CN111549072B - Vista基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种VISTA基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用，涉及动物基因工程领域。本发明构建的VISTA基因人源化动物模型能够加速与人VISTA基因或蛋白相关的领域的研究进展。优选的，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将鼠源的VISTA基因替换为人源的VISTA基因，构建能与抗人源VISTA抗体相互作用的小鼠模型，该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，可用于筛选和评价针对人VISTA基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。

Description

VISTA基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及动物基因工程领域，尤其涉及一种VISTA基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用。

背景技术

目前为止，人类癌症的发生率以及死亡率在所有的疾病中依然很高，2018年全球癌症年报报告显示，新发癌症病例1810万例，死亡病例960万例；其中，中国，2018年新增病例380.4万例、死亡病例229.6万例，在癌症发病人数以及死亡人数两方面排名都居全球榜首，情况不容乐观。癌症的治疗方式中，免疫疗法是目前最火热的，被称为癌症治疗的第三次革命，其中与“免疫检查点抑制剂”相关的药物已经成为攻克癌症难关的有效疗法。但是传统的药物筛选方式基本上是采用体外细胞水平的药效验证方法，但相较于人体内复杂的内环境，比如细胞基质以及细胞间的相关作用等都不能被有效地模仿出来，而免疫治疗是通过调动自身的免疫系统来间接杀伤肿瘤，因此传统的体外细胞水平药效验证方法并不适合于目前的免疫治疗药效评价；另一方面，虽然可以利用常规模型动物在体内筛选药物来规避这些问题时，但又存在动物和人体靶点分子、生理等方面存在差异的问题，这在免疫治疗中尤为突出，因为免疫治疗的药物很多是特异的大分子抗体药物，动物和人之间靶点分子1个氨基酸的差异，都有可能导致药物不识别动物体内的靶点，进而影响药效评价，延长研发周期，增加不确定性。因此，利用对基因进行人源化改造，利用人源化动物模型进行药物筛选可以更有效的反映出体内的情况，筛选出疗效高的药物。

VISTA(V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T cellactivation)与迄今为止被发现的其它在活化的T淋巴细胞上表达的负性检查点调节因子不同，VISTA是一种在

T淋巴细胞上表达的因子，属于CD28蛋白家族的成员，在抗原提呈细胞中作为共抑制因子抑制T细胞应答，使用中和VISTA单克隆抗体阻断VISTA位点时可以使T细胞应答增强以及耐受性降低。也有研究表明，VISTA基因缺失时

T细胞亚群会重新分布，沉默亚群显著减少，而记忆样激活T细胞亚群增加，在缺乏固有VISTA表达的情况下，

T细胞在表观遗传和转录水平表现为会对T细胞受体和细胞因子刺激产生更强的响应。就像其它负性检查点调节因子一样，在癌症中阻断VISTA可能会增强宿主产生抗肿瘤特异性免疫反应的能力。

目前，国内外针对VISTA靶点的药物研发也在如火如荼的进行中。而且，已经有靶向VISTA的药物进入临床研究阶段，如Curis公司的CA-170。除了小分子CA-170，Curis还在今年1月从ImmuNext公司获得了开发和商业化用于癌症治疗的VISTA抗体的独家全球权利，包括ImmuNext的领先化合物CI-8993。国内方面，NextPharma数据库显示，国内药企思坦维也在开发针对VISTA(PD-1H)靶点的抗体研发。

免疫疗法治疗癌症虽有一定成效，但若免疫应答程度过强，会对健康组织造成很大的伤害，造成免疫毒副反应，因此在进行药效评价的同时也需要对受试药物的毒性安全性等方面进行严格的筛选。但常用的免疫缺陷小鼠因为免疫系统缺陷，无法评价免疫治疗类药物；常用的野生型小鼠，因为人鼠靶点差异，药物无法识别小鼠体内的靶点，也不适合于毒性和安全性评价。为了减少人鼠之间的这种差异，对野生型小鼠进行人源化改造可以很好的‘再现’人体的微环境，在用于药效评价的同时，也可以应用于对药物的毒性和安全性评价。目前，人源化小鼠模型已经广泛应用于肿瘤，病毒感染等疾病研究领域。

如今，基因工程技术已经发展的比较成熟，利用基因修饰的手段对靶点分子进行人源化改造，建立人源化动物模型研究人类疾病可以很好的解决人类和动物之间的靶点差异问题：经过基因修饰以后，人源化模式动物体内可以全部或部分的表达相应的人类蛋白，模仿人体疾病发生时各种分子之间的相互作用，重现人体疾病的特征，大大缩小临床前动物模型和人体之间的差异，使药物筛选在动物整体水平的筛选研究成为可能；同时，该类模型使我们可以在免疫系统正常的模型上，对药物的毒性和药物代谢进行评价，可以更好的贴合临床药物功效，提高药物筛选成功的概率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种VISTA基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用，能够加速与人VISTA基因或蛋白相关的领域的研究进展。

为实现以上目的，本发明提供一种VISTA基因人源化动物细胞的构建方法，包括：在非人动物细胞内导入人VISTA基因，使得该人VISTA基因在非人动物细胞中表达产生人源化的VISTA蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源VISTA基因的表达。

本发明一些实施例中，利用基因编辑技术实现所述VISTA基因人源化动物细胞的构建，在所述非人动物细胞内形成人源化VISTA基因；

可选的，所述非人动物为啮齿类动物；可选的，所述非人动物细胞为受精卵细胞；

可选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法将小鼠的VISTA基因的第2和第3号外显子的全部或部分序列替换为人VISTA基因的第2和第3号外显子的全部或部分序列。

本发明一些实施例中，所述人源化VISTA基因选自下列组中的至少一种：

(1)基因的CDS编码序列如SEQ ID NO.6所示；

(2)基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明一些实施例中，所述构建方法包括：提供人VISTA基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9 mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。

具体的，所述sgRNA可以通过体外转录或者化学合成的方式获得。

本发明一些实施例中，所述人VISTA基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人VISTA基因编码区以及3’同源臂，所述5’同源臂为与小鼠Vista基因的第2号外显子5’端同源的DNA片段，所述3’同源臂为与小鼠Vista基因的第3号外显子3’端同源的DNA片段；

所述sgRNA在小鼠Vista基因的5’端靶位点位于小鼠Vista基因的第1号内含子中，所述sgRNA在小鼠Vista基因的3’端靶位点位于小鼠Vista基因的第3号内含子中。

可选的，所述5’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，所述3’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO.10所示；

可选的，所述人VISTA基因编码区的DNA序列如SEQ ID NO.11所示；

可选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO.18-27任一项所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO.28-37任一项所示；

优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO.22所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO.36所示。

本发明还提供一种VISTA基因人源化动物细胞，所述VISTA基因人源化动物细胞由上述VISTA基因人源化动物细胞的构建方法获得。

本发明还提供一种VISTA基因人源化动物模型的构建方法，将上述VISTA基因人源化动物细胞或者由所述VISTA基因人源化动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；

对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。

可选的，所述VISTA基因人源化动物模型的构建方法还包括：将所述F0代阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，建立稳定的人源化VISTA基因改造小鼠品系。

本发明还提供一种细胞或细胞系或细胞培养物，所述细胞或细胞系或细胞培养物来源于VISTA基因人源化动物模型或其子代，所述VISTA基因人源化动物模型由上述VISTA基因人源化动物模型的构建方法获得。

本发明还提供一种组织或器官，所述组织或器官来源于VISTA基因人源化动物模型或其子代，所述VISTA基因人源化动物模型由上述VISTA基因人源化动物模型的构建方法获得。

本发明还提供一种由上述VISTA基因人源化动物模型的构建方法获得的VISTA基因人源化动物模型、来源于所述VISTA基因人源化动物模型的细胞、细胞系或细胞培养物、组织、器官在与人VISTA基因或蛋白相关的领域中的应用；

可选的，所述应用包括人VISTA基因功能研究、人VISTA抗体研究、针对人VISTA靶位点的药物构建和药效研究中的至少一种。

本发明的有益效果：

本发明提供一种VISTA基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用，本发明构建的VISTA基因人源化动物模型能够加速与人VISTA基因或蛋白相关的领域的研究进展，例如能够用于人源VISTA靶点药物药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义，同时也是药物安全性评价的理想模型，对人源VISTA靶点药物的毒理学进行临床前体内评价。

优选的，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源的VISTA基因替换为人源的VISTA基因，构建能与抗人源VISTA抗体相互作用的小鼠模型，该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人VISTA基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。

进一步的，本发明构建的VISTA人源化小鼠，将小鼠Vista基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化小鼠拥有人源胞外区，可筛选人源VISTA靶点药物，而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为鼠VISTA与人VISTA基因对比示意图。

图2为改造后的人源化小鼠VISTA基因示意图。

图3对小鼠Vista基因进行人源化改造的打靶方案。

图4为本发明实施例3的PBR322-VISTA载体酶切鉴定电泳图。EcoRI酶切鉴定结果，理论条带大小为7512bp、5614bp、1556bp、1518bp、220bp(1556bp和1518bp分不开，220bp条带因为产物量太少，条带显示不明显)；M：1kb DNA ladder。

图5为本发明实施例5的sgRNA活性比较图。

图6为本发明实施例6的体外转录sgRNA-4、sgRNA-18电泳图。

图7为本发明实施例8的F0代小鼠基因型鉴定图。

图8为本发明实施例8的F1代小鼠基因型鉴定图。

图9为本发明实施例9的反转录PCR验证人源化RNA水平表达引物位置示意图。

图10为本发明实施例9的野生型小鼠、纯合子小鼠脾脏细胞RNA反转录PCR电泳结果。HO为纯合子小鼠；WT为野生型小鼠；M为电泳DNA marker。P1+P2为图9所示引物P1和P2，用于检测人源化是否影响RNA的正常剪切；P3+P4为图9所示引物P3和P4，用于检测人源化RNA是否表达。

图11为本发明实施例10的流式细胞术检测不同基因型小鼠外周血T细胞鼠源、人源VISTA表达结果。hVISTA为针对人源VISTA流式抗体；mVISTA为针对鼠源Vista流式抗体。

图12为本发明实施例10的流式细胞术检测不同基因型小鼠外周血巨噬细胞鼠源、人源VISTA表达结果。hVISTA为针对人源VISTA流式抗体；mVISTA为针对鼠源Vista流式抗体。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法和技术，通常按照所属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

本发明实施例所用的小鼠品系、生化试剂、实验仪器为：

申请所合成的引物合成和测序服务购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

C57BL/6，ICR小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。

EcoRI限制性内切酶购自NEB，货号为R3101M。

In-Fusion HD Cloning Kits购自Takara，货号为639650。

sgRNA体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354。

大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司，货号为9057。

Cas9 mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA。

APC anti-mouse VISTA(PD-1H)抗体购自Biolegend，货号为150205。

PE anti-human VISTA抗体购自ThermoFisher，货号为12-1088-41。

流式细胞仪生产厂家为BECKMAN COΜLTER，型号为CytoFLEX Flow Cytometer。

T7核酸内切酶I检测试剂盒，购自NEB公司，货号为M0302S。

PCR产物凝胶回收试剂盒为QIAquick Gel Extraction Kit，购自QIAGEN，货号为28706。

实施例1序列设计

小鼠的Vista基因和人的VISTA基因均含有多个转录本，本实施例的序列设计主要以其中一个转录本为例进行阐述。即，将小鼠Vista基因(NCBI Gene ID：74048)第2和第3号外显子(基于NCBI登录号为NM_028732.4→NP_083008.1的转录本，其mRNA序列如SEQ IDNO.1所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示)用人VISTA基因(Gene ID：64115)的第2和第3号外显子替换(基于NCBI登录号为NM_022153.2→NP_071436.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO.3所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示)，其中，鼠Vista与人VISTA基因结构对比示意图见图1，最终得到的改造后的人源化小鼠VISTA基因结构示意图见图2，部分人源化小鼠VISTA基因DNA序列(嵌合VISTA基因DNA)如下所示(SEQ ID NO.5)：

SEQ ID NO.5仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为插入的人VISTA基因序列，斜体是为了插入人VISTA基因序列引入的其他序列。

改造后的人源化小鼠VISTA的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQIDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

鉴于人VISTA基因和小鼠Vista基因有多个转录本，本实施例中的人源化序列设计的方法同样适用于其它转录本的人源化改造。可将上述小鼠Vista基因的转录本替换为其他转录本。

实施例2重组载体PBR322-VISTA的设计及构建

根据序列设计，发明人进一步的设计了如图3所示的打靶方案和包含5’同源臂、人VISTA基因片段、3’同源臂的载体。其中5’同源臂(SEQ ID NO.9)为NCBI登录号为NC_000076.6的第60353150-60357365位核苷酸，3’同源臂(SEQ ID NO.10)为NCBI登录号为NC_000076.6的第60359492-60362950位核苷酸，人VISTA(SEQ ID NO.11)基因片段为NCBI登录号为NC_000010.11的第71762239-71760643位核苷酸。

载体的构建过程如下：设计扩增3段同源重组片段(LA，KI，RA)的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。其中，5’同源臂对应LA片段，人VISTA基因片段对应KI片段，3’同源臂对应RA片段，引物序列如下：

LA(4216bp)：

F：5’-GTCGACAAGCTGTTTcagaatccagtctccagatc-3’(SEQID NO.12)

R：5’-ggttgggttggaatgtcagaataccctacctcagcttgacagccaggg-3’(SEQ IDNO.13)

KI(1597bp)：

F：5’-cattccaacccaacccctagttggggaagcttctg-3’(SEQ ID NO.14)

R：5’-cttgagttgtcttgggtgaggcagagtcaagaggagcagagac-3’(SEQ ID NO.15)

RA(3459bp)：

F：5’-ccaagacaactcaagAAACtggggacaactgagttaca-3’(SEQ ID NO.16)

R：5’-TGATTAATTGTCAACcaattaaggaatatccccag-3’(SEQ ID NO.17)

以C57BL/6小鼠基因组DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得LA、RA片段，以人DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得KI片段。通过In-fusion试剂盒将片段连接到PBR322-MCS质粒上，最终获得载体PBR322-VISTA。

实施例3载体PBR322-VISTA的验证

随机挑选5个PBR322-VISTA克隆，使用限制性内切酶EcoRI进行酶切验证，酶切产物电泳应出现7512bp、5614bp、1556bp、1518bp、220bp大小片段。酶切结果参见图4，质粒酶切结果符合预期，表明质粒酶切验证结果正确。质粒经测序公司测序验证正确，进行后续实验。

实施例4 Vista基因sgRNA设计

sgRNA靶序列决定了其靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA同源重组载体的前提。

根据打靶方案，设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA10)、3’端靶位点(sgRNA11-sgRNA20)的sgRNA序列。

以小鼠为例，根据Vista基因的功能和序列特征，5’端靶位点位于小鼠Vista基因内含子1中，3’端靶位点位于小鼠Vista基因内含子3中，各sgRNA在VISTA基因上的靶位点序列如下：

sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO.18)：5’-cagttttcagagacttgggaggg-3’

sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO.19)：5’-ccagttttcagagacttgggagg-3’

sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO.20)：5’-tgcccagttttcagagacttggg-3’

sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO.21)：5’-ctcccaagtctctgaaaactggg-3’

sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO.22)：5’-tcaagctgaggtagggtaccagg-3’

sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO.23)：5’-gcctgcattaaggaccctgtggg-3’

sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO.24)：5’-actggtttgtctctgcccacagg-3’

sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO.25)：5’-gagcaagcaagcctgcattaagg-3’

sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO.26)：5’-gcccacagggtccttaatgcagg-3’

sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO.27)：5’-gcaggcttgcttgctcagctggg-3’

sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO.28)：5’-tttttccttctgcctttccaggg-3’

sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO.29)：5’-atttttccttctgcctttccagg-3’

sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO.30)：5’-ctcatgtttgtctaaaggctggg-3’

sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO.31)：5’-cctcatgtttgtctaaaggctgg-3’

sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO.32)：5’-aaaccctcatgtttgtctaaagg-3’

sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO.33)：5’-ccagcctttagacaaacatgagg-3’

sgRNA-17靶位点序列(SEQ ID NO.34)：5’-cagcctttagacaaacatgaggg-3’

sgRNA-18靶位点序列(SEQ ID NO.35)：5’-taactcagttgtccccattctgg-3’

sgRNA-19靶位点序列(SEQ ID NO.36)：5’-catgagggtttgtgccagaatgg-3’

sgRNA-20靶位点序列(SEQ ID NO.37)：5’-atgagggtttgtgccagaatggg-3’

实施例5针对不同靶位点sgRNA筛选

利用试剂盒检测多个sgRNA的活性。使用T7核酸内切酶I检测试剂盒检测，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图5。

图5中，泳道1-20分别展示sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4、sgRNA-5、sgRNA-6、sgRNA-7、sgRNA-8、sgRNA-9、sgRNA-10、sgRNA-11、sgRNA-12、sgRNA-13、sgRNA-14、sgRNA-15、sgRNA-16、sgRNA-17、sgRNA-18、sgRNA-19、sgRNA-20的活性检测结果，泳道M表示DNAMarker，泳道WT表示以野生型小鼠基因组为模板扩增出的PCR产物用T7核酸内切酶I检测结果。

图5结果显示，sgRNA-4和sgRNA-18样品显示出较好的T7核酸内切酶I切割效果，表明具有更好的Cas9活性。从中优先选择sgRNA-4和sgRNA-18为后续实验的sgRNA。

实施例6 sgRNA体外转录

sgRNA的合成通过体外PCR扩增sgRNA模板，以该模板为底物，利用HiScribe^TM T7High Yield RNA Synthesis Kit试剂盒进行体外转录。

sgRNA-4和sgRNA-18的体外转录模板DNA的PCR引物分别为：

SgRNA-F4(SEQ ID NO.38)：5'-gcTAATACGACTCACTATAgtcaagctgaggtagggtaccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’

SgRNA-F18(SEQ ID NO.39)：5’-gcTAATACGACTCACTATAgcatgagggtttgtgccagaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’

下游PCR通用引物：

SgRNA-R(SEQ ID NO.40)：5’-aaaAGCACCGACTCGGTGCC-3’

由DNA合成公司合成含有sgRNA scaffold的片段DNA，序列信息为：

sgRNA scaffold(SEQ ID NO.41)：

5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3'

使用含有sgRNA scaffold的片段DNA作为模板，四条引物(SgRNA-F4和SgRNA-R、SgRNA-F18和SgRNA-R)分别扩增出产物，利用凝胶回收试剂盒，回收PCR产物作为转录模板。根据体外转录试剂盒操作说明体外转录sgRNA-4和sgRNA-18。体外转录产物电泳结果请见图6。

实施例7受精卵显微注射及胚胎移植

取小鼠的受精卵，如C57BL/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的sgRNA-4、sgRNA-18(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书提供方法进行转录)、Cas9 mRNA和PBR322-VISTA质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体ICR母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的F0代小鼠通过与野生型小鼠杂交，扩大种群数量，然后自交获得纯合子小鼠，建立稳定的hVISTA人源化小鼠品系。

实施例8VISTA人源化小鼠的鉴定

1、F0代同源重组阳性小鼠基因型鉴定

分别使用两对引物对得到的F0代hVISTA小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR鉴定，引物I位于5’同源臂左侧，引物IV位于3’同源臂右侧，引物II和引物III均位于插入的片段上，具体序列如下：

5’同源臂重组鉴定引物：

引物I：5’-TGGGGAGGTTGTTCAGTGGTT-3’(SEQ ID NO.42)

引物II：5’-CTTGAGTTGTCTTGGGTGAGGC-3’(SEQ ID NO.43)

PCR反应体系(20μL)如表1所示：

表1 PCR反应体系

PCR扩增反应条件如表2所示：

表2 PCR扩增反应条件

步骤	温度(℃)	时间	备注
				1	98	2min	-
2	98	10sec	-
				3	64	15sec	-
4	68	3min	重复步骤2-4 35个循环
				5	68	5min	-
6	12	-	保温

3’同源臂重组鉴定引物：

引物III：5’-ATTCTGACATTCCAACCCAACC-3’(SEQ ID NO.44)

引物IV:5’-GCTGAGTCCGCAAGCAAGAG-3’(SEQ ID NO.45)

PCR反应体系(20μL)如表3所示：

表3 PCR反应体系

PCR扩增反应条件如表4所示：

表4 PCR扩增反应条件

步骤	温度(℃)	时间	备注
				1	98	2min	-
2	98	10sec	-
				3	64	15sec	-
4	68	3min	重复步骤2-4 35个循环
				5	68	5min	-
6	12	-	保温

如果重组载体插入位置正确，5'同源臂鉴定引物对I和II，应只有1条6.2kb长度的PCR条带，3'同源臂鉴定引物对III和IV，应有1条5.3kb长度的PCR条带；阴性小鼠应均无条带。

F0代小鼠PCR鉴定结果见图7。

图7中，A表示编号为F0-1、F0-2、F0-3、F0-4、F0-5、F0-6、F0-7、F0-8、F0-9、F0-10、F0-11、F0-12、F0-13、F0-14(依次对应图片上部白字标注的泳道1-14)的F0代小鼠的5'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。

B表示编号为F0-1、F0-2、F0-4、F0-3、F0-5、F0-10、F0-7、F0-8、F0-9、F0-6、F0-11、F0-12、F0-13、F0-14(依次对应图片上部白字标注的泳道1-14)的F0代小鼠的3'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。

从图7可以看出，编号为F0-3、F0-6、F0-8的3只小鼠双侧同源臂同源重组鉴定均为阳性，即编号为F0-3、F0-6、F0-8的3只小鼠为阳性小鼠。

F1代小鼠基因型鉴定：

将F0代阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR鉴定。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。F1代小鼠PCR实验结果见图8。

图8中，A展示编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12、F1-13、F1-14、F1-15、F1-16、F1-17、F1-18(依次对应图片上部白字标注的泳道1-18)的F1代小鼠的5'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。

B展示编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12、F1-13、F1-14、F1-15、F1-16、F1-17、F1-18(依次对应图片上部白字标注的泳道1-18)的F1代小鼠的3'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。

从图8可以看出，有10只F1代小鼠(编号为F1-4、F1-5、F1-6、F1-9、F1-10、F1-13、F1-15、F1-16、F1-17、F1-18)两个同源臂同源重组鉴定均为阳性，即这10只小鼠均为阳性小鼠。

将获得的F1代阳性小鼠分别与野生型小鼠交配，扩繁种群。同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠。

实施例9人源化小鼠Vista RNA表达分析

选取一只hVISTA纯合子小鼠和一只同窝野生型小鼠(6周龄)抽提脾脏总RNA，利用反转录试剂盒，反转录为cDNA后进行PCR，进行两个实验：1)验证人源片段插入的人源化改造是否影响鼠源Vista基因的正常剪切；2)验证人源化小鼠中人源插入片段是否表达。实验1)与实验2)的检测结果如图10所示。

图10中，HO表示纯合子小鼠，WT表示野生型小鼠，M表示DNA Marker，M左侧两泳道展示实验1)的检测结果，M右侧两泳道展示实验2)的检测结果。

针对实验1)设计的VISTA RNA检测引物位置如图9的P1/P2引物位置所示，序列为：

P1：5’-AACCCTGCTCCTTGCTATTT-3’(SEQ ID NO.46)，和

P2：5’-GCCACCTGTCTCTGCTTATAG-3’(SEQ ID NO.47)

PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，55sec，35个循环)；72℃，5min；12℃保温。

野生型小鼠理论上可扩增出612bp大小的PCR产物；人源化纯合子小鼠理论上只能扩增出621bp大小的PCR产物。因为我们的人源化策略将鼠源的外显子2和外显子3替换成了人源的外显子2和外显子3，该替换因人源、鼠源剪切位点的差异有可能影响Vista基因的正常剪切。因此我们将PCR引物设计在鼠源的外显子1和外显子4上，进行反转录PCR时可以将外显子2和外显子3一并扩增出来，理论上我们可以通过对人源化纯合子小鼠的PCR产物测序，确认是否对剪切有影响。反转录PCR结果如图10所示，在野生型和纯合子小鼠中均扩增出符合理论预期的目的大小条带，对人源化纯合子小鼠的PCR产物测序结果显示，目的条带序列与预期人源化后的mRNA序列一致(SEQ ID NO.7)，说明人源化并没有影响鼠源Vista基因转录时的正常剪切。

针对实验2)设计的VISTA RNA检测引物位置如图9的P3/P4引物位置所示，序列为：

P3：5’-CCGTATTCCCTGTATGTCTGTC-3’(SEQ ID NO.48)，和

P4：5’-GTTGCTGCTGTCCATCCT-3’(SEQ ID NO.49)

PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，55sec，35个循环)；72℃，5min；12℃保温。

理论上人源化小鼠可扩增出600bp大小的PCR产物。

反转录PCR电泳结果见图10，如图10所示，只有在人源化纯合子小鼠中可检测到人源化的VISTA mRNA的表达，野生型小鼠中检测不到人源化的VISTA mRNA的表达。

实施例10人源化小鼠VISTA蛋白水平表达分析

杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，选取一只hVISTA纯合子小鼠，一只同窝野生型小鼠(6-7周龄)，眼内眦取外周血检测不同细胞类型上鼠源和人源化VISTA蛋白表达。外周血，加入红细胞裂解液，裂解5min后离心弃上清，用PBS清洗细胞1次，调整细胞浓度至10⁷/ml，取100μl，用CD16/CD32 Fc receptor封闭试剂封闭5分钟后，进行抗体标记。分别用APCanti-mouse抗体标记鼠源Vista；PE anti-human抗体标记人源VISTA。流式分析结果显示：在外周血T细胞中(图11)，野生型小鼠中无论是CD3⁺T细胞，CD4⁺T细胞，还是CD8⁺T细胞只均能检测到鼠源Vista蛋白的表达，而纯合子小鼠在CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞中均只能检测到人源VISTA蛋白的表达；在外周血巨噬细胞(图12)中，也观察到了类似的结果，野生型小鼠只能检测到鼠源Vista蛋白阳性的细胞，hVISTA纯合子小鼠中只能检测到人源VISTA蛋白阳性的细胞。

序列表

<110> 上海南方模式生物科技股份有限公司

<120> VISTA基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4846

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

gggggcgctg ctgggcgggg agcttgctcg gccgcctgcc tcgccttggg ctcagcattc 60

actctagcga gcgagcggcg tgtacagccg gctccctggg ctcctggagt cccgcttgct 120

ccaagcgcac tccagcagtc tctttctgct cttgcccggc tcgacggcga catgggtgtc 180

cccgcggtcc cagaggccag cagcccgcgc tggggaaccc tgctccttgc tattttcctg 240

gctgcatcca gaggtctggt agcagccttc aaggtcacca ctccatattc tctctatgtg 300

tgtcccgagg gacagaatgc caccctcacc tgcaggattc tgggccccgt gtccaaaggg 360

cacgatgtga ccatctacaa gacgtggtac ctcagctcac gaggcgaggt ccagatgtgc 420

aaagaacacc ggcccatacg caacttcaca ttgcagcacc ttcagcacca cggaagccac 480

ctgaaagcca acgccagcca tgaccagccc cagaagcatg ggctagagct agcttctgac 540

caccacggta acttctctat caccctgcgc aatgtgaccc caagggacag cggcctctac 600

tgctgtctag tgatagaatt aaaaaaccac cacccagaac aacggttcta cgggtccatg 660

gagctacagg tacaggcagg caaaggctcg gggtccacat gcatggcgtc taatgagcag 720

gacagtgaca gcatcacggc tgcggccctg gccaccggcg cctgcatcgt gggaatcctc 780

tgcctccccc ttatcctgct gctggtctat aagcagagac aggtggcctc tcaccgccgt 840

gcccaggagt tggtgaggat ggacagcagc aacacccaag gaatcgaaaa cccaggcttc 900

gagaccactc cacccttcca ggggatgcct gaggccaaga ccaggccgcc actgtcctat 960

gtggcccagc ggcaaccttc ggagtcagga cggtacctgc tctctgaccc cagcacacct 1020

ctgtcgcctc caggccctgg ggacgtcttt ttcccatccc tagatccagt ccctgactcc 1080

cctaactctg aagccatcta aaccagctgg ggaaccatga accatggtac ctgggtcagg 1140

gatatgtgca cttgatctat ggctggccct tggacagtct tttaggcact gactccagct 1200

tccttgctcc tgctctgagc ctagactctg cttttacaag atgcacagac cctcccctat 1260

ctctttcaga cgctacttgg ggggcaggga gaagatgttg gattgctcat tgctgttctc 1320

aagatcttgg gatgctgagt tctccctaga gacttgactt cgacagccac agatgtcaga 1380

tgacctgcat cctatgaacg tccggcttgg caagagcctt tcttcatgga aaccagtagc 1440

ccggagggga tgaggtaggc accttgccac cctcccggga gagagacaca agatgtgaga 1500

gactcctgct cactgtgggg gtgtggctgg cctgcttgtt tgcctgagga tgctcctctg 1560

ttggactgac tctatccccc tggattctgg agcttggctg gcctatgtcc caccagagga 1620

gcatctcagc agccttccac cagcaacctg agggcctgcc agcttcgtgg ctctgggctc 1680

tcattacctg tatggccgtc cacagagctc agtggccaga ggctttgaaa caggaagtac 1740

atgtcaggtt caggaaccac tgtgagctca ttagtgtctt gagcaatgtg aggcctggac 1800

cagtggacac ggagggaggg tggcgagagg atgatgggga tgatgagggg aacacgctcc 1860

cttcctgtcc ttgtcatcca ccactaccac tattcagtgt ggagcagtgg caaaggtgac 1920

cgacctccac aatgtcctag tgatgctgga ccatttctaa gtgtgaaaga gatgctatta 1980

aaaacagtat gtggcaatgg ctgccaacag ctgagtggac tggaggcact ggctttaagg 2040

ccctggaggt gcagggcccg gtatggggat agggatggga gtttcagtga gggcctaggg 2100

atcactccgc ttctgaccac tcttcttctg agcctcacct cagggtgacc ttcaggcaca 2160

cagaagagct tgcccctggt ccgatactac tcttggctct catctccagg gtttggcatg 2220

acctgggcac acagggggag tcttcagaaa ggattttaaa gcatgaaaag aaagggtagt 2280

tcttgtgagg tagggatggg cagctgatgt ttgagagtga ggagggatac ggctgggcag 2340

atcactctcc agtctctaga gggaaagtag ctctaagtct gggagagcag cagcccagtg 2400

gtaccatatg tcttcttgca gcttccactg gctgggctga actgggcatg ggtaggaaag 2460

ctcctgttct gggcctgcag ccagggagaa ccccattcat tccctgagga cagatgggtg 2520

gggagagaag agagagtttc aggccgggaa gcagcaataa gctatctgct ggggacccag 2580

acaagttgtc tgatgaggtc caagatgtgg gatgccagtt atacctgggg cttggggatc 2640

cttagaggct ttgtatcatc atcataggag tgtcggggtg gccagggcat caaagccatg 2700

acccctgttt tatcctcagg gtccactctt ctgcaccatc cattgctcta gatctatgca 2760

gttactatag acagaatgtg ttgttctgtt tggctttggg gataatggcc tggcgaactg 2820

ccagctgttc agtggcaggg ctgtgaggcc agtcaaagac tagaacccac agaccagctg 2880

aacgatgagt atagcctgtc ccctggggga gcctgacctg tctccagccc taagcttcag 2940

acctcaccac tcagatgact tctaagaatt tgcctgtggg gacccctgca tggctgcagc 3000

tccgtggaaa ggagaggagg cccccagcag aagaaccact cgcttcctgc ccagcttcct 3060

cctgtagggc tctaagtctc ttcttcttgg gaccctgcaa gcaaaggcat gtcagcttgg 3120

tggtttcctg ttttgggtga agttttgtgt ggtccgggtt ctgtctacat ccatgaactt 3180

gggtgctacc accttgctgc tgctgtagag acagctgcag gatcttaggg tggaaaatgg 3240

aggtgccctg aggtgctagc ccttggggca aaagatgggg tggcaatgag acacagtggg 3300

gaactgagtt ccccaagagg agggaggagc cctgtagcct caagggccat attgggttcc 3360

tggtaccagc aaaagcctag agagcgaagt ctgtattttg aggaggtaat tgatccttac 3420

ggaatccatc agaaatttgg agcgggtgct ttatctatct ctggagggtc tctacctatc 3480

tccgatgaag ctctccctgg gcctgggatg ggagaaacca ggaggaaagg tgtctgataa 3540

agcaggggct tcttgacaag ccaaagggcc actggtagct gttgtggacc gagctgaccc 3600

tgctgaagta ttgtagtgtg ccttggacca acttctcaaa agagcaaccc cggggctacc 3660

ctacttctgc caggaagagg cggagaaggg gctgagaggc ctggaagggg ctagctcctt 3720

ctttgagaac tgctccccgg aggacttgga ggaggcggct aggctacggg ctgctgaggg 3780

ccctttgtct ttcctaacct gggcactgtt aggatgctcc ctcctggaaa aggctttcct 3840

gggtgtgagc tagagcagtg tccatgccag cgctgaacct gccatggtgg gagctgaact 3900

aaaaatttct cagggaacta aaataggcaa aagaggaact gggggaggag ggtgccaggc 3960

aggatggggg gaagggaggg cagtgcaaaa gtctcttgaa acacagacag cccagctgag 4020

tgccagtccc agatcacaga gaatacggct catctggctc atgttctgca tgcttgctgc 4080

tttaccctgg cactttcctt ctccaccatg agtgcgagtc ctgggagtcc tgggagggtg 4140

aggattaatg ccagcctggg gagcagatag ctgacagagt ccttgggtaa ctggcttgaa 4200

ccaggacctc aggattccac tctggggatc tagctttgtc tgggccagtg aagatctcta 4260

taatggcatt attgccaggg gataaacatt tcactgggtt ctgatctgtt gggtgtggct 4320

tcctggaaaa tatggtgaga ggaattctgc taaggataca gttgataaga aagttctgag 4380

attgattagt aatgcctgcc ttggactcag gaagggaagt ggcagtatga atgccatgtc 4440

ttaatcattt tggttaaaat atgcttccca aaagatttcc acgtgtgttc ttgtttattt 4500

gacatctgtc tccatatcag tcttgaaagc ctttctgtgt gtatatatat gatgtttgcg 4560

tgtatatatg tttttgtgtg tgcatatgga agtcagaaat cactgggtgt cttcctccat 4620

tcctttgcaa tgtatgtttt tttttttttt acgatttatt tactatatga atgttttgcc 4680

tgaatacatg cataggtgtc acgtacatgc ctgctggaac gcttggaact ggagttacag 4740

gtggctatga gctacagtgt gagcactggg aatcaaacct gggtcttctg caagagcaac 4800

aaattaaaag tcagctctta actacttgag ctatttttcc aactcc 4846

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 2

Met Gly Val Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Trp Gly Thr

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala Ala

20 25 30

Phe Lys Val Thr Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

35 40 45

Asn Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Val Ser Lys Gly His

50 55 60

Asp Val Thr Ile Tyr Lys Thr Trp Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Glu Val

65 70 75 80

Gln Met Cys Lys Glu His Arg Pro Ile Arg Asn Phe Thr Leu Gln His

85 90 95

Leu Gln His His Gly Ser His Leu Lys Ala Asn Ala Ser His Asp Gln

100 105 110

Pro Gln Lys His Gly Leu Glu Leu Ala Ser Asp His His Gly Asn Phe

115 120 125

Ser Ile Thr Leu Arg Asn Val Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Cys

130 135 140

Cys Leu Val Ile Glu Leu Lys Asn His His Pro Glu Gln Arg Phe Tyr

145 150 155 160

Gly Ser Met Glu Leu Gln Val Gln Ala Gly Lys Gly Ser Gly Ser Thr

165 170 175

Cys Met Ala Ser Asn Glu Gln Asp Ser Asp Ser Ile Thr Ala Ala Ala

180 185 190

Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu Ile

195 200 205

Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser His Arg Arg Ala

210 215 220

Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Ser Asn Thr Gln Gly Ile Glu Asn

225 230 235 240

Pro Gly Phe Glu Thr Thr Pro Pro Phe Gln Gly Met Pro Glu Ala Lys

245 250 255

Thr Arg Pro Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser Glu Ser

260 265 270

Gly Arg Tyr Leu Leu Ser Asp Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly

275 280 285

Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp Ser Pro

290 295 300

Asn Ser Glu Ala Ile

305

<210> 3

<211> 4714

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 3

agtcgcggga ggcttccccg cgccggccgc gtcccgcccg ctccccggca ccagaagttc 60

ctctgcgcgt ccgacggcga catgggcgtc cccacggccc tggaggccgg cagctggcgc 120

tggggatccc tgctcttcgc tctcttcctg gctgcgtccc taggtccggt ggcagccttc 180

aaggtcgcca cgccgtattc cctgtatgtc tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc 240

tgcaggctct tgggccctgt ggacaaaggg cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac 300

cgcagctcga ggggcgaggt gcagacctgc tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg 360

ttccaggacc ttcacctgca ccatggaggc caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg 420

gctcagcgcc acgggctgga gtcggcctcc gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg 480

cgcaacctga ccctgctgga tagcggcctc tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac 540

caccactcgg agcacagggt ccatggtgcc atggagctgc aggtgcagac aggcaaagat 600

gcaccatcca actgtgtggt gtacccatcc tcctcccagg atagtgaaaa catcacggct 660

gcagccctgg ctacgggtgc ctgcatcgta ggaatcctct gcctccccct catcctgctc 720

ctggtctaca agcaaaggca ggcagcctcc aaccgccgtg cccaggagct ggtgcggatg 780

gacagcaaca ttcaagggat tgaaaacccc ggctttgaag cctcaccacc tgcccagggg 840

atacccgagg ccaaagtcag gcaccccctg tcctatgtgg cccagcggca gccttctgag 900

tctgggcggc atctgctttc ggagcccagc acccccctgt ctcctccagg ccccggagac 960

gtcttcttcc catccctgga ccctgtccct gactctccaa actttgaggt catctagccc 1020

agctggggga cagtgggctg ttgtggctgg gtctggggca ggtgcatttg agccagggct 1080

ggctctgtga gtggcctcct tggcctcggc cctggttccc tccctcctgc tctgggctca 1140

gatactgtga catcccagaa gcccagcccc tcaacccctc tggatgctac atggggatgc 1200

tggacggctc agcccctgtt ccaaggattt tggggtgctg agattctccc ctagagacct 1260

gaaattcacc agctacagat gccaaatgac ttacatctta agaagtctca gaacgtccag 1320

cccttcagca gctctcgttc tgagacatga gccttgggat gtggcagcat cagtgggaca 1380

agatggacac tgggccaccc tcccaggcac cagacacagg gcacggtgga gagacttctc 1440

ccccgtggcc gccttggctc ccccgttttg cccgaggctg ctcttctgtc agacttcctc 1500

tttgtaccac agtggctctg gggccaggcc tgcctgccca ctggccatcg ccaccttccc 1560

cagctgcctc ctaccagcag tttctctgaa gatctgtcaa caggttaagt caatctgggg 1620

cttccactgc ctgcattcca gtccccagag cttggtggtc ccgaaacggg aagtacatat 1680

tggggcatgg tggcctccgt gagcaaatgg tgtcttgggc aatctgaggc caggacagat 1740

gttgccccac ccactggaga tggtgctgag ggaggtgggt ggggccttct gggaaggtga 1800

gtggagaggg gcacctgccc cccgccctcc ccatccccta ctcccactgc tcagcgcggg 1860

ccattgcaag ggtgccacac aatgtcttgt ccaccctggg acacttctga gtatgaagcg 1920

ggatgctatt aaaaactaca tggggaaaca ggtgcaaacc ctggagatgg attgtaagag 1980

ccagtttaaa tctgcactct gctgctcctc ccccaccccc accttccact ccatacaatc 2040

tgggcctggt ggagtcttcg cttcagagcc attcggccag gtgcgggtga tgttcccatc 2100

tcctgcttgt gggcatgccc tggctttgtt tttatacaca taggcaaggt gagtcctctg 2160

tggaattgtg attgaaggat tttaaagcag gggaggagag tagggggcat ctctgtacac 2220

tctgggggta aaacagggaa ggcagtgcct gagcatgggg acaggtgagg tggggctggg 2280

cagaccccct gtagcgttta gcaggatggg ggccccaggt actgtggaga gcatagtcca 2340

gcctgggcat ttgtctccta gcagcctaca ctggctctgc tgagctgggc ctgggtgctg 2400

aaagccagga tttggggcta ggcgggaaga tgttcgccca attgcttggg gggttggggg 2460

gatggaaaag gggagcacct ctaggctgcc tggcagcagt gagccctggg cctgtggcta 2520

cagccaggga accccacctg gacacatggc cctgcttcta agccccccag ttaggcccaa 2580

aggaatggtc cactgagggc ctcctgctct gcctgggctg ggccaggggc tttgaggaga 2640

gggtaaacat aggcccggag atggggctga cacctcgagt ggccagaata tgcccaaacc 2700

ccggcttctc ccttgtccct aggcagaggg gggtcccttc ttttgttccc tctggtcacc 2760

acaatgcttg atgccagctg ccataggaag agggtgctgg ctggccatgg tggcacacac 2820

ctgtcctccc agcactttgc agggctgagg tggaaggacc gcttaagccc aggtgttcaa 2880

ggctgctgtg agctgtgttc gagccactac actccagcct ggggacggag caaaactttg 2940

cctcaaaaca aattttaaaa agaaagaaag aaggaaagag ggtatgtttt tcacaattca 3000

tgggggcctg catggcagga gtggggacag gacacctgct gttcctggag tcgaaggaca 3060

agcccacagc ccagattccg gttctcccaa ctcaggaaga gcatgccctg ccctctgggg 3120

aggctggcct ggccccagcc ctcagctgct gaccttgagg cagagacaac ttctaagaat 3180

ttggctgcca gaccccaggc ctggctgctg ctgtgtggag agggaggcgg cccgcagcag 3240

aacagccacc gcacttcctc ctcagcttcc tctggtgcgg ccctgccctc tcttctctgg 3300

acccttttac aactgaacgc atctgggctt cgtggtttcc tgttttcagc gaaatttact 3360

ctgagctccc agttccatct tcatccatgg ccacaggccc tgcctacaac gcactaggga 3420

cgtccctccc tgctgctgct ggggaggggc aggctgctgg agccgccctc tgagttgccc 3480

gggatggtag tgcctctgat gccagccctg gtggctgtgg gctggggtgc atgggagagc 3540

tgggtgcgag aacatggcgc ctccaggggg cgggaggagc actaggggct ggggcaggag 3600

gctcctggag cgctggattc gtggcacagt ctgaggccct gagagggaaa tccatgcttt 3660

taagaactaa ttcattgtta ggagatcaat caggaattag gggccatctt acctatctcc 3720

tgacattcac agtttaatag agacttcctg cctttattcc ctcccaggga gaggctgaag 3780

gaatggaatt gaaagcacca tttggagggt tttgctgaca cagcggggac tgctcagcac 3840

tccctaaaaa cacaccatgg aggccactgg tgactgctgg tgggcaggct ggccctgcct 3900

gggggagtcc gtggcgatgg gcgctggggt ggaggtgcag gagccccagg acctgctttt 3960

caaaagactt ctgcctgacc agagctccca ctacatgcag tggcccaggg cagaggggct 4020

gatacatggc ctttttcagg gggtgctcct cgcggggtgg acttgggagt gtgcagtggg 4080

acagggggct gcaggggtcc tgccaccacc gagcaccaac ttggcccctg gggtcctgcc 4140

tcatgaatga ggccttcccc agggctggcc tgactgtgct gggggctggg ttaacgtttt 4200

ctcagggaac cacaatgcac gaaagaggaa ctggggttgc taaccaggat gctgggaaca 4260

aaggcctctt gaagcccagc cacagcccag ctgagcatga ggcccagccc atagacggca 4320

caggccacct ggcccattcc ctgggcattc cctgctttgc attgctgctt ctcttcaccc 4380

catggaggct atgtcaccct aactatcctg gaatgtgttg agagggattc tgaatgatca 4440

atatagcttg gtgagacagt gccgagatag atagccatgt ctgccttggg cacgggagag 4500

ggaagtggca gcatgcatgc tgtttcttgg ccttttctgt tagaatactt ggtgctttcc 4560

aacacacttt cacatgtgtt gtaacttgtt tgatccaccc ccttccctga aaatcctggg 4620

aggttttatt gctgccattt aacacagagg gcaatagagg ttctgaaagg tctgtgtctt 4680

gtcaaaacaa gtaaacggtg gaactacgac taaa 4714

<210> 4

<211> 311

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 4

Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser

1 5 10 15

Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala

20 25 30

Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

35 40 45

Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His

50 55 60

Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val

65 70 75 80

Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp

85 90 95

Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp

100 105 110

Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn

115 120 125

Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr

130 135 140

Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val

145 150 155 160

His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser

165 170 175

Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr

180 185 190

Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu

195 200 205

Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn

210 215 220

Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile

225 230 235 240

Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu

245 250 255

Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser

260 265 270

Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro

275 280 285

Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp

290 295 300

Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile

305 310

<210> 5

<211> 1920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagccctaa agggcatttt tttttctccc tcccaagtct ctgaaaactg ggcactggtt 60

tgtctctgcc cacagggtcc ttaatgcagg cttgcttgct cagctgggtc cctggctgtc 120

aagctgaggt agggtattct gacattccaa cccaacccct agttggggaa gcttctgtga 180

ctccccctac aacagcctag gatggagtgg ggtttgtgaa caaatgcaga aggcagtctt 240

agggaggtca gctgacatgc ccctggcctg tggctgggaa gtagcagagg ctaaggttct 300

tccccgctct ggggttgcca ggagtagcac tggatcagtc aggtgacagg gctctcctct 360

ctctgagcag gtccggtggc agccttcaag gtcgccacgc cgtattccct gtatgtctgt 420

cccgaggggc agaacgtcac cctcacctgc aggctcttgg gccctgtgga caaagggcac 480

gatgtgacct tctacaagac gtggtaccgc agctcgaggg gcgaggtgca gacctgctca 540

gagcgccggc ccatccgcaa cctcacgttc caggaccttc acctgcacca tggaggccac 600

caggctgcca acaccagcca cgacctggct cagcgccacg ggctggagtc ggcctccgac 660

caccatggca acttctccat caccatgcgc aacctgaccc tgctggatag cggcctctac 720

tgctgcctgg tggtggagat caggcaccac cactcggagc acagggtcca tggtgccatg 780

gagctgcagg tgcagacagg tgagggcatc ctgcacgtga cagcctggcg tgtgtggagg 840

gctgcctgtc tgatggtgtg accattcatg acactgtgct gggcagagtg tgaggctgca 900

tgggtaacac tggcactcca gggagtgtgt gggtgagatg gggtggtcaa gggtgtgtgg 960

agtgtgggtt tgtagttagc tggagtgatg gagagggagg gtgtacctgg ctccatttgt 1020

gacagtgaga ctttttaatg tgtgaggctg taggtacctg ggctgggagt gtgactgctc 1080

atgatgacat catggctgct gtgggtatag gcatcagtgg gactgattgg tgccctgggg 1140

catgactcag tggatggctg aatggctgtt ggagaatata tgcgtgtgtg tgtctgtctg 1200

ttcaggtgag agtgcaaggg cccatggttc ggatagaggt gtgggcacca gcgggtattc 1260

acatgcccct gggagtggca tgaaaatggg cagggtgaga acatgccagg gtgtgtgtgg 1320

gtgcacacgt gtgcaggctg ccactgggcc aacactgccg agtaggcact agcgtgagaa 1380

cctggggcag gagggggaca ctggcctgga caagcctccc tggcctcctg ggcctgacac 1440

ccacctaatg gcccttctgt ttgttcccac aggcaaagat gcaccatcca actgtgtggt 1500

gtacccatcc tcctcccagg atagtgaaag taagggacca acctcttgcc ccttttgggt 1560

tctctgtttt cttctgtcct catcctgcac ccagaccctg tttggaactc tggcctcatc 1620

accccaagcc ctcagaaccc cccggtcctc ctccttttct gctgctgcac atcccttctg 1680

cttcctcctt ggtgcaatcc ccagaagccc actctccttc catctgctct ggagtctctg 1740

ctcctcttga ctctgcctca cccaagacaa ctcaagaaac tggggacaac tgagttacag 1800

cctcaactca agccccacct caatgaccaa gacgactttc tactcaaact acttgtattt 1860

tcaaacccaa ccgaccactc caccgtgatt tgttgacttg aatgagagcc acggcagtgt 1920

<210> 6

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgggtgtcc ccgcggtccc agaggccagc agcccgcgct ggggaaccct gctccttgct 60

attttcctgg ctgcatccag aggtccggtg gcagccttca aggtcgccac gccgtattcc 120

ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgtc accctcacct gcaggctctt gggccctgtg 180

gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctcgag gggcgaggtg 240

cagacctgct cagagcgccg gcccatccgc aacctcacgt tccaggacct tcacctgcac 300

catggaggcc accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagcgcca cgggctggag 360

tcggcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatgc gcaacctgac cctgctggat 420

agcggcctct actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accactcgga gcacagggtc 480

catggtgcca tggagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctgtgtggtg 540

tacccatcct cctcccagga tagtgaaagc atcacggctg cggccctggc caccggcgcc 600

tgcatcgtgg gaatcctctg cctccccctt atcctgctgc tggtctataa gcagagacag 660

gtggcctctc accgccgtgc ccaggagttg gtgaggatgg acagcagcaa cacccaagga 720

atcgaaaacc caggcttcga gaccactcca cccttccagg ggatgcctga ggccaagacc 780

aggccgccac tgtcctatgt ggcccagcgg caaccttcgg agtcaggacg gtacctgctc 840

tctgacccca gcacacctct gtcgcctcca ggccctgggg acgtcttttt cccatcccta 900

gatccagtcc ctgactcccc taactctgaa gccatctaa 939

<210> 7

<211> 4855

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggggcgctg ctgggcgggg agcttgctcg gccgcctgcc tcgccttggg ctcagcattc 60

actctagcga gcgagcggcg tgtacagccg gctccctggg ctcctggagt cccgcttgct 120

ccaagcgcac tccagcagtc tctttctgct cttgcccggc tcgacggcga catgggtgtc 180

cccgcggtcc cagaggccag cagcccgcgc tggggaaccc tgctccttgc tattttcctg 240

gctgcatcca gaggtccggt ggcagccttc aaggtcgcca cgccgtattc cctgtatgtc 300

tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc tgcaggctct tgggccctgt ggacaaaggg 360

cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac cgcagctcga ggggcgaggt gcagacctgc 420

tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg ttccaggacc ttcacctgca ccatggaggc 480

caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg gctcagcgcc acgggctgga gtcggcctcc 540

gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg cgcaacctga ccctgctgga tagcggcctc 600

tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac caccactcgg agcacagggt ccatggtgcc 660

atggagctgc aggtgcagac aggcaaagat gcaccatcca actgtgtggt gtacccatcc 720

tcctcccagg atagtgaaag catcacggct gcggccctgg ccaccggcgc ctgcatcgtg 780

ggaatcctct gcctccccct tatcctgctg ctggtctata agcagagaca ggtggcctct 840

caccgccgtg cccaggagtt ggtgaggatg gacagcagca acacccaagg aatcgaaaac 900

ccaggcttcg agaccactcc acccttccag gggatgcctg aggccaagac caggccgcca 960

ctgtcctatg tggcccagcg gcaaccttcg gagtcaggac ggtacctgct ctctgacccc 1020

agcacacctc tgtcgcctcc aggccctggg gacgtctttt tcccatccct agatccagtc 1080

cctgactccc ctaactctga agccatctaa accagctggg gaaccatgaa ccatggtacc 1140

tgggtcaggg atatgtgcac ttgatctatg gctggccctt ggacagtctt ttaggcactg 1200

actccagctt ccttgctcct gctctgagcc tagactctgc ttttacaaga tgcacagacc 1260

ctcccctatc tctttcagac gctacttggg gggcagggag aagatgttgg attgctcatt 1320

gctgttctca agatcttggg atgctgagtt ctccctagag acttgacttc gacagccaca 1380

gatgtcagat gacctgcatc ctatgaacgt ccggcttggc aagagccttt cttcatggaa 1440

accagtagcc cggaggggat gaggtaggca ccttgccacc ctcccgggag agagacacaa 1500

gatgtgagag actcctgctc actgtggggg tgtggctggc ctgcttgttt gcctgaggat 1560

gctcctctgt tggactgact ctatccccct ggattctgga gcttggctgg cctatgtccc 1620

accagaggag catctcagca gccttccacc agcaacctga gggcctgcca gcttcgtggc 1680

tctgggctct cattacctgt atggccgtcc acagagctca gtggccagag gctttgaaac 1740

aggaagtaca tgtcaggttc aggaaccact gtgagctcat tagtgtcttg agcaatgtga 1800

ggcctggacc agtggacacg gagggagggt ggcgagagga tgatggggat gatgagggga 1860

acacgctccc ttcctgtcct tgtcatccac cactaccact attcagtgtg gagcagtggc 1920

aaaggtgacc gacctccaca atgtcctagt gatgctggac catttctaag tgtgaaagag 1980

atgctattaa aaacagtatg tggcaatggc tgccaacagc tgagtggact ggaggcactg 2040

gctttaaggc cctggaggtg cagggcccgg tatggggata gggatgggag tttcagtgag 2100

ggcctaggga tcactccgct tctgaccact cttcttctga gcctcacctc agggtgacct 2160

tcaggcacac agaagagctt gcccctggtc cgatactact cttggctctc atctccaggg 2220

tttggcatga cctgggcaca cagggggagt cttcagaaag gattttaaag catgaaaaga 2280

aagggtagtt cttgtgaggt agggatgggc agctgatgtt tgagagtgag gagggatacg 2340

gctgggcaga tcactctcca gtctctagag ggaaagtagc tctaagtctg ggagagcagc 2400

agcccagtgg taccatatgt cttcttgcag cttccactgg ctgggctgaa ctgggcatgg 2460

gtaggaaagc tcctgttctg ggcctgcagc cagggagaac cccattcatt ccctgaggac 2520

agatgggtgg ggagagaaga gagagtttca ggccgggaag cagcaataag ctatctgctg 2580

gggacccaga caagttgtct gatgaggtcc aagatgtggg atgccagtta tacctggggc 2640

ttggggatcc ttagaggctt tgtatcatca tcataggagt gtcggggtgg ccagggcatc 2700

aaagccatga cccctgtttt atcctcaggg tccactcttc tgcaccatcc attgctctag 2760

atctatgcag ttactataga cagaatgtgt tgttctgttt ggctttgggg ataatggcct 2820

ggcgaactgc cagctgttca gtggcagggc tgtgaggcca gtcaaagact agaacccaca 2880

gaccagctga acgatgagta tagcctgtcc cctgggggag cctgacctgt ctccagccct 2940

aagcttcaga cctcaccact cagatgactt ctaagaattt gcctgtgggg acccctgcat 3000

ggctgcagct ccgtggaaag gagaggaggc ccccagcaga agaaccactc gcttcctgcc 3060

cagcttcctc ctgtagggct ctaagtctct tcttcttggg accctgcaag caaaggcatg 3120

tcagcttggt ggtttcctgt tttgggtgaa gttttgtgtg gtccgggttc tgtctacatc 3180

catgaacttg ggtgctacca ccttgctgct gctgtagaga cagctgcagg atcttagggt 3240

ggaaaatgga ggtgccctga ggtgctagcc cttggggcaa aagatggggt ggcaatgaga 3300

cacagtgggg aactgagttc cccaagagga gggaggagcc ctgtagcctc aagggccata 3360

ttgggttcct ggtaccagca aaagcctaga gagcgaagtc tgtattttga ggaggtaatt 3420

gatccttacg gaatccatca gaaatttgga gcgggtgctt tatctatctc tggagggtct 3480

ctacctatct ccgatgaagc tctccctggg cctgggatgg gagaaaccag gaggaaaggt 3540

gtctgataaa gcaggggctt cttgacaagc caaagggcca ctggtagctg ttgtggaccg 3600

agctgaccct gctgaagtat tgtagtgtgc cttggaccaa cttctcaaaa gagcaacccc 3660

ggggctaccc tacttctgcc aggaagaggc ggagaagggg ctgagaggcc tggaaggggc 3720

tagctccttc tttgagaact gctccccgga ggacttggag gaggcggcta ggctacgggc 3780

tgctgagggc cctttgtctt tcctaacctg ggcactgtta ggatgctccc tcctggaaaa 3840

ggctttcctg ggtgtgagct agagcagtgt ccatgccagc gctgaacctg ccatggtggg 3900

agctgaacta aaaatttctc agggaactaa aataggcaaa agaggaactg ggggaggagg 3960

gtgccaggca ggatgggggg aagggagggc agtgcaaaag tctcttgaaa cacagacagc 4020

ccagctgagt gccagtccca gatcacagag aatacggctc atctggctca tgttctgcat 4080

gcttgctgct ttaccctggc actttccttc tccaccatga gtgcgagtcc tgggagtcct 4140

gggagggtga ggattaatgc cagcctgggg agcagatagc tgacagagtc cttgggtaac 4200

tggcttgaac caggacctca ggattccact ctggggatct agctttgtct gggccagtga 4260

agatctctat aatggcatta ttgccagggg ataaacattt cactgggttc tgatctgttg 4320

ggtgtggctt cctggaaaat atggtgagag gaattctgct aaggatacag ttgataagaa 4380

agttctgaga ttgattagta atgcctgcct tggactcagg aagggaagtg gcagtatgaa 4440

tgccatgtct taatcatttt ggttaaaata tgcttcccaa aagatttcca cgtgtgttct 4500

tgtttatttg acatctgtct ccatatcagt cttgaaagcc tttctgtgtg tatatatatg 4560

atgtttgcgt gtatatatgt ttttgtgtgt gcatatggaa gtcagaaatc actgggtgtc 4620

ttcctccatt cctttgcaat gtatgttttt ttttttttta cgatttattt actatatgaa 4680

tgttttgcct gaatacatgc ataggtgtca cgtacatgcc tgctggaacg cttggaactg 4740

gagttacagg tggctatgag ctacagtgtg agcactggga atcaaacctg ggtcttctgc 4800

aagagcaaca aattaaaagt cagctcttaa ctacttgagc tatttttcca actcc 4855

<210> 8

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Gly Val Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Trp Gly Thr

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Pro Val Ala Ala

20 25 30

Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

35 40 45

Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His

50 55 60

Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val

65 70 75 80

Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp

85 90 95

Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp

100 105 110

Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn

115 120 125

Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr

130 135 140

Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val

145 150 155 160

His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser

165 170 175

Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Ser Ile Thr

180 185 190

Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu

195 200 205

Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser His

210 215 220

Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Ser Asn Thr Gln Gly

225 230 235 240

Ile Glu Asn Pro Gly Phe Glu Thr Thr Pro Pro Phe Gln Gly Met Pro

245 250 255

Glu Ala Lys Thr Arg Pro Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro

260 265 270

Ser Glu Ser Gly Arg Tyr Leu Leu Ser Asp Pro Ser Thr Pro Leu Ser

275 280 285

Pro Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro

290 295 300

Asp Ser Pro Asn Ser Glu Ala Ile

305 310

<210> 9

<211> 1597

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctagttggg gaagcttctg tgactccccc tacaacagcc taggatggag tggggtttgt 60

gaacaaatgc agaaggcagt cttagggagg tcagctgaca tgcccctggc ctgtggctgg 120

gaagtagcag aggctaaggt tcttccccgc tctggggttg ccaggagtag cactggatca 180

gtcaggtgac agggctctcc tctctctgag caggtccggt ggcagccttc aaggtcgcca 240

cgccgtattc cctgtatgtc tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc tgcaggctct 300

tgggccctgt ggacaaaggg cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac cgcagctcga 360

ggggcgaggt gcagacctgc tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg ttccaggacc 420

ttcacctgca ccatggaggc caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg gctcagcgcc 480

acgggctgga gtcggcctcc gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg cgcaacctga 540

ccctgctgga tagcggcctc tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac caccactcgg 600

agcacagggt ccatggtgcc atggagctgc aggtgcagac aggtgagggc atcctgcacg 660

tgacagcctg gcgtgtgtgg agggctgcct gtctgatggt gtgaccattc atgacactgt 720

gctgggcaga gtgtgaggct gcatgggtaa cactggcact ccagggagtg tgtgggtgag 780

atggggtggt caagggtgtg tggagtgtgg gtttgtagtt agctggagtg atggagaggg 840

agggtgtacc tggctccatt tgtgacagtg agacttttta atgtgtgagg ctgtaggtac 900

ctgggctggg agtgtgactg ctcatgatga catcatggct gctgtgggta taggcatcag 960

tgggactgat tggtgccctg gggcatgact cagtggatgg ctgaatggct gttggagaat 1020

atatgcgtgt gtgtgtctgt ctgttcaggt gagagtgcaa gggcccatgg ttcggataga 1080

ggtgtgggca ccagcgggta ttcacatgcc cctgggagtg gcatgaaaat gggcagggtg 1140

agaacatgcc agggtgtgtg tgggtgcaca cgtgtgcagg ctgccactgg gccaacactg 1200

ccgagtaggc actagcgtga gaacctgggg caggaggggg acactggcct ggacaagcct 1260

ccctggcctc ctgggcctga cacccaccta atggcccttc tgtttgttcc cacaggcaaa 1320

gatgcaccat ccaactgtgt ggtgtaccca tcctcctccc aggatagtga aagtaaggga 1380

ccaacctctt gccccttttg ggttctctgt tttcttctgt cctcatcctg cacccagacc 1440

ctgtttggaa ctctggcctc atcaccccaa gccctcagaa ccccccggtc ctcctccttt 1500

tctgctgctg cacatccctt ctgcttcctc cttggtgcaa tccccagaag cccactctcc 1560

ttccatctgc tctggagtct ctgctcctct tgactct 1597

<210> 10

<211> 3459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggggacaac tgagttacag cctcaactca agccccacct caatgaccaa gacgactttc 60

tactcaaact acttgtattt tcaaacccaa ccgaccactc caccgtgatt tgttgacttg 120

aatgagagcc acggcagtgt ggtggtgaga cctttggatc aagcccctct gccacacacc 180

ctgctgagca tggtggctca gtgctgaggt gtctcctcag cactgagcca ccatgccatc 240

ctcacttcct ctctcagcat cctcttctgt cccttcactc tgagcaacca ccctggtcct 300

gctgcttctt caagaacctg tctcggcaaa ctgctatttc tgttactgcc tgcatgccct 360

gggcagggaa atgaggttca gggagagcct ggctggtctg gaactcactg cggagaccag 420

gctagcctca gatttggagc agtcctcctg cctctgcctc ccaacttctg ggaccccagg 480

tgtgaacttt tggaaaagaa gccacacgct ttcagtcttg agaacagaga cacaagatgg 540

tagagcattt cgggctgagg aggctgggga cttttctgct cctgagactc taagggtgag 600

gtggaagcct tgaacttgac ctccgaggtg ggttagtctt tcttctccat acacctccat 660

ccttgggttt tgatgtttaa atcctcccca gttcttgggg ctgggaaatc tctttctggc 720

tcctgtttcc ttgagcgact gtccagcgaa ttggtttgtt gaggtccaaa agaacttgct 780

tgcttgaggg cagcggatga ctctgatgac ctgatatccc cttctatatt cctggctcca 840

gtaatatata tttctaatat attatatact atacatagct attatatata atatatatct 900

aatatatatt ctagtagtct agacattaga catcttctct ctatatatat atacatatac 960

acacatatat atgtgtacat atatacatat atatacacac ccacatatat ttatatacat 1020

atacacacac atatatatgt atatacacat acatacacac acacgcacac atatatatgt 1080

atgtatatat atacatgtat gacatgtgtg ctgcactttt gggagtgtgt ggagaatctg 1140

ggtagttcta ttacttccca catcacttct ccattgagga atgggaataa ctataacttt 1200

aacagggaag caaatgctac ccaggcactt gcctcgggga tgggaaacac actgtgtctc 1260

aggcccagga agctggagaa caaaacagta ggaagagggg aagactgtgg tgaactctca 1320

gccaccagtc tccatgaaca gttccagcac catggaggcg tgggctccta tttcctcccg 1380

atatacacga gacctaatga ctcagggcag cttatccact cctgtgccaa ggcaggatgg 1440

gaactgatag cagacatggc tgcgtttctt aatgtattta gcactggcca cccatgccat 1500

tgctcaacag gcctcttggc cagccgctga gaactattct atactgctca ttaaatttga 1560

gagttgagtt ccagcctcaa ctctcagagc tcaaccacag cattccctgg gtctattaat 1620

gatgcttcca gacgagatct ttgggttctc cctttctagt ccctgtctga gtggctaaat 1680

gttattttac ggaagagtag ctacatcaca ctaggtaaaa gtccaagtgg gtttcaggta 1740

agaggaagtg taagggataa gtaagggaag aagcctggcg tttgatagca ttgccacggg 1800

gctttggatt tcccctgaga tcagggcagg cctgtgcagc ctgactctgt acccctccca 1860

tccctaatgt ggcaggctat gccaggcact ttccccagac tcctttgcat atacccacag 1920

ggtacccggc aggccctgga catagactga gcaagctgag gctccccagc ctgcctgcca 1980

tgaaagagcc tggcacatgc cattggggtg gtgttggcaa ctgcttacac cagtgtctta 2040

tcaccttccc aggaaaagcc tggctcccga tggtaactaa gctttctctg caatgggtgt 2100

ctccttagag taaggggaac tgaagtcgga ctggctttat aaaggaatcc tgagcctctg 2160

agggcagctg agcccacaca tacacctcca gagcctgtcc caccatagcc tggacaagaa 2220

ctgcagcata taaggagata ggctctgtga gtgagcaggc tctgctcata gagggcagaa 2280

ttgccactgg cagaccagag ggtcagacag ggaggtcctg gccaaaccac caaggcagct 2340

tgtgagcacc tggctaactg caccacacgt tgcttagtaa caatgggaag agagacgaga 2400

gcgtttgcag ccagttctca gattgcccac agtaaagtcc taggatgcag tttagccact 2460

ctgaacagtg tgaattacag actgttctta ctttcaatat cccacgttca agcgcagcca 2520

cattaaaacc tgcagggaat ctgctttact gtggattgca acttcctttg caacccaccc 2580

agcaattggt cctgtttcca taccaatggg tacttctaaa gtgcctgcca aaggtctgct 2640

cgggttcgta tcgctcactg ggagcgtgtt tatgcttcca ggttgcttag catacagtgg 2700

gataaaaatg gcctttgttc ccaagtaaag tgcagaggca gcttaaagac caaggcacat 2760

ccggttccca gagctctctg gaggtgaacc gatcctatga caagagatcc tacccatgtt 2820

ttggcagaga gaaaggttca aattgggaag gaaatgggct tacgctagtt gtggttccaa 2880

gggctcatct gttcccagct aaactcctgg agtcagcaga tggactgaaa taaagcaagc 2940

ccccatgaca cagggctcat gcagagacat ggcccttcct gagacagttt tacaacagtc 3000

tgggagaaag cacacaggca atgctctctg gctcagtgct gcaatgctaa gtgtttaggt 3060

ccagatgtcc tgcctgggtg agcagagatc tgagcctaag gggttcttgc tgcagaaaga 3120

ggactgttga aaacggaagt aaacaatgtt gccaccagac agggatgtct ccgtcaattt 3180

tgggaaagct gtgtataaca gagctctgga aagagtgagg tgggtctctg tgtaggcaga 3240

gatgtccaaa ctgtgcttgg gtgctgggac aaggttctcc tgtgatctca taagacaaga 3300

ccagatctag gtaggttagg actgtgtgag gggacccagg ttgtggggaa ggaggggagc 3360

tttgaatttt gtatatgtgt atacattact gtgtgtgcat gtgtgtatgt gtacatactt 3420

ctgtacccag aggctgacac tggggatatt ccttaattg 3459

<210> 11

<211> 1597

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 11

cctagttggg gaagcttctg tgactccccc tacaacagcc taggatggag tggggtttgt 60

gaacaaatgc agaaggcagt cttagggagg tcagctgaca tgcccctggc ctgtggctgg 120

gaagtagcag aggctaaggt tcttccccgc tctggggttg ccaggagtag cactggatca 180

gtcaggtgac agggctctcc tctctctgag caggtccggt ggcagccttc aaggtcgcca 240

cgccgtattc cctgtatgtc tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc tgcaggctct 300

tgggccctgt ggacaaaggg cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac cgcagctcga 360

ggggcgaggt gcagacctgc tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg ttccaggacc 420

ttcacctgca ccatggaggc caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg gctcagcgcc 480

acgggctgga gtcggcctcc gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg cgcaacctga 540

ccctgctgga tagcggcctc tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac caccactcgg 600

agcacagggt ccatggtgcc atggagctgc aggtgcagac aggtgagggc atcctgcacg 660

tgacagcctg gcgtgtgtgg agggctgcct gtctgatggt gtgaccattc atgacactgt 720

gctgggcaga gtgtgaggct gcatgggtaa cactggcact ccagggagtg tgtgggtgag 780

atggggtggt caagggtgtg tggagtgtgg gtttgtagtt agctggagtg atggagaggg 840

agggtgtacc tggctccatt tgtgacagtg agacttttta atgtgtgagg ctgtaggtac 900

ctgggctggg agtgtgactg ctcatgatga catcatggct gctgtgggta taggcatcag 960

tgggactgat tggtgccctg gggcatgact cagtggatgg ctgaatggct gttggagaat 1020

atatgcgtgt gtgtgtctgt ctgttcaggt gagagtgcaa gggcccatgg ttcggataga 1080

ggtgtgggca ccagcgggta ttcacatgcc cctgggagtg gcatgaaaat gggcagggtg 1140

agaacatgcc agggtgtgtg tgggtgcaca cgtgtgcagg ctgccactgg gccaacactg 1200

ccgagtaggc actagcgtga gaacctgggg caggaggggg acactggcct ggacaagcct 1260

ccctggcctc ctgggcctga cacccaccta atggcccttc tgtttgttcc cacaggcaaa 1320

gatgcaccat ccaactgtgt ggtgtaccca tcctcctccc aggatagtga aagtaaggga 1380

ccaacctctt gccccttttg ggttctctgt tttcttctgt cctcatcctg cacccagacc 1440

ctgtttggaa ctctggcctc atcaccccaa gccctcagaa ccccccggtc ctcctccttt 1500

tctgctgctg cacatccctt ctgcttcctc cttggtgcaa tccccagaag cccactctcc 1560

ttccatctgc tctggagtct ctgctcctct tgactct 1597

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcgacaagc tgtttcagaa tccagtctcc agatc 35

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttgggttg gaatgtcaga ataccctacc tcagcttgac agccaggg 48

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cattccaacc caacccctag ttggggaagc ttctg 35

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttgagttgt cttgggtgag gcagagtcaa gaggagcaga gac 43

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccaagacaac tcaagaaact ggggacaact gagttaca 38

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgattaattg tcaaccaatt aaggaatatc cccag 35

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagttttcag agacttggga ggg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccagttttca gagacttggg agg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgcccagttt tcagagactt ggg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctcccaagtc tctgaaaact ggg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcaagctgag gtagggtacc agg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcctgcatta aggaccctgt ggg 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

actggtttgt ctctgcccac agg 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gagcaagcaa gcctgcatta agg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcccacaggg tccttaatgc agg 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcaggcttgc ttgctcagct ggg 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tttttccttc tgcctttcca ggg 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atttttcctt ctgcctttcc agg 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctcatgtttg tctaaaggct ggg 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cctcatgttt gtctaaaggc tgg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaaccctcat gtttgtctaa agg 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccagccttta gacaaacatg agg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cagcctttag acaaacatga ggg 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

taactcagtt gtccccattc tgg 23

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

catgagggtt tgtgccagaa tgg 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atgagggttt gtgccagaat ggg 23

<210> 38

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gctaatacga ctcactatag tcaagctgag gtagggtacc gttttagagc tagaaatagc 60

aag 63

<210> 39

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gctaatacga ctcactatag catgagggtt tgtgccagaa gttttagagc tagaaatagc 60

aag 63

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aaaagcaccg actcggtgcc 20

<210> 41

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt 80

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tggggaggtt gttcagtggt t 21

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cttgagttgt cttgggtgag gc 22

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

attctgacat tccaacccaa cc 22

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gctgagtccg caagcaagag 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

aaccctgctc cttgctattt 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gccacctgtc tctgcttata g 21

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ccgtattccc tgtatgtctg tc 22

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gttgctgctg tccatcct 18

Claims (6)

1.一种VISTA基因人源化小鼠动物细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：提供人VISTA基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9 mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述小鼠动物细胞中，将所述小鼠动物细胞转移至培养液中进行培养；

所述人VISTA基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人VISTA基因编码区以及3’同源臂，所述5’同源臂为与小鼠Vista基因的第2号外显子5’端同源的DNA片段，所述3’同源臂为与小鼠Vista基因的第3号外显子3’端同源的DNA片段；

所述5’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，所述3’同源臂的DNA序列如SEQ IDNO.10所示；所述人VISTA基因编码区的DNA序列如SEQ ID NO.11所示；

所述sgRNA在小鼠Vista基因的5’端靶位点位于小鼠Vista基因的第1号内含子中，所述sgRNA在小鼠Vista基因的3’端靶位点位于小鼠Vista基因的第3号内含子中；

所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO.21所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO.35所示。

2.一种VISTA基因人源化小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，将如权利要求1所述的VISTA基因人源化小鼠动物细胞的构建方法得到的小鼠细胞移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；

对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。

3.如权利要求2所述的VISTA基因人源化小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，还包括：将所述F0代阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，建立稳定的人源化VISTA基因改造小鼠品系。

4.一种细胞或细胞系或细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或细胞培养物来源于VISTA基因人源化动物模型或其子代，所述VISTA基因人源化动物模型由权利要求2-3中任一项所述的VISTA基因人源化小鼠动物模型的构建方法获得，所述的细胞或细胞系或细胞培养物不能发育为个体。

5.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于VISTA基因人源化动物模型或其子代，所述VISTA基因人源化动物模型由权利要求2-3中任一项所述的VISTA基因人源化小鼠动物模型的构建方法获得，所述的组织或器官不能发育为个体。

6.如权利要求2-3中任一项所述的VISTA基因人源化小鼠动物模型的构建方法获得的VISTA基因人源化动物模型、来源于所述VISTA基因人源化小鼠动物模型的细胞、细胞系或细胞培养物、组织、器官在人VISTA基因或蛋白研究中的应用；

所述应用包括人VISTA基因功能研究、人VISTA抗体研究、针对人VISTA靶位点的药物构建和药效研究中的至少一种，所述的应用为非疾病的诊断和治疗目的。

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