CN110938629B - 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，提供了一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品。该成套sgRNA包括Wip1‑sgRNA1和Wip1‑sgRNA2，其特异性强，可以显著减少脱靶现象，从而准确、高效地靶向修饰猪Wip1基因。该成套sgRNA特异性识别猪Wip1基因的第一外显子，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。

Description

特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品。
背景技术
野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wild-type p53-induced phosphatase 1,Wip1)首次被发现是在淋巴瘤的研究中，并被证实它和wild-type p53关系密切；同时通过免疫荧光实验，发现Wip1蛋白位于细胞核内。Wip1基因是一种新的原癌基因，其具有多方面的功能，在细胞生长发育、细胞增殖迁移、DNA损伤修复、肿瘤发生、细胞稳态、疾病、衰老等中均起着重要的调节功能。Wipl是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，人Wip1蛋白的相对分子质量为61KD，有605个氨基酸；小鼠Wip1蛋白的相对分子质量为66KD，有598个氨基酸。
Wip1在小鼠胚胎期组织内表达量较成体明显增高。研究表明Wip1基因缺失雄性小鼠的繁殖能力下降，主要原因是Wip1敲除后，精细胞中特定表达的蛋白-精蛋白显著减少。同时，Wip1在异染色质相关的DNA序列的转录调节方面起着重要的作用。此外，Wip1基因影响小鼠雄性繁殖能力，其可能是通过调控精子发生及运动发挥作用的。然而，Wip1基因在大型哺乳动物例如猪中的作用目前并没有相关的报道，有关Wip1基因对猪精子发生及运动是否发挥作用及相关分子机制研究尚属空白。因此，猪Wip1的研究成为目前关注的焦点。
建立一种可以快速、准确、有效地敲除猪Wip1基因的方法，获取纯合敲除猪Wip1基因的猪或猪源细胞，为研究猪繁殖力的遗传基础提供新的理论基础和基因标记，这不仅在家畜的繁殖领域具有广阔的应用前景；同时对人类的生殖健康也具有重要的生物学意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA，该成套sgRNA敲除效率高且特异性强。
本发明的第二目的在于提供一种用于猪Wip1基因编辑的成套DNA分子，该成套DNA分子包含编码上述成套sgRNA的DNA分子。
本发明的第三目的在于提供上述特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA或成套DNA分子的应用。
本发明的第四目的在于提供一种用于猪Wip1基因的敲除载体。
本发明的第五目的在于提供一种用于猪Wip1基因敲除的成套产品。
本发明的第六目的在于提供一种Wip1基因片段敲除的猪源细胞的构建方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA，包括Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2；
所述Wip1-sgRNA1中负责识别靶片段的核苷酸序列如下：
5’-GUGAGCGUCUUCUCCGACCA-3’(SEQ ID NO.1)；
所述Wip1-sgRNA2中负责识别靶片段的核苷酸序列如下：
5’-GGAGGACGUUACUCAGAUCG-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地，所述Wip1-sgRNA1的核苷酸序列如下：
5’-GUGAGCGUCUUCUCCGACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO.3)；
优选地，所述Wip1-sgRNA2的核苷酸序列如下：
5’-GGAGGACGUUACUCAGAUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO.4)。
一种用于猪Wip1基因编辑的成套DNA分子，包含编码上述Wip1-sgRNA1的DNA分子和编码上述Wip1-sgRNA2的DNA分子。
优选地，编码Wip1-sgRNA1中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如下：
5’-GTGAGCGTCTTCTCCGACCA-3’(SEQ ID NO.5)；
优选地，编码Wip1-sgRNA2中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如下：
5’-GGAGGACGTTACTCAGATCG-3’(SEQ ID NO.6)。
上述成套sgRNA或成套DNA分子在如下(a)-(d)中的应用：
(a)对猪Wip1基因第1外显子进行基因编辑；
(b)制备对猪Wip1基因第1外显子进行基因编辑的产品；
(c)构建Wip1基因敲除载体系统；
(d)构建纯合敲除Wip1基因的猪源细胞。
进一步地，所述猪Wip1基因第1外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
优选地，所述猪源细胞包括猪成纤维细胞。
一种用于猪Wip1基因的敲除载体，包括上述成套DNA分子。
进一步地，所述敲除载体包括Cas9/gRNA-Wip1-sg1和Cas9/gRNA-Wip1-sg2。
一种用于猪Wip1基因敲除的成套产品，包括能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料和能产生上述成套sgRNA的生物材料。
进一步地，能产生上述成套sgRNA的生物材料为本发明提供的敲除载体；
优选地，所述成套产品包括试剂或试剂盒。
一种敲除Wip1基因片段的猪源细胞的构建方法，将Cas9蛋白的mRNA和上述的成套sgRNA导入猪源细胞中，实现对猪源细胞基因组中Wip1基因第1外显子的基因敲除；
优选地，所述猪源细胞包括猪成纤维细胞；
所述猪Wip1基因第1外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA，该成套sgRNA包括Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2，其中，Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2的负责识别靶位点的片段分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。该成套sgRNA通过设计特定的负责识别靶片段的核苷酸序列，使得猪Wip1基因编辑的特异性强，在进行基因编辑时，可以显著减少脱靶现象，准确、高效地靶向修饰Wip1基因。该成套sgRNA可以通过CRISPR/Cas9系统实现猪或猪源细胞的Wip1基因编辑，可实现猪Wip1基因功能研究和新品种培育等方面的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中不同重组质粒对猪胎儿成纤维细胞的突变率；
图2为本发明实施例3中Wip1基因编辑猪的PCR检测结果，其中，M为100bp marker、1为野生猪、2为基因敲除猪。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA，包括Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2；
其中，Wip1-sgRNA1中负责识别靶片段的核苷酸序列如下：
5’-GUGAGCGUCUUCUCCGACCA-3’(SEQ ID NO.1)；
Wip1-sgRNA2中负责识别靶片段的核苷酸序列如下：
5’-GGAGGACGUUACUCAGAUCG-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明提供的成套sgRNA特异性强，在进行基因编辑时，可以显著减少脱靶现象，简单、准确、高效和定点的靶向修饰Wip1基因第1外显子上的一小段DNA序列，使蛋白质发生移码突变从而实现Wip1基因缺失。该成套sgRNA可以通过crisper cas9系统实现猪或猪源细胞的Wip1基因编辑，对研究猪繁殖力的遗传基础具有重要意义。
可选地，Wip1-sgRNA1的核苷酸序列如下：
5’-GUGAGCGUCUUCUCCGACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO.3)；
可选地，Wip1-sgRNA2的核苷酸序列如下：
5’-GGAGGACGUUACUCAGAUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明提供的Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2分别由96个核苷酸组成，其中5’末端20nt的RNA片段(分别命名为Wip1-sg1和Wip1-sg2)可以识别染色体上特定的DNA序列，其余76nt称为骨架RNA片段。
一种用于猪Wip1基因编辑的成套DNA分子，包含编码本发明提供的成套sgRNA的DNA分子。本发明提供的成套DNA分子能够分别转录得到Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2，将该成套DNA分子导入猪源细胞中与Cas9蛋白共同实现猪Wip1基因编辑。
在优选地实施方式中，编码Wip1-sgRNA1中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如下：
5’-GTGAGCGTCTTCTCCGACCA-3’(SEQ ID NO.5)；
编码Wip1-sgRNA2中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如下：
5’-GGAGGACGTTACTCAGATCG-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明还保护上述成套sgRNA或成套DNA分子在如下(a)-(d)中的应用：
(a)对猪Wip1基因第1外显子进行基因编辑；
(b)制备对猪Wip1基因第1外显子进行基因编辑的产品；
(c)构建Wip1基因敲除载体系统；
(d)构建纯合敲除Wip1基因的猪源细胞。
可选地，猪Wip1基因第1外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
5’-GCAGCTGCTAGGCTCCGCTTGCCCGGGCGCTCCGGCCCAGCTCTCGCGGACAAGTCCCGACATCGCGCCCCCCACCTCCGGGACCGCCCCCTCCCCCTTCTCGGCGTCGTCGAAGATAAACAATAGTTGGCCGGCTAGCGCCGAGTGTCTCCCGCCGCTCGGCGGGCTGCGTGGGACCGGCGGGATCTCGGCCAGCCGGCCATGGCGGGGCTGTACTCACTGGGAGTGAGCGTCTTCTCCGACCAGGGCGGGAGGAAGTACATGGAGGACGTTACTCAGATCGTGGTGGAGCCCGAGCCGACAACTGAAGAAAAGCCCTCGCCGCGGCGGTCGCTTTCTCAGCCGTCGCCCCCGCAGCGGACACCGCCGGCCCTTCCTGGAGGCGAAGTCTCGGGGAAAGGCCCAGCGGTGGCAGCCCGAGAAGCTCGCGACGCTCCGCCGGACGCCGGGGCCTCGCCAGCTCCCGGCCGCTGCTGCCGCCGCCGTTCCTCGGTGGCCTTTTCGCCGTGTGCGACGGGCACGGCGGGCGGGAGGCGGCACAGTTTGCCCGGGAGCACTTGTGGGGTTTCATCAAAAAACAGAAGGGCTTCACCTCGTCCGAGCCGGCGAAGGTGTGCGCTGCCATCCGCAAGGGCTTCCTTGCTTGTCACCTCGCCATGTGGAAGAAATTGGGTAAGTTCCCCGGCTTATTTGGCGCCCGCCTCTTTTTCAGGAGACTGTAGCGCCAGGTTGGGGGCCGTAGCTGCAGCACTGCAGGTCCCCACAACGAGAGCGCTCTCAGTGTCCATCGGTGGGAGTGAAGACTCTTCTAGGTGGAGGTCCGGGCAAACAAAGTAGCTTTGGGCAGGACAGGATTA-3’(SEQ ID NO.7)。
可选地，猪源细胞包括猪成纤维细胞，进一步为猪胎儿成纤维细胞。
本发明还保护一种用于猪Wip1基因的敲除载体，包括本发明提供的成套DNA分子。例如，将编码Wip1-sgRNA1的DNA分子和编码Wip1-sgRNA2的DNA分子分别与载体骨架重组，得到重组质粒，即为敲除载体。优选地，敲除载体为Cas9/gRNA-Wip1-sg1和Cas9/gRNA-Wip1-sg2。
本发明还保护一种用于猪Wip1基因敲除的成套产品，包括能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料和能产生本发明成套sgRNA的生物材料。该成套产品可以通过简单、快速、定点、高效地敲除猪Wip1基因第1外显子上的一小段DNA序列，实现Wip1基因沉默。本发明中，生物材料可以为表达盒，表达载体，重组细胞等等。
在优选地实施方式中，能产生成套sgRNA的生物材料为本发明提供的敲除载体。成套产品例如为试剂或试剂盒。
一种Wip1基因片段敲除的猪源细胞的构建方法，将Cas9蛋白的mRNA和本发明提供的成套sgRNA导入猪源细胞中，实现对猪源细胞基因组中Wip1基因第1外显子的基因敲除。需要说明的是，本发明提供的成套sgRNA可以实现Wip1基因第1外显子的基因敲除，即实现Wip1基因片段敲除，实现Wip1基因沉默。
可选地，猪源细胞包括猪成纤维细胞。猪Wip1基因第1外显子的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1成套靶向Wip1基因的sgRNA表达质粒的构建
利用北京唯尚立德生物科技有限公司的cas9/gRNA构建试剂盒(Catalog.No.VK001-01)完成构建，构建过程如下：
(1)根据猪Wip1基因的两个靶点序列，设计相应的引物序列，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，具体序列见表1：
表1两个sgRNA引物序列
核苷酸名称 序列(5’-3’) 序列号
Wip1-sg1-F aaacaccgGTGAGCGTCTTCTCCGACCA SEQ ID NO.8
Wip1-sg1-R ctctaaaacTGGTCGGAGAAGACGCTCAC SEQ ID NO.9
Wip1-sg2-F aaacaccgGGAGGACGTTACTCAGATCG SEQ ID NO.10
Wip1-sg2-R ctctaaaacCGATCTGAGTAACGTCCTCC SEQ ID NO.11
(2)寡核苷酸二聚体(oligoduplex)的形成
将合成的oligo分别稀释成10μM，分别按如下比例混合：
物质 体积
Wip1-sg1-F 1μL
Wip1-sg1-R 1μL
Solution1 5μL
H<sub>2</sub>O 3μL
最终体系 10μL
分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-1。
物质 体积
Wip1-sg2-F 1μL
Wip1-sg2-R 1μL
Solution1 5μL
H<sub>2</sub>O 3μL
最终体系 10μL
分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-2。
(3)寡核苷酸二聚体分别插入到载体中
在以下反应体系中进行反应：
Figure BDA0002325641380000091
Figure BDA0002325641380000101
充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-Wip1-sg1。
在以下反应体系中进行反应：
物质 体积
Cas9/gRNA Vector 1μL
oligoduplex-2 2μL
H<sub>2</sub>O 7μL
最终体系 10μL
充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-Wip1-sg2。
(4)转化
分别取步骤(3)的最终产物(载体Cas9/gRNA-Wip1-sg1、Cas9/gRNA-Wip1-sg2)5μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟后，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，直接涂于氨苄抗性的平板。
(5)验证
挑取白色菌落摇菌，提取质粒DNA送北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。测序引物为：5’-TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3’(SEQ ID NO.12)，测序结果表明，通过上述操作能顺利将编码sgRNA的DNA序列插入到Cas9/gRNA载体骨架中。随后，大量提取质粒，所提的质粒用于细胞的转染。
实施例2片段敲除Wip1基因猪胎儿成纤维细胞系的建立
1、sgRNA表达质粒的效率验证
(1)细胞转染
转染前一天将原代梅山猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。转染步骤严格按照Basic Primary FibroblastsNucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。具体来讲，将通过实施例1取得的重组质粒Cas9/gRNA-Wip1-sg1与Cas9/gRNA-Wip1-sg2各5μg，通过电转的方式分别转染猪胎儿成纤维细胞，以及两个重组质粒共转染，得到3种重组细胞。
(2)打靶效率的检测
电转染后的细胞培养48h后，一部分用于铺板，另外收集部分细胞，提取细胞基因组，进行PCR扩增，以检测打靶效率。
以提取的细胞基因组为模板，用Wip1-F(SEQ ID NO.13)与Wip1-R(SEQ ID NO.14)组成的引物对进行PCR扩增，其中Wip1基因的引物如下：
Wip1-F：5’-GCGGACAAGTCCCGACATCG-3’(SEQ ID NO.13)；
Wip1-R：5’-CCCCGAGACTTCGCCTCCAG-3’(SEQ ID NO.14)。
扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带。
回收的PCR扩增产物与PcloneEz-Topo载体(Clone Smarter，C5865-50)连接，获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，然后涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的固体培养基平板上进行培养。三组分别随机挑取21个克隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而算出重组质粒Cas9/gRNA-Wip1-sg1与Cas9/gRNA-Wip1-sg2的突变率，以及共转染质粒的敲除效率。
结果如图1所示，Cas9/gRNA-Wip1-sg1的突变率为38.1％(21个克隆里有8个发生突变)，Cas9/gRNA-Wip1-sg2质粒的效率为33.3％(21个克隆里有7个发生突变)，共转染质粒的突变率达到76.2％(21个克隆里有16个发生突变)，其中片段敲除效率为61.9％(21个克隆里有13个是敲除的)，纯合敲除效率为57.1％(21个克隆里有12个是纯合敲除的)。
该结果表明：本发明提供的成套sgRNA能高效的识别猪Wip1位点，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割。值得一提的是，共转染质粒的效率比单独转染一个质粒的切割效率都要高，片段敲除效率可达到61.9％。
(3)阳性单克隆细胞系的筛选
电转48h后细胞汇合度大约为90％左右时以适宜的密度铺板，每3天更换一次培养液。铺板后的细胞大约培养10天左右，观察到合适大小的克隆点形成。将单克隆细胞进行扩大培养，并进行基因型鉴定，获得多株Wip1双等位基因片段敲除的猪胎儿成纤维细胞系。
实施例3体细胞核移植技术制备片段敲除Wip1基因的基因编辑猪的方法
以实施例2获得的细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠。胚胎移植后，技术人员注意观察其返情情况，定期检查受体母猪妊娠情况。采集出生后的仔猪耳组织，提取其基因组，并以提取的基因组为模板，利用引物Wip1-F和Wip1-R进行扩增，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带。
结果如图2所示，电泳结果表明该实验成功获得片段敲除的Wip1基因编辑猪，其中，M为100bp marker、1为野生猪、2为基因敲除猪。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gugagcgucu ucuccgacca 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaggacguu acucagaucg 20
<210> 3
<211> 96
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
gugagcgucu ucuccgacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 4
<211> 96
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaggacguu acucagaucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgagcgtct tctccgacca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaggacgtt actcagatcg 20
<210> 7
<211> 857
<212> DNA
<213> 猪Wip1基因第1外显子
<400> 7
gcagctgcta ggctccgctt gcccgggcgc tccggcccag ctctcgcgga caagtcccga 60
catcgcgccc cccacctccg ggaccgcccc ctcccccttc tcggcgtcgt cgaagataaa 120
caatagttgg ccggctagcg ccgagtgtct cccgccgctc ggcgggctgc gtgggaccgg 180
cgggatctcg gccagccggc catggcgggg ctgtactcac tgggagtgag cgtcttctcc 240
gaccagggcg ggaggaagta catggaggac gttactcaga tcgtggtgga gcccgagccg 300
acaactgaag aaaagccctc gccgcggcgg tcgctttctc agccgtcgcc cccgcagcgg 360
acaccgccgg cccttcctgg aggcgaagtc tcggggaaag gcccagcggt ggcagcccga 420
gaagctcgcg acgctccgcc ggacgccggg gcctcgccag ctcccggccg ctgctgccgc 480
cgccgttcct cggtggcctt ttcgccgtgt gcgacgggca cggcgggcgg gaggcggcac 540
agtttgcccg ggagcacttg tggggtttca tcaaaaaaca gaagggcttc acctcgtccg 600
agccggcgaa ggtgtgcgct gccatccgca agggcttcct tgcttgtcac ctcgccatgt 660
ggaagaaatt gggtaagttc cccggcttat ttggcgcccg cctctttttc aggagactgt 720
agcgccaggt tgggggccgt agctgcagca ctgcaggtcc ccacaacgag agcgctctca 780
gtgtccatcg gtgggagtga agactcttct aggtggaggt ccgggcaaac aaagtagctt 840
tgggcaggac aggatta 857
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaacaccggt gagcgtcttc tccgacca 28
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctctaaaact ggtcggagaa gacgctcac 29
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaacaccggg aggacgttac tcagatcg 28
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctctaaaacc gatctgagta acgtcctcc 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcag 29
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcggacaagt cccgacatcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccccgagact tcgcctccag 20

Claims (13)

1.一种特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA，其特征在于，由Wip1-sgRNA1和Wip1-sgRNA2组成；
所述Wip1-sgRNA1中负责识别靶片段的核苷酸序列如下：
5’-GUGAGCGUCUUCUCCGACCA-3’(SEQ ID NO.1)；
所述Wip1-sgRNA2中负责识别靶片段的核苷酸序列如下：
5’-GGAGGACGUUACUCAGAUCG-3’(SEQ ID NO.2)；所述Wip1-sgRNA1的核苷酸序列如下：
5’-GUGAGCGUCUUCUCCGACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO.3)；
所述Wip1-sgRNA2的核苷酸序列如下：
5’-GGAGGACGUUACUCAGAUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3’(SEQ ID NO.4)。
2.一种用于猪Wip1基因编辑的成套DNA分子，其特征在于，由编码权利要求1所述的成套sgRNA的DNA分子组成；
编码Wip1-sgRNA1中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如下：
5’-GTGAGCGTCTTCTCCGACCA-3’(SEQ ID NO.5)；
编码Wip1-sgRNA2中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如下：
5’-GGAGGACGTTACTCAGATCG-3’(SEQ ID NO.6)。
3.权利要求1所述的成套sgRNA或权利要求2所述的成套DNA分子在如下(a)-(d)中的应用：
(a)对猪Wip1基因第1外显子进行基因编辑；
(b)制备对猪Wip1基因第1外显子进行基因编辑的产品；
(c)构建Wip1基因敲除载体系统；
(d)构建纯合敲除Wip1基因的猪源细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述猪Wip1基因第1外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪源细胞包括猪成纤维细胞。
6.一种用于猪Wip1基因的敲除载体，其特征在于，包括权利要求2所述的成套DNA分子。
7.根据权利要求6所述的敲除载体，其特征在于，所述敲除载体包括Cas9/gRNA-Wip1-sg1和Cas9/gRNA-Wip1-sg2。
8.一种用于猪Wip1基因敲除的成套产品，其特征在于，包括能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料和能产生权利要求1所述的成套sgRNA的生物材料。
9.根据权利要求8所述的成套产品，其特征在于，能产生权利要求1所述的成套sgRNA的生物材料为权利要求6或7所述的敲除载体。
10.根据权利要求9所述的成套产品，其特征在于，所述成套产品包括试剂或试剂盒。
11.一种敲除Wip1基因片段的猪源细胞的构建方法，其特征在于，将Cas9蛋白的mRNA和权利要求1所述的成套sgRNA导入猪源细胞中，实现对猪源细胞基因组中Wip1基因第1外显子的基因敲除。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述猪源细胞包括猪成纤维细胞。
13.根据权利要求11或12所述的构建方法，其特征在于，所述猪Wip1基因第1外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
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