CN109929876A - Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。本发明公开的Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法包括向受体细胞中导入sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突变，sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2，sgRNA1的靶序列为序列表中序列1的第1313‑1332位，sgRNA2的靶序列为序列表中序列1的第3118‑3137位。本发明的Vps28基因突变的方法和动物模型，为研究Vsp28基因在乳腺组织发育、泌乳以及其它生理生化代谢过程中的作用提供了便捷、可靠、经济的动物模型。

Description

Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。

背景技术

Vps28(Vacuolar protein sorting 28,Vps28)是编码液泡蛋白分选蛋白的基因，该蛋白是转运必需内吞体分选复合体ESCRT-Ⅰ(Endosomal Sorting Complex Requiredfor TransportⅠ)的重要组成成分。ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ共同组成ESCRT复合体。ESCRT复合体是一种内体蛋白分选转运装置，主要识别泛素化修饰的膜蛋白，在分选和降解泛素化的膜蛋白过程中发挥重要作用。此外，ESCRT参与多种细胞代谢过程，包括多泡体的形成、细胞脱落、自体吞噬和包膜病毒出芽等。有研究表明，如果ESCRT复合体组件受损，将导致各种不同疾病的发生，如白化病、神经变性病、肿瘤等。复合体中的组件中的ESCRT-Ⅰ包含泛素结合位点，通过聚集泛素化蛋白产生多泡体，并且是ESCRT-0和ESCRT-Ⅲ的桥梁。ESCRT-Ⅰ由Vps23，Vps28，Vps37和Mvb12组成。Vps28是ESCRT-Ⅰ的顶端帽子结构，与ESCRT-Ⅱ中的Vps36结合。Vps36同时与泛素蛋白结合。因此，Vps28可以通过影响内体ESCRT装置的稳定性而影响该装置对泛素化蛋白的识别、分选和转运。

Vps28位于奶牛的14号染色体，全长4978bp，编码221个氨基酸。小鼠的Vps28基因位于15号染色体，全长3999bp，编码221个氨基酸，与奶牛的蛋白序列同源性可达到99％。该蛋白在不同物种间高度保守。奶牛产奶性状全基因组关联分析(Genome-wide AssociationStudy，GWAS)研究发现Vps28与奶牛的产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白率显著相关(P<0.01)。随后，申请人利用目标区域捕获测序技术对Vps28基因5’UTR区的一个SNP位点在新的奶牛资源群体中进行产奶性状关联分析，结果显示该位点与产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率都显著相关，所有性状中最大P值为1.99E-09。利用qPCR技术对奶牛泌乳期的8个不同组织(心、肝、肺、肾、乳腺、卵巢、子宫、肌肉)进行Vps28基因表达量的检测，发现其在乳腺组织中呈现特异性高表达。在此基础上，申请人进一步在奶牛乳腺上皮细胞中对Vps28进行了基因干扰实验，结果显示在Vps28表达水平下调后，奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸转运蛋白CD36、脂肪分化相关蛋白ADFP及甘油三酯的表达水平均显著上升(P<0.05)。电子显微镜观察发现，与对照组相比，Vps28干扰组的乳腺上皮细胞中存在数量更多体积更大的脂肪滴，增加乳脂的合成。上述研究结果说明Vps28基因对奶牛的产奶性状表型发挥了重要作用，与奶牛的泌乳过程密切相关，是产奶性状的重要候选功能基因。

目前，进行基因功能研究最直接有效的方法是构建转基因和(或)基因敲除动物模型。CRISPR/Cas9技术通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行靶向DNA序列识别并造成DNA双链断裂，以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而实现对目标位点实现基因的定点敲除、敲入等多种修饰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何突变动物中的VPS28基因以及如何制备VPS28基因发生突变的动物模型。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种细胞中VPS28基因的定点突变方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向VPS28基因的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2；

所述sgRNA1的靶序列为如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列1的第1313-1332位；

A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；

A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列；

所述sgRNA2的靶序列为如下B1)、B2)或B3)：

B1)序列表中序列1的第3118-3137位；

B2)与B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA序列；

B3)在严格条件下与B1)限定的DNA序列杂交的由B1)衍生的DNA序列。

所述方法可包括向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突变。

向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9蛋白质可包括将所述sgRNA和所述Cas9蛋白质注射入所述受体细胞中。

所述受体细胞中含有VPS28基因。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述方法中，所述sgRNA1和所述sgRNA2均由各自的靶序列转录的RNA与sgRNA的骨架序列连接而成。所述sgRNA的骨架序列具体可由PX330载体(Addgene)中sgRNA的骨架序列对应的DNA序列转录。

上述方法中，所述Cas9蛋白质可为如下E1)、E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

E2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述E2)中的蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述方法中，所述受体细胞可为受精卵。

所述突变可为能引发VPS28基因功能改变的突变。

利用所述细胞中VPS28基因的定点突变方法制备得到的VPS28基因发生突变的细胞，也属于本发明的保护范围。

所述细胞非繁殖材料。

本发明还提供了制备VPS28基因突变动物的方法，所述方法包括：利用所述细胞中VPS28基因的定点突变方法制备VPS28基因突变的动物细胞，利用所述VPS28基因突变的动物细胞制备VPS28基因突变动物。

利用所述VPS28基因突变的动物细胞制备VPS28基因突变动物具体包括培养所述VPS28基因突变的动物细胞得到VPS28基因突变动物。

上述方法中，所述动物可为r1)或r2)：

r1)哺乳动物；

r2)小鼠。

所述sgRNA，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂为成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3或成套试剂4；

所述成套试剂1由所述sgRNA与所述Cas9蛋白质组成；

所述成套试剂2由与所述sgRNA相关的生物材料和与所述Cas9蛋白质相关的生物材料组成；

所述与所述sgRNA相关的生物材料为下述F1)至F7)中的任一种：

F1)编码所述sgRNA的核酸分子；

F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；

F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；

F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；

F5)含有F1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

F6)含有F1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有F2)所述表达盒的转基因动物组织；

F7)含有F1)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有F2)所述表达盒的转基因动物器官；

所述与所述Cas9蛋白质相关的生物材料为下述G1)至G7)中的任一种：

G1)编码所述Cas9蛋白质的核酸分子；

G2)含有G1)所述核酸分子的表达盒；

G3)含有G1)所述核酸分子的重组载体、或含有G2)所述表达盒的重组载体；

G4)含有G1)所述核酸分子的重组微生物、或含有G2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；

G5)含有G1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有G2)所述表达盒的转基因细胞系；

G6)含有G1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有G2)所述表达盒的转基因动物组织；

G7)含有G1)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有G2)所述表达盒的转基因动物器官；

所述成套试剂3由所述sgRNA和所述与所述Cas9蛋白质相关的生物材料组成；

所述成套试剂4由所述与所述sgRNA相关的生物材料和所述Cas9蛋白质组成。

所述成套试剂可用于制备VPS28基因定点突变的细胞，也可用于制备VPS28基因定点突变的动物。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述sgRNA或所述Cas9蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述sgRNA或所述Cas9蛋白质的编码基因转录的启动子，还可包括终止编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述转基因动物细胞系、转基因动物组织和转基因动物器官均不包括繁殖材料。

下述I或II的应用也属于本发明的保护范围：

I、利用所述细胞中VPS28基因的定点突变方法制备得到的VPS28基因发生突变的细胞或利用所述制备VPS28基因突变动物的方法制备的VPS28基因突变动物的下述任一应用：

X1)在动物育种中的应用；

X2)在研究乳腺组织发育和/或泌乳代谢过程中的应用；

II、所述sgRNA或所述成套试剂的下述任一应用：

Y1)在构建VPS28基因发生突变的细胞中的应用；

Y2)在制备用于构建VPS28基因发生突变的细胞产品中的应用；

Y3)在制备VPS28基因发生突变的动物中的应用；

Y4)在制备用于构建VPS28基因发生突变的动物产品中的应用；

Y5)在动物育种中的应用；

Y6)在研究乳腺组织发育和/或泌乳代谢过程中的应用。

本发明中，所述动物可为r1)或r2)：

r1)哺乳动物；

r2)小鼠。

本发明的Vps28基因突变的方法和动物模型，为研究Vsp28基因在乳腺组织发育、泌乳以及其它生理生化代谢过程中的作用提供了便捷、可靠、经济的动物模型。为进一步利用Vsp28基因突变动物模型对Vps28进行体内功能验证奠定了良好基础。经过功能验证的重要基因Vps28可用于奶牛的分子标记辅助选择，实现早期选种并提高育种准确性，可以加快我国建立高品质奶牛群体的步伐。

附图说明

图1为Vps28基因定点突变小鼠模型构建的技术路线图。

图2为sgRNA1和sgRNA2的电泳检测结果。其中，2#为sgRNA1，6#为sgRNA2。dl2000为RNA分子量标准。

图3为F0代第一种编辑类型(缺失1882bp)小鼠的检测结果。其中，上下两幅图的第1-4行序列均为F0代第一种编辑类型小鼠中目标序列的测序结果，第5行为目标基因未发生改变的小鼠中目标序列的测序结果，第6行为第1-5行共有的基因序列。

图4为F0代第二种编辑类型(缺失1963bp，引入8bp)小鼠的检测结果。其中，上下两幅图的第1行序列为F0代第二种编辑类型小鼠中目标序列的测序结果，第2行为目标基因未发生改变的小鼠中目标序列的测序结果，第3行为第1-2行共有的基因序列。

图5为F0代小鼠PCR鉴定电泳条带图。其中，泳道B6为野生型C57BL/6J；泳道N为空白对照，无模板；泳道DL2000为DNA分子量标准，从上至下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道6-22依次为6-22号小鼠，泳道7为缺失1874bp的小鼠，泳道8、9、16、21为缺失1882bp的小鼠，泳道15为缺失1872bp的小鼠，泳道19为缺失1963bp，同时引入8bp的小鼠。其它为阴性小鼠。

图6为F1代小鼠PCR鉴定电泳条带图。其中，泳道B6为野生型C57BL/6J；泳道N为空白对照，无模板；泳道P为鼠尾阳性对照(缺失1874bp的小鼠)；泳道TRANS2K2K为DNA分子量标准，大小为：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道48、49、53、54为缺失1874bp的小鼠；泳道57为缺失1963bp，同时引入8bp的小鼠；泳道58、59、61为缺失2029bp，同时引入14bp的小鼠。其它为阴性小鼠。

图7为小鼠乳腺组织中Vps28蛋白的western blot检测结果。前4个泳道为乳腺组织，后4个泳道为脾脏组织。Vps28+/+及+/+均表示野生型小鼠，+/-表示基因型为Vps28-/+的第三种编辑类型的杂合子小鼠。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

实施例1、Vps28基因定点突变小鼠模型的构建

本发明利用CRISPR/Cas9方法对Vps28基因(NCBI Gene ID：66914，

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/66914，Vps28基因的序列为序列表中序列1)进行定点突变，进而构建了Vps28基因定点突变小鼠模型。第1-96位为第一外显子的序列，第97-879位为第一内含子的序列；第880-951位为第二外显子的序列，第952-1464位为第二内含子的序列；第1465-1493位为第三外显子的序列，第1494-1599位为第三内含子的序列；第1600-1637位为第四外显子的序列，第1638-1909位为第四内含子的序列；第1910-1999位为第五外显子的序列，第2000-2590位为第五内含子的序列；第2591-2696位为第六外显子的序列，第2697-2812位为第六内含子的序列；第2813-2914位为第七外显子的序列，第2915-3376位为第七内含子的序列；第3377-3430位为第八外显子的序列，第3431-3522位为第八内含子的序列；第3523-3614位为第九外显子的序列，第3615-3734位为第九内含子的序列；第3735-3999位为第十外显子的序列。

技术路线如图1所示，具体操作方法如下：

一、靶DNA的确定

根据Vps28基因序列，确定利用CRISPR/Cas9方法突变Vps28基因时所用两个sgRNA(分别记为sgRNA1和sgRNA2)的靶序列，sgRNA1的靶序列为序列表中序列1的第1313-1332位，PAM序列为AGG，sgRNA2的靶序列为序列表中序列1的第3118-3137位，PAM序列为TGG。

二、sgRNA与Cas9蛋白的制备

合成分别用于体外转录sgRNA1和sgRNA2的DNA分子，利用MEGAshortscript^TM T7Transcription Kit(Ambion,AM1354)进行体外转录，分别得到sgRNA1溶液和sgRNA2溶液，sgRNA1和sgRNA2均由各自靶序列转录的RNA与sgRNA的骨架序列连接而成，sgRNA的骨架序列同文献(Cong L.et al.,Multiplex Genome Engineering Using CRISPRCas systems,Science.2013Feb 15；339(6121):819-23.)和PX330载体(Addgene)。

电泳检测sgRNA1溶液和sgRNA2溶液中sgRNA，结果如图2所示。

利用大肠杆菌原核表达体系体外表达Cas9蛋白，得到Cas9蛋白溶液，Cas9蛋白的序列为序列表中序列2。

三、F0代小鼠的制备

将步骤二得到的sgRNA1溶液、sgRNA2溶液和Cas9蛋白溶液等体积混合后得到混合液，取50nL混合液注射到雄性小鼠C57BL/6J的精子和雌性小鼠C57BL/6J的卵子体外受精0.5天形成的受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，胚胎移植的小鼠出生即为F0代小鼠。

四、F0代小鼠的鉴定

待F0代小鼠出生3周后剪尾利用3025-Vps28-5s-outtF1和3025-Vps28-3s-outtR2进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，鉴定得到两个阳性F0代小鼠，分别为8号(Vps28基因敲除后的基因组序列如序列3)和19号(Vps28基因敲除后的基因组序列如序列4)。利用野生型C57BL/6J作为对照，并利用3025-Vps28-5s-intF1和3025-Vps28-5s-intR1组成的内参引物对进行PCR扩增检测DNA提取质量，内参引物对能扩增得到目的产物表示DNA提取合格。所用引物信息如下表：

注：表中Wt表示野生型C57BL/6J，KO表示阳性F0代小鼠，none表示无扩增产物。

五、F1代小鼠获得及基因型鉴定

CRISPR/Cas9方法中Cas9对目标基因剪切后，机体会进行随机修复，所以F0代小鼠通常是嵌合情况，通过基因检测，检测出了4种目标基因的编辑类型，将其中两种编辑类型的F0代小鼠作为亲本进行配繁。F0代小鼠PCR鉴定电泳如图5所示，第一种编辑类型是缺失1882个核苷酸，图3；第二种编辑类型是缺失1963个核苷酸，同时引入8个核苷酸，图4；第三种编辑类型是缺失1874bp的小鼠。将第一种编辑类型的阳性8号F0代小鼠与野生型C57BL/6J交配；第二种编辑类型的阳性19号F0代小鼠与野生型C57B/6J交配。共获得三种类型F1代杂合子，分别为：编辑类型Ⅰ：缺失1874个核苷酸，目标基因编辑后的序列为序列表中序列5；编辑类型Ⅱ：缺失1963个核苷酸，并引入8个核苷酸，目标基因编辑后的序列为序列表中序列6；编辑类型Ⅲ：缺失2029个核苷酸，并引入14个核苷酸，目标基因编辑后的序列为序列表中序列7。两代小鼠出现F0代和F1代目的基因编辑类型不一致的情况，可能是由于F0代没有检测出的编辑类型遗传给了F1。F1代小鼠鉴定方法同F0代小鼠，鉴定结果见图6。

将F1代编辑类型Ⅰ的杂合子小鼠进行杂交(即该种编辑类型的公鼠与该种编辑类型的母鼠进行杂交)，测序鉴定结果显示只得到杂合子和野生型，其比例为40：18，接近2:1；将F1代编辑类型Ⅱ的杂合子小鼠进行杂交(即该种编辑类型的公鼠与该种编辑类型的母鼠进行杂交)获得后代中也仅有杂合子和野生型，且两种类型小鼠的比例约为2:1。两种繁殖方法均未获得F2代纯合子，推测目的基因上述编辑类型的纯合子小鼠可能胚胎致死。因此本发明可以获得上述编辑类型的F1代杂合子小鼠。

六、Vps28蛋白的鉴定

采用Vps28抗体(利用Vps28蛋白作为抗原免疫小鼠得到的抗体)对野生型C57BL/6J(基因型为Vps28+/+)小鼠和步骤五中的第三种编辑类型(缺失1874bp)的杂合子小鼠(基因型为Vps28-/+)进行Western blot实验，分别选择VPS28-/+基因型小鼠泌乳期的乳腺和脾脏以及野生型C57BL/6J的泌乳期乳腺和脾脏作为样品进行实验。利用β-Actin作为内参。结果显示Vps28基因在Vps28-/+基因型小鼠泌乳期的乳腺组织和脾脏组织中的蛋白表达量显著低于野生型C57BL/6J小鼠，结果如图7所示。上述结果说明VPS28基因在Vps28-/+基因型小鼠中的蛋白表达量显著下降，即VPS28基因敲除小鼠模型成功构建。

<110> 中国农业大学

<120> Vps28基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3999

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

gagtgccgag ctgccgatcg ggtttcccgg caggcgcagg cggaaaaagc gagcaccgag 60

cttctgtcgc catctccggg actccaaacg ccccaggtac acagcggcgg tggccgggtc 120

ccctcttcat aggaaccctt tggtctaggt gtcccggtcc cgtctcctct ggggctcagc 180

ggcccttgcc gcgcggccag tgtctcagta ggtgatgggc gctgtcaagt ggcattgctg 240

gtccacagtt caggttcccc tgtctgtgag ggtacccacc tttcttctgc gactccgccg 300

gctattccta gctcctgcga cctcggtagc tctcgctgct cctcaagcca ctccatctca 360

gtttgaccat cttccttgaa catttgtttt caccccattt caaatcctga ggcgtgtctg 420

ggctggcttc cttattagac aggacctatc ctgggccttg cctccgccac tttgccgcat 480

caaccaataa gcttgccctt attcatttct ccagtatctc ccacagatta gggtaaaacc 540

tacctccaca ctttccctca cacacagaaa gccccggaca cctagtctca gttcatttcc 600

actgaaagat gttgcaacaa tgcccttccc ctgtgcccaa gatgctgccc cagttctaac 660

agctactctt ccctacccta acccagctaa caggcaggac tcccatggca ctcgatgttc 720

atcctcaaag cctgacatga cattccccca tgacagtcct ttagcatcct gtgccgttcc 780

tgtagagagc aggaaagctg ttcacaacgc tctgatctcc agagcccagt tcttaaggtg 840

taaggggacc cttgagttag tgttggctct gctttccagg tctcttgtgc tgtatagctg 900

cctgggcctg caggatgttc cacgggatcc cagctactcc tggtgttgga ggtgagtgta 960

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aggaccacac tgctacgtcc atcccgtagt cattaggccc tgggtaatga ctagggccag 1080

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tgttggcggg ggaagagagc taaacctagc aatctgtatg tagcctctta gaggccatat 1320

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cagctcctcc ttgctctgtt gcagcccctg ggaacaagcc ggagctgtat gaggtaggta 1500

gcagatcctc acctggccac tgcaaacacc atgtggctgt cactggttct ataaccacgc 1560

ctggagatgc tgactgactc ttgcctgctt ttccaacagg aagtaaagct ctacaagaat 1620

gctcgggagc gggagaagta agtctaagct gccacgcaca catgcacatg cacacatacg 1680

cacacatgca cacttgcacc catccagcct ccatggctgg cccagcagtc taccaaaccc 1740

accaccacac caatggttgg ggagaacatg gcgtcgcgct aggaagatgg tccctgagga 1800

atatgtacca gggatggagt gggaggtggg ctgaactctg ccataggtgc agagcagcag 1860

ttggctgccc tgcctctgga cagcggcctg atggatggct ttgtcttagg tatgacaaca 1920

tggcagagct ctttgccgtg gtgaagacga tgcaggccct ggagaaggcg tacatcaagg 1980

actgtgtcac ccccaatgag tgagcaagcc tgtggcgtca gacattgatg gccaccaatc 2040

ctcagaagca tgtgtctccc tttcatgaag cttgtggatt cagtaggcag catacacaga 2100

gcccaagcta tgagggtgtt cattgttgct gctagtttcc gggcaggatc agccagggac 2160

cttctgtaag ggtgggtatg gttctgactt cagaaggcaa actggagcct tgggcagcac 2220

agtctaaggt atcactgtca ggtctaggta gccagcatgg atgctgatgc tttatccaca 2280

gatgacaagc ctgtttgact agaccaggag ttgccaggtg gtaatggagg tctgacacct 2340

ggcaaatgga atagacgtcc gctcttgtgc tgagttccag atcgacccac acggatcccc 2400

tgttgtagtt ctgtttctgt catatttccc tgctcttgtg cagagctccc ttcatacata 2460

gacccaacag gaagcccttg gccctcctag cctaccatga aagctgctat atctacaatt 2520

gttgagggag agcacaatga ggcaagctag actgtcctca gcctccagaa gcaaccggtc 2580

ccctctctag gtacactgca gcctgctcca ggctcctggt ccagtacaaa gctgccttcc 2640

gacaggtcca aggctcagag atcagctcca ttgatgaatt ttgccgaaag ttcagagtga 2700

gttagcaggt cctcccttcc atcgtgcagg agagggtgtg gtgggatatg gtctgagagc 2760

ctggtcccct agaggccctg tggtgcccag tacccatgtc tgttctcctc agctggactg 2820

cccacttgct atggagagga tcaaagagga ccggcccatc actatcaaag acgacaaggg 2880

caatctcaac cgctgcattg cagatgttgt ttcggtgtgt cccacagctc ctgggagggt 2940

cctgtgggga ttagagggaa gggactactg gcctaggtca gtcataaatg tgtattcttg 3000

gggtttctgg tcctaagcag tactctggga gggctcacct cagctgtgag gaggatgaga 3060

agcagccaag gagcctaagg cccacctgac tgagttcctt cttgtgaaag ggaccaggac 3120

ctactcgggc aggaccctgg cttgaggggg ttgtgtagga gtacttccca gattcccaga 3180

attcctctca gagttgtgat cccaaatgtc cgtaggccca gacagttagc agacaggtct 3240

taagtgtagc ccccaagcag gaaggagccc cagtgtgggg tgtcgggagg aacatgggtg 3300

ggggcctggt ccctataatt ggcctacaag ctatccccac tgagtaagag atgcctaatg 3360

tacatgctcc ccacagctct tcattacagt catggacaag ctgcgtctgg agatccgtgc 3420

catggacgag gtgcagaagt tgggcaggga gccccgggcc tggatggagg ggaacagagc 3480

aaggtacaga gggtctcacg agggtagcgc ttgtgtctgt agattcagcc agacctgcgg 3540

gagctgatgg agacaatgca cagaatgagc cacctgcctc cagacttcga gggccgccag 3600

acagtcagcc agtggtgagt tgctctcccg cgcaggcgca gggagcctcg tggtggtgag 3660

tgggtctccc gcaggaagcc tcgtggtgat gtcacagccc ctctgctcag acacacttgt 3720

gcctgtgccc ctaggctgca gaccctgagt ggtatgtcgg cctctgacga gctggatgac 3780

tctcaagttc gccagatgct cttcgatctg gagtccgctt acaacgcctt taaccgcttc 3840

ctacacgcct aagcctcacc gagacaggaa tgagagtggt agagatgtga cgactcagcc 3900

ccccagtgtg tctacatccg tcctagatgc ctatattgtc aggatatcac ccacaataaa 3960

tatttgtcta accttcctgc tgtgggcagc tatactgag 3999

<210> 2

<211> 513

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe

85 90 95

His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu

100 105 110

Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu

115 120 125

Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr

130 135 140

Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg

145 150 155 160

Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp

165 170 175

Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu

180 185 190

Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala

195 200 205

Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro

210 215 220

Gly Glu Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly

225 230 235 240

Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln

245 250 255

Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile

260 265 270

Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp

275 280 285

Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Lys Ala Pro Leu

290 295 300

Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr

305 310 315 320

Leu Leu Lys Ala Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Leu Leu Val

325 330 335

Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn

340 345 350

Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu

355 360 365

Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Asn Arg Glu

370 375 380

Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro

385 390 395 400

Leu Ala Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu

405 410 415

Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser

420 425 430

Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro

435 440 445

Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr

450 455 460

Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Tyr Val Thr Glu Met Arg Lys Pro Ala

465 470 475 480

Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys

485 490 495

Thr Asn Arg Lys Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile

500 505 510

Glu

<210> 3

<211> 2117

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 3

gagtgccgag ctgccgatcg ggtttcccgg caggcgcagg cggaaaaagc gagcaccgag 60

cttctgtcgc catctccggg actccaaacg ccccaggtac acagcggcgg tggccgggtc 120

ccctcttcat aggaaccctt tggtctaggt gtcccggtcc cgtctcctct ggggctcagc 180

ggcccttgcc gcgcggccag tgtctcagta ggtgatgggc gctgtcaagt ggcattgctg 240

gtccacagtt caggttcccc tgtctgtgag ggtacccacc tttcttctgc gactccgccg 300

gctattccta gctcctgcga cctcggtagc tctcgctgct cctcaagcca ctccatctca 360

gtttgaccat cttccttgaa catttgtttt caccccattt caaatcctga ggcgtgtctg 420

ggctggcttc cttattagac aggacctatc ctgggccttg cctccgccac tttgccgcat 480

caaccaataa gcttgccctt attcatttct ccagtatctc ccacagatta gggtaaaacc 540

tacctccaca ctttccctca cacacagaaa gccccggaca cctagtctca gttcatttcc 600

actgaaagat gttgcaacaa tgcccttccc ctgtgcccaa gatgctgccc cagttctaac 660

agctactctt ccctacccta acccagctaa caggcaggac tcccatggca ctcgatgttc 720

atcctcaaag cctgacatga cattccccca tgacagtcct ttagcatcct gtgccgttcc 780

tgtagagagc aggaaagctg ttcacaacgc tctgatctcc agagcccagt tcttaaggtg 840

taaggggacc cttgagttag tgttggctct gctttccagg tctcttgtgc tgtatagctg 900

cctgggcctg caggatgttc cacgggatcc cagctactcc tggtgttgga ggtgagtgta 960

ggctaaactg ggaggaaggg gaggagccaa ggctttccct gttgcagggg ctgttgggaa 1020

aggaccacac tgctacgtcc atcccgtagt cattaggccc tgggtaatga ctagggccag 1080

aattatttct ggtgggaatc tgagggcccc tgcaataccc tgctggggag cgagaatata 1140

ctctgggagg gctcacctca gctgtgagga ggatgagaag cagccaagga gcctaaggcc 1200

cacctgactg agttccttct tgtgaaaggg accaggacct actcgggcag gaccctggct 1260

tgagggggtt gtgtaggagt acttcccaga ttcccagaat tcctctcaga gttgtgatcc 1320

caaatgtccg taggcccaga cagttagcag acaggtctta agtgtagccc ccaagcagga 1380

aggagcccca gtgtggggtg tcgggaggaa catgggtggg ggcctggtcc ctataattgg 1440

cctacaagct atccccactg agtaagagat gcctaatgta catgctcccc acagctcttc 1500

attacagtca tggacaagct gcgtctggag atccgtgcca tggacgaggt gcagaagttg 1560

ggcagggagc cccgggcctg gatggagggg aacagagcaa ggtacagagg gtctcacgag 1620

ggtagcgctt gtgtctgtag attcagccag acctgcggga gctgatggag acaatgcaca 1680

gaatgagcca cctgcctcca gacttcgagg gccgccagac agtcagccag tggtgagttg 1740

ctctcccgcg caggcgcagg gagcctcgtg gtggtgagtg ggtctcccgc aggaagcctc 1800

gtggtgatgt cacagcccct ctgctcagac acacttgtgc ctgtgcccct aggctgcaga 1860

ccctgagtgg tatgtcggcc tctgacgagc tggatgactc tcaagttcgc cagatgctct 1920

tcgatctgga gtccgcttac aacgccttta accgcttcct acacgcctaa gcctcaccga 1980

gacaggaatg agagtggtag agatgtgacg actcagcccc ccagtgtgtc tacatccgtc 2040

ctagatgcct atattgtcag gatatcaccc acaataaata tttgtctaac cttcctgctg 2100

tgggcagcta tactgag 2117

<210> 4

<211> 2044

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

gagtgccgag ctgccgatcg ggtttcccgg caggcgcagg cggaaaaagc gagcaccgag 60

cttctgtcgc catctccggg actccaaacg ccccaggtac acagcggcgg tggccgggtc 120

ccctcttcat aggaaccctt tggtctaggt gtcccggtcc cgtctcctct ggggctcagc 180

ggcccttgcc gcgcggccag tgtctcagta ggtgatgggc gctgtcaagt ggcattgctg 240

gtccacagtt caggttcccc tgtctgtgag ggtacccacc tttcttctgc gactccgccg 300

gctattccta gctcctgcga cctcggtagc tctcgctgct cctcaagcca ctccatctca 360

gtttgaccat cttccttgaa catttgtttt caccccattt caaatcctga ggcgtgtctg 420

ggctggcttc cttattagac aggacctatc ctgggccttg cctccgccac tttgccgcat 480

caaccaataa gcttgccctt attcatttct ccagtatctc ccacagatta gggtaaaacc 540

tacctccaca ctttccctca cacacagaaa gccccggaca cctagtctca gttcatttcc 600

actgaaagat gttgcaacaa tgcccttccc ctgtgcccaa gatgctgccc cagttctaac 660

agctactctt ccctacccta acccagctaa caggcaggac tcccatggca ctcgatgttc 720

atcctcaaag cctgacatga cattccccca tgacagtcct ttagcatcct gtgccgttcc 780

tgtagagagc aggaaagctg ttcacaacgc tctgatctcc agagcccagt tcttaaggtg 840

taaggggacc cttgagttag tgttggctct gctttccagg tctcttgtgc tgtatagctg 900

cctgggcctg caggatgttc cacgggatcc cagctactcc tggtgttgga ggtgagtgta 960

ggctaaactg ggaggaaggg gaggagccaa ggctttccct gttgcagggg ctgttgggaa 1020

aggaccacac tgctacgtcc atcccgtagt cattagccca ccaggtactc tgggagggct 1080

cacctcagct gtgaggagga tgagaagcag ccaaggagcc taaggcccac ctgactgagt 1140

tccttcttgt gaaagggacc aggacctact cgggcaggac cctggcttga gggggttgtg 1200

taggagtact tcccagattc ccagaattcc tctcagagtt gtgatcccaa atgtccgtag 1260

gcccagacag ttagcagaca ggtcttaagt gtagccccca agcaggaagg agccccagtg 1320

tggggtgtcg ggaggaacat gggtgggggc ctggtcccta taattggcct acaagctatc 1380

cccactgagt aagagatgcc taatgtacat gctccccaca gctcttcatt acagtcatgg 1440

acaagctgcg tctggagatc cgtgccatgg acgaggtgca gaagttgggc agggagcccc 1500

gggcctggat ggaggggaac agagcaaggt acagagggtc tcacgagggt agcgcttgtg 1560

tctgtagatt cagccagacc tgcgggagct gatggagaca atgcacagaa tgagccacct 1620

gcctccagac ttcgagggcc gccagacagt cagccagtgg tgagttgctc tcccgcgcag 1680

gcgcagggag cctcgtggtg gtgagtgggt ctcccgcagg aagcctcgtg gtgatgtcac 1740

agcccctctg ctcagacaca cttgtgcctg tgcccctagg ctgcagaccc tgagtggtat 1800

gtcggcctct gacgagctgg atgactctca agttcgccag atgctcttcg atctggagtc 1860

cgcttacaac gcctttaacc gcttcctaca cgcctaagcc tcaccgagac aggaatgaga 1920

gtggtagaga tgtgacgact cagcccccca gtgtgtctac atccgtccta gatgcctata 1980

ttgtcaggat atcacccaca ataaatattt gtctaacctt cctgctgtgg gcagctatac 2040

tgag 2044

<210> 5

<211> 2125

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

gagtgccgag ctgccgatcg ggtttcccgg caggcgcagg cggaaaaagc gagcaccgag 60

cttctgtcgc catctccggg actccaaacg ccccaggtac acagcggcgg tggccgggtc 120

ccctcttcat aggaaccctt tggtctaggt gtcccggtcc cgtctcctct ggggctcagc 180

ggcccttgcc gcgcggccag tgtctcagta ggtgatgggc gctgtcaagt ggcattgctg 240

gtccacagtt caggttcccc tgtctgtgag ggtacccacc tttcttctgc gactccgccg 300

gctattccta gctcctgcga cctcggtagc tctcgctgct cctcaagcca ctccatctca 360

gtttgaccat cttccttgaa catttgtttt caccccattt caaatcctga ggcgtgtctg 420

ggctggcttc cttattagac aggacctatc ctgggccttg cctccgccac tttgccgcat 480

caaccaataa gcttgccctt attcatttct ccagtatctc ccacagatta gggtaaaacc 540

tacctccaca ctttccctca cacacagaaa gccccggaca cctagtctca gttcatttcc 600

actgaaagat gttgcaacaa tgcccttccc ctgtgcccaa gatgctgccc cagttctaac 660

agctactctt ccctacccta acccagctaa caggcaggac tcccatggca ctcgatgttc 720

atcctcaaag cctgacatga cattccccca tgacagtcct ttagcatcct gtgccgttcc 780

tgtagagagc aggaaagctg ttcacaacgc tctgatctcc agagcccagt tcttaaggtg 840

taaggggacc cttgagttag tgttggctct gctttccagg tctcttgtgc tgtatagctg 900

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ggctaaactg ggaggaaggg gaggagccaa ggctttccct gttgcagggg ctgttgggaa 1020

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aattatttct ggtgggaatc tgagggcccc tgcaataccc tgctggggag cgagaatata 1140

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ccctggcttg agggggttgt gtaggagtac ttcccagatt cccagaattc ctctcagagt 1320

tgtgatccca aatgtccgta ggcccagaca gttagcagac aggtcttaag tgtagccccc 1380

aagcaggaag gagccccagt gtggggtgtc gggaggaaca tgggtggggg cctggtccct 1440

ataattggcc tacaagctat ccccactgag taagagatgc ctaatgtaca tgctccccac 1500

agctcttcat tacagtcatg gacaagctgc gtctggagat ccgtgccatg gacgaggtgc 1560

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gtgagttgct ctcccgcgca ggcgcaggga gcctcgtggt ggtgagtggg tctcccgcag 1800

gaagcctcgt ggtgatgtca cagcccctct gctcagacac acttgtgcct gtgcccctag 1860

gctgcagacc ctgagtggta tgtcggcctc tgacgagctg gatgactctc aagttcgcca 1920

gatgctcttc gatctggagt ccgcttacaa cgcctttaac cgcttcctac acgcctaagc 1980

ctcaccgaga caggaatgag agtggtagag atgtgacgac tcagcccccc agtgtgtcta 2040

catccgtcct agatgcctat attgtcagga tatcacccac aataaatatt tgtctaacct 2100

tcctgctgtg ggcagctata ctgag 2125

<210> 6

<211> 2044

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

gagtgccgag ctgccgatcg ggtttcccgg caggcgcagg cggaaaaagc gagcaccgag 60

cttctgtcgc catctccggg actccaaacg ccccaggtac acagcggcgg tggccgggtc 120

ccctcttcat aggaaccctt tggtctaggt gtcccggtcc cgtctcctct ggggctcagc 180

ggcccttgcc gcgcggccag tgtctcagta ggtgatgggc gctgtcaagt ggcattgctg 240

gtccacagtt caggttcccc tgtctgtgag ggtacccacc tttcttctgc gactccgccg 300

gctattccta gctcctgcga cctcggtagc tctcgctgct cctcaagcca ctccatctca 360

gtttgaccat cttccttgaa catttgtttt caccccattt caaatcctga ggcgtgtctg 420

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caaccaataa gcttgccctt attcatttct ccagtatctc ccacagatta gggtaaaacc 540

tacctccaca ctttccctca cacacagaaa gccccggaca cctagtctca gttcatttcc 600

actgaaagat gttgcaacaa tgcccttccc ctgtgcccaa gatgctgccc cagttctaac 660

agctactctt ccctacccta acccagctaa caggcaggac tcccatggca ctcgatgttc 720

atcctcaaag cctgacatga cattccccca tgacagtcct ttagcatcct gtgccgttcc 780

tgtagagagc aggaaagctg ttcacaacgc tctgatctcc agagcccagt tcttaaggtg 840

taaggggacc cttgagttag tgttggctct gctttccagg tctcttgtgc tgtatagctg 900

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ggctaaactg ggaggaaggg gaggagccaa ggctttccct gttgcagggg ctgttgggaa 1020

aggaccacac tgctacgtcc atcccgtagt cattagccca ccaggtactc tgggagggct 1080

cacctcagct gtgaggagga tgagaagcag ccaaggagcc taaggcccac ctgactgagt 1140

tccttcttgt gaaagggacc aggacctact cgggcaggac cctggcttga gggggttgtg 1200

taggagtact tcccagattc ccagaattcc tctcagagtt gtgatcccaa atgtccgtag 1260

gcccagacag ttagcagaca ggtcttaagt gtagccccca agcaggaagg agccccagtg 1320

tggggtgtcg ggaggaacat gggtgggggc ctggtcccta taattggcct acaagctatc 1380

cccactgagt aagagatgcc taatgtacat gctccccaca gctcttcatt acagtcatgg 1440

acaagctgcg tctggagatc cgtgccatgg acgaggtgca gaagttgggc agggagcccc 1500

gggcctggat ggaggggaac agagcaaggt acagagggtc tcacgagggt agcgcttgtg 1560

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tgag 2044

<210> 7

<211> 1984

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

gagtgccgag ctgccgatcg ggtttcccgg caggcgcagg cggaaaaagc gagcaccgag 60

cttctgtcgc catctccggg actccaaacg ccccaggtac acagcggcgg tggccgggtc 120

ccctcttcat aggaaccctt tggtctaggt gtcccggtcc cgtctcctct ggggctcagc 180

ggcccttgcc gcgcggccag tgtctcagta ggtgatgggc gctgtcaagt ggcattgctg 240

gtccacagtt caggttcccc tgtctgtgag ggtacccacc tttcttctgc gactccgccg 300

gctattccta gctcctgcga cctcggtagc tctcgctgct cctcaagcca ctccatctca 360

gtttgaccat cttccttgaa catttgtttt caccccattt caaatcctga ggcgtgtctg 420

ggctggcttc cttattagac aggacctatc ctgggccttg cctccgccac tttgccgcat 480

caaccaataa gcttgccctt attcatttct ccagtatctc ccacagatta gggtaaaacc 540

tacctccaca ctttccctca cacacagaaa gccccggaca cctagtctca gttcatttcc 600

actgaaagat gttgcaacaa tgcccttccc ctgtgcccaa gatgctgccc cagttctaac 660

agctactctt ccctacccta acccagctaa caggcaggac tcccatggca ctcgatgttc 720

atcctcaaag cctgacatga cattccccca tgacagtcct ttagcatcct gtgccgttcc 780

tgtagagagc aggaaagctg ttcacaacgc tctgatctcc agagcccagt tcttaaggtg 840

taaggggacc cttgagttag tgttggctct gctttccagg tctcttgtgc tgtatagctg 900

cctgggcctg caggatgttc cacgggatcc cagctactcc tggtgttgga ggtgagtgta 960

ggctaaactg ggaggaaggg gaggagccaa ggctttccct gttgcagggg ccctcagatt 1020

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gcccagacag ttagcagaca ggtcttaagt gtagccccca agcaggaagg agccccagtg 1260

tggggtgtcg ggaggaacat gggtgggggc ctggtcccta taattggcct acaagctatc 1320

cccactgagt aagagatgcc taatgtacat gctccccaca gctcttcatt acagtcatgg 1380

acaagctgcg tctggagatc cgtgccatgg acgaggtgca gaagttgggc agggagcccc 1440

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cgcttacaac gcctttaacc gcttcctaca cgcctaagcc tcaccgagac aggaatgaga 1860

gtggtagaga tgtgacgact cagcccccca gtgtgtctac atccgtccta gatgcctata 1920

ttgtcaggat atcacccaca ataaatattt gtctaacctt cctgctgtgg gcagctatac 1980

tgag 1984

Claims (10)

1.细胞中VPS28基因的定点突变方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向VPS28基因的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或/和sgRNA2；

所述sgRNA1的靶序列为如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列1的第1313-1332位；

A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；

A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA序列；

所述sgRNA2的靶序列为如下B1)、B2)或B3)：

B1)序列表中序列1的第3118-3137位；

B2)与B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA序列；

B3)在严格条件下与B1)限定的DNA序列杂交的由B1)衍生的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括向受体细胞中导入所述sgRNA和Cas9蛋白质，实现VPS28基因的突变。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白质为如下E1)、E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

E2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为受精卵。

5.利用权利要求1-4中任一所述的方法制备得到的VPS28基因发生突变的细胞。

6.制备VPS28基因突变动物的方法，包括：利用权利要求1-4中任一所述的方法制备VPS28基因突变的动物细胞，利用所述VPS28基因突变的动物细胞制备VPS28基因突变动物。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述动物为r1)或r2)：

r1)哺乳动物；

r2)小鼠。

8.权利要求1-3中任一所述sgRNA。

9.成套试剂，为成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3或成套试剂4；

所述成套试剂1由权利要求1-3中任一所述sgRNA与所述Cas9蛋白质组成；

所述成套试剂2由与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料和与所述Cas9蛋白质相关的生物材料组成；

所述与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料为下述F1)至F7)中的任一种：

F1)编码所述sgRNA的核酸分子；

F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；

F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；

F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；

F5)含有F1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

F6)含有F1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有F2)所述表达盒的转基因动物组织；

F7)含有F1)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有F2)所述表达盒的转基因动物器官；

所述与所述Cas9蛋白质相关的生物材料为下述G1)至G7)中的任一种：

G1)编码所述Cas9蛋白质的核酸分子；

G2)含有G1)所述核酸分子的表达盒；

G3)含有G1)所述核酸分子的重组载体、或含有G2)所述表达盒的重组载体；

G4)含有G1)所述核酸分子的重组微生物、或含有G2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；

G5)含有G1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有G2)所述表达盒的转基因细胞系；

G6)含有G1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有G2)所述表达盒的转基因动物组织；

G7)含有G1)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有G2)所述表达盒的转基因动物器官；

所述成套试剂3由权利要求1-3中任一所述sgRNA和所述与所述Cas9蛋白质相关的生物材料组成；

所述成套试剂4由所述与权利要求1-3中任一所述sgRNA相关的生物材料和所述Cas9蛋白质组成。

10.下述I或II：

I、利用权利要求1-4中任一所述的方法制备得到的VPS28基因发生突变的细胞或利用权利要求6所述方法制备的VPS28基因突变动物的下述任一应用：

X1)在动物育种中的应用；

X2)在研究乳腺组织发育和/或泌乳代谢过程中的应用；

II、权利要求1-3中任一所述sgRNA或权利要求9所述成套试剂的下述任一应用：

Y1)在构建VPS28基因发生突变的细胞中的应用；

Y2)在制备用于构建VPS28基因发生突变的细胞产品中的应用；

Y3)在制备VPS28基因发生突变的动物中的应用；

Y4)在制备用于构建VPS28基因发生突变的动物产品中的应用；

Y5)在动物育种中的应用；

Y6)在研究乳腺组织发育和/或泌乳代谢过程中的应用。