CN117778465A - Idh1基因突变小鼠模型的构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法和应用，该方法包括将Idh1基因编码的蛋白质氨基酸序列中第208位的氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸，进一步，所述Idh1基因突变包括：Idh1基因序列的第623位核苷酸由A突变为G，进一步通过CRISPR/Cas9技术制备Idh1基因突变小鼠模型，包括使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的F0代小鼠。本申请的构建方法简单高效，特异性强，该方法制得的Idh1基因突变小鼠模型的可用于筛选治疗雌性不孕的药物。

Description

Idh1基因突变小鼠模型的构建方法和应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法和应用。

背景技术

辅助生殖技术是目前提高患者受孕率最有效的治疗手段之一，为提高辅助生殖技术成功率，有必要从基因层面了解卵母细胞减数分裂成熟、受精及早期胚胎发育的过程。

在卵子发生的过程中，表达产生的mRNA或蛋白质等均储存在卵母细胞中，并编码指导胚胎发育的信号分子（转录因子、受体或翻译调节蛋白），这类基因称为母源效应基因（MEG）。哺乳动物中MEGs的破坏会导致胚胎发生缺陷。近年来基于全外显子测序技术成本的下降及分析水平的日渐成熟，结合辅助生殖技术的发展，包括TLE6在内的33个MEGs突变与女性不孕症的关系相继被阐明，然而对于这些基因的功能及其特定位点发挥的作用现在的了解还不充分。

为更加充分详细的了解导致女性不孕相关的基因，为女性不孕提供新的诊断和治疗思路，我们仍需进一步对相关致病基因及其可能的致病位点进行挖掘和功能探究。

发明内容

本申请在研究小鼠的卵子发生过程中发现小鼠卵巢氧化应激会降低窦卵泡颗粒细胞IDH1的表达，IDH1蛋白是在细胞质和过氧化物酶体中发现的NADP(+)依赖性异柠檬酸脱氢酶，在NADPH的生成中起关键作用，而NADPH是许多生物合成途径中的重要辅助因子。IDH1蛋白由Idh1基因编码，Idh1基因位于2号染色体上，全长2313bp，氨基酸序列包括414个氨基酸残基。目前，IDH1突变在许多癌症类型中被观察到，然而，关于Idh1基因与生殖的相关研究非常有限。

为了更好的研究Idh1基因与生殖相关的重要作用，本申请提供了一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法和其应用。

以下是对本申请技术方案的说明：

一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其包括：将Idh1基因编码的IDH1蛋白的第208位的氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸。

进一步，所述Idh1基因突变包括：Idh1基因全长序列的第623位核苷酸由A突变为G。

进一步，所述Idh1基因突变还包括：Idh1基因全长序列的第629位~621位同义突变。

在其中一实施例中，通过CRISPR/Cas9技术制备Idh1基因突变小鼠模型，包括使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠；

所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列；

所述sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列；

所述Donor oligo包含如SEQ ID No.3所示的序列。

进一步，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括：

将载有编码Cas9 mRNA和sgRNA的DNA序列的载体，与Idh1基因点突变Donor oligo模板注射入小鼠受精卵后移植代孕，生产子代，获得F0代小鼠；

可选地，对所述子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为所述F0代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

进一步，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括还包括：

将所述F0代小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代小鼠；

可选地，对所述F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到的子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为所述F1代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

进一步，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括还包括：

将所述F1代小鼠自交，获得F2代小鼠；

可选地，对所述F1代小鼠自交得到的子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为所述F2代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

在其中一实施例中，所述基因测序所使用的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID No .4和SEQ ID No .5所示。

本申请还提供上述任一技术方案所述的构建方法制得的小鼠模型在开发治疗与Idh1基因缺陷相关疾病的药物中的应用。

进一步所述与Idh1基因缺陷相关疾病包括雌性不孕症。

小鼠Idh1基因(NM_001111320.11；p.Y208C)位于其第5号外显子。本申请以第5号外显子特异性靶点，突变位点通过同源定向修复引入第5号外显子，构建Idh1基因突变小鼠模型，有望用于开发治疗与Idh1基因缺陷相关疾病的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请一实施例中基因序列的示意图，全长27.885kb，灰色区域代表开放读码框，空白区域代表非翻译区，E2、E5和E9分别指第2、5和9号外显子；

图2是本申请一实施例Idh1基因突变小鼠的琼脂糖凝胶电泳结果图；图2中的maker和M指预染蛋白，WT指野生型，16-23指基因突变型，Water指空白对照；

图3是本申请一实施例构建Idh1基因突变小鼠模型的基因测序结果图；图3中WT指野生型，MT指突变型；

图4是本申请一实施例Idh1基因突变小鼠模型的生育力验证结果图；图4中横坐标代表基因型不同的小鼠，对照组为野生型小鼠，实验组为纯合突变小鼠，N为参与统计雌鼠数量，纵坐标为每只雌鼠平均产仔数。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请的技术方案进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。

本文中涉及“多个”、“多种”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本文中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本文中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。

本文中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃的范围内波动。

术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下），所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，在一些实施方案中，引物范围为10-100或更多个核苷酸（例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50个核苷酸等）。

在本申请的一个方面，提供了一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其包括：将Idh1基因编码的IDH1蛋白的第208位的氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸。

进一步，Idh1基因突变包括：第623位核苷酸由A突变为G。

进一步，Idh1基因突变还包括：Idh1基因全长序列的第619位~621位同义突变。引入同义突变，可以防止同源定向修复后gRNA对序列的结合和重新切割。

在其中一实施例中，IDH1蛋白的第207位对应的核苷酸TTG突变为CTT，TTG和CTT所编码的氨基酸均为亮氨酸。

在其中一实施例中，通过CRISPR/Cas9技术制备Idh1基因突变小鼠模型。规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，由多个规律性短重复回文序列与非重复间隔序列构成的R-S结构和及编码Cas9核酸酶的基因操纵子组成，通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点，近年来CRISPR/Cas9技术获得了快速发展。

使用CRISPR/Cas9技术进行基因突变需要两个关键因素，首先是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(ZFN)技术和类转录样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性，Mizuno等应用CRISPR/Cas9基因突变技术成功构建了白化病小鼠模型，Xue等通过尾静脉高压注射方式敲除pten基因，获得了肝功能异常疾病小鼠模型，可帮助人们发现相关疾病的潜在治疗靶点，对研究疾病的致病机理和药物筛选有重要作用。

本申请一实施例通过CRISPR/Cas9技术制备Idh1基因突变小鼠模型包括使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的F0代小鼠，sgRNA和Donor oligo将突变位点通过同源定向修复引入第5外显子。

图1是本申请一实施例小鼠Idh1位点的基因组区域的示意图。

本申请一实施例利用CRISPR/Cas9技术构建Idh1基因突变小鼠模型的原理是针对Idh1基因（NM_001111320.11；p.Y208C）第5号外显子，设计sgRNA序列，使其可以特异性靶向第5号外显子进行切割。

在其中一实施例中，sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列，sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列。

Donor oligo是在使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除过程中所使用的指一段高度同源的DNA模板，其原理是在sgRNA引导下，Cas9内切酶定点切割DNA双链而产生DNA缺口，然后生物体启动同源重组修复途径，当存在一段高度同源的DNA模板（Donor oligo）时，会以Donor oligo作为修复模板进行修复，从而达到将目的片段定点引入基因组的目的。

在其中一实施例中，Donor oligo包含如SEQ ID No.3所示的序列。

在其中一实施例中，通过CRISPR/Cas9技术制备Idh1基因突变小鼠模型，包括使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠；

sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；

sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列；

sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列；

Donor oligo包含如SEQ ID No.3所示的序列。

进一步，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括：

将载有编码Cas9 mRNA和sgRNA的DNA序列的载体，与Idh1基因点突变Donor oligo模板注射入小鼠受精卵后移植代孕，生产子代，获得F0代小鼠；

可选地，对子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为F0代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

进一步，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括还包括：

将F0代小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代小鼠；

可选地，对F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到的子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为F1代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

进一步，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括还包括：

将F1代小鼠自交，获得F2代小鼠；

可选地，对F1代小鼠自交得到的子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为F2代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

在其中一实施例中，基因测序所使用的上游引物（也记为引物1）和下游引物（也记为引物2）的序列分别如SEQ ID No .4和SEQ ID No .5所示。

进一步，基因测序的方式为PCR检测。

在其中一实施例中，基因测序的方式包括：

提取待测小鼠的DNA；

采用上游引物和下游引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

对PCR反应产物进行电泳测定，得到不同条带的电泳测定的结果；

根据电泳测定的结果鉴定待测小鼠的基因型。

本申请的再一方面，还提供了上述任一技术方案所述的构建方法制得的小鼠模型在开发治疗与Idh1基因缺陷相关疾病的药物中的应用。

进一步，与Idh1基因缺陷相关疾病包括雌性不孕症。

以下是一些具体的实施例。

以下实施例中所采用的引物组合物的序列详见表1

表1

一、构建Idh1基因突变小鼠模型

1. Idh1基因突变小鼠模型的构建

（1）针对位于Idh1基因（NM_001111320.11；p.Y208C）的功能丧失性突变，设计了相应的特异性靶向5号外显子的sgRNA序列和Donor oligo，Y208C（TAT到TGT）突变位点将通过同源定向修复引入第5外显子，同时还将引入同义突变L207=（TTG到CTT），以防止同源定向修复后gRNA对序列的结合和重新切割。构建策略还可参考图1和说明书中的描述。

设计如表1的序列组合，分别作为不同实施例的sgRNA和Donor oligo，制备相应的载体，备用。

（2）采用上述设计的序列制备的载体，通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和sgRNA，将Cas9 mRNA、sgRNA1、sgRNA2和Donor oligo显微注射入小鼠受精卵内，显微注射后的受精卵移植到C57BL/6J孕母鼠子宫，孕育出生的小鼠即为F0代小鼠。对F0代小鼠进行gDNA扩增并测序鉴定阳性的F0代小鼠。

（3）F0代阳性小鼠与C57BL/6J野生型小鼠进行交配，获得基因型鉴定为阳性的F1代杂合小鼠。

（4）F1代杂合小鼠之间交配繁育F2，从其中筛选纯合的Idh1基因突变小鼠，之后进行下一步功能研究。所有的小鼠均在无特定病原体（SPF级）的条件下饲养，并严格按照动物福利伦理委员会的标准进行饲养。

经检测，发现实施例1的sgRNA和Donor oligo成功制备Idh1基因点突变小鼠，并能制备Idh1基因点突变的纯合F2代小鼠。

2. 小鼠基因型的鉴定

2.1 小鼠gDNA提取

选取实施例1的Idh1基因点突变小鼠模型，利用天根公司的gDNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，DP304-03）提取小鼠脚趾gDNA。实验步骤如下：

（1）剪小鼠脚趾或尾巴装在1.5 mL的EP管中，加入200μL的缓冲液GA，并用消毒的剪刀将组织剪碎；

（2）加入20μL的Proteinase K溶液，上下颠倒混匀；

（3）将EP管中样品置于56℃水浴箱内水浴1h，期间上下颠倒混匀1次；

（4）加入200μL的缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10min；

（5）加人200μL的无水乙醇，并上下颠倒混匀；

（6）瞬时离心，将上述混合液加入到已放入收集管并做好标记的吸附柱中，12000rpm/min离心30s，弃废液并将吸附柱放入收集管中；

（7）向吸附柱中加入500μL的缓冲液GD，12000rpm/min离心30s，弃废液并将吸附柱放入收集管中；

（8）向吸附柱中加入600μL的漂洗液PW，12000rpm/min离心30s，弃废液并将吸附柱放入收集管中；

（9）重复步骤（8）；

（10）将吸附柱于12000rpm/min空离2min，弃收集管并将吸附柱放入新的已做好标记1.5mL的EP管，开盖晾干5min；

（11）向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL的TE，室温静置5min后，12000rpm/min离心1min，弃吸附柱盖好EP管，4℃保存gDNA。

2.2 小鼠gDNA的PCR反应

gDNA提取完成后，采用引物Idh1-F/R进行PCR扩增并测序。PCR反应体系为：10μLGreen mix Buffer、1μL gDNA、1μL Idh1-F、1μL Idh1-R，最后用ddH2O补足至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s；60℃退火 30s；72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min，最后4℃结束程序。程序完成后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳确定其条带大小，并将PCR扩增产物送至擎科生物科技有限公司（北京，中国）进行Sanger法测序验证。

引物组合物包括：

引物1：GAGAAATTGGTCCTTGGGTCTTTA；

引物2：AGTTTCCTTTCAGCCCTGCTAAAT；

PCR产物长度：432bp；

测序引物包括：

引物1：GAGAAATTGGTCCTTGGGTCTTTA。

2.3 扩增产物的电泳检测

取3μl的扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，220V电泳10分钟，凝胶成像拍照，结果如图2，其中，M泳道代表marker，500bp条带处最亮，Water为阴性对照，WT为野生型小鼠扩增产物。M与WT之间为各个待鉴定基因鼠扩增产物，条带明亮且单一，大小在400bp~500bp之间。该图表明扩增成功可以送测序，进行基因型分辨。

2.4 测序结果

对小鼠用引物Idh1-F/R进行PCR扩增的产物进行测序，测序结果分析以及序列对比的分析软件为“Chromas”，序列对比软件使用在线网站：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。小鼠测序结果的“峰形图”如图3，根据图3可知，与野生型相比，红色碱基对应位置发生了突变，杂合子小鼠序列对应位置出现双峰，一条链为野生型，一条链为突变型；纯合子小鼠对应位置呈现单峰，两条链均为突变型。

二、Idh1基因点突变小鼠模型的生育力实验测试结果

1. 材料

1.1 实验动物

实施例1构建得到的Idh1基因点突变小鼠模型纯合子小鼠以及正常野生型（WT）小鼠。

1.2 分组及处理

实验小鼠共9只，均通过PCR确定基因型后用于下一步实验。其中WT雄性组为3只（大小为8~10周龄），雌性野生型对照小鼠与Idh1纯合子小鼠共6只（大小为8~10周龄），每只雄性小鼠都分别与两只雌性鼠合笼，以后每天早上八点和下午两点观察雌鼠是否有阴道栓子形成，连续观察五天后，雌鼠分笼饲养，继续观察19~23天直至分娩，计数胎仔数。

1.3 实验结果

图4是上述实验的产仔统计结果，根据图4可知，本申请的基因突变模型小鼠生育能力降低明显，相较于对照组降低了约50%。

综上，本申请提供了一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法和应用，通过设计靶向目标位点的sgRNA序列，利用CRISPR/Cas9技术可以高效、精准的构建Idh1基因突变小鼠模型用于后续功能学研究。本申请首次通过CRISPR/Cas9技术构建了Idh1（NM_001111320.11；p.Y208C）基因点突变小鼠动物模型，对于进一步研究Idh1基因的功能以及其在小鼠或者人类女性不孕症中的遗传学研究奠定了良好的基础。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，但并不能因此理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：将Idh1基因编码的IDH1蛋白的第208位的氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸。

2.如权利要求1所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Idh1基因突变包括：Idh1基因全长序列的第623位核苷酸由A突变为G。

3.如权利要求2所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Idh1基因突变还包括：Idh1基因全长序列的第619位~621位同义突变。

4.如权利要求3所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9技术制备Idh1基因突变小鼠模型，包括使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠；

所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；

所述sgRNA1包含如SEQ ID No.1所示的序列；

所述sgRNA2包含如SEQ ID No.2所示的序列；

所述Donor oligo包含如SEQ ID No.3所示的序列。

5.如权利要求4所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括：

将载有编码Cas9 mRNA和sgRNA的DNA序列的载体，与Idh1基因点突变Donor oligo模板注射入小鼠受精卵后移植代孕，生产子代，获得F0代小鼠；

可选地，对所述子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为所述F0代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

6.如权利要求5所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括还包括：

将所述F0代小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代小鼠；

可选地，对所述F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到的子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为所述F1代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

7.如权利要求6所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，使用sgRNA和Donor oligo制备Idh1基因突变的小鼠包括还包括：

将所述F1代小鼠自交，获得F2代小鼠；

可选地，对所述F1代小鼠自交得到的子代进行筛选，取其中的阳性的小鼠作为所述F2代小鼠；

进一步可选地，筛选的方式包括基因测序。

8.如权利要求5~7任一项所述的Idh1基因突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述基因测序所使用的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID No .4和SEQ ID No .5所示。

9.权利要求1~8任一项所述的构建方法制得的小鼠模型在开发治疗与Idh1基因缺陷相关疾病的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述与Idh1基因缺陷相关疾病包括雌性不孕症。