CN111549070A - 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种对X染色体多拷贝基因进行基因编辑实现动物性别控制的方法，通过筛选并选择哺乳动物X染色体上的一个或多个多拷贝基因作为靶位点并设计合成对应的sgRNA，然后通过构建靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统对哺乳动物精子或受精卵中的X染色体进行切割，可以使整条X染色体失活，并可致死X精子，提高雄性哺乳动物的出生率，或致死XY型胚胎，提高雌性哺乳动物的出生率。本发明提供的方法，X染色体的切割效率高，脱靶率低，具有很好的性别控制效果。

Description

对X染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通过对X染色体多拷贝基因进行基因编辑来实现哺乳动物性别控制的方法。

背景技术

为了满足不同的生产需求，人们渴望通过性别控制技术，大量获得所需性别的畜禽，减少原材料的浪费。而基因编辑技术是对生物体基因组进行编辑的一种技术，可以实现某个基因的敲除、插入和替换等，为性别控制技术的研究提供了新的方向。利用基因编辑技术，可以建立性别相关基因的敲除系，研究其在性别分化和性腺发育中的作用，然后通过插入外源基因增强或抑制性别相关基因的表达，以达到性别比例偏移的目的。然而，性别相关基因的作用机制十分复杂，而且目前研究发现的性别相关基因可能并不完全，所以利用基因编辑技术调控单一性别相关基因的性控研究大部分都未能取得理想的性控效果，即便能获得性别比例偏移的，却也因具有生殖障碍等问题无法继续繁育。

从染色体水平分析，哺乳动物的性别主要是由XX型和XY型染色体决定的，性染色体上也存在着许多参与性别决定与分化的基因，有目的地改变动物的染色体类型更有可能达到性别控制的效果。正常雄性动物可以产生数量相同的两种精子分别携带着X染色体和Y染色体，这些精子通过受精过程，在雌性动物生殖道体内完成获能，并最终与卵母细胞结合，决定着受精卵的性别。所以利用只有一种染色体类型的精子进行受精，无疑是达到性控目的最好办法，但是由于X精子和Y精子之间的差异并不明显，现有的技术条件做到X/Y精子的完全分离十分困难。目前最为成熟的流式细胞仪分选技术也局限于奶牛的生产上，无法广泛应用。

CRISPR/Cas9系统是目前最热门的一种基因编辑工具，具有特异性地切割基因组的能力，同时在靶位点的选择上具有更高的灵活性，这让染色体的整体删除有了实现的可能。我们可以在性染色体上的保守序列设计多个靶位点，让Cas9蛋白在sgRNA的介导下对其进行定点切割，当切口数量超过自我修复的阈值后，便可以失活该性染色体。继而，将该切割反应设定在雄性动物产生精子的过程中发生，那么雄性动物便只可能产生一种染色体类型的精子。同时，由于基因编辑技术的可遗传性，性别控制的效果有可能继续存在与出生后代的繁育中。

中国专利CN105861554B公开了一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，该方法主要通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Y染色体上的Rbmy基因，使Rbmy基因丧失活性，进而使得Y精子或带有Y精子的受精卵丧失活性而无法发育为正常的胚胎来提高雌性哺乳动物的出生率的。但该方法的脱靶率较高，性别控制效果有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过对X染色体上的多拷贝基因进行基因编辑来实现哺乳动物性别控制的方法。发明人通过对哺乳动物XY两条染色体进行分析，发现X染色体和Y染色体具有不对称性，X染色体上存在一些多拷贝的性染色体特异基因，而这些多拷贝的性染色体特异基因在Y染色体上的等位基因拷贝数较少，甚至不存在等位基因。因此，相对于靶向Y染色体的基因编辑，靶向X染色体的基因编辑的脱靶率会更小，达到性控效果的效率会更高。

根据本发明的一个方面，提供了一种对X染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法，其包括：

筛选并选择哺乳动物X染色体上的一个或多个多拷贝基因作为靶位点，设计对应的sgRNA；

构建靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统；

将靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统转染或显微注射进精子中，或显微注射进哺乳动物受精卵的雄原核中。

本发明提供的方法通过筛选并选择哺乳动物X染色体上的一个或多个多拷贝基因作为靶位点，并通过构建靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统对哺乳动物的X染色体进行切割，切割效率高，脱靶率低，可以使整条X染色体失活，并可致死X精子，显著提高雄性哺乳动物的出生率，或者致死XY型胚胎，从而显著提高雌性哺乳动物的出生率，具有很好的性别控制效果。

在一些实施方式中，X染色体多拷贝基因可以为X染色体上拷贝数多于10的基因，优选为拷贝数多于50的基因。选择多拷贝基因作为靶位点的目的是要在染色体上造成尽可能多的切口，以超过染色体自身修复能力，从而使染色体失活。

在一些实施方式中，作为靶位点的多拷贝基因可以为两个。由此，可以使靶位点在染色体上的分布范围尽可能的广，以使对靶位点进行切割后，可以失活整条染色体。

在一些实施方式中，构建靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统可以包括：将两个多拷贝基因对应的sgRNA一起构建至能表达Cas9蛋白的载体上得到共表达载体。由此，可以避免构建和转染两个表达载体时可能出现的只转染成功一个载体或先切割其中一个位点再切割另一个位点，导致无法失活整条染色体的现象。通过构建和转染共表达载体，在对X染色进行切割时，可以保证同时对X染色体上的两个位点进行切割，让整条染色体在一定时间内产生大量切口，机体无法及时修复而导致染色体失活；此外，构建和转染共表达载体，还可以减少载体转染次数，减少对细胞的伤害。

在一些实施方式中，本发明提供的方法可以用于实现小鼠、猪、牛、羊等哺乳动物的性别控制。

根据本发明的另一个方面，提供了一种对X染色体多拷贝基因进行编辑实现小鼠性别控制的方法，其包括：

以小鼠X染色体上的X-B位点和X-D位点作为靶位点，设计对应的sgRNA，其中，X-B位点的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述X-D位点的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

构建靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统；

将靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统转染或显微注射进小鼠精子中，或显微注射进小鼠受精卵的雄原核中。

同时选择X-B位点和X-D位点作为靶位点，可以保证X染色体上的靶位点的数量足够多且分布范围足够广，使得对X染色体进行切割时，可以在X染色上大范围产生切口，有效提高失活整条染色体的效果。

在一些实施方式中，X-B位点对应的sgRNA为sgRNA X-B，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；X-D位点对应的sgRNA为sgRNA X-D，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施方式中，构建靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统可以包括：

设计并合成具有如下结构的基因片段：酶切位点I-loxP-启动子-sgRNA X-B-启动子-sgRNA X-D-loxP2272-酶切位点II；其中，加入loxP基因有利于方便后续替换不同的sgRNA；

将上述基因片段构建至能表达Cas9蛋白的载体上得到共表达载体。

在一些实施方式中，启动子可以选自CMV、CAG、U6、CBh中的一种或多种。

在一些实施方式中，启动子可以为U6。

在一些实施方式中，酶切位点I可以为MluI，酶切位点II可以为FseI，能表达Cas9蛋白的载体可以为以VP12-SpCas9-HF1载体为基本骨架的表达载体。

在一些实施方式中，能表达Cas9蛋白的载体还可以包括EGFP荧光基因和Neo标记基因的基因片段。

在一些实施方式中，将靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统显微注射入小鼠受精卵的雄原核中时，共表达载体显微注射的浓度可以为5-100ng/μL，如，可以为10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL或50ng/μL等其他浓度。

附图说明

图1为载体一的结构图。

图2为CMV载体的结构图。

图3为载体一以及sgRNA片段合成质粒双酶切结果的电泳图；图中M1为1000 DNAmarker，M2为10000 DNA Marker；a为原载体一，b为酶切后的载体一；M为10000 DNAmarker；pKMV为sgRNA片段合成质粒；

图4为sgRNA X-B和sgRNA X-D介导Cas9蛋白在体外切割靶序列效率验证的电泳图；图中a为未切割的sgRNA靶序列片段电泳结果，b为体外转录的sgRNA、靶序列以及Cas9蛋白体外反应后的电泳结果，箭头指示为切割后片段，M为2000 DNA marker。

图5为CMV载体、空载体转染MLTC-1细胞后不同时间点的荧光效果图；图中a为MLTC-1细胞转染CMV载体的荧光图；b为MLTC-1细胞转染空载体的荧光图。

图6为CMV载体、空载体转染MLTC-1细胞后不同时间点的绿色荧光细胞比例的结果图。

图7为CMV载体转染MLTC-1细胞的单克隆细胞团靶位点处测序结果图；图中，WT为靶片段X-B的理论序列，箭头指示为突变碱基。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为可以通过市售获得的常规产品，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1

1、小鼠多拷贝基因靶位点的选择与其对应sgRNA的设计

对小鼠的X染色进行深度测序，挑选出其中拷贝数多于50的重复序列备用。然后，利用CRISPR/Cas9靶序列在线设计软件分析备选序列，并与小鼠全基因组序列进行比对，选择了脱靶效率最小的X-B、X-D位点，设计对应的sgRNA X-B、sgRNA X-D序列，具体信息见下表1-2。

表1 小鼠X染色体上的多拷贝靶位点

靶位点名称	序列(5’-3’划线标注为PAM区)	拷贝数
			X-B	GCTTGGTTAGGGTGAGTGCT<u>TGG</u>(SEQ ID NO:1)	72
X-D	TAAGTGCTGTGTGCTGCTAC<u>TGG</u>(SEQ ID NO:2)	99

表2 sgRNA序列

sgRNA名称	靶位点	序列(5’-3’)
			sgRNA X-B	X-B	GCTTGGTTAGGGTGAGTGCT(SEQ ID NO:3)
sgRNA X-D	X-D	TAAGTGCTGTGTGCTGCTAC(SEQ ID NO:4)

2、靶向小鼠X染色体多拷贝基因的sgRNA和Cas9蛋白共表达系统的构建

载体一：其基本结构如图1所示，其是通过以VP12-SpCas9-HF1载体(购自广州佰路生物技术有限公司)为基本骨架，利用MluI与SpeI两个酶切位点，将包含两段sgRNA、EGFP荧光基因和Neo标记基因的基因片段转入VP12-SpCas9-HF1载体制得。

设计具有如下结构的序列：MluI-loxP-U6 promoter-sgRNA X-B-U6 promoter-sgRNA X-D-loxP2272-FseI，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。由深圳华大基因公司合成对应的基因片段，并利用MluI和FseI双酶切的方法将上述基因片段连接到载体pKMV中，即得sgRNA片段合成质粒。

分别取1μg的载体一和sgRNA片段合成质粒，利用MluI和FseI两种酶进行双酶切，酶切结果如图3所示。将酶切后的载体和目的片段回收，使用T4连接酶在22℃环境中连接一小时。最后经转化、涂板，挑取单克隆操作后，交由华大基因公司进行测序验证。测序结果显示构建好的靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9共表达载体(命名为CMV载体)序列与理论序列完全一致。构建好的CMV载体的结构如图2所示。

通过将CMV载体转染或显微注射至小鼠精子中，使部分X精子失活，再将处理后存活的精子和卵子结合形成受精卵并进行胚胎移植，即可显著提高雄性小鼠的出生率。

在其他实施例中，也可以通过将CMV载体通过显微注射注射入小鼠受精卵的雄原核中，然后将处理后存活的胚胎进行胚胎移植。胚胎经处理后，可能的效果包括：1)删除了一条X染色体：雌性胚胎变成XO型，有可能出生；雄性胚胎变成OY型胚胎，胚胎死亡；2)删除了两条X染色体，胚胎死亡；3)没有删除X染色体，出生后代性别比例1:1。因此，胚胎经处理后再进行胚胎移植，可以提高雌性小鼠的出生率。其中，CMV载体显微注射的浓度可以为5-100ng/μL。

在其他实施例中，对哺乳动物X染色体进行基因编辑的方法不仅限于利用CRISPR/Cas9系统进行特异性切割，还可以为RNA干扰、同源重组、基因敲出及插入等其他能对基因进行编辑的技术。

在其他实施例中，X染色体上的基因编辑的靶基因不仅限于X-B和X-D片段，还可以为其他任何X染色体上的多拷贝基因。

实验一、sgRNA X-B和sgRNA X-D介导Cas9蛋白在体外切割靶序列的效率验证

(1)根据靶位点X-B和X-D的核苷酸序列分别对应设计引物，以MLTC-1细胞的DNA为模板，通过PCR扩增，得到靶片段X-B和靶片段X-D；其中，相应的PCR引物如表3所示。

表3 靶片段扩增引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		X-B-F	TGAGTACTTGGTTAGGGTGAGC
X-B-R	TGGAAGTCTCTGGCATA
		X-D-F	AAGGTTCCCAATGGTCACAGG
X-D-R	ACCATACCATGGTTTTCCCCA

(2)将构建好的CMV载体菌液扩大培养后抽提质粒，用该质粒作为模板，使用表4中的引物进行PCR扩增，得到sgRNA X-B体外转录模板和sgRNA X-D体外转录模板；然后使用GeneArt^TM Precision gRNA Synthesis Kit(Life)试剂盒获得体外转录的sgRNA X-B和sgRNA X-D；

表4 sgRNA体外转录模板扩增引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		sgRNA X-B-F	TAATACGACTCACTATAGGGGCTTGGTTAGGGTGAGTGCT
sgRNA X-B-R	AAAAGCACCGACTCGGTGCC
		sgRNA X-D-F	TAATACGACTCACTATAGGGTAAGTGCTGTGTGCTGCTAC
sgRNA X-D-R	AAAAGCACCGACTCGGTGCC

(3)配制反应体系：体外转录的sgRNA 50ng，Cas9 enzyme 1μL，10xCas9 Reactionbuffer 2μL，Nuclease-free water 15μL

(4)将配制好的反应体系混合均匀，于37℃金属浴放置15min后，加入相应的靶片段，轻轻吹打混匀后，继续孵育1h；最后在反应体系中加入2μL蛋白酶K再次孵育20min；

(5)结束反应后将全部的反应产物进行2％琼脂糖电泳，以等量(100ng)的质粒做对照，使用凝胶成像系统分析其体外切割结果，如图4所示。

将成像结果进行灰度分析，结果显示sgRNA X-B和sgRNA X-D分别介导的Cas9蛋白对其靶序列的切割效率分别为60％和75％，表明两个sgRNA介导的CRISPR/Cas9系统均具有较高的切割效率。

实验二、MLTC-1细胞转染CMV载体实验

实验以MLTC-1细胞转染CMV载体为实验组，转染空载体组作为对照组。使用LONZAAmaxa Nucleofector2b细胞核电转仪配合试剂盒进行电转染，转染程序为U-023，质粒用量为15μg每孔。出于对质粒转染到细胞内后进行转录、翻译需要时间的考虑，本实验以12h为间隔，使用倒置显微镜观察两组细胞，并对不同时间段的细胞使用白光和荧光两种模式拍照记录，如图5所示。结果显示，转染48小时后，转染CMV载体组的绿色荧光细胞明显减少。

另外，为了能够更直观的展现绿色荧光细胞比例的变化，在荧光拍照后收集细胞进行流式细胞仪分析。收集细胞操作过程为：首先用0.25％的胰酶消化六孔板细胞1min，然后用移液器轻轻吹落细胞并转移至15mL的离心管中，经800rpm/min、5min离心后，弃上清，收集细胞。将收集的细胞进行流式细胞仪分析，结果如图6所示。

由图6的结果可知，两组的绿色荧光细胞比例均在转染后约48小时达到最大值，到转染后60小时，转染CMV载体的实验组绿色荧光细胞比例下降37.5％，转染空载体的对照组绿色荧光细胞比例仅下降1.5％，两组对比差异显著。这表明，CMV载体转染雄性小鼠细胞后可切割部分转染细胞的X染色体，使X染色体失活，OY基因型的细胞不能存活，致使绿色荧光细胞比例大大减少。

实验三、CMV载体对雄性小鼠细胞的X-B靶位点突变效率检测

由于sgRNA X-D的靶位点在X染色体上分布十分分散，故本次实验主要检测了转染CMV载体后MLTC-1细胞基因在X-B位点上的突变情况。

根据实验二中的细胞转染方法用CMV载体转染雄性小鼠细胞MLTC-1，将转染后的细胞悬液稀释到合适浓度，均匀铺在10cm细胞培养皿中培养数天，待到一个细胞团在显微镜40×倍视野中细胞个数约为6个且周围无杂细胞时挑取单克隆细胞团，将其转移至48孔板中培养，而后依据细胞生长情况一次传代至12孔板、6孔板、6cm细胞培养皿中，直至细胞长满6cm细胞培养皿，便可收集细胞提取其DNA。设计及合成引物X-B mutation-F:5’-GCATGCTTGGTTAGGGTGAGTT-3’；X-B mutation-R：5’-GCTGGAAACCCAAGCAC-3’对X-B的部分靶位点进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，纯化后进行TA克隆，将X-B的靶位点片段克隆到pEASY-T5 Zero克隆载体中；经大肠杆菌感受态转化后，获得的菌液送华大基因公司使用通用引物M13进行测序；将测序结果与靶片段的理论序列进行比对，寻找突变位点。

本实验共挑取192个单克隆细胞团，检测了其中36个克隆细胞的突变情况，在其中4个单克隆细胞团寻找到突变位点，测序比对结果如图7所示。结果表明，CMV载体对雄性小鼠细胞X-B靶位点的突变率约为11.1％，突变类型以点突变为主。

由于基因组的自我修复机制，CMV载体即使对部分转染后的细胞X染色体进行了切割，该细胞也可能被成功修复而存活下来，但这部分细胞的基因很可能在靶位点附近形成突变。CMV载体对X-B靶位点的突变率检测结果，表明CMV载体在小鼠细胞中发挥对靶位点的切割作用，其中，对X-B靶位点的突变率为11.1％。由于(1)部分细胞的X染色体被切割后失活，由于OY基因型的细胞不能存活，细胞死亡，无法检测突变率；(2)实验仅检测了CMV载体对X-B靶位点的突变率，未检测CMV载体对X-D的突变率；因此，转染后的细胞X染色体实际的突变率是高于11.1％的。

结合转染后细胞致死性与靶位点突变率的结果分析，可知CMV载体可以对小鼠X染色体进行有效切割，并有较大机率失活X染色体，切割效率高，脱靶率低。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 对X染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法

<130> 2020

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gcttggttag ggtgagtgct tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

taagtgctgt gtgctgctac tgg 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcttggttag ggtgagtgct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

taagtgctgt gtgctgctac 20

<210> 5

<211> 1024

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

acgcgtcgtc gacgataact tcgtatagca tacattatac gaagttattg tacaaaaaag 60

caggctttaa aggaaccaat tcagtcgact ggatccggtc acaaggtcgg gcaggaagag 120

ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 180

attggaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 240

taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg 300

cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga 360

aacaccggct tggttagggt gagtgctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 420

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 480

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 540

aaatggctct agagagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa 600

ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa 660

tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa 720

aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat 780

cttgtggaaa ggacgaaaca ccgtaagtgc tgtgtgctgc tacgttttag agctagaaat 840

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 900

tttttgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt ttagcgcgtg 960

cgccaattct gcagacaaat ggataacttc gtataaagta tcctatacga agttatggcc 1020

ggcc 1024

Claims (10)

1.对X染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法，其包括：

筛选并选择哺乳动物X染色体上的一个或多个多拷贝基因作为靶位点，设计对应的sgRNA；

构建靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统；

将靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统转染或显微注射进精子中，或显微注射进哺乳动物受精卵的雄原核中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述作为靶位点的多拷贝基因为两个。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构建靶向X染色体多拷贝基因的CRISPR/Cas9表达系统包括：将两个多拷贝基因对应的sgRNA一起构建至能表达Cas9蛋白的载体上得到共表达载体。

4.对X染色体多拷贝基因进行编辑实现小鼠性别控制的方法，其包括：

以小鼠X染色体上的X-B位点和X-D位点作为靶位点，设计对应的sgRNA，其中，所述X-B位点的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述X-D位点的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

构建靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统；

将靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统转染或显微注射进小鼠精子中，或显微注射进小鼠受精卵的雄原核中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述X-B位点对应的sgRNA为sgRNA X-B，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述X-D位点对应的sgRNA为sgRNAX-D，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述构建靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统包括：

设计并合成具有如下结构的基因片段：酶切位点I-loxP-启动子-sgRNA X-B-启动子-sgRNAX-D-loxP2272-酶切位点II；

将上述基因片段构建至能表达Cas9蛋白的载体上得到共表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子选自CMV、CAG、U6、CBh中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶切位点I为MluI，所述酶切位点II为FseI，所述能表达Cas9蛋白的载体为以VP12-SpCas9-HF1载体为基本骨架的表达载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述能表达Cas9蛋白的载体还包括EGFP荧光基因和Neo标记基因的基因片段。

10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，将靶向X-B位点和X-D位点的CRISPR/Cas9表达系统显微注射入小鼠受精卵的雄原核中时，所述共表达载体显微注射的浓度为5-100ng/μL。

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