CN112626122B - hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用 - Google Patents

hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112626122B
CN112626122B CN202011594798.9A CN202011594798A CN112626122B CN 112626122 B CN112626122 B CN 112626122B CN 202011594798 A CN202011594798 A CN 202011594798A CN 112626122 B CN112626122 B CN 112626122B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse
hkdr
humanized
sequence
mouse model
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011594798.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112626122A (zh
Inventor
范昌发
曹愿
王佑春
吴勇
刘甦苏
赵皓阳
翟世杰
谷文达
杨远松
孙晓炜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institutes for Food and Drug Control
Original Assignee
National Institutes for Food and Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institutes for Food and Drug Control filed Critical National Institutes for Food and Drug Control
Priority to CN202011594798.9A priority Critical patent/CN112626122B/zh
Publication of CN112626122A publication Critical patent/CN112626122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112626122B publication Critical patent/CN112626122B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Abstract

本发明涉及一种hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用，属于动物模型构建技术领域。该hKDR人源化小鼠模型的建立方法，将人源KDR基因序列插入至小鼠Kdr基因的外显子4中，建立得到hKDR人源化小鼠模型。通过该方法可建立hKDR人源化小鼠模型，利用该人源化小鼠模型进行抗体或药物评价，可更真实地模拟不同抗体或药物的功能。

Description

hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用
技术领域
本发明涉及动物模型的构建，特别是涉及一种hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用。
背景技术
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)又称血管通透因子，是一种选择性的内皮细胞有丝分裂原，能特异性地作用于血管内皮细胞，其受体包括VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Kdr)和VEGFR3。其中，Kdr是一种III型受体络氨酸激酶，能够介导血管和淋巴管的形成，在肿瘤血管生成中起到重要作用。
目前，许多实体肿瘤的研究是基于小鼠模型，但随着复杂的生物学进展和伦理技术约束，越来越需要进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前人源化小鼠填补了这些空白，现已成为体内临床前生物医学研究的重要研究工具。
人源化小鼠是携带功能性人类基因、细胞、组织和/或器官、免疫系统或微生物的小鼠，用于生物医学研究和临床治疗方案的开发。有些人源化小鼠携带人类细胞，有些则与人类具有某些一致的遗传和生理特性。因为小鼠基因组与人类基因组高度相似，且更易于操作和改变，所以小鼠可以方便地模拟人类的生物学特性。
人的KDR基因位于4号染色体，大小约41kb，小鼠Kdr基因位于5号染色体，大小约45kb。由于不同物种间同一基因差异较大，目前国内外均没有关于小鼠Kdr人源化模型的相关报道。
随着生物技术的不断发展，基因编辑技术也在不断地提升，从经典的ES(Embryonic stem cell)细胞介导的同源重组，到各种内切酶系统，如锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat)，通过识别DNA序列，实现对基因的编辑。尤其是CRISPR/Cas9系统，操作简单，周期短，效率高，越来越多地用于基因修复、动物模型构建、药物靶点筛选等方面。
目前已经研发出多个针对人KDR基因靶点的抗体或者药物。由于人KDR基因与小鼠Kdr基因同源性为85％，存在较大的差异。这些针对人KDR基因靶点的抗体或者药物并不能识别小鼠Kdr基因靶点，导致无法用普通野生型小鼠评价这类抗体的有效性及安全性。故需要对野生型小鼠的Kdr基因进行人源化改造，使其变成人的KDR基因，能用于评价抗体或药物的体内有效性及安全性。
但目前也没有任何有关利用CRISPR技术实现对小鼠基因的编辑，从而得到小鼠hKDR人源化模型的研究。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种hKDR人源化小鼠模型的建立方法，通过该方法可建立hKDR人源化小鼠模型，利用该人源化小鼠模型进行药物评价，可以实现针对人KDR靶点的抗体或药物体内效力及安全性评价。
一种hKDR人源化小鼠模型的建立方法，将人源KDR基因序列插入至小鼠Kdr基因的外显子4中，建立得到hKDR人源化小鼠模型。
本发明人在前期调研中了解到，小鼠Kdr基因位于5号染色体(Chromosome 5:75,932,827-75,978,458，ENSMUSG00000062960)，全长约45kb，有3个转录本，表达蛋白全长1345aa。经过同源性比对，精确找出人鼠之间基因序列差异，在外显子4-9区域具有不同，经过反复摸索和调整，发明人发现，将人源KDR基因序列插入至小鼠Kdr的外显子4中，具有较高的效率，可以实现精准打靶。
在其中一个实施例中，所述人源KDR基因序列选自：人源KDR基因外显子4至外显子7的蛋白质编码区。在人源KDR基因外显子4至外显子7的KDR CDS区域插入小鼠基因组，具有较好的同源重组效率，更为重要的是能够实现人源KDR基因功能。
在其中一个实施例中，所述人源KDR基因序列的插入序列如SEQ ID NO:1所示。
在其中一个实施例中，利用CRISPR/Cas9系统将所述人源KDR基因序列插入至小鼠Kdr基因的外显子4中，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9和sgRNA，所述sgRNA的靶向结构域靶向的序列如SEQ ID NO:2所示。
可以理解的，上述Cas9在使用时，可以直接使用Cas9酶，也可通过Cas9 mRNA转录得到Cas9酶。
在其中一个实施例中，具体包括以下步骤：
1)构建打靶载体：构建得到依次包含5’同源臂、人源KDR基因、终止密码子、WPRE元件、Poly A和3’同源臂的打靶载体；
2)制备sgRNA：根据确定的切割位点设计sgRNA，合成得到作为体外转录sgRNA的DNA模板，待用；
3)显微注射及胚胎移植：将所述打靶载体、Cas9和sgRNA混合，注射入受精卵细胞中，并将成活的受精卵细胞移植入假孕小鼠输卵管中，得到阳性F0代小鼠；
4)交配得到子代鼠：将上述阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到hKDR人源化基因敲入小鼠。
同样可以理解的，上述sgRNA，在使用时，可以直接使用sgRNA，也可通过sgRNA的DNA模板转录得到sgRNA。
在其中一个实施例中，所述5’同源臂为位于SEQ ID NO:2序列上游2139bp±100bp的序列；所述3’同源臂为位于SEQ ID NO:2序列下游2099bp±100bp的序列；所述终止密码子为TAA。
在其中一个实施例中，所述sgRNA对应的序列如SEQ ID NO:3所示。
在其中一个实施例中，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
本发明还公开了上述的hKDR人源化小鼠模型的建立方法建立得到的hKDR人源化小鼠模型。
上述hKDR人源化小鼠模型，可用于抗肿瘤的药效学评价研究中，能够更真实地反应不同抗体或药物针对人源KDR基因的功能。
本发明还公开了上述的hKDR人源化小鼠模型在筛查靶向KDR基因的药物或研究与KDR基因相关的机理中的应用。
可以理解的，上述hKDR人源化小鼠模型同样可以用于与KDR基因相关的病理或生理过程的机理研究。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的hKDR人源化小鼠模型的建立方法，利用CRISPR/Cas9技术建立了人源化的hKDR小鼠模型，通过PCR和测序结果显示，本发明成功获得了hKDR人源化小鼠；且通过Q-PCR结果显示，杂合及野生型小鼠的心、肺、肾组织里均有明显的hKDR表达。
附图说明
图1为实施例1中hKDR人源化小鼠的构建策略示意图；
图2为实施例1中F0代hKDR小鼠凝胶电泳分析鉴定图；
图3为实施例1中F1代hKDR小鼠凝胶电泳分析鉴定图；
图4为实施例1中F1代hKDR小鼠测序峰图；
图5为实施例1中F1代hKDR小鼠southern blot鉴定结果图；
图6为实施例2中不同组别小鼠心、肺和肾中hKDR mRNA的相对表达量；
图7为实施例3中不同组别小鼠肿瘤形态图；
图8为实施例3中不同组别小鼠肿瘤重量对比图；
图9为实施例3中不同组别小鼠肿瘤体积增长趋势图；
图10为实施例3中不同组别小鼠体重增长趋势图；
图11为实施例3中不同组别小鼠血清炎症因子水平示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例中所用主要实验动物、试剂和统计方法如下。
1、实验动物。
3～4周龄SPF级C57BL/6小鼠用于超数排卵，6～8周龄ICR雄/雌鼠，用于结扎雄鼠/假孕母鼠。实验用鼠均来自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，饲养于SPF级环境中。动物生产许可证号为SCXK(京)2014-0013。
本实验在中国食品药品检定研究院实验动物伦理委员会监督下进行(伦理审批号：#2017-B-004)。
2、试剂与仪器。
胚胎操作液和透明质酸购自Sigma公司；绒毛膜促性腺激素购自宁波第二激素厂；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq酶、Trizol试剂、RT-PCR试剂盒均购自Takara公司；琼脂糖购自HydraGene公司；sgRNA体外转录试剂盒及纯化试剂盒购自Ambion公司；Cas9 mRNA购自NEB公司；质粒大提试剂盒和感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Cyramza mab抗体(雷莫芦单抗)由北京义翘神州技术科技有限公司提供表达服务。
3、统计学分析方法。
采用Graphpad Prism 7.0进行统计，数据表示为均值±标准差(x±s)，One-WayANOVA方法分析数据，P<0.05为显著性差异。
实施例1
一种hKDR人源化小鼠模型，通过以下方法建立得到：
1、构建打靶载体。
1.1构建策略。
本发明人在前期调研中了解到，人的KDR基因位于4号染色体，大小约41kb，而小鼠Kdr基因位于5号染色体(Chromosome 5:75,932,827-75,978,458，ENSMUSG00000062960)，全长约45kb，有3个转录本，表达蛋白全长1345aa。
经过同源性比对，精确找出人鼠之间基因序列差异，在外显子4-9区域具有不同，经过反复摸索和调整，发明人发现，将人源KDR基因序列插入至小鼠Kdr的外显子4中，具有较高的效率，可以实现精准打靶。
人的KDR基因(hKDR)序列有30个外显子，全长约41kb，本发明人经调研推测，人源KDR基因外显子4至外显子7的蛋白质编码区对于KDR基因功能实现具有重要意义，据此设计插入序列。插入序列由GENEWIZ(苏州金唯智生物科技有限公司)合成，所设计合成的人源KDR基因序列的插入序列如下：
aacaaaaacaaaactgtggtgattccatgtctcgggtccatttcaaatctcaacgtgtcactttgtgcaagatacccagaaaagagatttgttcctgatggtaacagaatttcctgggacagcaagaagggctttactattcccagctacatgatcagctatgctggcatggtcttctgtgaagcaaaaattaatgatgaaagttaccagtctattatgtacatagttgtcgttgtagggtataggatttatgatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcaca(SEQ ID NO:1)。
本实施例的hKDR人源化小鼠的构建策略如图1所示，即将人KDR基因的部分外显子4至外显子7的蛋白质编码区(sequence coding for amino acids in protein，CDS)区域(SEQ ID NO:1所示序列)插入到小鼠Kdr外显子4中，构成“hKDR CDS(exon 4～exon 7)-KDRCDS(exon 7～TAA)-WPRE-Poly A”的打靶载体。利用高保真Taq DNA聚合酶从BAC克隆中扩增出含有同源臂(homology arm)的小鼠基因组片段，然后将其与重组位点一起克隆入打靶载体，即得到依次包含5’同源臂、人源KDR基因、终止密码子、WPRE元件、Poly A和3’同源臂的打靶载体。
本实施例中，5’同源臂为位于SEQ ID NO:2序列上游的2139bp序列；所述3’同源臂为位于SEQ ID NO:2序列下游的2099bp序列；终止密码子为TAA。
1.2验证。
上述打靶载体构建完成后，按照常规方法，用ApaLI、Drdl和Fspl分别进行酶切验证，得到正确的打靶载体。
2、sgRNA的体外合成及转录
如上所述，确定切割位点位于外显子4区域，设计目标sgRNA序列。本实施例中，目标sgRNA对应的序列如SEQ ID NO:3所示，其中靶向结构域靶向特定结合位点的序列如SEQID NO:2所示。
设计好的引物由GENEWIZ公司合成，退火连接后，异丙醇回收DNA并纯化，作为体外转录sgRNA的模版。
按照Invitrogen公司MEGA shortscript T7 high yield Transcription Kit和MEGA clear Transcription Clean-Up kit说明书操作，进行sgRNA体外转录及纯化，最后加入50μL Rnase-free的水，采用Nandrop进行浓度测定并分装，放入-80℃保存，备用。
3、显微注射及胚胎移植。
3.1动物准备。
6周龄C57BL/6雌性小鼠超数排卵后与雄鼠合笼，挑选见栓雌鼠，剖开腹腔，在输卵管壶腹部收集受精卵细胞。
3.2显微注射。
将上述验证正确的打靶载体、转录后的sgRNA和Cas9混合物，运用Eppendorf NK2显微注射仪将混合物直接注射入受精卵细胞中，于5％CO2，37℃培养箱中培养24h。
3.3胚胎移植。
挑选成活的受精卵细胞移植入C57BL/6假孕雌鼠输卵管中，共移植215枚受精卵至9只ICR假孕鼠中，共出生83只F0代小鼠。
3.4阳性小鼠筛选。
提取全部小鼠鼠尾基因组DNA，采用PCR方法筛选阳性小鼠。
针对Region1和Region2(如图1中所示)的鉴定引物如下表1所示。
表1鉴定小鼠的引物信息
Figure BDA0002867802510000051
Figure BDA0002867802510000061
MT:mutant type(突变型)；WT:wildtype(野生型)。
扩增反应条件：94℃3min；94℃30s，60℃30s，65℃50s，33个循环；65℃10min。
取扩增产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定结果如图2所示，图2A为F0代小鼠region1区域扩增产物凝胶电泳图，图2B为F0代小鼠region2区域扩增产物凝胶电泳图，如图中所示，得到阳性鼠2只(23号和47号)。
4、交配得到子代鼠。
将上述阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，得到的F1代鼠采用同样的方法进行鉴定，PCR鉴定结果如图3所示，其中，图3A为F1代小鼠region1区域扩增产物凝胶电泳图，图3B为F1代小鼠region2区域扩增产物凝胶电泳图。
取部分扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，针对Region1的测序引物序列为F4(5’-3’)：GTATGTGTTTCTCTGCCCTCCTCG(SEQ ID NO:14)；针对Region2的测序引物序列R3(5’-3’)：CCAGCACTGTCTAAATTCAACGGC(SEQ ID NO:9)。为了缩短延伸时间，可采用鉴定引物F3/R3进行鉴定，扩增反应条件：94℃3min；94℃30s，60℃35s，72℃35s，33个循环；72℃5min。
测序结果如图4所示，从图中可以看出，所得F1代小鼠具有正确的阳性插入序列。
再次提取高浓度基因组，分别用Nsil和Bsu36I酶切，按照常规方法，进行Southernblot杂交检测。
Southern blot鉴定结果如图5所示，图5A为5’同源臂侧southern blot鉴定结果，图5B为3’同源臂侧southern blot鉴定结果，结果表示，本实施例得到4只阳性(3号、4号、7号和24号)hKDR人源化基因敲入小鼠。
将上述得到的F1阳性杂合小鼠(hKDR人源化基因敲入小鼠)进行自交，得到F2纯合小鼠，即得。
实施例2
hKDR小鼠(KDR人源化基因敲入小鼠)核酸水平验证实验。
1、方法。
对实施例1得到的F1杂合小鼠和F2纯合小鼠的心、肺、肾进行Q-PCR验证。具体方法如下：
Trizol法分别提取杂合和纯合hKDR小鼠的脾、肾、胰腺的总RNA，反转录PCR获得cDNA，以cDNA为模版进行检测。
扩增引物：
上游序列：5’-TGTGGTTCTGAGTCCGTCTC-3’(SEQ ID NO:15)；
下游序列：5’-GTGCTGTTCTTCTTGGTCATCA-3’(SEQ ID NO:16)；
内参(小鼠GAPDH基因)：
上游序列：5’-CAGCAACTCCCACTCTTCCAC-3’(SEQ ID NO:17)；
下游序列：5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3’(SEQ ID NO:18)。
扩增条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；4℃至+∞。
数据分析以hKDR/GAPDH比值计算。
2、结果。
结果如图6所示，图6为不同组别小鼠心、肺和肾中hKDR mRNA的相对表达量(图中从左到右依次为home组，hete组和WT组)，从图中能够明显看出，野生型小鼠(WT)hKDR基因不表达，而纯合型hKDR小鼠(homo)基因高表达，杂合型hKDR小鼠(hete)也有一定的表达。
该结果从核酸水平上证明本发明成功构建了hKDR人源化小鼠模型。
实施例3
hKDR小鼠(hKDR人源化基因敲入小鼠)抗肿瘤实验验证。
Ramucirumab(IMC-1121B)是一种针对KDR的完全人源化的IgG1单克隆抗体，已被美国食品和药物管理局批准用于治疗人类肿瘤，如胃癌、肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢癌和结肠直肠癌。
本实验研究了与Ramucirumab单抗具有相同结构，相同功能的单克隆抗体，称之为Cyramza mab分子作为阳性对照药物，对hKDR小鼠进行抗肿瘤实验验证。
1、方法。
分别取3-4周龄纯合hKDR小鼠(F2代小鼠)和野生型C57BL/6小鼠，后颈背部皮肤消毒脱毛后注射MC38细胞(5×106个/只)，选取待肿瘤长至200mm3左右的小鼠。
3-4周龄纯合hKDR小鼠随机分为2组：空白对照组、Cyramza mab组，每组3只；野生型小鼠C57BL/6随机分为2组：空白对照组、Cyramza mab组，每组3只，给药量20mg/kg，每周2次，连续给药6次，每次给药前对小鼠进行称重并测量肿瘤大小，对照组给予等量的生理盐水。
实验结束后，对各组小鼠解剖，取肿瘤及血清。
1.1对肿瘤的处理方法。
取肿瘤后观察肿瘤体积，测量其重量，并拍照记录。
1.2对血清的处理方法。
测量炎症因子TNF-α，IL-6，IL-10的含量。
2、结果。
2.1肿瘤实验结果。
结果如图7-10所示。肿瘤形态如图7所示，从图7中可以看出，给予Cyramza mab后，hKDR小鼠的肿瘤体积明显低于野生型C57BL/6小鼠，而C57BL/6小鼠无明显差异。肿瘤重量如图8所示，图8表示，hKDR小鼠中，与PBS组相比，Cyramza mab给药组小鼠肿瘤重量显著降低(P<0.01)，说明模型建立的成功；而给予Cyramza mab后，hKDR小鼠显著低于C57BL/6小鼠(P<0.001)，说明hKDR小鼠能够与Cyramza mab结合，抑制了肿瘤的增长。图9中动态展示了各组小鼠的肿瘤体积增长情况，从图中可以看出，给药后，hKDR小鼠的体积始终低于其他三个组。图10为各组小鼠体重增长情况，结果显示各组无明显差异。
2.2血清炎症因子检测结果。
实验结束后，对各组小鼠血清进行炎症因子的检测，小鼠血清炎症因子水平结果如图11所示，图11中每种炎症因子柱状图从左到右依次为C57BL/6小鼠PBS组，hKDR小鼠PBS组，C57BL/6小鼠给药组，hKDR小鼠给药组，从图中可以看出，hKDR组小鼠的TNF-α水平显著低于C57BL/6小鼠(P<0.05)。
上述证实验进一步说明，hKDR小鼠中成功插入了人的KDR基因片段，从而验证了hKDR人源化模型建立的成功。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 60
ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 120
agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 180
gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 240
tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 300
aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 360
gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 420
tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 480
gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca 556
<210> 2
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtttgaaatc gaccctcggc 20
<210> 3
<211> 96
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttgaaatc gaccctcggc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 98
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtagggga tgaataggat ctc 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatcctata ccctacaacg acaac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggaagaca ggaacaaatt atctc 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgaccagag aggaccctat atc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttatgtttc aggttcaggg gga 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccagcactgt ctaaattcaa cggc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttcgctgtg caggataatg gtga 24
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggagtaact tcatccccta gagacag 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttacctcgt tttcagtcac tgcatcc 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aactggggag agtaaagcct atctcgc 27
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtatgtgttt ctctgccctc ctcg 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgtggttctg agtccgtctc 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgctgttct tcttggtcat ca 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagcaactcc cactcttcca c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggtccaggg tttcttactc 20

Claims (4)

1.一种hKDR人源化小鼠模型的建立方法，包括以下步骤：
1)构建打靶载体：构建得到依次包含5’同源臂、人源KDR基因、终止密码子、WPRE元件、Poly A和3’同源臂的打靶载体；所述5’同源臂为位于SEQ ID NO:2序列上游2139bp±100bp的序列，所述人源KDR基因的插入序列如SEQ ID NO:1所示，所述3’同源臂为位于SEQ IDNO:2序列下游2099bp±100bp的序列；所述终止密码子为TAA；
2)制备sgRNA：根据确定的切割位点设计sgRNA，合成得到作为体外转录sgRNA的DNA模板，待用；所述sgRNA对应的序列如SEQ ID NO:3所示；
3)显微注射及胚胎移植：将所述打靶载体、Cas9和sgRNA混合，注射入受精卵细胞中，并将成活的受精卵细胞移植入假孕小鼠输卵管中，得到阳性F0代小鼠；
4)交配得到子代鼠：将上述阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到hKDR人源化基因敲入小鼠。
2.根据权利要求1所述的hKDR人源化小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6小鼠。
3.权利要求1-2任一项所述的hKDR人源化小鼠模型的建立方法建立得到的KDR人源化小鼠模型。
4.权利要求3所述的hKDR人源化小鼠模型在筛查靶向KDR基因的药物或研究与KDR基因相关的机理中的应用。
CN202011594798.9A 2020-12-29 2020-12-29 hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用 Active CN112626122B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011594798.9A CN112626122B (zh) 2020-12-29 2020-12-29 hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011594798.9A CN112626122B (zh) 2020-12-29 2020-12-29 hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112626122A CN112626122A (zh) 2021-04-09
CN112626122B true CN112626122B (zh) 2022-08-09

Family

ID=75286093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011594798.9A Active CN112626122B (zh) 2020-12-29 2020-12-29 hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112626122B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921492B (zh) * 2022-05-05 2024-04-16 复旦大学 一种基因打靶载体、i型干扰素受体部分人源化的小鼠模型及其构建方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107815467B (zh) * 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US20210153484A1 (en) * 2018-04-09 2021-05-27 The Wistar lnstitute Humanized Mouse Model
CN109486860B (zh) * 2018-12-04 2022-04-08 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种tigit人源化小鼠模型的构建方法及其应用
CN111690689B (zh) * 2020-06-03 2022-05-27 上海南方模式生物科技股份有限公司 人源化ccr2基因改造动物模型的构建方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112626122A (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11234420B2 (en) Method for constructing PD-1 gene modified humanized animal model and use thereof
CN107858373B (zh) 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法
EP2517556B1 (en) Site-Specific Recombination Method, Rodents &amp; Rodent Cells capable of Expressing Chimaeric Antibodies or Chains
US20200056202A1 (en) Animal models and therapeutic molecules
CN108531487B (zh) 人源化sirpa基因改造动物模型的制备方法及应用
CN111926017B (zh) 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
WO2020074874A1 (en) Animal models and therapeutic molecules
CN110885858A (zh) Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用
CN111690689B (zh) 人源化ccr2基因改造动物模型的构建方法及其应用
CN107815467A (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN115989041A (zh) 经工程化为表达adar1的细胞和非人动物及其用途
CN114277055A (zh) Il1b和il1a基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN112626122B (zh) hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用
CN107955817B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN112725379A (zh) 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用
CN113122574A (zh) 一种免疫缺陷型人源化非人动物的构建方法
CN108070614B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN112553252B (zh) Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用
CN114134183A (zh) 一种siglec15基因人源化动物模型的构建方法及应用
CN109694885B (zh) 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒
CN109280674B (zh) 一种筛选抗体的非人模式动物的构建方法及其应用
CN114747541B (zh) 一种psgl-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用
CN113817770B (zh) Cd73基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN116284330A (zh) 一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用
CN114990128A (zh) Cd20基因人源化非人动物的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant