CN117587008A - 靶向Rbmxl2基因的核酸产品和少弱畸形精子症动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种靶向Rbmxl2基因的核酸产品和少弱畸形精子症动物模型的构建方法。所述核酸产品包括第一gRNA和第二gRNA；所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。采用本申请的核酸产品构建得到的动物模型能够用于研究Rbmxl2基因功能以及男性少弱畸形精子症之间的分子机制，为临床诊断和治疗提供新的参考。
Description
技术领域
本申请涉及动物模型技术领域，特别是涉及一种靶向Rbmxl2基因的核酸产品和少弱畸形精子症动物模型的构建方法。
背景技术
少、弱、畸形精子症是男性不育的常见原因之一。引起男性少、弱、畸形精子症的原因包括：环境影响、生活和作息习惯以及遗传因素等，其中约15%的男性不育患者是由于遗传因素引起的。
研究发现与精子发生相关的基因超过2000个。目前，在动物模型中已证实有400多个基因可以导致雄性不育，在人体中已证实有100多个基因可以导致男性不育。然而，尚有许多男性不育患者的致病机制尚不明确。因此，寻找新的致病基因和新的动物模型对于临床诊断和治疗男性不育相关疾病具有重要意义。
发明内容
基于此，本申请一个或者多个实施例提供了一种靶向Rbmxl2基因的核酸产品和少弱畸形精子症动物模型的构建方法。技术方案包括：
根据本申请的第一方面，提供了一种靶向Rbmxl2基因的核酸产品，所述核酸产品包括第一gRNA和第二gRNA；
所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
根据本申请的第二方面，提供了一种Rbmxl2基因编辑系统，所述编辑系统包括上述的核酸产品；
可选地，所述编辑系统还包括Cas9核酸酶、Cas9mRNA和Donoroligo中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述Donor oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
根据本申请的第三方面，提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括上述的靶向Rbmxl2基因的核酸产品或上述的Rbmxl2基因编辑系统。
根据本申请的第四方面，提供了一种少弱畸形精子症动物模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
用上述的Rbmxl2基因编辑系统构建少弱畸形精子症动物模型。
在其中一个实施例中，所述构建方法包括如下步骤：
将所述Rbmxl2基因编辑系统转入目标动物的受精卵内；
将转入所述Rbmxl2基因编辑系统的受精卵移植到雌性动物体内并产出F0代；以及
将所述F0代与野生型进行交配，获得F1代杂合子，将F1代杂合子进行自交，筛选出纯合的F2代作为少弱畸形精子症动物模型。
在其中一个实施例中，所述转入的方法包括显微注射。
在其中一个实施例中，所述构建方法还包括如下步骤：
使用核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示的引物对鉴定所述动物模型的基因型。
在其中一个实施例中，鉴定的方法包括PCR和Sanger测序中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述目标动物包括小鼠或大鼠。
与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：
本申请在临床上发现一例携带Rbmxl2 p.P7S突变的少弱畸形精子症患者。针对该突变位点，本申请设计得到特异性gRNA，能够特异性地敲入Rbmxl2 p.P7S突变，从而构建得到雄性不育的动物模型。该模型能够用于研究Rbmxl2基因功能以及男性少弱畸形精子症之间的分子机制，为临床诊断和治疗提供新的参考。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1中gRNA靶向位点的示意图；
图2为本申请实施例1中野生型小鼠、杂合型小鼠以及纯合型小鼠的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本申请实施例1中野生型小鼠、杂合型小鼠以及纯合型小鼠的Sanger测序峰图；
图4为本申请实施例1中野生型小鼠以及纯合型小鼠的精子数量统计图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
Cas9 mRNA可瞬时表达Cas9蛋白酶，Cas9蛋白酶的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。
规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，由多个规律性短重复回文序列与非重复间隔序列构成的R-S结构和及编码Cas9核酸酶的基因操纵子组成，通过导向RNA（sgRNA）介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。由于其具有特异性高、分子构建简单、流程短等特点，近年来CRISPR/Cas9技术获得了快速发展。与锌指核酸酶（ZFN）技术和类转录样效应因子核酸酶（TALEN）技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
基因敲入（Knock-in）是指当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行同源重组修复（HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。
根据本申请的第一方面，提供了一种靶向Rbmxl2基因的核酸产品，核酸产品包括第一gRNA和第二gRNA；
第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；第二gRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
具体地，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：5’-ATGGTTGAAGCCGACCGTCCAGG-3’;SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为：5’-GAAGAGCTTCCCTGGACGGTCGG-3’。
申请人通过临床研究发现一例携带c.19C>T（p.P7S）突变的少弱畸形精子症患者，针对该突变位点的上下游分别设计得到特定序列的第一gRNA和第二gRNA，第一gRNA和第二gRNA能够结合Crispr/Cas9系统特异性地将突变位点敲入，制备得到模拟人Rbmxl2 c.19C>T突变的Rbmxl2基因敲入动物模型，与野生型小鼠相比，其生育力明显降低。
本申请采用双gRNA策略，确保能够有效地敲入目的基因突变，从而制备得到携带特定基因突变位点的动物模型。
根据本申请的第二方面，提供了一种包括上述核酸产品的Rbmxl2基因编辑系统。
在其中一些实施例中，Rbmxl2基因编辑系统还包括Cas9核酸酶、Cas9 mRNA和Donor oligo中的一种或多种。可理解地，Rbmxl2基因编辑系统可以包含上述任意一种、任意两组的组合或者三种的组合。
Donor oligo是一种与突变位点上下游紧邻序列具有高度同源的DNA模板，选择合适的Donor oligo对同源重组的效率具有重要的影响。
Donor DNA模板对同源重组的效率具有重要的影响。在实验过程中需要考虑以下因素：（1）插入位点与双链DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）的距离。距离不应该超过100bp，而最理想的距离是在10bp以内。如果超过这个距离，重组效率会大大降低。（2）敲入片段的长度。短片段的敲入（如Tag标签等）可以使用ssODN。长片段的敲入则需要dsDNA质粒作为修复模板，需要注意的是敲入的片段不能过长，一般不超过5kb（包含抗性和荧光筛选），过长会降低重组效率。（3）同源臂的长度。一般而言，加长同源臂能一定程度上提高重组效率。并且插入的片段越大，所需要的同源臂长度越长，而同源臂一般选取约1500bp较为合适。（4）同源臂模板的选择。同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源，降低重组效率。
在一个具体示例中，Donor oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
具体地，SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为5’- TTCACCACCTCAATCGCCGCTGCTGCCGTCGCTGCTGCCGACATGGTTGAAGCCGACCGTTCAGGGAAGCTCTTCATCGGCGGTCTCAACCTCGAGACCGACGAGAAGGGCCTCGAAACCGCT-3’。
根据本申请的第三方面，提供了一种包括上述靶向Rbmxl2基因的核酸产品或上述Rbmxl2基因编辑系统的重组细胞。
可理解地，通过Rbmxl2基因编辑系统对细胞的Rbmxl2基因进行编辑，获得的重组细胞可以通过细胞分裂的方式将突变的基因型传递给子代细胞，具有稳定性和可遗传性。
根据本申请的第四方面，提供了一种少弱畸形精子症动物模型的构建方法，包括步骤S10~S40。
步骤S10：针对目标动物的Rbmxl2基因设计第一gRNA、第二gRNA和Donor oligo。
在其中一些实施例中，针对目标动物Rbmxl2 c.19C>T突变位点的上下游分别设计第一gRNA和第二gRNA。
在一个具体示例中，第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
采用上述特定核苷酸序列的gRNA，结合Crispr/Cas9系统，能够将Rbmxl2基因的突变位点特异性地敲入目标动物的基因组内，从而构建得到携带Rbmxl2基因突变的动物模型。
步骤S20：将第一gRNA、第二gRNA和Cas9 mRNA共同转入目标动物的受精卵内。
在其中一些实施例中，转入的方法为显微注射。
步骤S30：将受精卵移植到雌性动物体内，产出F0代。
步骤S40：将F0代与野生型进行交配，获得F1代杂合子，将F1代杂合子进行自交，筛选出纯合的F2代作为少弱畸形精子症动物模型。
在其中一些实施例中，目标动物包括小鼠或大鼠。可选地，目标动物为小鼠。
在其中一些实施例中，上述构建方法还包括步骤S50。
步骤S50：鉴定目标动物的基因型。
在其中一些实施例中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示的引物对鉴定目标动物的基因型。
具体地，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为：5’-CTTTCTTTCTTCTTCGCCTAACGG-3’;SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为：5’-GTGGCTTGGGCCACTTTGAT-3’。
在其中一些实施例中，鉴定的方法包括PCR和Sanger测序中的一种或多种。
在一个具体示例中，鉴定目标动物的基因型，包括步骤S51~S55。
步骤S51：提取小鼠脚趾或尾巴的基因组DNA。
步骤S52：以小鼠脚趾或尾巴的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。
步骤S53：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
步骤S54：对扩增产物进行测序。
步骤S55：根据琼脂糖凝胶电泳的结果或者测序的结果，鉴定目标动物的基因型。
在其中一些实施例中，PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸40s，共循环35次；72℃延伸5min，4℃保存。
本申请的少弱畸形精子症动物模型的构建方法，至少具有简单易操作、成本低、快速高效等优点。
采用上述方法构建得到的动物模型，能够模拟少弱畸形精子症患者的c.19C>T（p.P7S）突变，为临床上研究少弱畸形精子症的发病机制、寻找治疗药物提供有效的动物模型。
根据本申请的第四方面，提供了一种采用上述的少弱畸形精子症动物模型的构建方法构建得到的少弱畸形精子症动物模型在筛选治疗少弱畸形精子症的药物中的应用。
少弱畸形精子症动物模型的构建，能够帮助科研人员寻找与疾病相关的潜在靶点，对研究疾病的致病机理和药物筛选有重要作用。
下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。以下具体实施例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售，所涉及到的工艺，如无特殊说明，均为本领域技术人员常规选择。
实施例1：
（1）申请人在临床上发现一例携带Rbmxl2基因突变的少弱畸形精子症患者，该患者Rbmxl2基因的第1号外显子上包含一处c.19C>T（p.P7S）突变。
Rbmxl2（RNA binding motif protein, X-linked-like 2）编码一个RNA结合蛋白，被认为参与mRNA的剪切调控。其定位于小鼠第7号染色体上，在小鼠中有1个转录本（NM_029660），全长为1472bp，包含1个外显子，编码的蛋白质包含385个氨基酸残基。
（2）序列设计
针对Rbmxl2基因c.19C>T突变位点设计双gRNA（包括第一gRNA和第二sgRNA），第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。设计并合成一段与特异性靶点上下游紧邻序列具有高度同源的DNA模板（Donor oligo），核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。gRNA和Donor oligo的构建策略如图1所示，序列信息如表1所示。
表1
（3）显微注得F0代小鼠
将特异性靶点gRNA-A1、gRNA-A2、Donor oligo和Cas9 mRNA通过显微注射注入小鼠受精卵内，将显微注射后的受精卵移植到母鼠子宫内，孕育出生的小鼠即为F0代小鼠。
（4）F1代小鼠的繁殖
将步骤（2）中性成熟的F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，得到F1代杂合子小鼠（Rbmxl2+/-）。
（5）F2代小鼠的繁殖
F1代杂合子小鼠杂交，获得F2代纯合子小鼠（Rbmxl2-/-），即携带Rbmxl2 c.19C>T突变的基因敲入小鼠模型。
（6）小鼠鉴定
F0代、F1代以及F2代小鼠出生10天后，分别剪尾，使用天根公司的gDNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，DP304-03）提取尾巴样品中的gDNA。具体步骤如下：
小鼠脚趾或尾巴样品中加入200μL缓冲液GA，使用酒精消毒的剪刀将组织剪碎；加入20μL Proteinase K溶液，上下颠倒混匀；将EP管插入浮漂中并置于56℃水浴箱内水浴1h，期间颠倒混匀1次；加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min；加人200μL无水乙醇，上下颠倒混匀后再于振荡器上剧烈震荡15sec；将上述混合液移入吸附柱，12000rpm/min离心30sec，弃收集管，并将吸附柱放入新的收集管；向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，上下颠倒混匀后，12000rpm/min离心30sec，弃收集管并将吸附柱放入全新收集管；向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，上下颠倒混匀后，12000rpm/min离心30sec，弃收集管并将吸附柱放入全新收集管，重复一次；将吸附柱于12000rpm/min空离2min，弃收集管并将吸附柱放入全新1.5mL EP管，晾干5min；向吸附膜的中间部位悬空滴加250μL TE，室温静置5min后，12000rpm/min离心1min，弃吸附柱，盖好EP管，并做好标记。
以gDNA为模板，采用SEQ ID NO:4~5所示的引物对（核苷酸序列如表2所示）进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系如表3所示，反应程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸40s，共循环35次；72℃延伸5min，4℃保存。
表2
表3
采用2%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示：图2中R12-HOM-Z和R12-HOM-W为纯合子小鼠，R14-HET-Z和R14-HET-Z为杂合子小鼠，R15-WT-Z和R15-WT-W为野生型小鼠。纯合子小鼠、杂合子小鼠和野生型小鼠的扩增产物均为600bp，电泳检测出目的条带即可将扩增产物送测序。
将扩增产物送往擎科生物科技有限公司（北京，中国）进行Sanger测序验证。采用分析软件Chromas对测序结果进行分析，使用在线网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行序列比对。纯合子小鼠的测序峰图如图3所示：R12为纯合子小鼠，R14为杂合子小鼠，R15为野生型小鼠，纯合子小鼠的Rbmxl2基因中，第19号碱基被替换为T。
（7）精子数量统计
通过收集小鼠附睾尾部的精子，使用计算机辅助精液分析系统（CASA）对F2代纯合子小鼠（Rbmxl2-/-）和WT小鼠（Rbmxl2+/+）的精子数量进行统计，结果如图4所示：与野生型小鼠相比，本实施例构建得到的Rbmxl2敲除纯合小鼠的精子数量显著降低（**代表p＜0.01）。
此外，通过小鼠合笼实验证明纯合子小鼠的生育力明显低于野生型小鼠；通过染色观察也发现纯合子小鼠的精子数量减少。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种靶向Rbmxl2基因的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括第一gRNA和第二gRNA；
所述第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二gRNA的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
2.一种Rbmxl2基因编辑系统，其特征在于，所述编辑系统包括权利要求1所述的核酸产品；
可选地，所述编辑系统还包括Cas9核酸酶、Cas9 mRNA和Donor oligo中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的Rbmxl2基因编辑系统，其特征在于，所述Donor oligo的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求1所述的靶向Rbmxl2基因的核酸产品或权利要求2~3任一项所述的Rbmxl2基因编辑系统。
5.一种少弱畸形精子症动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
用权利要求2~3任一项所述的Rbmxl2基因编辑系统构建少弱畸形精子症动物模型。
6.根据权利要求5所述的少弱畸形精子症动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
将所述Rbmxl2基因编辑系统转入目标动物的受精卵内；
将转入所述Rbmxl2基因编辑系统的受精卵移植到雌性动物体内并产出F0代；以及
将所述F0代与野生型进行交配，获得F1代杂合子，将F1代杂合子进行自交，筛选出纯合的F2代作为少弱畸形精子症动物模型。
7.根据权利要求6所述的少弱畸形精子症动物模型的构建方法，其特征在于，所述转入的方法包括显微注射。
8.根据权利要求6~7任一项所述的少弱畸形精子症动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：
使用核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示的引物对鉴定所述动物模型的基因型。
9.根据权利要求8所述的少弱畸形精子症动物模型的构建方法，其特征在于，鉴定的方法包括PCR和Sanger测序中的一种或多种。
10.根据权利要求6~7和9任一项所述的少弱畸形精子症动物模型的构建方法，其特征在于，所述目标动物包括小鼠或大鼠。
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