CN116284330A - 一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用 - Google Patents
一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116284330A CN116284330A CN202211342936.3A CN202211342936A CN116284330A CN 116284330 A CN116284330 A CN 116284330A CN 202211342936 A CN202211342936 A CN 202211342936A CN 116284330 A CN116284330 A CN 116284330A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- human
- human animal
- humanized
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150002659 CD38 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 12
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 80
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 56
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 101100220062 Homo sapiens CD38 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000052645 human CD38 Human genes 0.000 claims description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 claims description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 8
- 101100438927 Mus musculus Cd38 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 claims description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 claims 3
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 abstract 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 39
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000000033 Purinergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010080192 Purinergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0368—Animal model for inflammation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种CD38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用，该方法建立的CD38基因人源化的非人动物蛋白中包含：SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的全部或部分。本发明构建的模型可应用在免疫治疗及免疫检查点抑制剂筛选等。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD38基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
CD38在1980年代由Reinherz等人的一项先驱研究中首次被鉴定出来，旨在使用单克隆抗体检测人淋巴细胞的表面抗原，最初被称为T10。CD38主要由终末分化的浆细胞及其恶性对应物表达，但也可以在其他成熟免疫细胞的表面上发现，例如B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及发育早期和晚期的骨髓细胞。然而，多能造血干细胞缺乏表达，表明它是一种谱系定义标志物。
CD38是一种多功能跨膜II型糖蛋白，其保留酶活性并作为受体。在其众多酶促功能中，CD38参与细胞内烟酰胺二核苷酸(NAD)的分解代谢，参与细胞外NAD前体的代谢，并且是细胞内钙稳态的主要调节剂。特别是，高水平的细胞外腺苷在癌症生物学中的作用越来越高：它通过与嘌呤能受体(CD38/CD203a/CD73外酶途径)的结合促进免疫抑制有关，并且可能被肿瘤微环境的T细胞利用以介导免疫逃逸。事实上，这种途径的激活与骨髓瘤进展和疾病侵袭性相关。其受体成分调节CD31介导的白细胞与内皮壁之间的粘附，因此有利于白细胞的活化和增殖并促进B细胞分化。
在过去的四十年中，CD38对细胞生物学的贡献以及CD38与人类疾病的联系一直是实质性研究的焦点。CD38最初被描述为T细胞中能够诱导细胞活化的表面蛋白。不久之后，CD38在其他免疫细胞中也报道了表达，如B细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和髓系细胞。同样，CD38在细胞分化、细胞因子释放、迁移和凋亡过程中的作用被揭示出来。自从这些发现被报道以来，许多研究都试图了解CD38通过调节免疫反应在多大程度上有助于炎症和自身免疫性疾病的发展。到目前为止，已知CD38表达在激活后在免疫细胞中稳健诱导并调节感染诱导的炎症过程，从细胞募集到诱导适应性免疫反应。尽管如此，CD38用于介导炎症每个阶段的机制仍然知之甚少。CD38在炎症性自身免疫中的功能也是几种疾病中许多研究的主题。根据所分析的疾病类型，免疫细胞群或动物模型，一些报告表明CD38可以抑制或诱导自身免疫。缺乏共识凸显了需要更多的研究来了解CD38的生物学及其对炎症和自身免疫的贡献。
人源化小鼠模拟人类疾病，因此通常用于传染病、退行性和癌症疾病的研究。最近的模型还反映了造血、自然免疫、神经生物学和影响疾病病理生物学的分子途径。一系列免疫缺陷小鼠品系允许长寿命的人类祖细胞移植。先天性和适应性免疫的存在使高水平的人血淋巴重构成为可能，细胞对广泛的微生物感染具有敏感性。这些小鼠还有助于研究人类病理生物学，自然疾病过程和广泛人类疾病的治疗效果。虽然人源化小鼠模拟具有这些无可比拟的优点，但是由于人CD38氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人CD38和小鼠CD38蛋白序列的一致性仅为59％左右，识别人CD38蛋白的抗体通常无法识别小鼠CD38，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向CD38信号通路药物的药效。鉴于CD38全球研发进展及靶向重要应用价值，为了使临床前期试验更有效并使研发失败率最小化，CD38人源化小鼠模型的有效建立极为重要。
发明内容
针对上述缺陷，本发明将编码人类CD38的基因敲入到其同源C57BL/6JGpt小鼠位点，构建能表达人CD38细胞因子的小鼠模型，为研究人源免疫细胞发育、免疫治疗、炎症、自身免疫疾病及相关药物筛选提供了有利模型。
本发明提供一种CD38基因人源化的非人动物蛋白。
一种CD38基因人源化的非人动物蛋白，该CD38基因人源化的非人动物蛋白中包含：SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的全部或部分。
本发明还提供一种CD38基因人源化的非人动物蛋白。
一种CD38基因人源化的非人动物蛋白，该CD38基因人源化的非人动物蛋白中包含：与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
本发明还提供一种CD38基因人源化的非人动物蛋白。
一种CD38基因人源化的非人动物蛋白，该CD38基因人源化的非人动物蛋白中包含：与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸。
本发明还提供一种CD38基因人源化的非人动物蛋白。
一种CD38基因人源化的非人动物蛋白，该CD38基因人源化的非人动物蛋白中包含：与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的氨基酸序列的全部或部分。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2的编码蛋白所示氨基酸序列的部分。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的编码蛋白所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的编码蛋白所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸。
作为优选，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的编码蛋白所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
作为优选，所述非人动物为小鼠。
本发明还提供一种嵌合CD38基因。
一种嵌合CD38基因，该嵌合CD38基因包含：人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的全部或部分。
本发明还提供一种嵌合CD38基因。
一种嵌合CD38基因，该嵌合CD38基因包含：与人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
本发明还提供一种嵌合CD38基因。
一种嵌合CD38基因，该嵌合CD38基因包含：与人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸。
本发明还提供一种嵌合CD38基因。
一种嵌合CD38基因，该嵌合CD38基因包含：与人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明还提供一种CD38构建体。
一种CD38构建体，该CD38构建体包含人CD38基因或嵌合CD38基因，该构建体表达人或人源化CD38蛋白，该人源化CD38蛋白为上述的CD38基因人源化的非人动物蛋白，嵌合CD38基因为上述的嵌合CD38基因。
本发明还提供一种载体。
一种载体，包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列至少包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
本发明还提供一种CD38基因人源化的非人动物构建方法。
一种CD38基因人源化的非人动物构建方法，该构建方法在非人动物上将人源CD38基因的CDS和PolyA插入该非人动物Cd38基因ATG下游，人源CD38基因在该非人动物基因的内源调控下进行表达，该非人动物Cd38基因表达被关闭。
作为优选，插入片段长度1.4kb。
作为优选，所述的非人动物为小鼠。
本发明还提供一种CD38基因人源化的非人动物构建方法。
一种CD38基因人源化的非人动物构建方法，该构建方法包括用包含人CD38核苷酸序列的部分导入非人动物CD38基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化CD38蛋白，所述的人源化CD38蛋白如上述的CD38基因人源化的非人动物蛋白；优选的，所述的非人动物还包括上述的嵌合CD38基因。
本发明还提供一种CD38基因人源化的非人动物构建方法。
一种CD38基因人源化的非人动物构建方法，包括以下步骤：
S1：确定人源CD38基因插入片段的序列：人源CD38基因片段为人源CD38基因的CDS序列，序列为SEQ No.1，CDS长度903nt，编码300aa；
S2：确定人源片段插入的位点：人源片段插入的位点为非人源Cd38的基因的1号exon区域，序列为SEQ No.2；
S3：利用CRISPR Cas9的方式将人源CD38基因的CDS部分和PolyA插入鼠源Cd38基因ATG下游。
作为优选，该步骤包括：
S31：确定人源片段替换区域及插入的人源序列：选取人源CD38基因的CDS部分插入小鼠Cd38基因ATG下游，选取的人源CD38基因序列为SEQ No.3；
S32：CD38人源化小鼠制备的sgRNA筛选；
S33：人源化打靶载体构建；
S34：CD38人源化模型建立：根据筛选得到的sgRNA设计并构建携带人源序列的ssDNA donor，将ssDNA donor及Cas9/sgRNA系统注射至非人动物受精卵中，移植至假孕雌非人动物体内，受体非人动物生出F0代，F0代与背景非人动物配繁获得杂合F1，杂合F1大量扩繁后进行互配，获得纯合子F2。
本发明还提供一种多基因修饰的非人动物的构建方法。
一种多基因修饰的非人动物的构建方法，该多基因修饰的非人动物的构建方法将上述的CD38基因人源化的非人动物构建方法获得的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
本发明还提供一种包含CD38基因人源化改造的细胞、组织或者器官。
一种包含CD38基因人源化改造的细胞、组织或者器官，所述的细胞、组织或者器官包含上述的嵌合CD38基因，所述的细胞、组织或者器官表达上述的CD38基因人源化的非人动物蛋白。
本发明还提供一种应用方法。
上述构建方法构建的非人动物、上述述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的CD38基因人源化的非人动物蛋白、上述的嵌合CD38基因、上述的构建体或者上述的细胞、组织或者器官应用于涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CD38功能、人CD38信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面
附图说明
图1为本发明人源化CD38小鼠模型策略图；
图2打靶目标载体结构示意图；
图3为本发明CD38-KI-target F0小鼠鉴定电泳图,图3-A：5’端引物鉴定，图3-B：3’端鉴定电泳图，图3-C:串联鉴定电泳图；
图4为本发明CD38-KI-target F1小鼠5’端和3’端鉴定电泳图；
图5为本发明B6-hCD38人源化小鼠人源CD38蛋白流式检测结果图。
图6为本发明B6-hCD38人源化小鼠人CD38蛋白的表达水平统计图(n＝2,or 3)；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1CD38人源化小鼠模型建立：
本实施例使用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6JGpt背景的小鼠(背景鼠)上将人源CD38基因的CDS和PolyA插入鼠源Cd38基因ATG下游，人源CD38基因在鼠源基因的内源调控下进行表达，鼠源Cd38基因表达被关闭，插入片段长度约1.4kb,模型策略如图1。
S1：确定人源CD38基因插入片段的序列。
根据Ensembl数据显示，人源CD38基因有5个转录本，编码1种完整的氨基酸序列。根据CD38的结构域功能分析，本实施例选择CD38-201(ENST00000226279.8)转录本进行构建，选择插入人源CD38基因片段为人源CD38基因的C DS序列，如SEQ No.1所示，CDS长度903nt，编码300aa。
SEQ No.1：
S2：确定人源片段插入的位点。
小鼠Cd38基因有2个转录本，本方案在Cd38-201(ENSMUST00000030964.6)转录本进行基因编辑，小鼠Cd38-201(ENSMUST00000030964.6)转录本包含8个exons，翻译起始位点ATG位于exon1，翻译终止位点TGA位于exon8，编码304aa。人源片段插入的位点为鼠源Cd38的基因的1号exon区域。即Chromosome 5:44,025,895 44,026,462区域。所对应序列如SEQ No.2所示。
SEQ No.2：
S3：注射获得阳性鼠
利用CRISPR Cas9的方式将人源CD38基因的CDS部分和PolyA插入鼠源Cd38基因ATG下游，其中人源CD38基因CDS长度903nt，编码300aa，PolyA基因，插入片段长度约1.4kb。插入的人源片段会在鼠源Cd38-201转录本exon1编码区上引入1-2个同义突变，使人源CD38基因在鼠源基因的内源调控下进行表达，鼠源Cd38基因表达被关闭，建立人源化基因小鼠。C57BL/6JGpt为背景鼠，成功获得了CD38人源化小鼠模型。
S31：确定人源化基因片段替换区域序列
根据人源CD38蛋白功能域及人鼠同源性比较，人源片段替换区域包括人源CD38基因的CDS部分和PolyA。片段长度约1.4kb。人源片段替换区域序列如SEQ No.3所示。人源片段在鼠源基因的内源调控下进行表达，鼠源Cd38基因表达被关闭。人源片段插入后小鼠Cd38的基因的1号exons区域对应序列如SEQ N0.4所示。
SEQ No.3：
SEQ N0.4：
S32：CD38人源化小鼠制备的sgRNA筛选筛选sgRNA，筛选出的sgRNA信息如下表1。
表1 sgRNA信息
| gRNA name | gRNA sequence(5’→3’) | PAM |
| S1 | CTAAATTCATAGTTAGCCAT | TGG |
| S2 | GGCTAACTATGAATTTAGCC | AGG |
S33：人源化打靶载体构建
CRISPR/Cas9技术的Donor(打靶载体)有两种形式：dsDNA(双链)和ssDNA(单链)，dsDNA Donor制备方便且长度可达5Kbp，但容易产生随机插入且中靶效率偏低；ssDNADonor制备虽繁琐但不易产生随机插入。本发明采用本领域常用技术手段构建打靶载体，打靶载体包含SEQ No.3序列，打靶载体示意图如图2所示。构建好的打靶载体通过转录，然后再逆转录，获得可用于注射的ssDNA donor。
S34：CD38人源化小鼠模型建立
根据筛选得到的sgRNA设计并构建携带人源序列的ssDNA donor，将ssDNA donor及Cas9/sgRNA系统注射至0.5d的小鼠受精卵中，移植至0.5d假孕雌鼠体内，受体鼠生出的F0代小仔在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型，获得阳性F0。
人源化F0小鼠基因型鉴定。对获得的F0小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，引物GPT000168-02-mCD38-5tF1/BGH-p A-tR1分别位于5’端同源臂外及ssDNA donor的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组5’端进行了有效插入；GPT000168-02-hCD38-3tF1/GPT000168-02-mCD38-3tR1分别位于ssDNA donor的人源片段内及3’端同源臂外，如该对引物扩增产生PCR引物，说明目标donor在小鼠基因组3’端进行了有效插入。BGH-pA-tF1/GPT000168-02-hCD38-tR1引物分别对串联重复进行检测，若未发生串联重复，则表明目标donor有效插入。
F0代小鼠与背景鼠配繁获得F1代杂合小鼠，F1代杂合小鼠F1进行互配后，获得F2代纯合子小鼠。
FO引物序列见表2，PCR反应体系见表三，PCR反应条件见表4，测序引物序列见表5。
表2 FO引物序列
表3 PCR反应体系
表4 PCR反应条件
对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序，测序正确的克隆经鉴定为阳性F0小鼠。
表5测序引物序列
CD38-KI-target F0小鼠5’端、3’端、串联检测鉴定电泳图如图3，CD 38-KI-target F1小鼠5’端、3’端、野生型基因鉴定电泳图如图4，其中：WT为C57BL/6JGpt(B6)基因组DNA，阴性对照；N为negative空白对照，无模板的对照；P为阳性对照；M为DNA Marker：TRANS 2K PLUS II条带：8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。结果：获得3只阳性F0小鼠，如图3所示，71#，72#，94#小鼠的人源CD38基因5’及3’端鉴定均为阳性，测序无突变，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠。阳性F0小鼠与背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果见图4所示，162#，165#小鼠人源CD38基因5’及3’端鉴定均为阳性，同时鼠源野生型基因检测也为阳性，表明获得的小鼠为正确进行基因重组的杂合阳性小鼠。F1小鼠大量扩繁后进行互配，获得纯合子小鼠。
实施例2B6-hCD38人源化小鼠中人源CD38蛋白检测
取实施例1的背景鼠(B6背景鼠)、F1小鼠(B6-hCD38杂合鼠)及纯合子小鼠F2(B6-hCD38人源化小鼠)的外周血，通过流式检测人源CD38蛋白的表达。分别使用抗人的CD38抗体和抗鼠的CD38抗体对B6背景鼠、B6-hCD38杂合鼠以及B6-hCD38纯合鼠进行流式检测，结果如图5，图5中，在背景鼠中只检测到mCD38，B6-hCD38杂合鼠中同时检测到hCD38和mCD38，B6-hCD38纯合鼠中只检测到hCD38，表明成功建立了CD38人源化小鼠。如图6，B6-hCD38人源化小鼠人CD38蛋白的表达水平统计图所示，B6-hCD38纯合鼠的hCD38表达比例达到68％左右。
实施例3
将实施例1建立的人源化小鼠模型用于人源免疫细胞发育、免疫治疗、炎症、自身免疫疾病及相关药物的筛选。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CD38基因人源化的非人动物蛋白，该CD38基因人源化的非人动物蛋白中包含：SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的全部或部分；或
与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或
与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
与SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
优选地，所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1的编码蛋白所示的氨基酸序列的全部或部分；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为与SEQ IDNO：1的编码蛋白所示的氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为与SEQ IDNO：1的编码蛋白所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于人CD38蛋白的氨基酸序列为与SEQ IDNO：1的编码蛋白所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列为SEQID NO：2的编码蛋白所示氨基酸序列的部分；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列与SEQID NO：2的编码蛋白所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列与SEQID NO：2的编码蛋白所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
所述CD38基因人源化的非人动物蛋白中中来源于非人动物CD38蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的编码蛋白所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
优选地，所述非人动物为小鼠。
2.一种嵌合CD38基因，该嵌合CD38基因包含：人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQID NO：4所示核苷酸序列的全部或部分；或
与人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或
与人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
与人CD38核苷酸序列的SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
3.一种CD38构建体，该CD38构建体包含人CD38基因或嵌合CD38基因，该构建体表达人或人源化CD38蛋白，该人源化CD38蛋白为权利要求1所述的CD38基因人源化的非人动物蛋白，嵌合CD38基因为权利要求2所述的嵌合CD38基因。
4.一种载体，包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列至少包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
5.一种CD38基因人源化的非人动物构建方法，该构建方法在非人动物上将人源CD38基因的CDS和PolyA插入该非人动物CD38基因ATG下游，人源CD38基因在该非人动物基因的内源调控下进行表达，该非人动物CD38基因表达被关闭；优选插入片段长度1.4kb；优选的，所述的非人动物为小鼠。
6.一种CD38基因人源化的非人动物构建方法，该构建方法包括用包含人CD38核苷酸序列的部分导入非人动物CD38基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化CD38蛋白，所述的人源化CD38蛋白如权利要求1所述的CD38基因人源化的非人动物蛋白；优选的，所述的非人动物还包括权利要求2所述的嵌合CD38基因。
7.一种CD38基因人源化的非人动物构建方法，包括以下步骤：
S1：确定人源CD38基因插入片段的序列：人源CD38基因片段为人源CD38基因的CDS序列，序列为SEQ No.1，CDS长度903nt，编码300aa；
S2：确定人源片段插入的位点：人源片段插入的位点为非人源Cd38的基因的1号exon区域，序列为SEQ No.2；
S3：利用CRISPR Cas9的方式将人源CD38基因的CDS部分和PolyA插入鼠源Cd38基因ATG下游；优选地，该步骤包括：
S31：确定人源片段替换区域及插入的人源序列：选取人源CD38基因的CDS部分插入小鼠Cd38基因ATG下游，选取的人源CD38基因序列为SEQ No.3；
S32：CD38人源化小鼠制备的sgRNA筛选；
S33：人源化打靶载体构建；
S34：CD38人源化模型建立：根据筛选得到的sgRNA设计并构建携带人源序列的ssDNAdonor，将ssDNA donor及Cas9/sgRNA系统注射至非人动物受精卵中，移植至假孕雌非人动物体内，受体非人动物生出F0代，F0代与背景非人动物配繁获得杂合F1，杂合F1大量扩繁后进行互配，获得纯合子F2。
8.一种多基因修饰的非人动物的构建方法，该多基因修饰的非人动物的构建方法将权利要求7所述的CD38基因人源化的非人动物构建方法获得的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
9.一种包含CD38基因人源化改造的细胞、组织或者器官，所述的细胞、组织或者器官包含权利要求2所述的嵌合CD38基因，所述的细胞、组织或者器官表达权利要求1所述的CD38基因人源化的非人动物蛋白。
10.权利要求7所述的构建方法构建的非人动物、权利要求8所述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、权利要求1所述的CD38基因人源化的非人动物蛋白、权利要求2所述的嵌合CD38基因、权利要求3所述的构建体或者权利要求9所述的细胞、组织或者器官应用于涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CD38功能、人CD38信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211342936.3A CN116284330A (zh) | 2022-10-31 | 2022-10-31 | 一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211342936.3A CN116284330A (zh) | 2022-10-31 | 2022-10-31 | 一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116284330A true CN116284330A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86778455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211342936.3A Pending CN116284330A (zh) | 2022-10-31 | 2022-10-31 | 一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116284330A (zh) |
-
2022
- 2022-10-31 CN CN202211342936.3A patent/CN116284330A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107475300B (zh) | Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用 | |
| CN111118019B (zh) | 人源化细胞因子il3基因改造非人动物的构建方法及应用 | |
| US20190281798A1 (en) | Genetically Modified Non-Human Animal With Human Or Chimeric PD-L1 | |
| CN111549072B (zh) | Vista基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用 | |
| CN107815467B (zh) | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 | |
| EP3507373A1 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric pd-l1 | |
| CN111690689B (zh) | 人源化ccr2基因改造动物模型的构建方法及其应用 | |
| CN110885858A (zh) | Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用 | |
| CN111073907A (zh) | 人源化细胞因子csf1基因改造非人动物的构建方法及应用 | |
| CN112725379A (zh) | 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用 | |
| CN109929875B (zh) | 一种lag3基因人源化动物模型的构建方法及其应用 | |
| CN108070613B (zh) | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 | |
| CN112779284B (zh) | Thpo基因人源化的非人动物的构建方法及应用 | |
| CN111647623B (zh) | 一种sirpa人源化动物模型的构建方法及其应用 | |
| CN108070614B (zh) | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 | |
| CN112626122B (zh) | hKDR人源化小鼠模型及其建立方法和应用 | |
| CN115011606A (zh) | Cd37基因人源化非人动物的构建方法及应用 | |
| CN116284330A (zh) | 一种cd38基因人源化的非人动物的构建方法及其应用 | |
| CN114751973A (zh) | Siglec15基因人源化非人动物的构建方法和应用 | |
| CN114134183A (zh) | 一种siglec15基因人源化动物模型的构建方法及应用 | |
| CN109694885B (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术制备PI3Kγ全身敲除模式小鼠方法及其应用和试剂盒 | |
| CN111549070A (zh) | 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法 | |
| CN111304247A (zh) | 人源化lag-3基因改造动物模型的制备方法及应用 | |
| CN114747541B (zh) | 一种psgl-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用 | |
| CN114592011B (zh) | 一种ptdss2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |