CN113234758B - 利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法。本发明利用受体基因组天然的“TTAA”四联体序列，以及修复模板上携带的PiggyBac转座酶的识别序列，将基因打靶过程中引入的选择标记基因删除，实现无残留的基因编辑，从而彻底消除生物安全隐患。由此可见，采用本发明所述PiggyBac转座酶系统能实现“无痕”打靶，解决了现有技术无法克服的瓶颈。而且本发明将CRISPR/Cas9和PiggyBac两个技术联合使用能够实现保真度100％的基因突变和无残留基因编辑，是目前生物安全技术水平最高的方法。

Description

利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法。
背景技术
基因打靶技术发展至今已有40余年。回溯其发展历史，基因打靶技术可分为两个阶段。一是传统基因打靶，最初是基于胚胎干细胞的体外培养，通过同源重组修复方式将外源基因靶向受体基因组特点位点，实现内源基因的定点敲除及外源基因的定点表达，其缺点是打靶效率低下，同时也会引入外源标记基因，这对于畜禽育种不利。二是CRISPR/Cas9介导的基因打靶技术，该类技术在精准性和效率方面，产生了质的飞跃。即利用CRISPR/Cas9引发基因组DNA的双链断裂，通过细胞的自身修复机制实现外源基因的定点整合，但该过程中容易产生核苷酸片段的随机插入、缺失或突变等，同样也会引入无法删除的外源标记基因。考虑到无意义的外源基因片段会给生物安全带来隐患，科研家研发了一种删除标记基因的工具，即利用CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用，将loxP瞄定在标记基因两侧。在得到阳性细胞后，Cre重组酶特异识别loxP位点并删除标记基因。该技术一方面可实现高效的基因打靶，另一方面也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而，筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列，严重影响外源基因表达的效率，甚至造成移码突变，给基因打靶相关的研究带来极大难题，同时在生物安全及伦理层面仍然存在一定的局限性。要突破这一瓶颈，研发“无痕”打靶技术成为当务之急。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法。采用本发明所述PiggyBac转座酶系统能实现“无痕”打靶，解决了现有技术无法克服的瓶颈。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了PiggyBac转座酶系统在构建无痕工程动物中的应用。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将PCR扩增的标签基因插入第一载体，得初级载体；
(2)PCR扩增动物基因组的左右臂，将PCR扩增得到的左臂和右臂插入初级载体，得到第一重组载体；
(3)将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；
(4)将PCR扩增的目标基因插入第二载体，得第二重组载体；
(5)将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；
(6)将胚胎移植至母猪，得到工程动物；
步骤(3)和步骤(4)没有时间先后顺序。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程猪的方法，包括以下步骤：
a、将PCR扩增的IGFⅠ插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体；
b、PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，扩增得到将左臂插入初级载体的EcoRⅠ和NsiⅠ位点，将扩增得到右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体；
c、将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；
d、将PCR扩增的pbase插入pcDNA3.1的EcoRⅠ和XhoⅠ之间，得第二重组载体；
e、将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；
f、将胚胎移植至母猪，得到工程猪；
步骤c和步骤d没有时间先后顺序。
优选的，步骤a所述PCR扩增的上游引物PB-IGFm-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物PB-IGFm-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环。
优选的，当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT1-LAF1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PBT1-LAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT3-RAF2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物PBT3-RAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选的，当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；
当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。
优选的，步骤d所述PCR扩增的上游引物pbase-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物pbase-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
优选的，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸110s，30个循环。
优选的，步骤c所述共转染的方式为电转染。
有益效果：本发明提供了PiggyBac转座酶系统在构建无痕工程动物中的应用。本发明利用修复模板上携带的PiggyBac转座酶的识别序列，将基因打靶过程中引入的选择标记基因删除，实现无残留的基因编辑，从而彻底消除生物安全隐患。由此可见，采用本发明所述PiggyBac转座酶系统能实现“无痕”打靶，解决了现有技术无法克服的瓶颈。
而且，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程猪的方法，包括以下步骤：将PCR扩增的IGF插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体；PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，将左臂插入初级载体的EcoRⅠ和NsiⅠ位点，将右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体；将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；将PCR扩增的pbase插入pcDNA3.1的EcoRⅠ和XhoⅠ之间，得第二重组载体；将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；将胚胎移植至母猪，得到工程猪。本发明利用CRISPR/Cas9系统将猪MSTN基因的转录区切除，利用PB-IGFⅠ载体作为供体DNA，通过同源重组修复方式可以将猪MSTN转录区基因组置换为目标基因组，最后通过pbase酶将两个“TTAA”位点间的基因序列删除，实现外源基因的无痕置换，制备出基因工程猪，即本发明将CRIPSR/cas9与修复模板(repairtemplate)用于基因打靶，能够实现保真度为100％的基因突变，利用所述CRISPR/Cas9系统定点切割基因组，通过同源重组修复方式将目的DNA片段敲除，完成有痕打靶；利用修复模板上携带的PiggyBac转座酶的识别序列，将基因打靶过程中引入的选择标记基因删除，实现无残留的基因编辑，从而彻底消除生物安全隐患。在本发明具体实施中，采用此方法完成了猪IGFⅠ基因与MSTN基因的“无痕全置换”。由此可见，本发明所述的内源和外源DNA“全置换”的无痕基因编辑技术；采用本发明所述方法打靶效率高，不会引入外源标记基因，有利于生物育种，而且本发明所述方法不会影响外源基因表达的效率和移码突变，对生物安全；并且PiggyBac转座酶系统包括PB-IGFⅠ陷阱载体，即包括5020bp的DNA序列，该序列中包括两端的“TTAA”位点、IGFⅠ的截短型CDS序列，位于3’端“TTAA”的右侧，而5’端的“TTAA”位点为猪MSTN的天然位点，位于MSTN基因启动子上游的-5bp～8bp之间(Sscrofa11.1：Chr15：94628571～94628575)，3’端“TTAA”为人工引入位点，后面紧跟IGFⅠ的CDS区，Piggybac介导无痕删除后，将残留一个“TTAA”识别基序。而该基序，恰好为猪MSTN启动子区域的天然序列。由此完成了IGFI的无痕敲入，确保了IGFI编码区无缝接入MSTN转录调控元件，形成“基因陷阱”；同时保真度可达到100％，精准可控可预测，可以实现任意位点的基因定点无痕敲入。本发明所述方法在本实施例的成功运用，创立了“基因陷阱”生物育种新方法，即将特定经济性状的正调控基因置换该性状的内源负调控基因，利用负调控基因的顺式作用元件“诱导”正调控基因表达，取得“事半功倍”之效，最终获得目标性状突出的生物新种质。由此可见本发明所述方法将为生物育种提供新策略，也为培育突破性品种提供有力的技术支撑。
附图说明
图1为技术路线示意图；
图2为PB-IGFⅠ打靶载体骨架示意图及酶切验证，其中(1)为PB-IGFm载体骨架，(2)为PB-IGFm载体的酶切验证，M为1kb的DNAladder，PB-IGFⅠ为载体名称；
图3为pcDNA3.1-Pbase载体骨架示意图及酶切验证，其中(1)为pcDNA3.1-Pbase载体骨架，(2)为pcDNA3.1-Pbase载体的酶切验证，M为1kb DNAladder，+为代表有，-为代表无；
图4为PCR检测单克隆，其中M为markerDL5000，+为阳性对照，5’端阳性1385bp，3’端阳性1448bp。
图5为基因打靶概率分布情况；图6为17#克隆测序结果；
图7为IGFⅠ基因敲入35日龄胎猪成纤维细胞(含标记基因)；
图8为35日龄基因工程胎猪Southern Blotting基因分型；
图9为置换后WB检测MSTN表达水平；
图10为PCR鉴定删除效率(混合细胞)，其中(1)为删除效率的PCR检测结果，M为DNAladder 2000，NC1为扩增模板为ddH2O，NC2为将MSTN置换为IGFⅠ后的样品(含标记基因)，sample1为转染pbase载体两次的样品，sample2为转染pbase 1次和流式分选后的样品，sample3为转染pbase 1次的样品，++为进行两次转染pbase，+为进行一次转染pbase，-为没有处理；(2)为对(1)中各个处理组样品的灰度分析，横坐标为样品名称，纵坐标为(1)中各个处理组样品的平均值；
图11为PCR检测单克隆基因型，其中M为DNAladder 2000，1#、5#、7#、8#、24#、29#、31#、33#、36#、38#为筛选出来的单克隆样品，混合1、混合2、混合3为转染pbase后的样品(未进行单克隆筛选)，W为将MSTN置换为IGFⅠ后的样品(含标记基因)；
图12为31#阳性单克隆测序部分图；
图13为原代“全置换”基因工程猪照片(无痕删除)；
图14为PCR检测原代“全置换”基因工程猪基因型，其中M为DL2000，1为水，2为置换后删除标记基因前的样本，3为删除标记基因后，未挑取单克隆前的混合样品，4～6为无痕编辑猪“IGFⅠ001、IGFⅠ002、IGFⅠ003”样本；
图15为原代“全置换”基因工程猪代表性测序结果(IGFⅠ002号样本)。
具体实施方式
如无特殊要求，本发明采用的试剂均为本领域技术人员常规购买所得。
本发明提供了PiggyBac转座酶系统在构建无痕工程动物中的应用。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程动物的方法，包括以下步骤：
(1)将PCR扩增的标签基因插入第一载体，得初级载体；
(2)PCR扩增动物基因组的左右臂，将PCR扩增得到的左臂和右臂插入初级载体，得到第一重组载体；
(3)将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；
(4)将PCR扩增的目标基因插入第二载体，得第二重组载体；
(5)将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；
(6)将胚胎移植至母猪，得到工程动物；
步骤(3)和步骤(4)没有时间先后顺序。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程猪的方法，包括以下步骤：
a、将PCR扩增的IGFⅠ插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体；
b、PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，将扩增得到左臂插入初级载体的EcoRⅠ和NsiⅠ位点，将扩增得到右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体；
c、将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；
d、将PCR扩增的pbase插入pcDNA3.1的EcoRⅠ和XhoⅠ之间，得第二重组载体；
e、将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；
f、将胚胎移植至母猪，得到工程猪；
步骤c和步骤d没有时间先后顺序。
本发明PCR扩增IGFⅠ插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体。在本发明中，所述的IGFⅠ的GENE ID:3479所述PCR扩增的上游引物PB-IGFm-F1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：gccaccATGGGACCTGAGACCC；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点BsiWⅠ；所述PCR扩增的下游引物PB-IGFm-R1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：GAGACcctaggCCGACTTGGCAGGC，其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点AvrⅡ；所述PCR扩增的扩增程序优选包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30S，72℃延伸20S，30个循环；所述PCR扩增的体系以25μl计，优选包括：10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl。
本发明PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，将扩增得到左臂插入初级载体的EcoRⅠ和NsiⅠ位点，将扩增得到右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体。
本发明当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT1-LAF1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示：gaattcCTGGAAATCTGAGGCAAACTGC；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点EcoRⅠ；所述PCR扩增的下游引物PBT1-LAR2的核苷酸序列优选如SEQID NO.4所示：atgcatAATCAATACAATCTTTCTCCTTG；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点NsiⅠ；所述PCR扩增的扩增程序优选包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环；所述PCR扩增的体系以25μl计，优选包括：10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl。
本发明当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT3-RAF2的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示：cctaggGATTTATATTTGGTTCATTACTTCC；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点AvrⅡ；所述PCR扩增的下游引物PBT3-RAR1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示：AGCTggtaccGCAGTTTCTCCAAGTATGC；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点KpnⅠ；所述PCR扩增的扩增程序优选包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；所述PCR扩增的体系以25μl计，优选包括：10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl。在本发明中，所述猪MSTN基因的右臂优选为猪MSTN基因3′下游非翻译区；所述猪MSTN基因的左臂优选为猪MSTN基因5′上游非翻译区。
本发明将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞。本发明所述T11和T31已经公开于“ISOZYGOUS AND SELECTABLE MARKER-FREE MSTNKNOCKOUT CLONED PIGS GENERATED BY THE COMBINED USE OF CRISPR/CAS9 AND CRE/LOXP”(PMID:27530319)。本发明对所述T11和T31已经公开于《Isozygous and selectablemarker-free MSTN knockout clonedpigs generatedbythe combined use ofCRISPR/Cas9 and Cre/LoxP》(网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4987667/)，本发明对所述T11和T31的来源没有特殊限定。
在本发明中，当所述纤维细胞的汇合度达到90％时优选进行共转染；所述共转染的方式优选为电转染；所述电转染的电压优选为100V；所述电转染的脉冲时间优选为4ms；所述脉冲的次数优选为1次。
本发明所述共转染前，优选将所述纤维细胞优选在DMEM(含10％胎牛血清、1％双抗)培养基培养；所述培养的时间优选为24h；温度优选为39℃。
本发明将PCR扩增的pbase插入PCDNA3.1的EcoRⅠ和XhoⅠ之间，得第二重组载体。在本发明中，所述PCR扩增的上游引物pbase-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示：GgaattcCATGGGCAGCAGCCTGGACGAC；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点EcoRⅠ；所述PCR扩增的下游引物pbase-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示：CctcgagGAGAAACAGCTCTGGCACATGTC；其中小写带有下划线的部分优选为酶切位点XhoⅠ；所述PCR扩增的扩增程序优选包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸110s(即1’50s)，30个循环；所述PCR扩增的体系以25μl计，优选包括：10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl。
本发明将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎。在本发明中，当所述第一纤维细胞的汇合度达到90％时优选进行转染；所述转染的方式优选为电转染；所述电转染的电压优选为130V；所述电转染的脉冲时间优选为4ms；所述脉冲的次数优选为1次；电转染时，所述第二重组载体的用量优选为3μg/孔。
本发明所述转染前，优选将所述第一成纤维细胞优选在DMEM(含10％胎牛血清、1％双抗)培养基培养；所述培养的时间优选为24h；温度优选为39℃。
在本发明中，所述核移植的方式优选包括以下步骤：将母猪脱去卵丘的卵母细胞进行重组，得重组胚；将重组胚进行融合激活和培养，得胚胎；所述重组的方式优选为用固定吸管吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质后，将转染后所得受体细胞从去核切口注入卵周间隙。
在本发明中，所述固定吸管的内径优选为25～30μm；所述固定吸管的外径优选为100～120μm；所述受体细胞优选为直径20～30μm、圆形且光滑的受体细胞。
本发明所述重组前，优选将所述母猪脱去卵丘的卵母细胞和受体细胞进行平衡处理；所述平衡处理的溶液优选为操作滴液；所述操作滴液的组分优选包括M199 Hank’s+7.5μg/ml CB+0.1％BSA；所述平衡的时间优选为15min；所述平衡的温度优选为39℃；所述平衡的湿度优选为100％；平衡处理时，CO2的体积百分含量优选为5％。
本发明所述融合激活前，优选还包括对重组胚进行恢复培养，得到恢复重组胚；所述恢复培养的培养液包括NCSU-23和BSA；所述NCSU-23的用量优选为50μl/滴；所述BSA的浓度优选为4mg/mL；所述BSA的用量优选为2mg；所述恢复培养的时间优选为0.5～1h；所述恢复培养的温度优选为39℃；所述恢复培养的湿度优选为100％；恢复培养时，CO2的体积百分含量优选为5％。
本发明所述恢复培养后，优选还包括对所述恢复重组胚进行平衡处理，得平衡重组胚；所述平衡处理的溶液优选为融合液；所述融合液的组分优选包括0.3M甘露醇+1.0mM氯化钙+0.1mM氯化镁；所述平衡的时间优选为2min；所述平衡的温度优选为25℃；所述平衡的湿度优选为50％～70％，更优选为57％～68％；平衡处理时，CO2的体积百分含量优选为5％。
本发明所述融合激活前，优选还包括对平衡重组胚进行清洗，得到清洗重组胚；所述清洗的次数优选为3～5次；所述清洗的溶液组分优选为0.3M甘露醇+1.0mM氯化钙+1.0mM氯化镁+0.1％PVA聚乙烯醇。
在本发明中，所述融合激活的方式优选包括以下步骤：将所述清洗重组胚进行电击，得电击重组胚；所述电击的时间优选为60μs；所述电击的强度优选为1.2kV/cm；所述电击的脉冲次数优选为2次。
本发明所述溶液激活后，优选还包括对所述电击重组胚进行清洗，得清洗电击重组胚；所述清洗的清洗液优选包括NCSU-23和BSA；所述NCSU-23的用量优选为500μl；所述BSA的浓度优选为4mg/mL；所述BSA的用量优选为2mg；所述清洗的次数优选为5次。
本发明将所述清洗电击重组胚进行培养，得胚胎；培养时，所用培养液的组分优选包括PZM-3BASE和BSA；所述PZM-3BASE的用量优选为100mL；所述BSA的浓度优选为0.3％，用量优选为0.3g；所述培养的时间优选为0.5～1h后进行胚胎移植；所述培养的温度优选为39℃；所述培养的湿度优选为100％；培养时，CO2的体积百分含量优选为5％。
本发明将胚胎移植至母猪，得到工程猪。本发明对所述移植的方式没有任何特殊限定，采用本领域人员所熟知的方式即可，在本发明具体实施例中，优选在母猪输卵管深部移植，每头受体移植约300枚胚胎。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照图1的技术路线进行操作
1、CRIPR/Cas9系统介导双链断裂后置换基因。
(1)载体构建：PB-IGFm、pcDNA3.1-Pbase载体构建。具体实施如下：
PB-IGFm质粒构建：
①先将IGFⅠ克隆到PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，上游引物：PB-IGFm-F1如SEQ ID No.1所示；下游引物PB-IGFm-R1如SEQ ID No.2所示；扩增产物长度为250bp；
PCR反应体系为10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD1μl，最后加ddH2O补足至25μl；PCR反应条件为：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，56℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环。
将所得PCR产物进行纯化后，进行连接，连接方式为纯化后的PCR产物3μl采用SolutionⅠ6μl，16℃连接8h，得初级载体，最后4℃保存。
②再将猪MSTN基因的左臂构建到初级载体的EcoRⅠ和NsiⅠ位点之间；左臂上游引物PBT1-LAF1如SEQ ID No.3所示；左臂下游引物PBT1-LAR2如SEQ ID No.4所示；
产物长度为1000bp；
PCR反应体系为10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl；PCR反应条件为：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。
将所得PCR产物进行纯化后，进行连接，连接方式为纯化后的PCR产物3μl采用SolutionⅠ6μl，16℃连接8h，最后4℃保存。
③最后将猪MSTN基因的右臂构建到第二步得到载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，右臂上游引物PBT3-RAF2如SEQ ID No.5所示；右臂下游引物PBT3-RAR1如SEQ ID No.6所示；扩增产物长度：755bp；
PCR反应体系为10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl；PCR反应条件为：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，56℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环。
将所得PCR产物进行纯化后，进行连接，连接方式为纯化后的PCR产物3μl采用SolutionⅠ6μl，16℃连接8h，得第一重组载体，命名为PB-IGFm，最后4℃保存。
因载体较大，故在酶切验证时，设置了2个PB-IGFⅠ载体骨架。结果如图2所示，采用NotⅠ对其进行酶切处理，37℃孵育2h，得到目的片段为2777bp，说明验证结果正确。
pcDNA3.1-Pbase构建：
将pbase克隆到pcDNA3.1的EcoRⅠ位点和XhoⅠ位点之间，上游引物pbase-F如SEQID No.7所示；下游引物pbase-R如SEQ ID No.8所示；扩增目的长度为：1832bp。
PCR反应体系为10×Buffer2.5μl，dNTP(Mg2+)2μl，上下游引物各1μl，模板1μl，DNA聚合酶KOD 1μl，最后加ddH2O补足至25μl；反应条件为：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，56℃退火30s，72℃延伸1、50s，共30个循环。
将所得PCR产物进行纯化后，进行连接，连接方式为纯化后的PCR产物3μl，pcDNA3.1载体用EcoRⅠ和XhoⅠ线性化并纯化后的产物1μl，SolutionⅠ6μl，共计10μl体系。置于16℃孵育8h，得第二重组载体，最后4℃保存。
酶切的试验步骤：将构建好的pcDNA3.1-Pbase重组载体取500ng，加入EcoRⅠ和XhoⅠ各1μl，10×Buffer 2μl，最后用水补足至20μl，37℃孵育2h后即可。结果如图3所示，采用EcoRⅠ和XhoⅠ对其进行酶切处理，37℃孵育2h，得到目的片段为1831bp，酶切验证结果正确。
(2)T11、T31和PB-IGFm质粒共转染大白猪成纤维细胞：采用DMEM培养基(含10％胎牛血清、1％双抗)培养细胞。当细胞汇合度达到90％时，收取细胞至电转杯中进行电转，电穿孔条件为100V 4ms 1次脉冲。
(3)单克隆筛选及PCR鉴定：电转24h以后进行换液处理，待细胞汇合度再次达到90％后，在培养基中加入不同浓度的G418进行筛选，浓度为：
100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml。
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3～5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后扩大培养并收取细胞提取基因组DNA。
采用巢式PCR方法对挑取的82个单克隆中筛选出的9、14、17、27、37、38、41、45、49、62、73、81、82号(#)共14个单克隆的5、端和3、端进行检测。5’端上游检测上游引物T1-UP：CTGGAAATCTGAGGCAAACTGC(SEQ ID No.9)，下游检测下游引物MKR：GGGCTATGAACTAATGACCCC(SEQ ID No.10)，目的片段为1385bp，反应条件为：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，56℃退火30s，72℃延伸1’20s，共30个循环；反应体系为r-taq mix12.5μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl，最后加ddH2O补足至25μl；最后4℃保存。3’端上游检测上游引物EGFP-QF2：AAATGAATGCAATTGTT GTTG(SEQ ID No.11)，下游检测下游引物T2-down：GCCTGCCTTTGCAACACTGCAG(SEQ ID No.12)，目的片段为1448bp。反应条件同5’端一致；反应体系为r-taqmix12.5μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl，最后加ddH2O补足至25μl。结果如图4所示，5’端检测到的阳性样品有：14#、17#、81#、82#共4个样品，3’端检测到的阳性样品有：14#、17#、45#、81#、82#共5个样品。
对打靶概率分布进行分析，结果如图5所示，纯合阳性为：14#、17#、81#、82#，占比18％。
对17#样品进行测序，结果如图6所示，结果与目标序列一致。
(4)核移植，将筛选获得的单克隆细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴(组分为M199 Hank’s+7.5μg/ml CB+1％FBS)，39℃，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜(DM2500，Leica)上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，显微从去核切口注入卵周间隙，操作30～40个卵后，将重构胚转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，其中NCSU-23的用量为500μl，BSA的用量为2mg，在39℃，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，得恢复重组胚，最后对完整的存活的恢复重组胚进行激活操作。
重组胚的融合激活：将恢复好的重构胚(恢复重组胚)分批转移到融合液(组分为0.3M甘露醇+1.0mM氯化钙+1.0mM氯化镁)中平衡2min，清洗3～5遍后，其中清洗所用溶液的组分为0.3M甘露醇+1.0mM氯化钙+0.1mM氯化镁+0.1％PVA聚乙烯醇每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加一个60μs，1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击获得的电击重组胚用NCSU-23+4mg/ml BSA洗涤5遍，其中NCSU-23的用量为500μl，BSA的用量为2mg，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液(组分为100mL PZM-3BASE+0.3g 0.3％BSA)中，在39℃、5％CO2、100％湿度下培养0.5～1h后，采用自制拨卵针在显微镜下判定克隆胚胎的融合情况。
(5)胚胎移植和妊娠检测：克隆胚胎体外培养1～2d后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约300枚胚胎。胚胎移植后，对未返情的受体于28～30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至克隆猪出生。
2、转IGFⅠ基因胎猪(含标记基因)初步鉴定。
(1)胎猪成纤维细胞分离及冻存。
移植后经超声波检测受孕母猪妊娠情况，选取受孕成功的母猪，在受孕后5周(35日)从母猪子宫内取出胎儿，至于无菌环境下操作，去除头部、内脏及四肢，将组织块剪碎后均匀接种在6孔板中，放入39℃、5％CO2培养箱中倒置培养2h，随后加入适量含1％双抗的培养基中培养，并根据生长情况更换培养基(DMEM，含10％FBS，1％双抗)，待细胞从组织块中爬出后，除去组织块，用PBS清洗3遍后用0.25％胰酶消化并传代扩大培养，待细胞汇合度达到100％(图7，该细胞是由5周龄的胎猪中分离得到，且含有标记基因)时收取细胞冻存。
细胞冻存：细胞长满后除去培养基，用PBS清洗3遍，随后每孔(6孔板)加入300μl的0.25％胰酶消化细胞3min，待细胞变圆后加入含血清的培养基终止消化，并用移液枪进行吹打使细胞从培养板上脱落，收集细胞2500rpm离心2min，除去上清，加入细胞500μl冻存液(含10％DMSO、20％FBS和70％DMEM)，最后采用程序降温法将细胞冻存并转移至液氮中。
(2)Southern Blotting鉴定胎猪样品基因型。
采用Southern印迹杂交法分析外源基因整合情况。实验方法：PCR检测分离得到的胎猪样品基因组DNA各取15μg，苯酚抽提1次，氯仿/异戊醇抽提1次，加2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。-20℃冷冻后离心取沉淀，70％乙醇洗沉淀一次。DNA样品抽真空干燥，加20μlddH2O溶解，用10μl限制性内切酶XbaⅠ(100IU)37℃消化6h，消化样品抽真空浓缩到15μl备用。用PCR法扩增目的基因530bp片段，PCR反应体系为：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μl，Taq酶1μl(1U)，1μl 10μmol/L上游引物Right-F：CAAGCGACAG TATATGAACT(SEQ ID No.13)，1μl10umol/L下游引物Right-R：GCACCTGAAGAAA GGAGAAC(SEQ ID No.14)，4×2.5mmol/L，2μldNTPs，150ng DNA样品，加ddH2O至25μl总体积。PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30次循环反应；72℃5min，最后4℃保存。回收纯化530bp扩增片段产物作为Southern印迹杂交探针，检测使用罗氏公司地高辛标记核酸检测试剂盒完成。样品用0.9％琼脂糖凝胶电泳，碱变性、中和处理。盐桥吸印法核酸转膜24h，120℃烤膜30min。尼龙膜42℃进行预杂交1h、杂交20h，68℃水浴洗膜。室温封阻尼龙膜、结合抗体、洗抗体，在暗室避光进行显色反应23h，观察记录杂交带结果。阳性猪杂交带为5014bp，只出现6647bp为野生型条带则为阴性猪，若杂交结果同时出现两条带则为杂合子。结果如图8所示，共检测了8头猪仔，其中2、4、5、7号(#)样品为纯合子，1、3、6、8号样品为杂合子。本发明选取2号样品猪作为删除标记基因对象。
(3)WB检测MSTN表达量变化。
样品准备：选取2#、4#、5#、7#纯合样品作为检测对象，将其细胞样品和野生型大白猪细胞接种至6孔板中，当汇合度达到100％时，去除培养基，用预冷的DPBS清洗3遍。每孔加入100ul的RIPA裂解液置于冰上裂解20min。随后收取上清在高速冷冻离心机中离心，12000rpm，4℃，5min，随即用BCA试剂盒测蛋白浓度。将测好浓度的蛋白按4：1加入蛋白上样缓冲液,置于100℃水浴中煮沸10min。
SDS-PAGE电泳：制作10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，将准备好的野生型样品和待测样品加到胶中进行电泳，80v，30min。待蛋白样品跑过浓缩胶后更换电压至100v，90min，直至溴酚蓝跑到凝胶最底端即可进行下一步。转膜：取出凝胶，准备大小适当的PVDF膜(用前在甲醇中侵泡激活1min)，采用两层海绵4张滤纸将切好的凝胶和PVDF膜固定，置于电转仪中电转，
200mA2h。
封闭-抗体孵育及显色：取出PVDF膜，置于5％脱脂奶粉中封闭2h，随后用TBST清洗3遍后进行抗体孵育，最后用ECL显色液显色，并用曝光设备采集最后数据。
结果如图9所示：2#、4#、5#、7#纯合样品MSTN表达量相比于野生型样品显著降低，该结果说明本发明成功失活了MSTN基因，也从侧面印证了上一步Southern blotting的试验结果。
对sample1、sample2和sample3进行灰度分析，分别对3个样品采用不用的处理方法，结果如图10所示，在所有混合样品中，转入Pbase后在经过流式分选(sorting)得到的样品删除效率最高，达到了62％，其余两个样品均达到了40％以上，平均效率为43.2％，说明piggyback转座酶系统可以高效的删除目标序列，而且总体而言删除效率较高，这同时为后期大比例稀释挑单克隆的成功率提供可操作性。
3、PiggyBac转座酶系统介导标记基因无痕删除。
(1)pcDNA3.1-Pbase质粒转染及单克隆筛选。
根据Southernblotting杂交结果，本发明选取2#纯合子作为试验对象。将2#样本接种至6孔板中培养，同时准备质粒pcDNA3.1-Pbase，待汇合度达到90％时，收取细胞进行电转(参数为：130v，1ms，1次脉冲，质粒3μg/孔)。电转24h后进行换液处理，待细胞恢复生长后收取细胞，进行稀释接种到6孔板中进行培养。当单个细胞长出新生细胞团后，将该细胞团进行扩大培养，最后提取基因组DNA进行PCR检测。
(2)单克隆检测及测序鉴定。
PCR检测上游引物为：IGF-CS-F：5’-TGAATCAGCTCACCCTTGACTGT-3’(SEQ IDNo.15)；下游引物为：IGF-CS-R：5’-CAGGCATGTAGCCTGTGGTACATA-3’(SEQ ID No.16)；Neo-Rv：5’-ATTGCATCAGCCATGATGGATAC-3’(SEQ ID No.17)，产物分别为612bp和1616bp(Neo-Rv)。PCR反应体系为r-taq mix12.5μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl，最后加ddH2O补足至25μl；PCR反应条件：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，58℃退火30s，72℃延伸1’20s，共30个循环，最后4℃保存。经琼脂糖凝胶电泳确认之后选取阳性PCR产物送往生工生物工程(武汉)股份有限公司进行测序。结果如图11和图12所示，31#、36#和38#为阳性纯合，1#、7#、8#、24#、29#和33#为杂合子，5#样本未发生删除，图12为31#阳性单克隆测序部分图，与目标序列一致。
(3)核移植及仔猪耳组织细胞分离。
经测序验证后选取31#阳性克隆细胞送往河南创源生物科技有限公司进行核移植。待受孕母猪分娩后取仔猪耳组织用于分离细胞，PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性2min，58℃退火30s，72℃延伸1’20s，共30个循环，最后4℃保存。
4、转IGFⅠ基因猪(无痕编辑)基因型鉴定。
基因型鉴定(PCR及测序)：提取初生仔猪基因组DNA样品进行PCR验证，上游引物IGF-CS-F如SEQ ID No.15所示；下游引物IGF-CS-R如SEQ ID No.16所示；Neo-Rv如SEQ IDNo.17所示。PCR反应体系为r-taq mix12.5μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl，最后加ddH2O补足至25μl；PCR反应条件：预变性94℃，2min，变性94℃，2min，58℃退火30s，72℃延伸1’20s，共30个循环，最后4℃保存。经琼脂糖凝胶电泳确认之后选取阳性PCR产物(IGFⅠ001、IGFⅠ002、IGFⅠ003样本)送往生工生物工程(武汉)股份有限公司进行测序。
结果如图14和图15所示，图14说明已经将标记基因删除，图15则是对图14的结果进一步的佐证。在基因改良的过程中，100％确认最后得到的基因工程猪是无残留痕迹的。
实施例2
构建工程猪：操作步骤同实施例1中的CRIPR/Cas9系统介导双链断裂后置换基因中的步骤(4)。
本发明实现国际首例“无痕”基因工程猪，该成果的特点是：利用CRSPR/Cas9和Piggybac转座酶系统，将猪内源MSTN基因与外源IGFⅠ基因互换，并利用猪MSTN的相关表达元件，使互换后的IGFⅠ发挥其功能。图13是将31#单克隆作为供体细胞克隆产生的个体。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 利用PiggyBac转座酶系统构建无痕工程动物的方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaccatgg gacctgagac cc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagaccctag gccgacttgg caggc 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcctgg aaatctgagg caaactgc 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcataatc aatacaatct ttctccttg 29
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctagggatt tatatttggt tcattacttc c 31
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctggtacc gcagtttctc caagtatgc 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaattccat gggcagcagc ctggacgac 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctcgaggag aaacagctct ggcacatgtc 30
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggaaatct gaggcaaact gc 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggctatgaa ctaatgaccc c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaatgaatgc aattgttgtt g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcctgccttt gcaacactgc ag 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagcgacag tatatgaact 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcacctgaag aaaggagaac 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaatcagct cacccttgac tgt 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggcatgta gcctgtggta cata 24
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attgcatcag ccatgatgga tac 23

Claims (8)

1.一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac构建工程猪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将PCR扩增的IGFⅠ插入PB载体的BsiWⅠ位点和AvrⅡ位点之间，得初级载体；
b、PCR扩增猪MSTN基因的左右臂，将扩增得到左臂插入初级载体的EcoRI和NsiI位点，将扩增得到右臂构建到初级载体的AvrⅡ和KpnⅠ位点之间，得到第一重组载体；
c、将T11、T31和第一重组载体共转染成纤维细胞后培养，得到第一成纤维细胞；
d、将PCR扩增的pbase插入pcDNA3.1的EcoRⅠ和XhoⅠ之间，得第二重组载体；
e、将第二重组载体转染至第一成纤维细胞后，进行核移植，得到胚胎；
f、将胚胎移植至母猪，得到工程猪；
步骤c和步骤d没有时间先后顺序。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a所述PCR扩增的上游引物PB-IGFm-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物PB-IGFm-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT1-LAF1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PBT1-LAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的上游引物PBT3-RAF2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物PBT3-RAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，当扩增所述猪MSTN基因的左臂时，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；
当扩增所述猪MSTN基因的右臂时，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d所述PCR扩增的上游引物pbase-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物pbase-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序包括：94℃预变性2min；94℃变性2min，56℃退火30s，72℃延伸110s，30个循环。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c所述共转染的方式为电转染。
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