CN111304247A - 人源化lag-3基因改造动物模型的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及一种人源化LAG‑3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

人源化LAG-3基因改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化LAG-3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药方面的应用。
背景技术
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。
淋巴细胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)属于免疫球蛋白超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成，是目前已经确定的T细胞抑制性受体之一。LAG-3主要表达在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞上，通过与其配体组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡ，MHCⅡ)结合，负调控T细胞功能。
已有证据表明，LAG-3在多种免疫应答类型中发挥了重要调控作用，特别是在肿瘤免疫中。LAG-3在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中异常表达，且与多项病理参数和预后密切相关。LAG-3抑制剂阻碍其信号通路，能增强特异性CD8+T细胞的抗肿瘤作用。此外，联合阻断LAG-3和PD-1可能是通过增加效应T细胞的比例起到减缓肿瘤生长的协同作用。可见抗LAG-3治疗联合其它多个信号分子，在临床上对改善肿瘤免疫治疗疗效具有应用价值，可能是今后研究的重要方向之一。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前与LAG-3相关的实验动物很少。Toru Miyazaki(1996)等人利用同源重组技术，将小鼠Lag-3基因上1-3号外显子用新霉素抗性基因替换，制备出Lag-3基因敲除小鼠。该小鼠NK细胞功能受损，对靶细胞的杀伤作用减弱或消失。进一步的研究证实该小鼠抗原特异性CD8+T细胞增殖增加；CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较野生型增加，但两者比值未观察到明显变化。此外，该小鼠制备过程中使用的胚胎干细胞(ES细胞)来源于129遗传背景的小鼠，得到嵌合鼠后需与C57BL/6进行多次回交。该方法缺陷在于：一般需要超过10代的回交才能获得纯合子，回交往往需要2年的时间，耗费时间、资金和科研精力；另一方面，回交次数不同也会造成试验结果重复性差。
由于目前的模型小鼠存在上述缺陷，且不能用于抗人LAG-3抗体药物的动物体内药效检测与评价，考虑LAG-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效，本发明提供一种建立人源化LAG-3基因改造动物模型的新方法，并得到LAG-3基因人源化动物。
发明内容
本发明的第一方面，涉及一种人源化基因改造动物模型的构建方法，所述的人源化基因改造动物模型体内表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列，所述的人LAG-3基因通过内源LAG-3调控元件调控。
进一步优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列。
再进一步优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中还包括外显子5至外显子7的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人LAG-3基因通过LAG-3调控元件调控。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子3的全部核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子4的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2-3的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2、4的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子3、4的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2-4的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括内源LAG-3基因的外显子1的全部核苷酸序列、外显子2的部分核苷酸序列、外显子4的部分核苷酸序列和外显子5及其后的全部核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施例中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3至外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
或者，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括内源LAG-3基因的外显子1的全部核苷酸序列、外显子2的部分核苷酸序列、外显子7的部分核苷酸序列和外显子8的全部核苷酸序列。
优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的核苷酸序列为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的核苷酸序列的全部或部分为人来源，同时编码该动物来源部分和人来源部分LAG-3蛋白的核苷酸序列通过序列拼接连接于动物来源LAG-3启动子后。
优选的，所述人源化LAG-3基因编码的跨膜区部分为人来源。
本发明所述的人源化基因改造动物模型的构建方法，使用基因编辑技术进行LAG-3人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的DNA打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物为小鼠，所述小鼠LAG-3的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：1中的全部或部分片段所示，所述小鼠LAG-3的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：2中的全部或部分片段所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述人LAG-3的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：3中的全部或部分片段所示，所述人LAG-3的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：4中的全部或部分片段所示。
优选的，将编码胞外区的内源LAG-3基因全部或部分核苷酸序列替换为人编码胞外区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列。其中，所述的人编码胞外区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的部分核苷酸序列。进一步优选的，将编码胞外区和跨膜区的内源LAG-3基因全部或部分核苷酸序列替换为人编码胞外区和跨膜区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列。
其中，所述的人编码胞外区和跨膜区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，使用sgRNA靶向LAG-3基因，将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子4的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的全部或部分核苷酸序列。优选的，使用sgRNA靶向的5’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：10-16任一项所示，3’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：17-23任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO：14和/或SEQ ID NO：17。
在本发明的一个具体实施方式中，使用靶向载体构建人源化基因改造动物模型，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列；所述的靶向载体将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子4的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的全部或部分核苷酸序列；
优选的，所述的供体DNA序列还包含外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列；所述的靶向载体将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子7的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示或所述5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124914544-124910898位核苷酸序列相同。和/或，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或所述3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124903953-124907833位核苷酸序列相同；其中，所述的待改变的转换区位于LAG-3基因的外显子2至外显子4；所述的供体DNA序列如SEQID NO：7所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示；和/或，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示；其中，所述的待改变的转换区位于LAG-3基因的外显子2至外显子7；所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：42所示。
本发明的第二方面，涉及采用本发明所述的人源化基因改造动物模型的构建方法构建的人源化基因改造动物模型。
本发明的第三方面，涉及一种LAG-3基因缺失的动物模型的制备方法，所述的方法包括将动物的内源LAG-3基因的外显子2-4的全部或部分核苷酸序列或外显子2-7的全部或部分核苷酸序列敲除，使得内源LAG-3蛋白失活。
在本发明的一个具体实施方式中，使用sgRNA序列靶向动物的内源LAG-3基因，进而敲除内源LAG-3基因的外显子2-4的全部或部分核苷酸序列；优选的，使用sgRNA靶向的5’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：10-16任一项所示，3’端靶位点核苷酸序列如SEQ IDNO：17-23任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO：14和/或SEQID NO：17。
本发明的第四方面，涉及一种采用本发明所述的LAG-3基因缺失的动物模型的制备方法制备获得的LAG-3基因缺失的动物模型。
本发明的第五方面，涉及一种人源化基因改造动物模型，所述的人源化基因改造动物模型体内表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2-4的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2-7的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人LAG-3基因通过内源LAG-3调控元件调控或通过人LAG-3调控元件调控。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括内源LAG-3基因的外显子1的全部核苷酸序列、外显子2的部分核苷酸序列、外显子4的部分核苷酸序列和外显子5及其后的全部核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3至外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括内源LAG-3基因的外显子1的全部核苷酸序列、外显子2的部分核苷酸序列、外显子7的部分核苷酸序列和外显子8的全部核苷酸序列。
优选的，所述动物基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的核苷酸序列为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的核苷酸序列的全部或部分为人来源，同时编码该动物来源部分和人来源部分LAG-3蛋白的核苷酸序列通过序列拼接连接于动物来源LAG-3启动子后。
进一步优选的，编码跨膜区的人源化LAG-3基因的核苷酸序列为动物来源或者人来源。
本发明的第六方面，涉及一种LAG-3基因的靶向载体，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区；所述的供体DNA序列至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的供体DNA序列还包含外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的供体DNA序列包含人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示或所述5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124914544-124910898位核苷酸序列相同。和/或，优选的，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或所述3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124903953-124907833位核苷酸序列相同。
优选的，所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：7所示。其中，所述的待改变的转换区位于LAG-3基因的外显子2至外显子4。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示。和/或，优选的，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示。
优选的，所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：42所示。其中，所述的待改变的转换区位于LAG-3基因的外显子2至外显子7。
本发明所述的LAG-3基因的靶向载体还包括可选择的基因标记。
优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第七方面，涉及一种特异的靶向LAG-3基因的sgRNA序列，所述的sgRNA序列在动物LAG-3基因的靶位点位于动物LAG-3基因的外显子2和/或外显子4上。优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：10-16任一项所示，3’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：17-23任一项所示。更优选的，使用的sgRNA靶位点核苷酸序列为SEQ IDNO：14和/或SEQ ID NO：17。
本发明的第八方面，涉及一种编码上述的sgRNA序列的DNA分子。
本发明的第九方面，涉及一种构建人源化基因改造动物模型的载体，所述的载体产生上述的sgRNA序列，用于敲除或替换LAG-3基因的外显子2至外显子4的部分或全部。
本发明的第十方面，涉及所述构建人源化基因改造动物模型的载体的制备方法，包括如下步骤：
1)将序列如SEQ ID NO：10-16所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：17-23所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体pHSG299上，经测序验证，获得pT7-sgRNAG2载体；
3)分别合成步骤1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2)所述的pT7-sgRNAG2载体的双链；
4)将步骤3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNAG2载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
本发明的第十一方面，涉及一种LAG-3基因敲除非人动物的制备方法，包括如下步骤：
a)按照上述制备sgRNA载体的方法步骤1)-4)，获得sgRNA载体；
b)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
c)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的LAG-3基因被敲除，获得LAG-3基因敲除阳性小鼠；
d)将步骤c)筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的LAG-3基因敲除小鼠。
其中，步骤c)中所述PCR技术的引物为SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：66。
本发明的第十二方面，涉及一种LAG-3基因人源化非人动物的制备方法，包括如下步骤：
第一步：按照上述制备sgRNA载体的步骤1)-4)，获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物、上述的LAG-3基因的靶向载体和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至雌性动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体动物的输卵管中发育，得到F0代动物；
第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的LAG-3基因人源化非人动物。
本发明的第十三方面，涉及一种上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的DNA分子或上述的载体在动物LAG-3基因编辑中的应用。
本发明的第十四方面，涉及一种LAG-3基因改造的人源化细胞株，所述的人源化细胞株的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列，所述的人LAG-3基因通过LAG-3调控元件调控。该人源化细胞株表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。优选的，所述的人源化细胞株的基因组中还包括人LAG-3基因的外显子5至外显子7的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化细胞株的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。
本发明的第十五方面，涉及一种LAG-3基因缺失的细胞株，所述的LAG-3基因缺失的细胞株缺失内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的LAG-3基因缺失的细胞株采用sgRNA靶向细胞株，敲除内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列，其中，sgRNA靶向的5’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：10-16任一项所示，3’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：17-23任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO：14和/或SEQ ID NO：17。
本发明的第十六方面，涉及一种制备多基因人源化改造动物的方法，包括如下步骤：
(a)应用本发明所述的方法制备人源化基因改造动物模型或LAG-3基因缺失的动物模型；
(b)将步骤(a)制备获得的动物模型或上述的人源化基因改造动物与其他基因人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化改造动物。
优选的，所述多基因人源化改造动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的其他基因人源化动物选自基因PD-1(201710505554.0，PCT/CN2017/090320)、PD-L1(201710757022.6，PCT/CN2017/099574)、CTLA-4(201710757917.X，PCT/CN2017/099577)、BTLA(201710948551.4，PCT/CN2017/106024)、CD27(201711402264.X，PCT/CN2017/117984)、CD28(201710465217.3)、CD47(201810295709.7，PCT/CN2018/081628)、CD137(201711473251.1，PCT/CN2017/120388)、CD154(201710464564.4，201710872886.2)、OX40(201710757005.2，PCT/CN2017/099575)、SIRPα(201810296193.8，PCT/CN2018/081629)、TIGIT(201710757916.5，PCT/CN2017/099576)、TIM-3(201711103773.2，PCT/CN2017/110494)、CD40(201710464564.4，201710872886.2)或GITR(201710465493.X，201710872122.3)人源化动物中的一种或两种以上的组合。
本发明的第十七方面，涉及根据上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备获得的多基因人源化改造动物或其后代。
本发明的第十八方面，涉及一种荷瘤动物模型，所述动物模型的制备方法包括通过本发明所述的人源化基因改造动物模型的构建方法或制备多基因人源化改造动物的方法制备动物的步骤。
优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的人源化基因改造动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第十九方面，涉及一种荷瘤动物模型的制备方法，所述的制备方法包括上述的方法制备人源化基因改造动物模型或LAG-3基因缺失的动物模型。
本发明的第二十方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的人源化基因改造动物模型的构建方法获得的人源化基因改造动物模型、上述的人源化基因改造动物模型、上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备获得的多基因人源化改造动物、上述的多基因人源化非人动物或其后代或上述的荷瘤动物模型。
本发明的第二十一方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的人源化基因改造动物模型的构建方法获得的人源化基因改造动物模型、上述的人源化基因改造动物模型、上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备获得的多基因人源化改造动物、上述的多基因人源化非人动物或其后代或上述的荷瘤动物模型。
优选的，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。
本发明的第二十二方面，涉及一种人源化LAG-3蛋白，所述的人源化LAG-3蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中，胞外区包含人LAG-3蛋白胞外区的全部或部分氨基酸序列。
优选的，所述的人源化LAG-3蛋白包括人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列和非人动物LAG-3蛋白的部分氨基酸序列，优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的部分核苷酸序列编码的氨基酸序列；优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的部分核苷酸序列编码的氨基酸序列。
进一步优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LAG-3蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
d)具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第二十三方面，涉及一种编码上述人源化LAG-3蛋白的人源化LAG-3基因，所述的人源化LAG-3基因包含人LAG-3基因的部分核苷酸序列和非人动物LAG-3基因的部分核苷酸序列，优选的，所述的人LAG-3基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示核苷酸序列的部分或全部；
f)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
h)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化LAG-3基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的序列的部分或全部；
b)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)转录的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列杂交；
d)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
e)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)为包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示序列的全部或部分；
f)与包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)与包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
h)具有包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明所述的动物为啮齿类动物。优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
本发明的第二十四方面，涉及一种表达上述的人源化LAG-3蛋白的构建体，优选的，所述的构建体包含人源化LAG-3基因。
本发明的第二十五方面，涉及一种包含上述构建体的细胞或细胞系或原代细胞培养物。
本发明的第二十六方面，涉及一种包含上述细胞或细胞系或原代细胞培养物的组织或器官或其培养物。
本发明的第二十七方面，涉及一种上述的构建方法获得的人源化基因改造动物模型或LAG-3基因缺失的动物模型、上述的人源化基因改造动物模型、上述的LAG-3基因改造的人源化细胞株或LAG-3基因缺失的细胞株、上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备获得的多基因人源化改造动物、上述的多基因人源化非人动物或其后代、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化LAG-3蛋白、上述的人源化LAG-3基因、上述的构建体、包含上述构建体的细胞或细胞系或原代细胞培养物或包含上述细胞或细胞系或原代细胞培养物的组织或器官或其培养物在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体；或者，作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人LAG-3信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价；或者，研究LAG-3基因功能研究、人LAG-3抗体、针对人LAG-3靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
本发明所述的构建方法制备的人源化基因改造动物模型，其体内可正常表达人或人源化LAG-3蛋白，且表达的人或人源化LAG-3蛋白能识别并结合人LAG-3抗体。此外，使用本方法制备的LAG-3基因人源化动物还可与其它基因改造人源化动物交配，得到双基因人源化或多基因人源化动物模型。可用于肿瘤药物筛选等方面。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。例如“外显子2至外显子4的全部”为整体，即外显子2至外显子4的全部核苷酸序列，包括外显子2、外显子3、外显子4及期间内含子的核苷酸序列；“外显子2至外显子4的部分”为整体的局部或整体的个体，即外显子2至外显子4中的一个或两个以上连续或间隔的核苷酸序列。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
在一个方面，所述动物是非人哺乳动物。优选的，所述非人哺乳动物是小型哺乳动物。在一个实施方式中，所述动物模型是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠和人LAG-3基因对比示意图(非按比例)；
图2：人源化小鼠LAG-3基因示意图(非按比例)，其中，人源化区域为外显子2至外显子4的全部或部分；
图3：人源化小鼠LAG-3基因示意图(非按比例)，其中，人源化区域为外显子2至外显子7的全部或部分；
图4：打靶示意图策略示意图(非按比例)，其中，人源化区域为外显子2至外显子4的全部或部分；
图5：PCR检测结果，其中，其中，M为Marker，WT为野生型，+为阳性对照，H2O为水对照，C1-C12为克隆编号；
图6：FRT重组过程示意图(非按比例)；
图7：打靶策略示意图(非按比例)，其中，人源化区域为外显子2至外显子4的全部或部分；
图8：sgRNA的相对活性检测结果，其中Con为阴性对照，PC为阳性对照，blank为空白对照；(A)为sgRNA1-sgRNA7相对活性检测结果；(B)为sgRNA8-sgRNA14相对活性检测结果；
图9：(A)重组载体酶切结果图，图中1-6分别指6个载体质粒，ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker；(B)Marker分子量说明；
图10：鼠尾PCR鉴定结果(F0)，其中，M为Marker，WT为野生型，+为阳性对照，H2O为水对照，图(A)为5’端引物(L-GT-F/L-GT-R)PCR扩增结果图，图(B)为3’端引物(R-GT-F/R-GT-R)PCR扩增结果图；
图11：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，M为Marker，WT为野生型，+为阳性对照，H2O为水对照，F1-1至F1-3为小鼠编号，图(A)为5’端引物(L-GT-F/L-GT-R)PCR扩增结果图，图(B)为3’端引物(R-GT-F/R-GT-R)PCR扩增结果图；
图12：F1代小鼠Southern blot结果，其中WT为野生型，F1-1、F1-2为小鼠编号；
图13：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图C、F为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3(s)基因人源化杂合子小鼠，分别使用mLAG-3PE(图A、B、C)或hLAG-3APC(图D、E、F)和mTcRβPerCP进行细胞标记，流式检测LAG-3蛋白表达；
图14：LAG-3基因敲除小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型，+为阳性对照，H2O为水对照；
图15：打靶策略示意图(非按比例)，其中，人源化区域为外显子2至外显子7的全部或部分；
图16：(A)重组载体酶切结果图，图中#1至-#6分别指6个载体质粒，Ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker；(B)Marker分子量说明；
图17：细胞PCR鉴定结果，其中，图(A)为引物F1/R1扩增结果，图(B)为引物F2/R2扩增结果，+为阳性对照，WT为野生型对照，M为Marker，H2O为水对照；图中标记克隆号的泳道的鉴定结果为阳性，其余未标明克隆号的泳道对应的细胞为阴性；
图18：细胞Southern blot结果，其中WT为野生型；
图19：FRT重组过程示意图(非按比例)；
图20：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对WT-F和WT-R用于扩增野生型LAG-3基因1-2号外显子片段；图(B)使用引物对WT-F和Mut-R用于扩增改造后的小鼠LAG-3基因1-2号外显子片段，用以验证重组载体是否存在并正确插入基因组位点；图(C)使用引物对Frt-F和Frt-R用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除；图(D)使用引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在；其中，WT为野生型，H2O为水对照，M为Marker，+为阳性对照；
图21：流式分析结果，其中，图A、E为未经刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、F为未经刺激的LAG-3人源化鼠杂合子；图C、G经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图D、H为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3人源化鼠，分别使用mLAG-3PE(图A、B、C、D)或hLAG-3APC(图E、F、G、H)和mTcRβPerCP进行细胞标记，流式检测LAG-3蛋白表达；
图22：小鼠结肠癌细胞MC38植入LAG-3人源化小鼠体内，并利用抗人LAG-3抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重情况；
图23：小鼠结肠癌细胞MC38植入LAG-3人源化小鼠体内，并利用抗人LAG-3抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重变化情况；
图24：小鼠结肠癌细胞MC38植入LAG-3人源化小鼠体内，并利用抗人LAG-3抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠肿瘤体积测量结果；
图25：流式分析结果，其中，图A、C为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、D为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3(s)基因人源化纯合子小鼠，分别使用anti-mLAG-3PE(图A、B)或anti-hLAG-3APC(图C、D)和mTcRβPerCP进行细胞标记，流式检测LAG-3蛋白表达；
图26：流式分析结果，其中，图A、C、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、D、F为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3(s)基因人源化纯合子小鼠，分别使用hIgG(图A、B)、IgG4-kappa(图C、D)或Relatlimab(图E、F)孵育，及加入anti-hIgG Alexa Fluor 647、mTcRβFITC进行细胞标记，流式检测小鼠体内活化的T细胞与人LAG-3抗体的结合能力；
图27：流式分析结果，其中，图A、C、E为经鼠CD3抗体刺激的C57BL/6野生型鼠，图B、D、F为经鼠CD3抗体刺激的LAG-3(l)基因人源化纯合子小鼠，分别使用hIgG(图A、B)、IgG4-kappa(图C、D)或Relatlimab(图E、F)孵育，及加入anti-hIgG Alexa Fluor 647、mTcRβFITC进行细胞标记，流式检测小鼠体内活化的T细胞与人LAG-3抗体的结合能力；
图28：对比C57BL/6野生型鼠与LAG-3(l)基因人源化纯合子小鼠，脾脏中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、CD4、CD8、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)、白细胞(Monocyte)；
图29：对比C57BL/6野生型鼠与LAG-3(l)基因人源化纯合子小鼠，外周血中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、CD4、CD8、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)、白细胞(Monocyte)；
图30：对比C57BL/6野生型鼠与LAG-3(l)基因人源化纯合子小鼠，脾脏中T细胞亚群(CD4、CD8、Treg细胞)情况；
图31：对比C57BL/6野生型鼠与LAG-3(l)基因人源化纯合子小鼠，外周血中T细胞亚群(CD4、CD8、Treg细胞)情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
EcoRI，ScaI，HindIII，BamHI，XhoI，EcoRV，SalI，BbsI酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3122M，R3104M，R3136M；R0146M，R3195M，R3138M，R0539L；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；
BAC文库订购自invitrogen，货号分别为：RPCI23.C、RPCI11.C；
BV711 Hamster Anti-Mouse CD3e(mCD3)购自BD公司，货号：563123；
PE anti-mouse CD223(LAG-3)Antibody(mLAG-3PE)来源Biolegend，货号为125208；
Alexa
Figure BDA0002328923940000171
647anti-human CD223(LAG-3)Antibody(hLAG-3AlexaFluor647)来源Biolegend，货号为369304；
CD223(LAG-3)Monoclonal Antibody(3DS223H)(hLAG-3APC)购自eBioscience，货号为17-2239-42；
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；
Alexa
Figure BDA0002328923940000181
647AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific(anti-hIgG Alexa Fluor 647)购自Jackson，货号为：109-606-170；
FITC anti-Mouse TCRβChain(mTcRβFITC)购自Biolegend，货号为：109205；
流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur；
IgG4-kappa购自Crown Bio，货号为：C0004-4。
实施例1LAG-3基因人源化小鼠
小鼠LAG-3基因(NCBI Gene ID：16768，Primary source：MGI：106588，UniProtID：Q61790，位于6号染色体NC_000072.6的第124904359至124912434位，基于转录本NM_008479.2(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_032505.1(SEQ ID NO：2))和人LAG-3基因(NCBIGene ID：3902，Primary source：HGNC:6476，UniProt ID：P18627，位于12号染色体NC_000012.12的第6772483至6778455位，基于转录本NM_002286.5(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_002277.4(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠LAG-3基因座的胞外区引入编码人LAG-3蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化LAG-3蛋白。用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在内源小鼠LAG-3基因座上用某些人LAG-3基因序列替换特定小鼠LAG-3基因序列，在小鼠或人LAG-3调节元件的控制下，例如一种人源化策略得到的人源化LAG-3基因座示意图如图2所示，另一种LAG-3小鼠人源化策略是在LAG-3基因胞外区进行更大范围的序列替换，得到的小鼠人源化LAG-3基因座示意图如图3所示。
图2所示人源化LAG-3人源化小鼠的制备通过以下操作完成。设计图4所示打靶示意图其中小鼠和人LAG-3的DNA分别来自于细菌人工染色体(BAC)RP23-121J20和RP11-578M14。其中，打靶载体上含有5’同源臂、3’同源臂以及包含人LAG-3序列(简称“A片段”，SEQ ID NO：7)的DNA片段，其中5’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第124914544-124910898位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第124903953-124907833位核苷酸序列相同；A片段与NCBI登录号与NC_000012.12的第6773206-6774857位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠LAG-3的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。Neo盒上游与小鼠LAG-3基因座的连接设计为
5’-GAGGGACTCCCCTACTCTGAATTGCCAGGATGTCCAAGAAGGTAGAAACAGAGATGATAAAAATTTGAAAGAAAAATTTGAATGGTTTGATCAAAGCTTGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAAC-3’(SEQ ID NO:68)，其中，Neo为斜体下划线。Neo盒下游与小鼠LAG-3基因座的连接设计为：
5’-AGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGAAAAGAATGAGGCATATATTTTTGAACCCTTGTCTGCTTTTGGCCTAGGGCTCTGTTAAAAT-3’(SEQ ID NO:69)，其中，Neo盒为斜体下划线。人LAG-3基因片段上游与小鼠LAG-3基因座的连接设计为：
5’-CTTGGCTCAATGCCCTTGGCCTCTCTTTTGTTCCACTAGTTGTGTCTTCAGGGCCAGGGGCTGAG GTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTC-3’(SEQ IDNO:70)，其中，人LAG-3基因序列为斜体下划线。人LAG-3基因片段下游与小鼠LAG-3基因的连接设计为：
5’-TCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTAACTCTTCTAAGCAGCCTTGACCACAACCTTCCTGCTCACCACCTCTCCTGACTCATGCATGGACCCCCAAAACTTTCTCAGCTGCGTGTGGTCTCACTCCACATCACTT-3’(SEQ ID NO:71)。其中人LAG-3基因序列为斜体下划线。
经过常规方法(扩增、酶切、连接或合成)构建打靶载体。选择两个质粒送到测序公司测序，将测序正确的构建正确的打靶载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，在利用引物扩增确认细胞中是否发生重组，具体引物序列如下：
WT-F1(SEQ ID NO:72)：5’-CTCCCTTCAACAGGGAG GCATGATG-3’；
MT-R1(SEQ ID NO:73)：5’-CTTCAGAGGGAGTGACACCTCAGGG-3’，
扩增条带为360bp为阳性克隆，同时使用引物：
MUT-F1(SEQ ID NO:74)：5’-CAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTG-3’；
WT-R1(SEQ ID NO:75)：5’-AGACAGCAGCTAAAAGATGCCCAGAG-3’，扩增条带为418bp为阳性克隆，检测结果见图5，从图5A和5B可以看出8个细胞全部为阳性克隆。将正确的阳性克隆(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。
将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图6)后，再通过互相交配即可得到表达人源化LAG-3蛋白的LAG-3基因人源化纯合子小鼠。
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术也可得到图2所示替换策略的人源化小鼠，进一步设计了如图7所示的打靶策略示意图。由于靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率，因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA14)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于LAG-3基因第2号外显子和第4号外显子上，各sgRNA在LAG-3上的靶位点序列如下：
sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-GTTCCACTAGTTGTGTCTTCAGG-3’
sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-GGCCCTGAAGACACAACTAGTGG-3’
sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-ACCACGGGGAGCTCTTTCCCAGG-3’
sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-CTAGTTGTGTCTTCAGGGCCTGG-3’
sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-GCCTGGGAAAGAGCTCCCCGTGG-3’
sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-CCTCCTGGGCCCACACCACGGGG-3’
sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-GGAAAGAGCTCCCCGTGGTGTGG-3’
sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-TGACGCGGTGAGTTGTAGACAGG-3’
sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-TGTAGACAGGCACTCGGTTCTGG-3’
sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-CTCCATCACGTACAACCTCA AGG-3’
sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：20)：5’-AGTCCTCAAGCTGTCTGATTGGG-3’
sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：21)：5’-GTTTCAGCTAAAAAATGACGCGG-3’
sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-GTCTCTGTGCACTGGTTCCAGGG-3’
sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-CAGGCACTCGGTTCTGGCCCTGG-3’
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，其中，sgRNA1、sgRNA4、sgRNA10活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA1、sgRNA4、sgRNA10的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA1、sgRNA4、sgRNA10是具有活性的，并且活性满足基因打靶实验要求，检测结果参见图8和表1。从中随机选择2个(分别是sgRNA5和sgRNA8)进行后续实验，在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(序列见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-sgRNA5和pT7-sgRNA8。
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：62)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
表1 sgRNA的活性检测结果
Figure BDA0002328923940000211
表2 sgRNA序列
Figure BDA0002328923940000212
图7所示的打靶策略示意图中，其中打靶载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：5)、3’同源臂(SEQ ID NO：6)以及包含人LAG-3序列的DNA片段(简称“A片段”，SEQ ID NO：7)，其中5’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第124911766-124910898位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第124909232-124908030位核苷酸序列相同；A片段与NCBI登录号与NC_000012.12的第6773206-6774857位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠LAG-3的mRNA序列及其编码的蛋白序列与前述制备方法获得的序列一致(分别如SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9)。打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的重组载体可通过测序或酶切等常规进行初步验证，验证结果见图9，使用3组酶进行酶切验证，其中，BamHI+EcoRI应出现2086bp+5154bp，HindIII应出现2472bp+4768bp，XhoI+NotI应出现2064bp+5176bp，酶切结果均符合预期，其中质粒2、3经测序公司测序验证正确，将验证正确的质粒2后用于后续实验。
取C57BL/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-sgRNA5和pT7-sgRNA8质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、Cas9mRNA和重组载体质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。
通过上述方法获得的基因改造人源化小鼠，通过PCR的方法进行检测，F0代小鼠的鉴定结果见图10，其中，编号F0-1、F0-2、F0-3、F0-5、F0-7、F0-9、F0-11、F0-12的7只小鼠均为阳性小鼠。PCR分析包括下述引物：
L-GT-F：5’-AGCATTCACACAGGGTGGGGAATTT-3’(SEQ ID NO：32)，
L-GT-R：5’-CTGGCCTGGAGTTTACTTGGCATCAG-3’(SEQ ID NO：33)；
R-GT-F：5’-CCCCTGGAGCTTCTCAACTCCATTC-3’(SEQ ID NO：34)
R-GT-R：5’-CTCTGTTTCTACCTTCTTGGACATCCTGGC-3’(SEQ ID NO：35)
将获得的F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配可得到F1代小鼠，可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，部分F1代小鼠实验结果见图11，结果显示编号F1-1、F1-2的小鼠均为阳性小鼠。进一步的使用Southern Blot技术进行检测，检测结果见图12，检测结果表明这F1-1、F1-2两只小鼠为阳性杂合子且无随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的基因工程小鼠(后续简称LAG3(s))。
Southern Blot检测时用BamHI消化DNA并使用2个探针进行杂交，探针引物如下：
5’探针(5’Probe)：
F：5’-GGCCACTTATCATCACTTGCCC-3’(SEQ ID NO：36)，
R：5’-GGTGGTAAAGGGGCCTAGGAG-3’(SEQ ID NO：37)；
A探针(AProbe)：
F：5’-CTCCAGAAGTGGATGCGGCCAGTCC-3’(SEQ ID NO：38)，
R：5’-GCGGCAGGAGAGGGCGCGGTCCCTG-3’(SEQ ID NO：39)；
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化LAG-3蛋白的表达情况，例如可用抗鼠LAG-3抗体PE anti-mouse CD223(LAG-3)Antibody(mLAG-3PE)和鼠源T细胞表面抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)或抗人LAG-3抗体CD223(LAG-3)Monoclonal Antibody(3DS223H)(hLAG-3APC)和mTcRβPerCP对经抗鼠CD3抗体(mCD3)刺激的小鼠脾脏细胞识别染色后，进行流式检测LAG-3蛋白表达。流式分析结果(见图13)显示，可在LAG-3(s)基因人源化杂合子小鼠脾脏内，检测到表达鼠LAG-3蛋白(图13C)和人源化LAG-3蛋白(图13F)的细胞；而在野生型C57BL/6小鼠的脾脏内，只能检测到表达鼠LAG-3蛋白(图13A、B)，未检测到表达人或人源化LAG-3蛋白的细胞(图13D、E)。
将鉴定为阳性的杂合子小鼠互相交配，可得到LAG-3(s)基因人源化纯合子小鼠。按同样方法取7-8周龄的野生型C57BL/6小鼠和LAG-3(s)基因人源化纯合子小鼠进行流式检测LAG-3蛋白表达。流式分析结果(见图25)表明，可在LAG-3(s)基因人源化纯合子体内检测到表达人源化LAG-3蛋白(图25D)，而在野生型小鼠体内只能检测到表达鼠LAG-3蛋白(图25A)，未检测到表达人或人源化LAG-3蛋白的细胞(图25C)。
取1只本方法得到纯合子小鼠(6周龄)，另取1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，将经抗鼠CD3抗体(mCD3)刺激的小鼠脾脏细胞分为三份，其中两份随机加入Relatlimab或IgG4-kappa，孵育30min后每份再加入Alexa
Figure BDA0002328923940000231
647AffiniPure F(ab')2Fragment GoatAnti-Human IgG,Fcγfragment specific(anti-hIgG Alexa Fluor 647)、鼠源T细胞表面抗体FITC anti-Mouse TCRβChain(mTcRβFITC)对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。与对照组(图26A、B、C、D)相比，人LAG-3抗体Relatlimab(图26E、F)与LAG-3(s)基因人源化纯合子小鼠体内活化的T细胞有很好的结合。
此外，由于Cas9的切割造成基因组DNA的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，本方法还可同时得到LAG-3蛋白功能丧失的基因敲除小鼠，可通过常规PCR的方法检测基因缺失情况，鉴定结果参见图14，结合图14A和图14B，编号为001、002、003、009、010、011、017、019的小鼠为基因敲除杂合子小鼠；编号为006、008、013、015、016的小鼠为基因敲除纯合子小鼠。PCR分析包括下述引物：
5’MSD-F：5’-GCTTTGGGAAGCTCCAGGTAAG-3’(SEQ ID NO：63)
WT-R2：5’-AGACAGCAGCTAAAAGATGCCCAG-3’(SEQ ID NO：64)
WT-F：5’-CTCCCTTCAACAGGGAGGCATGAT-3’(SEQ ID NO：65)
WT-R：5’-ATAACTACCCCTGTCCCCACTTCCG-3’(SEQ ID NO：66)
另外还可以使用其它基因编辑系统和制备方法，包括但不限于利用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因打靶技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。以胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备进行不同程度的基因人源化替换。
以图3所示的小鼠人源化LAG-3基因座示意图为例，设计如图15所示的打靶策略示意图。分别用细菌人工染色体(BAC)RP23-121J20和RP11-578M14获得小鼠和人LAG-3DNA。其中图15所示的打靶载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：40)、3’同源臂(SEQ ID NO：41)以及包含人LAG-3序列(简称“A2片段”，SEQ ID NO：42)的DNA片段，其中5’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第124915890-124910898位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第124904008-124900076位核苷酸序列相同；A2片段与NCBI登录号与NC_000012.12的第6773206-6777888位核苷酸序列相同。包含人LAG-3序列的DNA片段上游与5’同源臂直接连接，下游与小鼠LAG-3基因座的连接设计为5’-GTTTCTCATCCTTGGTGTCCTTTCTCTGCTCCTTTTGGTGACTGGGGCCTTTGGCTTTCACTGGTGGAGAAAACAGGTGAGAC-3’(SEQ ID NO：67)内，其中序列“TGACT”的最后一个“T”是人的最后一个核苷酸，序列“GGGGC”的第一个“G”是小鼠LAG-3基因座的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠LAG-3的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示。
打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠LAG-3基因座的连接设计为5’-GGCCCACACCTAGCTCAGCTGCACTTCAGTCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’(SEQ ID NO：45)内，其中序列“TTCAGT”的最后一个“T”是鼠的最后一个核苷酸，序列“CTCGA”的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与小鼠LAG-3基因座的连接设计为5’-GTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCACT AGTCACTTGTGCTCAGACCCCTGGCTACAGAGAAGGAAAGC-3’(SEQ ID NO：46)内，其中序列“CTAGTC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“ACTTG”的“A”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的重组载体可通过测序或酶切等常规进行初步验证，验证结果见图16，使用3组酶进行酶切验证，其中，EcoRV+NotI应出现11530bp+5808bp+2910bp+1570bp，SmaI应出现10959bp+9297bp+910bp+414bp+238bp，ScaI+KpnI应出现10358bp+4596bp+2294bp+1769bp+1359bp+916bp+526bp，酶切结果显示除#2号克隆外，其余均符合预期，其中质粒#4、#5经测序公司测序验证正确。将构建正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，部分克隆PCR和Southern Blot(分别用BamHI或AseI或SspI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)的检测结果见图17、图18。图17表明编号为1-F09的细胞为阳性克隆，其余未标记泳道均为阴性克隆；图18的Southern Blot检测结果表明经PCR鉴定为阳性的12个克隆中，9个克隆(1-C08，1-D05，1-E08，1-F09，1-G07，2-A09，2-B03，2-C08，2-G05)确定为阳性杂合克隆且无随机插入。
PCR测定包括下述引物：
F：5’-GTAATACAAGTGCCCAAACCCACCA-3’(SEQ ID NO：47)，
R：5’-CGGGTGTGGGGTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：48)。
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
F：5’-ATGTGTGAGTTGGTGTTAGCCTGGG-3’(SEQ ID NO：49)，
R：5’-GACACTCCACTCCCTTCTCCCTTCA-3’(SEQ ID NO：50)；
3’探针(3’Probe)：
F：5’-ACTCCTATAATGAGGTGAGAGGCAG-3’(SEQ ID NO：51)，
R：5’-GCCCCGCTGGGATTTAGGACAGCAAC-3’(SEQ ID NO：52)；
Neo探针(Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：53)，
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：54)。
将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图19)后，再通过互相交配即可得到表达人LAG-3蛋白的LAG-3基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去Neo)的鉴定结果见图20，其中，编号为F1-2的小鼠为阳性杂合小鼠。PCR测定包括下述引物：
WT-F：5’-GCCAGGGCATTTCTCTATTCTCCAATC-3’(SEQ ID NO：55)，
WT-R：5’-GAGGTGGGGCACTACAGGATGC-3’(SEQ ID NO：56)；
WT-F：(SEQ ID NO：55)，
Mut-R：5’-CGGGTGTGGGGTTGAGTGCT-3’(SEQ ID NO：57)
Frt-F：5’-GACCTCCGTAATCCTTTCCCCAT-3’(SEQ ID NO：58)；
Frt-R：5’-TTCTGGATTTCACATGGGTGGTGT-3’(SEQ ID NO：59)；
Flp-F2：5’-GACAAGCGTTAGTAGGCACATATAC-3’(SEQ ID NO：60)；
Flp-R2：5’-GCTCCAATTTCCCACAACATTAGT-3’(SEQ ID NO：61)。
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的B-hLAG-3人源化基因工程小鼠(后续简称LAG3(l))。
同样的，可采用前述流式方法确认LAG(l)体内人源化LAG-3蛋白的表达情况(图21)，结果与LAG3(s)小鼠的检测结果相似，无明显差异。将上述LAG3(l)基因人源化杂合子小鼠相互交配，得到了LAG-3(l)基因人源化纯合子小鼠。测定人LAG-3抗体Relatlimab的结合情况(图27)。进一步的，还检测了该小鼠脾脏、外周血等的免疫细胞和T细胞亚群情况，与野生型相比未发现明显差异(图28-31)。
实施例2 LAG-3基因人源化小鼠模型体内药效验证
利用本方法制备的人源化小鼠构建的肿瘤模型，可用于测试靶向人LAG3的药物。在一个实验中，取实施例1制备的LAG-3(s)基因人源化纯合子小鼠(4-6周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝8/组)。治疗组随机选择一种抗人LAG-3单克隆抗体(AB1，使用常规方法免疫小鼠得到，参见
Janeway'sImmunobiology
(9thEdition))，给药剂量为10mg/kg，对照组注射生理盐水。给药方式：腹腔注射，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。
表3中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后14天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)。
表3肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率
Figure BDA0002328923940000261
Figure BDA0002328923940000271
整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好，且所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对所述治疗组抗体耐受良好。治疗组(G2)和对照组(G1)小鼠平均体重增长在整个实验周期内均无显著区别(图22、23)，表明这种抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。但从肿瘤体积结果上看(图24)，在各个时期，治疗组肿瘤体积均小于对照组，且差异具有显著性；即与对照组(G1)相比，治疗组肿瘤体积呈现明显的抑制增长的效果，表明这种抗人LAG-3单抗在抑制肿瘤生长方面具有一定作用。证明了本方法制备的人源化LAG-3小鼠可用于筛选抗人LAG-3抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于人LAG-3信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。
实施例3双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
利用本方法或制得的LAG-3小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞或胚胎干细胞可选择来源于含有其它基因修饰的小鼠，或者，也可选择对LAG-3人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到LAG-3人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的LAG-3小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到LAG-3人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人LAG-3和其他基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司
北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 人源化LAG-3基因改造动物模型的制备方法及应用
<130> 1
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2020
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
gggcagtggg gaggagaagc agaaggactg ggtctggagg agcagctcaa gttctagcta 60
gctgcagtgg gtttgcctgc actctgctct gggtcccagc ccgggcctct gatcattatc 120
catcctgctg tctccagtcc ccactcctgg ggcgtcctct tcaccctaca ttctttccct 180
ccgcctcacc tcctccttgt agaacttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 240
tctctctctc tctgtgtgtg tgtgtgtgtc tgtctgtctg tctgtctctc tctcctccca 300
ggaccttttt ctaacctccc ttggagggct ggggaggccc gggccataga ggagatgagg 360
gaggacctgc tccttggctt tttgcttctg ggactgcttt gggaagctcc agttgtgtct 420
tcagggcctg ggaaagagct ccccgtggtg tgggcccagg agggagctcc cgtccatctt 480
ccctgcagcc tcaaatcccc caacctggat cctaactttc tacgaagagg aggggttatc 540
tggcaacatc aaccagacag tggccaaccc actcccatcc cggcccttga ccttcaccag 600
gggatgccct cgcctagaca acccgcaccc ggtcgctaca cggtgctgag cgtggctcca 660
ggaggcctgc gcagcgggag gcagcccctg catccccacg tgcagctgga ggagcgcggc 720
ctccagcgcg gggacttctc tctgtggttg cgcccagctc tgcgcaccga tgcgggcgag 780
taccacgcca ccgtgcgcct cccgaaccgc gccctctcct gcagtctccg cctgcgcgtc 840
ggccaggcct cgatgattgc tagtccctca ggagtcctca agctgtctga ttgggtcctt 900
ttgaactgct ccttcagccg tcctgaccgc ccagtctctg tgcactggtt ccagggccag 960
aaccgagtgc ctgtctacaa ctcaccgcgt cattttttag ctgaaacttt cctgttactg 1020
ccccaagtca gccccctgga ctctgggacc tggggctgtg tcctcaccta cagagatggc 1080
ttcaatgtct ccatcacgta caacctcaag gttctgggtc tggagcccgt agcccctctg 1140
acagtgtacg ctgctgaagg ttctagggtg gagctgccct gtcatttgcc cccaggagtg 1200
gggacccctt ctttgctcat tgccaagtgg actcctcctg gaggaggtcc tgagctcccc 1260
gtggctggaa agagtggcaa ttttaccctt caccttgagg ctgtgggtct ggcacaggct 1320
gggacctaca cctgtagcat ccatctgcag ggacagcagc tcaatgccac tgtcacgttg 1380
gcggtcatca cagtgactcc caaatccttc gggttacctg gctcccgggg gaagctgttg 1440
tgtgaggtaa ccccggcatc tggaaaggaa agatttgtgt ggcgtcccct gaacaatctg 1500
tccaggagtt gcccgggccc tgtgctggag attcaggagg ccaggctcct tgctgagcga 1560
tggcagtgtc agctgtacga gggccagagg cttcttggag cgacagtgta cgccgcagag 1620
tctagctcag gcgcccacag tgctaggaga atctcaggtg accttaaagg aggccatctc 1680
gttctcgttc tcatccttgg tgccctctcc ctgttccttt tggtggccgg ggcctttggc 1740
tttcactggt ggagaaaaca gttgctactg agaagatttt ctgccttaga acatgggatt 1800
cagccatttc cggctcagag gaagatagag gagctggagc gagaactgga gacggagatg 1860
ggacaggagc cggagcccga gccggagcca cagctggagc cagagcccag gcagctctga 1920
cctggagccg aggcagccag caggtctcag cagctccgcc cgcccgcccg cccgcccgaa 1980
taaactccct gtcagcagca tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2020
<210> 2
<211> 521
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 2
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu
65 70 75 80
His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr
85 90 95
Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu
100 105 110
His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe
115 120 125
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His
130 135 140
Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys
165 170 175
Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
180 185 190
Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr
195 200 205
Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln
210 215 220
Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg
225 230 235 240
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu
245 250 255
Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val
260 265 270
Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu
275 280 285
Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala
290 295 300
Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu
325 330 335
Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala
355 360 365
Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala
385 390 395 400
Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala
405 410 415
Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg
420 425 430
Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu
435 440 445
Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe His
450 455 460
Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His
465 470 475 480
Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg
485 490 495
Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu
515 520
<210> 3
<211> 1995
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
acaggggtga aggcccagag accagcagaa cggcatccca gccacgacgg ccactttgct 60
ctgtctgctc tccgccacgg ccctgctctg ttccctggga cacccccgcc cccacctcct 120
caggctgcct gatctgccca gctttccagc tttcctctgg attccggcct ctggtcatcc 180
ctccccaccc tctctccaag gccctctcct ggtctccctt cttctagaac cccttcctcc 240
acctccctct ctgcagaact tctcctttac cccccacccc ccaccactgc cccctttcct 300
tttctgacct ccttttggag ggctcagcgc tgcccagacc ataggagaga tgtgggaggc 360
tcagttcctg ggcttgctgt ttctgcagcc gctttgggtg gctccagtga agcctctcca 420
gccaggggct gaggtcccgg tggtgtgggc ccaggagggg gctcctgccc agctcccctg 480
cagccccaca atccccctcc aggatctcag ccttctgcga agagcagggg tcacttggca 540
gcatcagcca gacagtggcc cgcccgctgc cgcccccggc catcccctgg cccccggccc 600
tcacccggcg gcgccctcct cctgggggcc caggccccgc cgctacacgg tgctgagcgt 660
gggtcccgga ggcctgcgca gcgggaggct gcccctgcag ccccgcgtcc agctggatga 720
gcgcggccgg cagcgcgggg acttctcgct atggctgcgc ccagcccggc gcgcggacgc 780
cggcgagtac cgcgccgcgg tgcacctcag ggaccgcgcc ctctcctgcc gcctccgtct 840
gcgcctgggc caggcctcga tgactgccag ccccccagga tctctcagag cctccgactg 900
ggtcattttg aactgctcct tcagccgccc tgaccgccca gcctctgtgc attggttccg 960
gaaccggggc cagggccgag tccctgtccg ggagtccccc catcaccact tagcggaaag 1020
cttcctcttc ctgccccaag tcagccccat ggactctggg ccctggggct gcatcctcac 1080
ctacagagat ggcttcaacg tctccatcat gtataacctc actgttctgg gtctggagcc 1140
cccaactccc ttgacagtgt acgctggagc aggttccagg gtggggctgc cctgccgcct 1200
gcctgctggt gtggggaccc ggtctttcct cactgccaag tggactcctc ctgggggagg 1260
ccctgacctc ctggtgactg gagacaatgg cgactttacc cttcgactag aggatgtgag 1320
ccaggcccag gctgggacct acacctgcca tatccatctg caggaacagc agctcaatgc 1380
cactgtcaca ttggcaatca tcacagtgac tcccaaatcc tttgggtcac ctggatccct 1440
ggggaagctg ctttgtgagg tgactccagt atctggacaa gaacgctttg tgtggagctc 1500
tctggacacc ccatcccaga ggagtttctc aggaccttgg ctggaggcac aggaggccca 1560
gctcctttcc cagccttggc aatgccagct gtaccagggg gagaggcttc ttggagcagc 1620
agtgtacttc acagagctgt ctagcccagg tgcccaacgc tctgggagag ccccaggtgc 1680
cctcccagca ggccacctcc tgctgtttct catccttggt gtcctttctc tgctcctttt 1740
ggtgactgga gcctttggct ttcacctttg gagaagacag tggcgaccaa gacgattttc 1800
tgccttagag caagggattc accctccgca ggctcagagc aagatagagg agctggagca 1860
agaaccggag ccggagccgg agccggaacc ggagcccgag cccgagcccg agccggagca 1920
gctctgacct ggagctgagg cagccagcag atctcagcag cccagtccaa ataaactccc 1980
tgtcagcagc aaaaa 1995
<210> 4
<211> 525
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 5
<211> 869
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatcagccc cctcacactt tccactgcga agcgaaaccc cgcgccttgg tctggggggg 60
cgggcagtgg ggaggagaag cagaaggact gggtctggag gagcagctca agttctagct 120
agctgcagtg ggtttgcctg cactctgctc tgggtcccag cccgggcctc tgatcattat 180
ccatcctgct gtctccagtc cccactcctg gggcgtcctc ttcaccctac attctttccc 240
tccgcctcac ctcctccttg tagaacttct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 300
ctctctctct ctctgtgtgt gtgtgtgtgt ctgtctgtct gtctgtctct ctctcctccc 360
aggacctttt tctaacctcc cttggagggc tggggaggcc cgggccatag aggagatgag 420
ggaggacctg ctccttggct ttttgcttct gggactgctt tgggaagctc caggtaaggt 480
ggagagtcca gcagggacct ctatggctgt ctctttagct gtggtgatat tccaatgctt 540
ttgttgaggg gaggggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ttttgagaca gggtttcttt 600
gtgttgccct ggctgtcctg ggactggctc tgatgaccag gctggccttg aatttatagt 660
gatccacttg cctctgcctc cccagtgctg ggattagagg cgtgcaccat cactttgtat 720
aagggcagat cccaaagctg cctcagcctc ccttcaacag ggaggcatga tgtttctttc 780
ttaggaaagc cagggcattt ctctattctc caatctcttg gctcaatgcc cttggcctct 840
cttttgttcc actagttgtg tcttcaggg 869
<210> 6
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttctgggta actcttctaa gcagccttga ccacaacctt cctgctcacc acctctcctg 60
actcatgcat ggacccccaa aactttctca gctgcgtgtg gtctcactcc acatcacttt 120
gtttcagtgt ccaaaccatt ttctctctgg gcatctttta gctgctgtct ctcttacttt 180
tatttattta tttgtgtgtt tatttattta ttttcatttt agcgtgcgtt ggtgttttgc 240
ctgcatagat gtctgtgtca gggtattgga ttccctggaa cttgacctac agacagtcat 300
gagataccat atgggtgctg ggaattgaac ccagctcctc tggaaggaca gccagtgttc 360
taatctgcca tctctcactg tttatccctt ggctgttcag cctcctgagc ctttggtctc 420
ttgctgcctc agtttcccta gtttctctgc tttgctctgt ttctttctgt gttacagcca 480
aatgcctcct tcccccttct gccttacttc cttgatgtct ccaccctctg gcccactgct 540
tacccttggt aacggcttgg cttttccttc ttctctccag gtctggagcc cgtagcccct 600
ctgacagtgt acgctgctga aggttctagg gtggagctgc cctgtcattt gcccccagga 660
gtggggaccc cttctttgct cattgccaag tggactcctc ctggaggagg tcctgagctc 720
cccgtggctg gaaagagtgg caattttacc cttcaccttg aggctgtggg tctggcacag 780
gctgggacct acacctgtag catccatctg cagggacagc agctcaatgc cactgtcacg 840
ttggcggtca tcacaggtca gccacaggtg ggaatggaat agtttccatc tcagggagaa 900
agaacagggt gggagtgttg gctgtcagag aggggtgtgt gcattcgtgc gtgtgcgtgt 960
gcctgtgcgt gtgtgcgtgt gtgtgtgcgc gcgcgcatga ccagtatatg ttcctcagca 1020
tgtatttgag gtcactggac aactctgtgg agttagttct ctctacccac ctttctctgg 1080
gttctagggt ttgcacagaa agcacctttt ctcctttagc ttaggatggc cttgaactcc 1140
tgattctgct gcttacaagg cccaagtgct gggactagag acatgtacta ctgtgcctgt 1200
caa 1203
<210> 7
<211> 1652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaggggctg aggtcccggt ggtgtgggcc caggaggggg ctcctgccca gctcccctgc 60
agccccacaa tccccctcca ggatctcagc cttctgcgaa gagcaggggt cacttggcag 120
catcagccag acaggtatgc accccaaact tgggcaacag gacctccgaa tccagcactc 180
aaccccacac ccgtgccggt cctctgtccc ctgccctgag gtgtcactcc ctctgaagcc 240
agtgacccag tctccctgcc ctcgcttgca ccgttcctgc ccttgctctg caatcagcga 300
ccctcacgcc agcatccctt ctctccagaa gtggatgcgg ccagtccaac agaggggtcg 360
ggcgtgaggg gacggttggt ggtcaagaga actcttgggg cgggctttct catcctcaac 420
gggtggctgc ctgcatcctc ccgggcttcc tacccctgga gcttctcaac tccattctct 480
ttcccgccca gtggcccgcc cgctgccgcc cccggccatc ccctggcccc cggccctcac 540
ccggcggcgc cctcctcctg ggggcccagg ccccgccgct acacggtgct gagcgtgggt 600
cccggaggcc tgcgcagcgg gaggctgccc ctgcagcccc gcgtccagct ggatgagcgc 660
ggccggcagc gcggggactt ctcgctatgg ctgcgcccag cccggcgcgc ggacgccggc 720
gagtaccgcg ccgcggtgca cctcagggac cgcgccctct cctgccgcct ccgtctgcgc 780
ctgggccagg cctcgagtat gtggggcggg acgatgggag aagggctggg aggtgggtcc 840
ccatcccctg cctcccggga cgcaggaagg gctggggcag aggctgcgcc ctaggccctg 900
tcggagagct cccagaagag tagaggaagg gggtgggcgg cctgctggag tggaaggtgc 960
ccccgaagca cgtgtatggg gggccctgtg gagagattgt gtcacccccg agctcccctt 1020
ctcccaccca cgcgggagtg cccagaggga gggggagggg gggagagcat ggggctaaag 1080
tgattcattt cagatatctg tagctcaggg ggtgggcttc gcggggttcc aggccaggaa 1140
aacggcaagg gtggctgatg ccaagtaaac tccaggccag ggacggggaa agtggtcctg 1200
gggagtcttg gggatccact ttatgcacct ccaggtgctg gaagctgaga tggggagagg 1260
gtgatgtggg agaggagaag acaagtctaa agccaggtgc ctgtttccag gagcttccgg 1320
cttggcagcc ctgctgtgtt gggaaattgt ttccagtggg ctgatgaagt cttctttatc 1380
cttgcacagt gactgccagc cccccaggat ctctcagagc ctccgactgg gtcattttga 1440
actgctcctt cagccgccct gaccgcccag cctctgtgca ttggttccgg aaccggggcc 1500
agggccgagt ccctgtccgg gagtcccccc atcaccactt agcggaaagc ttcctcttcc 1560
tgccccaagt cagccccatg gactctgggc cctggggctg catcctcacc tacagagatg 1620
gcttcaacgt ctccatcatg tataacctca ct 1652
<210> 8
<211> 2038
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggcagtggg gaggagaagc agaaggactg ggtctggagg agcagctcaa gttctagcta 60
gctgcagtgg gtttgcctgc actctgctct gggtcccagc ccgggcctct gatcattatc 120
catcctgctg tctccagtcc ccactcctgg ggcgtcctct tcaccctaca ttctttccct 180
ccgcctcacc tcctccttgt agaacttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 240
tctctctctc tctgtgtgtg tgtgtgtgtc tgtctgtctg tctgtctctc tctcctccca 300
ggaccttttt ctaacctccc ttggagggct ggggaggccc gggccataga ggagatgagg 360
gaggacctgc tccttggctt tttgcttctg ggactgcttt gggaagctcc agttgtgtct 420
tcagggccag gggctgaggt cccggtggtg tgggcccagg agggggctcc tgcccagctc 480
ccctgcagcc ccacaatccc cctccaggat ctcagccttc tgcgaagagc aggggtcact 540
tggcagcatc agccagacag tggcccgccc gctgccgccc ccggccatcc cctggccccc 600
ggccctcacc cggcggcgcc ctcctcctgg gggcccaggc cccgccgcta cacggtgctg 660
agcgtgggtc ccggaggcct gcgcagcggg aggctgcccc tgcagccccg cgtccagctg 720
gatgagcgcg gccggcagcg cggggacttc tcgctatggc tgcgcccagc ccggcgcgcg 780
gacgccggcg agtaccgcgc cgcggtgcac ctcagggacc gcgccctctc ctgccgcctc 840
cgtctgcgcc tgggccaggc ctcgatgact gccagccccc caggatctct cagagcctcc 900
gactgggtca ttttgaactg ctccttcagc cgccctgacc gcccagcctc tgtgcattgg 960
ttccggaacc ggggccaggg ccgagtccct gtccgggagt ccccccatca ccacttagcg 1020
gaaagcttcc tcttcctgcc ccaagtcagc cccatggact ctgggccctg gggctgcatc 1080
ctcacctaca gagatggctt caacgtctcc atcatgtata acctcactgt tctgggtctg 1140
gagcccgtag cccctctgac agtgtacgct gctgaaggtt ctagggtgga gctgccctgt 1200
catttgcccc caggagtggg gaccccttct ttgctcattg ccaagtggac tcctcctgga 1260
ggaggtcctg agctccccgt ggctggaaag agtggcaatt ttacccttca ccttgaggct 1320
gtgggtctgg cacaggctgg gacctacacc tgtagcatcc atctgcaggg acagcagctc 1380
aatgccactg tcacgttggc ggtcatcaca gtgactccca aatccttcgg gttacctggc 1440
tcccggggga agctgttgtg tgaggtaacc ccggcatctg gaaaggaaag atttgtgtgg 1500
cgtcccctga acaatctgtc caggagttgc ccgggccctg tgctggagat tcaggaggcc 1560
aggctccttg ctgagcgatg gcagtgtcag ctgtacgagg gccagaggct tcttggagcg 1620
acagtgtacg ccgcagagtc tagctcaggc gcccacagtg ctaggagaat ctcaggtgac 1680
cttaaaggag gccatctcgt tctcgttctc atccttggtg ccctctccct gttccttttg 1740
gtggccgggg cctttggctt tcactggtgg agaaaacagt tgctactgag aagattttct 1800
gccttagaac atgggattca gccatttccg gctcagagga agatagagga gctggagcga 1860
gaactggaga cggagatggg acaggagccg gagcccgagc cggagccaca gctggagcca 1920
gagcccaggc agctctgacc tggagccgag gcagccagca ggtctcagca gctccgcccg 1980
cccgcccgcc cgcccgaata aactccctgt cagcagcatc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2038
<210> 9
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Ala Glu Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val
275 280 285
Gly Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Glu Leu Pro Val Ala Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu
305 310 315 320
Glu Ala Val Gly Leu Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His
325 330 335
Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro
370 375 380
Leu Asn Asn Leu Ser Arg Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln
385 390 395 400
Glu Ala Arg Leu Leu Ala Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly
405 410 415
Gln Arg Leu Leu Gly Ala Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly
420 425 430
Ala His Ser Ala Arg Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu
435 440 445
Val Leu Val Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala
450 455 460
Gly Ala Phe Gly Phe His Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg
465 470 475 480
Phe Ser Ala Leu Glu His Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys
485 490 495
Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu
515 520 525
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttccactag ttgtgtcttc agg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggccctgaag acacaactag tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accacgggga gctctttccc agg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagttgtgt cttcagggcc tgg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcctgggaaa gagctccccg tgg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctcctgggc ccacaccacg ggg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggaaagagct ccccgtggtg tgg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgacgcggtg agttgtagac agg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtagacagg cactcggttc tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctccatcacg tacaacctca agg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtcctcaag ctgtctgatt ggg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtttcagcta aaaaatgacg cgg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtctctgtgc actggttcca ggg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caggcactcg gttctggccc tgg 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcctgggaaa gagctccccg 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taggcctggg aaagagctcc ccg 23
<210> 26
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cggggagctc tttcccagg 19
<210> 27
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaaccgggga gctctttccc agg 23
<210> 28
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgcggtgag ttgtagac 18
<210> 29
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taggacgcgg tgagttgtag ac 22
<210> 30
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtctacaact caccgcgt 18
<210> 31
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaacgtctac aactcaccgc gt 22
<210> 32
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agcattcaca cagggtgggg aattt 25
<210> 33
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctggcctgga gtttacttgg catcag 26
<210> 34
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cccctggagc ttctcaactc cattc 25
<210> 35
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctctgtttct accttcttgg acatcctggc 30
<210> 36
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggccacttat catcacttgc cc 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggtggtaaag gggcctagga g 21
<210> 38
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctccagaagt ggatgcggcc agtcc 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcggcaggag agggcgcggt ccctg 25
<210> 40
<211> 4993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggacacgtac ctctggggtg atctacttag gagaactccg gcccacttgg gatcgtgtac 60
acagagttgc atactaacgt tagataagag cggaggagaa ggtggcccct gccaaggaga 120
catgggatct gtatggggtt ggaaggctgg tgtgtccaga ggggcttacc cactgtcaga 180
atagaatagg acctgctggg cttttggagt gaaggcagac agcctggtgg gagggactct 240
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<210> 41
<211> 3933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<210> 42
<211> 4683
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
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ccaagtgagt gcagggtgat tgagacttgg ggttcaacct gtgatatcac gtaagggggg 4020
cagaatccca aaagatctct tccttctact cttttcagtg actcccaaat cctttgggtc 4080
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act 4683
<210> 43
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gggcagtggg gaggagaagc agaaggactg ggtctggagg agcagctcaa gttctagcta 60
gctgcagtgg gtttgcctgc actctgctct gggtcccagc ccgggcctct gatcattatc 120
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ggccctcacc cggcggcgcc ctcctcctgg gggcccaggc cccgccgcta cacggtgctg 660
agcgtgggtc ccggaggcct gcgcagcggg aggctgcccc tgcagccccg cgtccagctg 720
gatgagcgcg gccggcagcg cggggacttc tcgctatggc tgcgcccagc ccggcgcgcg 780
gacgccggcg agtaccgcgc cgcggtgcac ctcagggacc gcgccctctc ctgccgcctc 840
cgtctgcgcc tgggccaggc ctcgatgact gccagccccc caggatctct cagagcctcc 900
gactgggtca ttttgaactg ctccttcagc cgccctgacc gcccagcctc tgtgcattgg 960
ttccggaacc ggggccaggg ccgagtccct gtccgggagt ccccccatca ccacttagcg 1020
gaaagcttcc tcttcctgcc ccaagtcagc cccatggact ctgggccctg gggctgcatc 1080
ctcacctaca gagatggctt caacgtctcc atcatgtata acctcactgt tctgggtctg 1140
gagcccccaa ctcccttgac agtgtacgct ggagcaggtt ccagggtggg gctgccctgc 1200
cgcctgcctg ctggtgtggg gacccggtct ttcctcactg ccaagtggac tcctcctggg 1260
ggaggccctg acctcctggt gactggagac aatggcgact ttacccttcg actagaggat 1320
gtgagccagg cccaggctgg gacctacacc tgccatatcc atctgcagga acagcagctc 1380
aatgccactg tcacattggc aatcatcaca gtgactccca aatcctttgg gtcacctgga 1440
tccctgggga agctgctttg tgaggtgact ccagtatctg gacaagaacg ctttgtgtgg 1500
agctctctgg acaccccatc ccagaggagt ttctcaggac cttggctgga ggcacaggag 1560
gcccagctcc tttcccagcc ttggcaatgc cagctgtacc agggggagag gcttcttgga 1620
gcagcagtgt acttcacaga gctgtctagc ccaggtgccc aacgctctgg gagagcccca 1680
ggtgccctcc cagcaggcca cctcctgctg tttctcatcc ttggtgtcct ttctctgctc 1740
cttttggtga ctggggcctt tggctttcac tggtggagaa aacagttgct actgagaaga 1800
ttttctgcct tagaacatgg gattcagcca tttccggctc agaggaagat agaggagctg 1860
gagcgagaac tggagacgga gatgggacag gagccggagc ccgagccgga gccacagctg 1920
gagccagagc ccaggcagct ctgacctgga gccgaggcag ccagcaggtc tcagcagctc 1980
cgcccgcccg cccgcccgcc cgaataaact ccctgtcagc agcatcaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaaa 2044
<210> 44
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu His Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln
485 490 495
Arg Lys Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln
515 520 525
Leu
<210> 45
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggcccacacc tagctcagct gcacttcagt ctcgaggtcg acggtatcga taagcttgat 60
atcgaattcc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 104
<210> 46
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gttcctattc tctagaaagt ataggaactt catcagtcag gtacataatg gtggatccac 60
tagtcacttg tgctcagacc cctggctaca gagaaggaaa gc 102
<210> 47
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gtaatacaag tgcccaaacc cacca 25
<210> 48
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cgggtgtggg gttgagtgct 20
<210> 49
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atgtgtgagt tggtgttagc ctggg 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gacactccac tcccttctcc cttca 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
actcctataa tgaggtgaga ggcag 25
<210> 52
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gccccgctgg gatttaggac agcaac 26
<210> 53
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggatcggcca ttgaacaaga tgg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cagaagaact cgtcaagaag gcg 23
<210> 55
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gccagggcat ttctctattc tccaatc 27
<210> 56
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gaggtggggc actacaggat gc 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cgggtgtggg gttgagtgct 20
<210> 58
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gacctccgta atcctttccc cat 23
<210> 59
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ttctggattt cacatgggtg gtgt 24
<210> 60
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 61
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 62
<211> 132
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttaaaggat cc 132
<210> 63
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gctttgggaa gctccaggta ag 22
<210> 64
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
agacagcagc taaaagatgc ccag 24
<210> 65
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctcccttcaa cagggaggca tgat 24
<210> 66
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ataactaccc ctgtccccac ttccg 25
<210> 67
<211> 83
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gtttctcatc cttggtgtcc tttctctgct ccttttggtg actggggcct ttggctttca 60
ctggtggaga aaacaggtga gac 83
<210> 68
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gagggactcc cctactctga attgccagga tgtccaagaa ggtagaaaca gagatgataa 60
aaatttgaaa gaaaaatttg aatggtttga tcaaagcttg aattccgaag ttcctattct 120
ctagaaagta taggaac 137
<210> 69
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcatcagtca ggtacataat ggtgaaaaga 60
atgaggcata tatttttgaa cccttgtctg cttttggcct agggctctgt taaaat 116
<210> 70
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cttggctcaa tgcccttggc ctctcttttg ttccactagt tgtgtcttca gggccagggg 60
ctgaggtccc ggtggtgtgg gcccaggagg gggctcctgc ccagctcccc tgcagcccca 120
caatccccct c 131
<210> 71
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tcctcaccta cagagatggc ttcaacgtct ccatcatgta taacctcact gttctgggta 60
actcttctaa gcagccttga ccacaacctt cctgctcacc acctctcctg actcatgcat 120
ggacccccaa aactttctca gctgcgtgtg gtctcactcc acatcactt 169
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ctcccttcaa cagggaggca tgatg 25
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cttcagaggg agtgacacct caggg 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
caggatctct cagagcctcc gactg 25
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
agacagcagc taaaagatgc ccagag 26

Claims (37)

1.一种人源化基因改造动物模型的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型体内表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列，所述的人LAG-3基因通过内源LAG-3调控元件调控。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的核苷酸序列为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的核苷酸序列的全部或部分为人来源，同时编码该动物来源部分和人来源部分LAG-3蛋白的核苷酸序列通过序列拼接连接于动物来源LAG-3启动子后。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将编码胞外区的内源LAG-3基因全部或部分核苷酸序列替换为人编码胞外区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列；其中，所述的人编码胞外区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的部分核苷酸序列；优选的，将编码胞外区和跨膜区的内源LAG-3基因全部或部分核苷酸序列替换为人编码胞外区和跨膜区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列；其中，所述的人编码胞外区和跨膜区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的部分核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体构建人源化基因改造动物模型，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列；所述的靶向载体将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子4的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的全部或部分核苷酸序列；
优选的，所述的供体DNA序列还包含外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列；所述的靶向载体将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子7的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白包括人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列和非人动物LAG-3蛋白的部分氨基酸序列，优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型基因组中包括人源化LAG-3基因，所述的人源化LAG-3基因包含人LAG-3基因的部分核苷酸序列和非人动物LAG-3基因的部分核苷酸序列，优选的，所述的人LAG-3基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示核苷酸序列的部分或全部；
f)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
h)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化LAG-3基因编码权利要求7或8所述的人源化LAG-3蛋白，或所述的人源化LAG-3基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的序列的部分或全部；
b)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)为包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示序列的全部或部分；
f)与包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)与包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
h)具有包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
11.一种LAG-3基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的供体DNA序列包含外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示或所述5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124914544-124910898位核苷酸序列相同；
和/或，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示或所述3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124903953-124907833位核苷酸序列相同。
13.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示；
和/或，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ IDNO：41所示。
14.一种特异的靶向LAG-3基因的sgRNA序列，其特征在于，所述的sgRNA序列在动物LAG-3基因的靶位点位于动物LAG-3基因的外显子2和/或外显子4上；优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点核苷酸序列如SEQ ID NO：10-16任一项所示，3’端靶位点核苷酸序列如SEQ IDNO：17-23任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO：14和/或SEQID NO：17。
15.一种构建人源化基因改造动物模型的载体，所述的载体产生权利要求14所述的sgRNA序列，用于敲除或替换LAG-3基因的外显子2至外显子4的部分或全部。
16.一种权利要求11-13任一所述的靶向载体、权利要求14所述的sgRNA序列或权利要求15所述的载体在动物LAG-3基因编辑中的应用。
17.一种LAG-3基因缺失的动物模型的构建方法，其特征在于，所述的方法包括将动物的内源LAG-3基因的外显子2-4的全部或部分序列或外显子2-7的全部或部分序列敲除，使得内源LAG-3蛋白失活。
18.一种LAG-3基因改造的人源化细胞株，其特征在于，所述的人源化细胞株的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列，所述的人LAG-3基因通过LAG-3调控元件调控。
19.根据权利要求18所述的人源化细胞株，其特征在于，所述的人源化细胞株的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。
20.一种LAG-3基因缺失的细胞株，其特征在于，所述的细胞株至少缺失内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列。
21.一种制备多基因人源化改造动物的方法，包括如下步骤：
(a)应用权利要求1-10和17任一所述的构建方法构建动物模型；
(b)将步骤(a)制备获得的动物模型与其他基因人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化改造动物。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的其他基因人源化动物选自基因PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40或GITR人源化动物中的一种或两种以上的组合。
23.根据权利要求1-10、17任一所述的构建方法或权利要求21-22任一所述的方法制备获得的动物或其后代。
24.一种荷瘤动物模型的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括权利要求1-10、17任一所述的构建方法或权利要求21-22任一所述的方法制备动物。
25.一种人源化LAG-3蛋白，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，胞外区包含人LAG-3蛋白胞外区的全部或部分氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的人源化LAG-3蛋白，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白包括人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列和非人动物LAG-3蛋白的部分氨基酸序列，优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的部分核苷酸序列编码的氨基酸序列；优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的部分核苷酸序列编码的氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的人源化LAG-3蛋白，其特征在于，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQ ID NO：4第25-258位或第25-465位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
28.根据权利要求25-27任一所述的人源化LAG-3蛋白，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：44所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
29.一种编码权利要求25-28任一所述的人源化LAG-3蛋白的人源化LAG-3基因，其特征在于，所述的人源化LAG-3基因包含人LAG-3基因的部分核苷酸序列和非人动物LAG-3基因的部分核苷酸序列，优选的，所述的人LAG-3基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的部分或全部；
b)与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：42所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示核苷酸序列的部分或全部；
f)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
h)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
30.根据权利要求29所述的人源化LAG-3基因，其特征在于，所述的人源化LAG-3基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的序列的部分或全部；
b)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)转录的mRNA的序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)为包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示序列的全部或部分；
f)与包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)与包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
h)具有包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
31.根据权利要求1-10、14-17、21-30任一所述的构建方法、sgRNA序列、载体、应用、方法、动物或其后代、制备方法、人源化LAG-3蛋白或人源化LAG-3基因，其特征在于，所述的动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
32.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-10任一所述的构建方法获得的人源化基因改造动物模型、权利要求17所述的构建方法获得的LAG-3基因缺失的动物模型、权利要求21-22任一所述的方法制备获得的多基因人源化改造动物、权利要求23所述的动物或其后代或者权利要求24所述的制备方法获得的荷瘤动物模型。
33.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求1-10任一所述的构建方法获得的人源化基因改造动物模型、权利要求17所述的构建方法获得的LAG-3基因缺失的动物模型、权利要求21-22任一所述的方法制备获得的多基因人源化改造动物、权利要求23所述的动物或其后代或者权利要求24所述的制备方法获得的荷瘤动物模型。
34.一种表达权利要求25-28任一所述的人源化LAG-3蛋白的构建体，优选的，所述的构建体包含人源化LAG-3基因。
35.一种包含权利要求34所述构建体的细胞。
36.一种包含权利要求35所述细胞的组织。
37.一种权利要求1-10任一所述的构建方法获得的人源化基因改造动物模型、权利要求17所述的构建方法获得的LAG-3基因缺失的动物模型、权利要求18-19任一所述的LAG-3基因改造的人源化细胞株、权利要求20所述的LAG-3基因缺失的细胞株、权利要求21-22任一所述的方法制备获得的多基因人源化改造动物、权利要求23所述的动物或其后代、权利要求24所述的制备方法获得的荷瘤动物模型、权利要求25-28任一所述的人源化LAG-3蛋白、权利要求29-30所述的人源化LAG-3基因、权利要求32所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求33所述的组织或器官或其培养物、权利要求34所述的构建体、权利要求35所述的细胞或权利要求36所述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体；或者，作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人LAG-3信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价；或者，研究LAG-3基因功能研究、人LAG-3抗体、针对人LAG-3靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
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