表型，关联分析表明，BMPR-IB基因的该处突变与FecB基因的行为完全一致，证明BMPR-IB基因是控制Booroola、Merino羊高繁特性的主效基因。Campbell等的研究也证实了BMPR-IB基因A746G突变(FecB)是通过提高卵泡细胞对促性腺激素(GnRH)的敏感性而实现其生物学效应。Montgaomery研究发现促性腺激素释放素受体(GnRHR)位于绵羊六号染色体FecB位点的外侧，FecB基因突变可以增加GnRH的释放量，从而导致卵泡刺激素(FSH)的浓度上升而排卵数增加。此外，研究者通过对Booroola羊多胎性状的分离规律研究表明，其多胎性能是由于常染色体上的突变所致，该基因对排卵数是加性的，对产羔数是部分显性的。

绵羊的繁殖性状是绵羊的重要经济性状。在绵羊品种库中现有的近700个品种中，除少数具有产羔率高、性成熟早和常年发情的特点外，绝大多数属季节性发情，年产一胎，每胎单羔的绵羊品种。因此，如何有效地提高绵羊的繁殖力成为人们十分关注的研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA。

本发明首先提供了一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA，为序列表的序列4自5’末端第1至20位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第1至20位核苷酸的RNA。本发明的实施例中，所述能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA具体可为序列表的序列4所示的RNA或序列表的序列6所示的RNA。将序列表的序列4所示的RNA命名为sgRNA-1。将序列表的序列6所示的RNA命名为sgRNA-2。

编码所述“能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA”的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述DNA分子具体可为序列表的序列3所示的DNA分子或序列表的序列5所示的DNA分子。

含有编码所述“能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA”的DNA分子的重组载体也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的靶向序列，如序列表的序列3所示。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括所述“能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA”。所述试剂盒还可包括Cas9 mRNA。所述Cas9 mRNA为编码序列表的序列8所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9 mRNA具体可为具有序列表的序列9自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列9所示的RNA。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括编码所述“能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA”的DNA分子。所述试剂盒还可包括编码Cas9mRNA的DNA分子。编码所述“能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA”的DNA分子具体可为序列表的序列3所示的DNA分子或序列表的序列5所示的DNA分子。所述Cas9 mRNA为编码序列表的序列8所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9 mRNA具体可为具有序列表的序列9自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列9所示的RNA。编码Cas9 mRNA的DNA分子具体可为具有序列表的序列7自5’末端第24至4295位核苷酸的DNA分子，更具体可为序列表的序列7所示的分子。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括含有“编码所述能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA”的DNA分子的重组质粒。所述试剂盒还可包括含有编码Cas9 mRNA的DNA分子的重组质粒。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的方法，是将能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA和Cas9 mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊FecB基因。所述共转染的方式具体可为共注射。所述绵羊细胞具体可为绵羊受精卵细胞。

以上任一所述绵羊FecB基因可为编码序列表的序列2所示的蛋白质的基因。以上任一所述绵羊FecB基因具体可为序列表的序列1所示的DNA分子或序列表的序列1自5’末端第157-1665位核苷酸所示的DNA分子。

目前在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高，因此获得特异、高效的sgRNA成为绵羊基因组编辑培育的关键。本发明将上述sgRNA与Cas9 mRNA共同注射至绵羊受精卵，敲除效率可达38％，证明上述sgRNA特异性较高且能够精确靶向修饰绵羊FecB基因，实现基因突变。本发明为首次采用CRISPR-Cas9技术在绵羊受精卵中实现基因组精准修饰突变，利用这种方法不仅构建步骤简单、安全性高，而且大大降低了昂贵的实验成本和缩短实验周期，为提高绵羊繁殖力奠定了基础，也为今后绵羊分子细胞工程育种提供了安全、精准的新方法。

本发明中，将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射动物受精卵，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合，而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在于生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。采用本发明提供的sgRNA和Cas9 mRNA，可以借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术在绵羊胚胎上对FecB基因进行定向修饰和改造，可大大缩短育种时间，加快育种进程，提高绵羊繁殖力，为下一步通过受精卵注射和胚胎移植开展绵羊基因组编辑育种奠定基础，同时为今后利用含有高繁殖力FecB基因的杂种母羊和杂种公羊建立肉用多胎绵羊核心群，加速绵羊多胎品系的选育步伐有着深远的意义。

附图说明

图1为限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒后的1％琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为1kbDNA Marker。

图2为采用FecB-TF和FecB-TR组成的引物对进行PCR扩增的PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为150bpDNA Marker。

图3为sgRNA-2的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker。

图4为采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对进行PCR扩增的PCR扩增产物的电泳图；泳道M为1kb DNA Marker。

图5为Cas9 mRNA的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker。

图6为巣式PCR产物的电泳图；1-20为靶标基因FecB的PCR扩增产物，CK1、CK2分别为裂解液和水对照，泳道M为150bp DNA Marker。

图7为T7核酸内切酶I(T7E1)鉴定的结果；泳道1-22为靶标基因FecB的酶切产物，CK1、CK2分别为裂解液和水对照的酶切产物，泳道M为150bp DNA Marker。

图8为TA克隆测序比对的结果；框中的序列为sgRNA序列，GGG为FecB基因Cas9打靶的PAM序列。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，详见《分子克隆(第三版)》。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。px330质粒：Addgene公司，货号为42330。RNA纯化试剂盒：Life Technologies公司，货号为AM1908。

实施例中的相关引物的核苷酸序列见表1。

表1引物序列

引物	序列(5’→3’)
		FecB-CF	CACCGAGATTGGAAAAGGTCGCTAT
FecB-CR	AAACATAGCGACCTTTTCCAATCTC
		FecB-TF	TTAATACGACTCACTATAGAGATTGGAAAAGGTCGCTAT
FecB-TR	AAAAGCACCGACTCGGTGCC
		FecB-F1	CAGTCTGGCATTTGGCTAT
FecB-R1	AGGTCTCCCATTAGAAGCA
		FecB-F2	TGTATTGGCACACACATTCT

注：各引物均为单链DNA分子。

实施例1、制备sgRNA和Cas9 mRNA

一、设计靶序列以及识别靶序列的sgRNA

绵羊FecB基因如序列表的序列1所示(开放阅读框为自5’末端第157-1665位核苷酸)，其编码的蛋白质如序列表的序列2所示。

设计sgRNA针对绵羊FecB基因的靶序列(序列表的序列3，该靶序列在绵羊FecB基因的外显子8上)：5’-AGATTGGAAAAGGTCGCTAT-3’。

设计针对上述靶序列的sgRNA,即sgRNA-1(序列表的序列4)：

5’-AGAUUGGAAAAGGUCGCUAUGGG-3’。

二、制备sgRNA

1、用限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳(酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图1)，然后回收并纯化线性化的质粒。

2、将步骤1的纯化产物进行去磷酸化。

3、将引物FecB-CF和引物FecB-CR退火，得到两端均为粘末端的双链DNA分子。

4、将步骤2的产物与步骤3得到的双链DNA分子连接，得到重组质粒。

5、以步骤4得到的重组质粒为模板，采用FecB-TF和FecB-TR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳图见图2。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列5所示。

6、取步骤5得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒(T7Kit，Life Technologies公司，货号为AM1354)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到sgRNA-2。sgRNA-2的凝胶电泳图见图3。sgRNA-2如序列表的序列6所示。sgRNA-2自5’末端第2至21位核苷酸对应sgRNA-1。

三、制备Cas9 mRNA

1、以px330质粒为模板，采用Cas9-F(下划线标注T7启动子)和Cas9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(4311bp)。PCR扩增产物的电泳图见图4。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列7所示。序列表的序列7中，自5’末端第24-4295为Cas9的开放阅读框。编码序列表的序列8所示的Cas9蛋白。

Cas9-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3’；

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒(Life Technologies公司的mMESSAGE T7 Ultra Kit,货号为AM1345)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到Cas9 mRNA。Cas9 mRNA的凝胶电泳图见图5。Cas9 mRNA如序列表的序列9所示。Cas9 mRNA自5’末端第7至4278位核苷酸为编码区。

实施例2、sgRNA/Cas9 mRNA突变效率检测

一、绵羊受精卵的获得

1、卵母细胞的成熟

从屠宰场采集绵羊卵巢(卵巢来自哈萨克羊)，用注射器从卵巢表面直径为2-5mm的卵泡中抽取卵母细胞，在显微镜下挑选出卵母细胞，置于38.6℃、5％CO₂培养箱内进行成熟培养。

2、卵母细胞的体外受精

(1)将体外成熟24-26h的卵母细胞用0.1％透明质酸酶轻轻吹打以除去颗粒细胞，再用受精液(受精液：SOF液+体积百分含量为20％的发情羊血清+6IU/mL肝素钠+100IU/mL庆大霉素)洗涤3次，然后放入平衡好的受精液滴内(每个受精液滴为50μL受精液，放入20-30枚卵母细胞)。平衡好的受精液滴的制备方法：将受精液滴在含5％CO₂的38.6℃培养箱中，放置3-4个小时。

(2)取冷冻的精液(精液来自哈萨克羊)，解冻，然后放入38.6℃培养箱中15-20min(有活力的精子会向上游)，然后吸取上部的精液，离心5min，然后轻轻吹打混匀，得到精子混悬液(对精子混悬液进行精子计数)。

(3)将步骤(2)得到的精子混悬液加入完成步骤(1)的受精液滴中，使精子的浓度为2×10⁶个/mL，38.6℃静置孵育12h，然后用平衡好的体外培养液(体外培养液配方：TCM199培养液+体积百分含量为20％的发情羊血清+10μg/mLβ-巯基乙醇+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+1μg/mL雌激素)反复吹吸受精卵，然后按50枚/孔的密度移入四孔培养板内。平衡好的体外培养液的制备方法：将体外培养液在含5％CO₂的37℃培养箱中，放置3-4个小时。

受精后48h统计卵裂率，第8d统计囊胚率。

二、单细胞期受精卵的显微注射

1、将实施例1制备的sgRNA-2、实施例1制备的Cas9 mRNA混合，用Nuclease-freeWater稀释，得到混合液。混合液中，sgRNA-2的浓度为50ng/μL，Cas9 mRNA的浓度为100ng/μL。

2、试验处理：采用NIKON公司的显微注射仪将步骤1得到的混合液注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内，置于38.6℃、5％CO₂培养箱中培养。对照处理：采用NIKON公司的显微注射仪将无RNase水注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内，置于38.6℃、5％CO₂培养箱中培养。

3、受精卵突变检测

(1)胚胎样品收集

步骤2中培养7天后，取胚胎，用PBS缓冲液洗涤2遍，然后置于5μL裂解液中，瞬时离心后37℃裂解3h。裂解液：溶剂为Tris-HCl(50mM、pH8.0)，含0.5％(体积比)Triton X-100和1mg/mL Proteinase K。

(2)PCR扩增

以步骤(1)的裂解产物为模板，进行巣式PCR。巣式PCR中，第一轮PCR扩增采用FecB-F1和FecB-R1组成的引物对，第二轮PCR扩增采用FecB-F2和FecB-R1组成的引物对。巣式PCR产物的电泳图见图6(片段长度为538bp)。

(3)T7核酸内切酶I(T7E1)鉴定

将试验处理步骤(2)得到的PCR产物和对照处理步骤(2)得到的PCR产物进行变性退火，形成异源杂交双链。反应程序：95℃10min；85℃、75℃、65℃、55℃、45℃、35℃、25℃各1min(每个温度梯度降温速率为0.3℃/s)；10℃Pause。

得到异源杂交双链后，在体系中加入T7E1酶(购自美国NEB公司)，37℃反应30min，然后进行2％的琼脂糖电泳，结果见图7。

箭头指示试验处理出现两条切割条带(大约215bp和323bp)，而对照处理未见切割条带，证明DNA分子被Cas9和sgRNA特异性编辑。

(4)TA克隆测序比对

将T7E1酶切为阳性的PCR产物测序，分析胚胎发生编辑效率为38％(见表2)。

将上述酶切为阳性的PCR产物克隆至pMD-19T载体，随机挑取9-10个单克隆测序来精确定位突变位点。部分发生突变的胚胎的结果见表3(突变类型指的是存在几种突变形式)和图8(序列后的注释形式为“n/m”，n表示该编辑形式数量，m表示所挑取的单克隆总数)。sgRNA-2和Cas9 mRNA在绵羊胚胎中能高效特异地靶向修饰FecB基因，而且突变的类型主要为单碱基插入或小片段删除。其中46个单克隆中31个克隆发生了突变且切割位点均毗邻PAM序列，这31个突变克隆中包含4种突变形式，最长、最短的删除片段分别为16bp、6bp，也有一部分克隆含有单碱基插入，这些结果证明了CRISPR/Cas9在绵羊受精卵中可以特异性的切割DNA，为制作基因敲除动物奠定了基础。

表2 CRISPR/Cas9靶向删除FecB基因mRNA显微注射绵羊体外胚胎结果

	注射卵数(枚)	有效卵裂胚(枚)	卵裂率(％)	检测胚(枚)	突变率(％)
						试验处理	251	140	56(140/251)	88	38(33/88)
对照处理	53	48	91(48/53)	48	0(0/48)

表3 CRISPR/Cas9靶向删除FecB基因胚胎单克隆测序比对结果

Claims (9)

1.一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA，为序列表的序列6所示的RNA。

2.编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为序列表的序列5所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体。

5.一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的靶向序列，如序列表的序列3所示。

6.一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括权利要求1所述的sgRNA。

7.一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子。

8.一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括含有编码权利要求1所述的sgRNA的DNA分子的重组质粒。

9.一种特异性敲除绵羊FecB基因的方法，是将权利要求1所述的sgRNA和Cas9mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊FecB基因。