CN111926037A - 一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因的方法。所述制备方法包括：设计sgRNA寡聚核苷酸链；将sgRNA寡聚核苷酸链通过程序性退火得到含黏性末端的退火后的sgRNA双链；将退火后的sgRNA双链与酶切处理后的PX459‑puro载体连接得到PX459‑puro‑sgRNA质粒。本发明提供的质粒的制备方法简单有效，敲除MSTN基因的方法则可以有效敲除MSTN基因，提高桃源黑猪仔猪的生长速率。

Description

一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因 的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因的方法。
背景技术
随着国民经济飞速发展和人民生活水平的不断提高，消费者们对肉类食品的品质有了更高的需求，但现阶段国内优秀肉类食品仍为一大空缺。市场上常见的肉类食品集中在猪肉。2000～2014年间，我国每年人均购买17.86千克的猪肉相关制品，在全球肉类购买总量中所占的比例为65.98％。中国猪肉市场中流通的肉猪品种繁杂，2011年出版的《中国畜禽遗传资源志·猪志》共收录了76个地方猪种，部分地方猪种具有“三高”的优势，即肌内脂肪含量高、繁殖力高、抗病抗逆抗性高，但通常这些地方猪种也有“三低”的缺陷，即生长速率低、瘦肉率低、饲料报酬低。“三低”缺陷大大抵消了“三高”带来的优势，使地方猪种的发展举步维艰。
传统的育种方法主要依赖于杂种优势和自然选择，主要包括诱变育种、杂交育种、多倍体育种和细胞工程育种等手段。但是传统育种手段主要集中在个体水平，育种耗费时间长，劳动成本高。
现有技术还有MSTN基因可调控成肌细胞细胞周期的进程进而调控肌肉的生长发育的相关研究。畜牧学者采用了多种方法试图抑制MSTN基因的表达及活性，如免疫抑制、反义RNA介导的转录后沉默，但是上述方法普遍有技术复杂，浪费编辑成本及人力成本的缺陷。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因的方法。本发明提供的利用双sgRNA技术构建敲除MSTN基因的质粒技术简单，敲除MSTN基因的效果明显，通过敲除MSTN基因使得目标动物个体骨骼肌肌肉重量显著增加，骨骼肌增长速率明显升高。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒，所述质粒的制备方法包括以下步骤：
(1)设计4对sgRNA寡聚核苷酸链，分别命名为MSTN-E1-1-F、MSTN-E1-1-R、MSTN-E1-2-F、MSTN-E1-2-R、MSTN-E3-1-F、MSTN-E3-1-R、MSTN-E3-2-F和MSTN-E3-2-R；所述MSTN-E1-1-F、MSTN-E1-1-R、MSTN-E1-2-F、MSTN-E1-2-R、MSTN-E3-1-F、MSTN-E3-1-R、MSTN-E3-2-F和MSTN-E3-2-R的寡聚核苷酸链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～8所示；
(2)将步骤(1)所述4对sgRNA寡聚核苷酸链分别通过程序性退火得到含黏性末端的退火后的sgRNA双链；所述退火的体系如下：
正向寡聚核苷酸链 9ul
反向寡聚核苷酸链 9ul
NEB3.1 2ul；
(3)对载体进行酶切处理得到酶切产物；
(4)将步骤(2)得到的退火后的sgRNA双链分别与步骤(3)得到的酶切产物混合，进行连接反应，得到PX459-puro-sgRNA质粒，分别命名为MSTN-E1-1、MSTN-E1-2、MSTN-E3-1、MSTN-E3-2；
所述步骤(1)和步骤(3)没有时间先后顺序的限定。
优选的，所述载体的酶切方法包括：按照酶切体系加样后，放置于37℃恒温水浴锅酶切2h；所述酶切体系如下：
Figure BDA0002652887910000021
本发明还提供了一种基于利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒的敲除MSTN基因的方法，包括以下步骤：将所述的PX459-puro-sgRNA质粒转染至成纤维细胞。
优选的，所述成纤维细胞的来源包括桃源黑猪。
本发明提供了利用利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒，通过设计sgRNA寡聚核苷酸链、制备重组载体和利用电穿孔技术将质粒转染至成纤维细胞等操作，起到敲除MSTN基因的技术效果。实施例结果表明，本发明提供的利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒可以有效提高桃源黑猪的瘦肉率，经过基因编辑的桃源黑猪的仔猪的生长速率明显高于野生型桃源黑猪。
附图说明
图1细胞转染结果，左图为荧光系统下的效果图，右图为未打开荧光系统的效果图；
图2 MSTN基因第1外显子测序结果；
图3 MSTN-EXON1样品测序结果；
图4 MSTN基因第3外显子测序结果；
图5 MSTN-EXON3样品测序结果；
图6 G0代MSTN基因编辑桃源黑猪仔猪；
图7基因扩增片段；
图8五头仔猪的基因测序结果；
图9仔猪体重的记录；
图10载体。
具体实施方式
本发明提供了一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒，所述质粒的制备方法包括以下步骤：
(1)设计4对sgRNA寡聚核苷酸链，分别命名为MSTN-E1-1-F、MSTN-E1-1-R、MSTN-E1-2-F、MSTN-E1-2-R、MSTN-E3-1-F、MSTN-E3-1-R、MSTN-E3-2-F和MSTN-E3-2-R；所述MSTN-E1-1-F、MSTN-E1-1-R、MSTN-E1-2-F、MSTN-E1-2-R、MSTN-E3-1-F、MSTN-E3-1-R、MSTN-E3-2-F和MSTN-E3-2-R的寡聚核苷酸链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～8所示；
(2)将步骤(1)所述4对sgRNA寡聚核苷酸链分别通过程序性退火得到含黏性末端的退火后的sgRNA双链；所述退火的体系如下：
正向寡聚核苷酸链 9ul
反向寡聚核苷酸链 9ul
NEB3.1 2ul；
(3)对pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459-puro)载体进行酶切处理得到酶切产物；
(4)将步骤(2)得到的退火后的sgRNA双链分别与步骤(3)得到的酶切产物混合，进行连接反应，得到PX459-puro-sgRNA质粒，分别命名为MSTN-E1-1、MSTN-E1-2、MSTN-E3-1、MSTN-E3-2；
所述步骤(1)和步骤(3)没有时间先后顺序的限定。
在本发明中，所述NEB3.1优选购自BioLabs公司，货号为#B7203S。
在本发明中，所述寡聚核苷酸链的构建方法优选为：本发明在MSTN基因第1外显子和第3外显子处分别设计2对sgRNA寡聚核苷酸链，并在编码链的5'端添加CACC，模板链5'端添加AAAC酶切位点，得到核苷酸序列如SEQ ID NO:1～8所示的寡聚核苷酸链，送至生工生物工程有限公司合成。
在本发明中，所述PX459-puro载体的酶切方法优选包括：按照酶切体系加样后，放置于37℃恒温水浴锅酶切2h；所述载体如图10所示；所述酶切体系优选如下：
Figure BDA0002652887910000041
在本发明中，所述10×FastDigest Green Buffer购自Thermo Scientific，Lot：00492169，BbsI FastDigest enzyme购自Thermo Scientific，Lot：00730403。
在本发明中，所述酶切时所述用的限制性内切酶优选为BbsI；得到酶切产物后，本发明优选进行纯化回收。本发明对所述纯化和回收的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规纯化和回收方法即可。
在本发明中，所述连接反应中使用的酶优选为Solution I快速连接酶(购自TaKaRa，Lot：AJ12667A)；反应条件优选为16℃孵育30min，放至于4℃的环境下保存；连接体系优选如下：
PX459-puro的酶切产物 1ul
SgRNA双链 3ul
Solution I 6ul。
本发明还提供了一种基于利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒的敲除MSTN基因的方法，包括以下步骤：将上述的PX459-puro-sgRNA质粒转染至成纤维细胞。所述转染的方法优选为利用电穿孔技术转染。本发明对所述连接反应的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规连接反应方法即可。所述转染的的步骤优选为：
(1)清洗电转杯：向电转杯中加入500ul DPBS缓冲液，使用移液枪吹打，取加长枪头在电转杯中搅拌几下，吸弃液体，使用DPBS缓冲液清洗2遍；加入200ul电转液清洗1遍，盖上盖子后将电转杯置于37℃的温箱中；
(2)制备电转混合液：分别取含有MSTN-E1-1、MSTN-E1-2、MSTN-E3-1和MSTN-E3-2基因片段的质粒3.5μg加入细胞沉淀所在的EP管中，加入电解液补充混合液至50ul，细胞沉淀可视体积估算为1～2ul；
(3)电转：电转混合液转移至预热后的电转杯中，按照电穿孔仪的操作进行电转；参数为电压135V，脉冲为1，时间为3ms；
(4)细胞转移：电转后的成纤维细胞转移至预热好的加有培养基的细胞皿中，吸取200ul干净的培养基反复冲洗电转杯，将所有细胞转移至培养皿中，在37℃、5％CO2的温箱中培养，次日换液并观察；
(5)电转后清洗：电转杯中加入500ul DPBS缓冲液，移液枪吹打，取加长枪头在电转杯中搅拌几下，吸弃液体，DPBS缓冲液清洗2遍。加入500ul分析纯酒精清洗一遍，倒掉酒精，开盖静置。
在本发明中，所述成纤维细胞的来源优选包括桃源黑猪，进一步优选为桃源黑猪35d的胎儿；所述成纤维细胞的的分离培养优选包括：成纤维细胞的分离、成纤维细胞的纯化、成纤维细胞的冻存、成纤维细胞的复苏、成纤维细胞传代、培养和成纤维细胞的收集。本发明对所述成纤维细胞的分离培养的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规成纤维细胞的分离培养方法即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、构建敲除MSTN基因的质粒
登录NCBI官网检索猪MSTN基因的基因组序列，在该基因第1外显子和第3外显子处设计4对sgRNA寡聚核苷酸链，分别在有义链5'端添加CACC，模板链5'端添加AAAC酶切位点后送生工生物工程有限公司合成。4对sgRNA寡聚核苷酸链序列如SEQIDNO.1～8所示。
将合成的单链sgRNA寡聚核苷酸通过程序性退火为含黏性末端的双链，即sgRNA短链。退火体系如下：
正向寡聚核苷酸链 9ul
反向寡聚核苷酸链 9ul
NEB3.1 2ul
根据质粒图谱使用限制性内切酶BbsI对PX459-puro载体进行酶切处理，按照下方体系加样后，放置于37℃恒温水浴锅酶切2h。酶切体系：
Figure BDA0002652887910000061
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，在紫外下切割含目的片段的胶，并使用诺维赞DNA胶回收试剂盒纯化切割成功的酶切产物。纯化步骤如下：
(1)加入等倍体积BufferGDP。50～55℃水浴7-10min，期间颠倒几次，仔细观察确保凝胶块完全溶解。
(2)瞬时离心收集管壁上散落的液滴。将DNA迷你吸附柱装入2ml收集管中，转移全部溶胶液至吸附柱中，12000rpm离心30-60sec。若溶胶体积大于650μl，则多次离心。
(3)弃滤液，把柱子放回收集管，加300μlBufferGDP，静置1min。12000rpm离心30-60sec。
(4)弃滤液，把柱子放回收集管。加700μlBufferGW(使用前仔细确认是否添加无水乙醇)至吸附柱中。12000rpm离心30～60sec。
(5)重复步骤(4)。
(6)弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12000rpm离心2min。将吸附柱置于在1.5ml灭菌的离心管中，缓慢滴加20-30μl超纯水至吸附柱中央，静置2min。12000rpm离心1min。丢弃吸附柱，DNA保存于-20℃
使用SolutionI快速连接酶将退火后的sgRNA双链连接到酶切产物上，反应条件：16℃孵育30min，放至4℃保存，连接体系如下：
PX459-puro的酶切产物 1ul
SgRNA双链 3ul
SolutionI 6ul
2、成纤维细胞的分离培养
(1)从怀孕35d的桃源母猪体内无菌取出胎儿，浸泡在含有100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS中，放入无菌操作台，用镊子去除头、尾、四肢及脏器，PBS清洗，眼科剪将胚胎剪碎成约1mm的小块，PBS冲洗两次，培养基冲洗一次。组织块直接接种到细胞培养皿上，加入少量含10％FBS的DMEM培养液，39℃、5％CO2培养箱中培养24h，组织块吸附牢固后，次日补加DMEM至正常体积，3d后换液。
细胞在组织块周围均匀铺开生长成片时加入2mL含有0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA的混合溶液(溶于PBS中)消化细至细胞边沿略微收缩，加入2mL培养液终止消化，反复吹打至细胞全部悬浮，转入1.5mLEP管，室温1000rpm、5min。弃上清、加入培养液重悬细胞，计数后接种适当的量2×105于新培养瓶继续培养。5～7d的培养后，细胞汇合度达到85～90％，再次按1：2比例传代培养。反复传代直至纯化为成纤维细胞。
细胞传代，培养汇合度达到80％时，细胞处于对数生长期，DPBS清洗2遍直至细胞澄清透亮。DPBS1：1稀释胰酶后消化细胞，在显微镜下观察到细胞开始收缩时，加入1mL培养液吹打均匀，收集至1.5mL EP管中，室温2500rpm、2min，弃上清。加入500μl冻存液重悬细胞，转移至冻存管内。冻存管上标记好细胞品种、代数、时间等信息，检查无误后放至程序降温盒内-80℃过夜，待温度降到最低后转移至液氮中，程序降温盒内放置时间不可超过7天。
从液氮罐中取出装有PFFsF1代的细胞冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅中快速解冻，约1min后拿出，75％酒精喷洒消毒后移入超净工作台内，将冻存管中的细胞悬液迅速转移至新的1.5mLEP管中，室温2500rpm、2.5min。弃上清，向EP管中加入1mL37℃预热的DPBS，移液枪混匀后，2500rpm离心2min。弃上清，向EP管中加入1mL37℃预热的细胞培养液，移液枪混匀后将细胞悬液转移至细胞培养皿，补全细胞培养液，37°温箱，5％CO2浓度过夜培养。次日给细胞换液，吸弃旧培养液后用DPBS清洗细胞，加入新的预热好的培养液。
细胞汇合度达90％时，吸弃旧培养液，预热后的DPBS清洗细胞2次，加入200ulDPBS和200ul胰蛋白酶消化30-60s，显微镜下观察细胞开始收缩时，加入1mL细胞培养液终止消化，移液枪轻轻吹打至全部细胞悬浮于培养液中，将细胞悬液转移至1.5mLEP管中，室温2500rpm、2min。弃上清，加入1mLDPBS吹打清洗，2500rpm、2min。弃上清，加入1mL细胞培养液，移液器吹打混匀，按照1：6的比例传代。
3、利用电穿孔技术转染细胞
细胞汇合度达90％时，吸弃旧培养液，预热后的DPBS清洗细胞2次，加入200ulDPBS和200ul胰蛋白酶消化30～60s，显微镜下观察细胞开始收缩时，加入1mL细胞培养液终止消化，移液枪轻轻吹打至全部细胞悬浮于培养液中，将细胞悬液转移至1.5mL EP管中，室温2500rpm、2min。弃上清，加入1mL DPBS吹打清洗，2500rpm、2min。弃上清，细胞沉淀收集至1.5mL EP管中。
转染的的步骤为：
(1)清洗电转杯：向电转杯中加入500ulDPBS缓冲液，使用移液枪吹打，取加长枪头在电转杯中搅拌几下，吸弃液体，使用DPBS缓冲液清洗2遍；加入200ul电转液清洗1遍，盖上盖子后将电转杯置于37℃的温箱中；
(2)制备电转混合液：分别取含有MSTN-E1-1、MSTN-E1-2、MSTN-E3-1和MSTN-E3-2基因片段的质粒3.5μg加入细胞沉淀所在的EP管中，加入电解液补充混合液至50ul，细胞沉淀可视体积估算为1～2ul；
(3)电转：电转混合液转移至预热后的电转杯中，按照电穿孔仪的操作进行电转；参数为电压135V，脉冲为1，时间为3ms；
(4)细胞转移：电转后的成纤维细胞转移至预热好的加有培养基的细胞皿中，吸取200ul干净的培养基反复冲洗电转杯，将所有细胞转移至培养皿中，在37℃、5％CO2的温箱中培养，次日换液并观察；
(5)电转后清洗：电转杯中加入500ulDPBS缓冲液，移液枪吹打，取加长枪头在电转杯中搅拌几下，吸弃液体，DPBS缓冲液清洗2遍。加入500ul分析纯酒精清洗一遍，倒掉酒精，开盖静置。
应用例1
PBT3质粒是带有EGFP绿色荧光筛选标记的对照质粒，大小为9.5K。PX459质粒本身不带荧光筛选标记，仅带有嘌呤霉素筛选标记，大小为9.3。细胞电转染方案如表1所示准备4孔细胞，1个孔转染MSTN-E1-1和MSTN-E1-2，并另转1个孔PBT3作为对照每孔所用的质粒量相等都为7μg；1个孔转染MSTN-E3-1和MSTN-E3-2，并另转染一孔PBT3作为对照，每孔所用的质粒量相等都为7μg。转染结果如图1所示。
表1细胞电转染方案
Figure BDA0002652887910000091
由图1可知，经过转染24h后，使用荧光显微镜拍照，可观察到PBT3质粒的荧光转染效率约为40％，同时说明了PX459-puro-sgRNA敲除载体的转染效率也在40％左右。
应用例2
1、通过体细胞核移植技术共获得基因编辑猪克隆胚胎600枚，选择两头后备母猪于2019年11月20日进行胚胎移植。两头后备母猪分别为大白猪和长白猪，均在2019年11月20日发情，进行胚胎移植时两头后备母猪已排卵4小时，每头后备母猪各移植300枚胚胎。
2020年3月16日出生5头G0代MSTN基因编辑桃源黑猪仔猪。5头仔猪为公猪。如图6所示。
2、野生型细胞的MSTN基因并未进行编辑，扩增出的片段大小应为727bp。以水为模板作为阴性对照应无扩增条带。筛选出的MSTN双等位基因敲除细胞和基因编辑仔猪的MSTN基因扩增片段大小应均为473bp。扩增结果如图7所示。
由图8(图中1～5指代5只基因编辑的仔猪)可知，基因编辑仔猪扩增出来的目的片段同筛选出的细胞一致，均符合实验预期，证明这5头G0代基因编辑仔猪均为MSTN双等位基因敲除(mstn-/-)。
3、对G0代基因编辑仔猪的DNA进行扩增测序。其中MSTN-EXON3原始序列如图4所示。
EXON3-双切前序列编号为SEQ ID NO:9，如下所示：TCATGAGCACCCACAGCGATCTACTACCATGGCTGGAATTTTCCCATATATTATTTGTTCTTTGCCATTAAAATATAGCATATTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAGTACAGCAGGGGCCTGCTGAACCTCTGGGGTTTGCTTGGTGCACAAGATGAGTGTGAGGGTATTTTTGTAAAAATACAAATTCACACTCTCCAGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTTTTGGGTGCAATAATCCAGTCCCATCCAAAAGCTTCAAAATCCACAGTTAGAGGGTAACGACAGCATCGAGATTCTGTTGAGTGCTCATCACAGTCGAGTCCAAAATCTCTCCTGGATCTTTTTGGTGTGTCTGTTACCTTGACTTCTAAAAAGGGATT
EXON3-双切预期理论结果的编号为SEQ ID NO:10，如下所示：TCATGAGCACCCACATTAGAGGGTAACGACAGCATCGAGATTCTGTTGAGTGCTCATCACAGTCGAGTCCAAAATCTCTCCTGGATCTTTTTGGTGTGTCTGTTACCTTGACTTCTAAAAAGGGATT
五头仔猪的基因测序结果如图8所示。图8为1～5号仔猪的MSTN第三外显子序列。
由图8可知，1～5号样品与细胞双切结果完全一致，说明MSTN基因编辑猪制备成功。
4、2020年3月16日出生5头G0代MSTN基因编辑桃源黑猪仔猪纯合子(mstn-/-)。其中5号猪在7日龄夭折，其余4头健康。记录仔猪初生重和野生型桃源黑猪的初生重，记录基因编辑仔猪的断奶重(28日龄)，同时记录野生型桃源黑猪之后的体重，取均值作为WT对照。实验结果如表2和图9所示。
表2基因编辑猪与WT猪的体重统计
Figure BDA0002652887910000111
由表2和图9可知，基因编辑仔猪的生长速率明显高于WT猪。
应用例3
取应用例2中的出生仔猪的尾尖部分，抽取基因组DNA进行PCR鉴定。对出生仔猪的基因组DNA进行扩增，以J2细胞作为基因编辑阴性对照，测序检测初生仔猪是否为MSTN双等位基因敲除纯合子。
1、MSTN基因第1外显子测序结果如图2所示。
由图2可知，加粗并有下划线的部分是基因编辑时缺失的片段，加框的是sgRNA序列，点号“·”是切割位点。
EXON-1样品：
第一外显子原序列编号为SEQ ID NO:11，如下所示：ACTCTGTAGGCATGGTAATGATCGTTTCCGTCGTAGCGTGATAATCATCATCTTCCAAGGAGCCATCACTGCTGTCATCTCTCTGGACATCGTACTGATCAATCAGTTCCCGGAGTGGAGGAGCTTTGGGCAAAAGTTGTCTTATAGCATCTTTGCTAATGTTAGGAGCTGTTTCCAGGCGAAGTTTACTGAGGATTTGAATTTTTATGGCTTCTAGTCTTGAAGATTTAGTGTTTTGTCTCCACATACATGCATTACACAGCCCCTCTTTTTCCACATTTTCCTTTTGCTCGCTGTTCTCATTCAGATCCACGGGACCAGCAACAATCAGCATAAACAGGTAAATATAAACATAGATTTGCAGTTTTTGCAT
第一外显子编辑后的序列编号为SEQ ID NO:12，如下所示：
ACTCTGTAGGCATGGTAATGATCGTTTCCGTCGGAAGTTTACTGAGGATTTGAATTTTTATGGCTTCTAGTCTTGAAGATTTAGTGTTTTGTCTCCACATACATGCATTACACAGCCCCTCTTTTTCCACATTTTCCTTTTGCTCGCTGTTCTCATTCAGATCCACGGGACCAGCAACAATCAGCATAAACAGGTAAATATAAACATAGATTTGCAGTTTTTGCATMSTN-EXON1样品测序结果如图3所示。由图3可知，MSTN-EXON1基因成功敲除147bp。
2、MSTN基因第3外显子测序结果如图4所示。
由图4可知，加粗并有下划线的部分是基因编辑时缺失的片段，加框的是sgRNA序列，点号“·”是切割位点。
EXON-3样品：
第三外显子原序列编号为SEQ ID NO:13，如下所示：TCATGAGCACCCACAGCGATCTACTACCATGGCTGGAATTTTCCCATATATTATTTGTTCTTTGCCATTAAAATATAGCATATTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAGTACAGCAGGGGCCTGCTGAACCTCTGGGGTTTGCTTGGTGCACAAGATGAGTGTGAGGGTATTTTTGTAAAAATACAAATTCACACTCTCCAGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTTTTGGGTGCAATAATCCAGTCCCATCCAAAAGCTTCAAAATCCACAGTTAGAGGGTAACGACAGCATCGAGATTCTGTTGAGTGCTCATCACAGTCGAGTCCAAAATCTCTCCTGGATCTTTTTGGTGTGTCTGTTACCTTGACTTCTAAAAAGGGATT
第三外显子编辑后序列编号为SEQ ID NO:14，如下所示：TCATGAGCACCCACATTAGAGGGTAACGACAGCATCGAGATTCTGTTGAGTGCTCATCACAGTCGAGTCCAAAATCTCTCCTGGATCTTTTTGGTGTGTCTGTTACCTTGACTTCTAAAAAGGGATT
MSTN-EXON3样品测序结果如图5所示。由图5可知，MSTN-EXON3基因成功敲除254bp。
由上述实施例和应用例可知，本发明提供的利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒能够有效敲除桃源黑猪的MSTN基因，使得桃源黑猪的骨骼肌增长速率显著提高。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
中国科学院亚热带农业生态研究所
湖南惠生农业科技开发股份有限公司
<120> 一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒及敲除MSTN基因的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgtgatg attatcacgc tacga 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactcgtag cgtgataatc atcac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgaatcc tcagtaaact tcgcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacggcgaa gtttactgag gattc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgccatg gtagtagatc gctgt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacccatgg tagtagatcg ctgtc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccgctgtc gttaccctct aactg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaccagtta gagggtaacg acagc 25
<210> 9
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcatgagcac ccacagcgat ctactaccat ggctggaatt ttcccatata ttatttgttc 60
tttgccatta aaatatagca tattgattgg agacatcttt gtgggagtac agcaggggcc 120
tgctgaacct ctggggtttg cttggtgcac aagatgagtg tgagggtatt tttgtaaaaa 180
tacaaattca cactctccag agcagtaatt ggccttatat cttttgggtg caataatcca 240
gtcccatcca aaagcttcaa aatccacagt tagagggtaa cgacagcatc gagattctgt 300
tgagtgctca tcacagtcga gtccaaaatc tctcctggat ctttttggtg tgtctgttac 360
cttgacttct aaaaagggat t 381
<210> 10
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcatgagcac ccacattaga gggtaacgac agcatcgaga ttctgttgag tgctcatcac 60
agtcgagtcc aaaatctctc ctggatcttt ttggtgtgtc tgttaccttg acttctaaaa 120
agggatt 127
<210> 11
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actctgtagg catggtaatg atcgtttccg tcgtagcgtg ataatcatca tcttccaagg 60
agccatcact gctgtcatct ctctggacat cgtactgatc aatcagttcc cggagtggag 120
gagctttggg caaaagttgt cttatagcat ctttgctaat gttaggagct gtttccaggc 180
gaagtttact gaggatttga atttttatgg cttctagtct tgaagattta gtgttttgtc 240
tccacataca tgcattacac agcccctctt tttccacatt ttccttttgc tcgctgttct 300
cattcagatc cacgggacca gcaacaatca gcataaacag gtaaatataa acatagattt 360
gcagtttttg cat 373
<210> 12
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actctgtagg catggtaatg atcgtttccg tcggaagttt actgaggatt tgaattttta 60
tggcttctag tcttgaagat ttagtgtttt gtctccacat acatgcatta cacagcccct 120
ctttttccac attttccttt tgctcgctgt tctcattcag atccacggga ccagcaacaa 180
tcagcataaa caggtaaata taaacataga tttgcagttt ttgcat 226
<210> 13
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcatgagcac ccacagcgat ctactaccat ggctggaatt ttcccatata ttatttgttc 60
tttgccatta aaatatagca tattgattgg agacatcttt gtgggagtac agcaggggcc 120
tgctgaacct ctggggtttg cttggtgcac aagatgagtg tgagggtatt tttgtaaaaa 180
tacaaattca cactctccag agcagtaatt ggccttatat cttttgggtg caataatcca 240
gtcccatcca aaagcttcaa aatccacagt tagagggtaa cgacagcatc gagattctgt 300
tgagtgctca tcacagtcga gtccaaaatc tctcctggat ctttttggtg tgtctgttac 360
cttgacttct aaaaagggat t 381
<210> 14
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcatgagcac ccacattaga gggtaacgac agcatcgaga ttctgttgag tgctcatcac 60
agtcgagtcc aaaatctctc ctggatcttt ttggtgtgtc tgttaccttg acttctaaaa 120
agggatt 127

Claims (4)

1.一种利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒，其特征在于，所述质粒的制备方法包括以下步骤：
(1)设计4对sgRNA寡聚核苷酸链，分别命名为MSTN-E1-1-F、MSTN-E1-1-R、MSTN-E1-2-F、MSTN-E1-2-R、MSTN-E3-1-F、MSTN-E3-1-R、MSTN-E3-2-F和MSTN-E3-2-R；所述MSTN-E1-1-F、MSTN-E1-1-R、MSTN-E1-2-F、MSTN-E1-2-R、MSTN-E3-1-F、MSTN-E3-1-R、MSTN-E3-2-F和MSTN-E3-2-R的寡聚核苷酸链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～8所示；
(2)将步骤(1)所述4对sgRNA寡聚核苷酸链分别通过程序性退火得到含黏性末端的退火后的sgRNA双链；所述退火的体系如下：
正向寡聚核苷酸链 9ul
反向寡聚核苷酸链 9ul
NEB3.1 2ul；
(3)对载体进行酶切处理得到酶切产物；
(4)将步骤(2)得到的退火后的sgRNA双链分别与步骤(3)得到的酶切产物混合，进行连接反应，得到PX459-puro-sgRNA质粒，分别命名为MSTN-E1-1、MSTN-E1-2、MSTN-E3-1和MSTN-E3-2；
所述步骤(1)和步骤(3)没有时间先后顺序的限定。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述载体的酶切方法包括：按照酶切体系加样后，放置于37℃恒温水浴锅酶切2h；所述酶切体系如下：
Figure FDA0002652887900000011
3.一种基于利用双sgRNA技术敲除MSTN基因的质粒的敲除MSTN基因的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的PX459-puro-sgRNA质粒转染至成纤维细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞的来源包括桃源黑猪。
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