CN103468732A - piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法，属于基因工程领域。所述表达载体是通过将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pCyL50质粒上构建得到的。将该载体导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。本发明的表达载体具有piggyBac转座子，极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。本发明的转基因猪的构建方法为各种转基因动物的制备提供了一条新的思路，同时也对转基因动物生物模型的制作提供一种简便高效的方法。

Description

piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种携带报告基因和抗性基因的piggyBac转座子表达载体：pPB-CMV-Neo/EGFP及其构建方法，以及piggyBac转座子转基因猪及其构建方法。

背景技术

转基因的概念是随着研究者首次通过原核显微注射法生产出携带外源基因的小鼠而产生的。在过去的三十三年时间里，为提高转基因动物的制备效率，研究者们发展了数种方法，但是最受研究者们欢迎的还是通过将线性化的转基因DNA利用原核显微注射法来进行转基因动物的制备。利用原核显微注射法生产转基因动物有十分明显的优点：如它所需要的仪器设备相对简单，而其他方法都会对仪器设备有特殊的要求，特别是慢病毒介导法，需要特制的仪器设备以提高安全性；但最重要的还是因为原核显微注射法制备转基因动物具有很好的稳定性，尤其在转基因小鼠制备上，如果有足够的受精卵进行原核显微注射，就可以保证获得转基因小鼠。然而在制备转基因家畜大型哺乳动物上，如牛、羊、猪等，由于卵母细胞中的高脂类含量，使得常规的光学显微镜因难以分辨清细胞核的结构，或是在操作过程中需要处理单个细胞胚胎，因此使用原核显微注射法制备转基因家畜的效率并不高。

另一种转基因动物制备方法是胞浆内精子注射法，即利用精子作为转基因载体，来实现外源基因的插入，然而与原核显微注射法一样，该方法在转基因小鼠制备效率上高，但被研究者证明在转基因猪的制备上却被证明效率不高，因此也不适合转基因家畜的制备。

目前，通过体细胞核移植的方法来生产家畜已经得到了广泛的应用，且该技术已经越来越成熟。然而利用该方法生产动物效率只有2%。在进行体细胞核移植之前，还需要对体细胞进行转基因操作，如果这一步骤的效率也不高，将大大降低最后转基因动物的制备效率。通过对体细胞进行转基因改造，再进行体细胞核移植，成为一种制备转基因动物切实可行的办法。而对体细胞进行转基因改造所利用载体，经历了从早期的随机整合的质粒DNA载体、病毒载体，到睡美人（Sleeping Beauty）转座子系统。近年来另外一种转座子系统，即piggyBac（pB）转座子系统，最初是从粉纹夜蛾中分离出来的，也已经应用于转基因领域，并且取得了大量的研究进展。但暂并没有见到利用piggyBac（pB）转座子系统结合体细胞克隆法制备转基因动物的相关报道。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种piggyBac转座子表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)、以SEQ ID NO:5的质粒为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，PCR扩增出序列号为SEQ ID NO:3的含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；

(2)、分别用SalI酶切步骤1的loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养，提取阳性克隆的质粒，SalI进行酶切鉴定，得到piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列号为SEQ IDNO:4。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。

本发明还提供了上述构建方法构建得到的piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列号为SEQ ID NO:4。

本发明还提供了piggyBac转座子转基因猪的构建方法，包括以下步骤：

(1)、将表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到piggyBac转座子的转基因猪。

在其中一个实施例中，所述共转染的步骤为：

（1）、把表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000μL

I中，混匀；

（2）、加入7μL用前混匀的PLUS^TMReagents，混匀后静置5min；

（3）、加入21μL用前混匀的Lipofectamine^TMLTX，混匀后静置30min；

（4）、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。

在其中一个实施例中，所述表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。

在其中一个实施例中，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为：

转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39℃，5%CO₂，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。

本发明还提供了上述构建方法构建得到的piggyBac转座子转基因猪。

本发明申请人已经证明利用piggyBac（pB）转座子系统对哺乳动物细胞系进行转基因操作是十分高效的。piggyBac（pB）转座子系统包括2个质粒载体：pB转座子载体和mPB转座酶载体，其中pB转座子载体携带着转座元件和目的基因，转座元件可使pB转座子载体以转座方式整合进入细胞基因组，目的基因则是本发明申请人所要研究的对象；mPB转座酶载体则会表达转座酶，负责对pB转座子载体转座元件外的无用序列进行切割，提高pB转座子载体的整合效率。而且，由于piggyBac（pB）转座子系统的主动整合特性，除了整合效率高之外，它较普通质粒载体还具有单拷贝多位点整合的特点，这样进一步提高转基因动物的生产效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的表达载体采用piggyBac转座系统，将普通质粒串联重组的转基因整合模式，变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。该转座系统含有多克隆位点MCS，可以方便地进行载体重构建，以便研究感兴趣的基因；还携带有EGFP绿色荧光标记、Neo抗性筛选标记，便于检测和筛选细胞系，其loxP重组位点，也可以方便后期删除。

2、本发明的转基因猪的构建方法提供了一种高效制备转基因动物的方法，为各种转基因动物的制备提供了一条新的思路，同时也对转基因动物生物模型的制作提供一种简便高效的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段的PCR扩增结果电泳鉴定图谱，其中M为marker，1为EGFP-Neo融合双标记片段的PCR产物；

图2为本发明实施例1中构建得到的载体pPB-CMV-Neo/EGFP的图谱，其中，PB3’和PB5’为转座子载体中的转座元件，MCS为多克隆位点，CMV为Neo/EGFP融合基因的启动子，Neo为新霉素抗性基因，EGFP为绿色荧光蛋白基因，BGH polyA为终止信号，AmpiR为氨苄抗性基因；

图3为本发明实施例3中的转基因猪绿色荧光检测结果，其中A部分为活体照片，B部分为解剖照片，蓝光为荧光灯蓝光激发条件下所拍照片，自然光为自然条件下所拍照片；转基因代表获得的转基因猪，野生型为同期出生的同品种杜洛克非转基因猪。

图4为本发明实施例3中的转基因猪PCR、southern blot结果，其中A部分，M为DNA Marker，1至8为8只不同转基因猪的DNA样品；9,10为非转基因猪DNA对照；最后一条泳道是质粒对照；A部分第一张图代表目的基因EGFP片段PCR扩增电泳结果，第二张图代表转座酶质粒PCR扩增电泳结果，第三张图是β-actin为内参基因对照；B部分，M为DIG标记的Marker，1C是将带有EGFP基因的转基因质粒用于Southern杂交的1个拷贝的阳性对照，3C是将带有EGFP基因的转基因质粒用于Southern杂交的5个拷贝的阳性对照，5C是将带有EGFP基因的转基因质粒用于Southern杂交的10个拷贝的阳性对照；1至8为8只不同转基因猪DNA的EGFP基因片段southern blot杂交结果，9,10为非转基因猪DNA对照；

图5为本发明实施例4中的piggyBac转座子系统与普通质粒筛选绿色荧光单克隆细胞团的效率对比图，其中A部分为转染后细胞在蓝色荧光灯下的成像，左边是普通的EGFP质粒

pT2AL200R175-CAGGS-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞的结果，右边为piggyBac转座子系统转染猪胎儿成纤维细胞的结果，B部分是分别统计piggyBac转座子系统和普通EGFP质粒

pT2AL200R175-CAGGS-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞所获得的阳性细胞克隆团数。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。

实施例1携带报告基因与抗性基因的piggyBac转座子表达载体：pPB-CMV-Neo/EGFP的构建

包括以下步骤：

1、扩增含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段

以质粒pPSP-PB-neoEGFP-XynB-manA(SEQ ID NO:5，这个质粒是经过申请人采用改造常规手段，PCR、酶切以及连接的方法改造而成的)为模板，设计引物，5′加酶切位点SalI，扩增出含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；引物序列分别如下：

Neo/EGFP-F:

5’-GTCGACCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGC-3’(SEQ ID NO:1);Neo/EGFP-R:

5’-GTCGACGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO:2)PCR的反应体系为

PCR反应程序：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。

PCR结束后，对PCR的结果进行鉴定，由图1可知，loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段大小与预期相符（约3052bp），序列为SEQ IDNO:3。

2、将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与pB转座子载体pCyL50载体连接，构建携带报告基因与抗性基因的piggyBac转座子表达载体：pPB-CMV-Neo/EGFP

将步骤1获得的loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50(pB转座子载体，由Sanger Institute赠送)分别用

SalI（Thermo scientific）进行酶切，酶切后纯化，再利用TaKaRa连接试剂盒进行连接。把连接产物转化感受态细胞DH5α，培养后挑选单克隆菌落进行扩大培养，通过菌液PCR初步验证是否获得阳性克隆。再提取阳性克隆的质粒，利用

SalI（Thermo scientific）进行酶切鉴定，并电泳检测酶切结果。选择酶切结果与预期相符的2-3个克隆送往上海英骏生物技术服务有限公司进行正反两个方向测序，选出与目的序列一致的测序结果，说明该菌落基因组中含有成功将loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50相连接的目的基因，即pPB-CMV-Neo/EGFP质粒构建成功。pPB-CMV-Neo/EGFP载体的序列为SEQ ID NO:4，载体图谱如图2所示。

实施例2利用实施例1的表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP构建转基因猪

包括以下步骤：

包括以下步骤：

1、筛选可稳定表达的单克隆抗体

将转座子质粒pPB-CMV-Neo/EGFP(即实施例1构建得到的表达载体)与转座酶质粒mPB（Sanger Institute赠送）混合共转染猪胎儿成纤维细胞系；用无抗生素的含有10%胎牛血清的细胞生长培养基复苏猪胎儿成纤维细胞至直径为60mm细胞培养皿中，当细胞达到50%-80%汇合度时即用于转染。转染步骤如下：

（1）把转座子质粒pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB按摩尔数比3:1混合加入到1000μL

I（life technology）的离心管中，混匀；

（2）PLUS^TMReagents（life technology）用前混匀，取7μL加入离心管中，混匀后静置5min；

（3）Lipofectamine^TMLTX（life technology）用前混匀，取21μL加到混合液中，混匀后静置30min；

（4）用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液加入细胞培养皿中，左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基。

转染48小时后，吸弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mL G418筛选浓度培养基4mL，隔天换液。同时将未转染的猪胚胎成纤维细胞用作抗生素筛选的对照细胞。将所有的细胞培养板置于39℃，5%CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。当有单个的细胞克隆出现时，用克隆环分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系。

2、体细胞核移植

(1)猪卵母细胞－颗粒细胞复合体（COCs）的采集及体外成熟培养从猪屠宰场（广东省天河肉联厂）收集猪卵巢，放入含有1%双抗（双抗为life technology的产品：Penicillin-Streptomycin-Glutamine）的28～37℃生理盐水中并于4h内送回实验室。用37℃的生理盐水清洗后拿带有18号针头的10mL注射器抽取直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞。在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs），用M199成熟培养液洗涤后，转入提前置于CO₂培养箱中孵育4h以上的加有500μLM199培养液的四孔板内，在39℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养42～44h。

(2)COCs上颗粒细胞的去除和成熟卵的挑选

卵母细胞成熟后，将COCs转移到含透明质酸酶的离心管中，用移液器吹打后将液体转移到30mm培养皿中，用吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞。

(3)供核细胞的准备

用胰酶消化后离心洗涤，用HN操作液(无钙H-NCSU-23显微操作液)将卵母细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体。

HN操作液的配方如下(所有试剂均为分析纯级别，购自广州康龙生物科技有限公司)：

(4)卵母细胞的去核与注核

挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120μm的固定针，内径为15～20μm的去核针采用盲吸法去核：在65mm无菌培养盘中加入约50μL的操作液滴，并用石蜡油覆盖，然后将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中。用固定针固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大约5点钟的位置。用去核针沿3点钟位置刺进去，去除极体及附近的胞质，之后把针撤出并将极体和胞质吐出，挑选一个体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程。重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h。

(5)卵母细胞和体细胞的融合及激活

将重构卵分批转移到融合液中平衡2min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs,2DC的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5%CO₂饱和湿度的培养箱中，4h后在体视显微镜下判定融合情况。将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧（5%O₂+5%CO₂+90%N₂）的条件下培养。

(6)通过手术移植克隆胚生产转基因猪

受体母猪为广东省华农温氏畜牧股份有限公司的优质母猪。本发明采用输卵管移植法，胚胎发育处于为2细胞或4细胞期时进行移植。手术当天对母猪禁食，手术前绑定母猪并对它进行全身静脉麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，先用清水清洗手术部位及四周，擦干后先用碘酒大范围消毒，再用75%酒精脱碘。盖上手术布同时暴露手术部位，沿腹中线切开皮肤和皮下肌肉，然后分离皮下脂肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牵引出子宫和输卵管，检查排卵情况。将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入。然后恢复子宫和输卵管到腹腔内。常规手术缝合，术后连续4天注射抗生素消炎。即得到piggyBac转座子的转基因猪。

实施例3实施例2构建得到的piggyBac转座子的转基因猪的检测

受体母猪经妊娠和分娩，并进行转基因猪绿色荧光荧光检测，PCR，southern bloting及定量PCR的检测。通过以下方法进行检测

1、绿色荧光检测

用蓝色光灯直接照射检测，转基因阳性猪可发绿色荧光，如图3所示，转基因猪的各解剖器官均发绿色荧光，初步证明转基因质粒已整合且能在转基因猪上表达。

2、DNA水平的检测

通过PCR、southern blot、IPCR等方法进行DNA水平的检测，图4为转基因猪PCR、southern blot结果，从图4可知，转基因猪中能检测到目的基因片段，而非转基因猪中则没有目的基因，且转座酶质粒并未在转基因猪中检测到，即本发明中转座整合是具有稳定性的。在southern杂交结果中，转基因猪中能检测到目的基因片段，而非转基因猪中则没有目的基因，且转基因猪的杂交片段与1拷贝的阳性对照条带相似，说明是单拷贝多位点的整合。以猪内参基因β-actin对照，检测到目的基因EGFP和转座子载体PB5’的拷贝数一致，大约为8个拷贝数，该结果与southern blot相符合，从另一方面验证了本发明中转座子系统的整合是单拷贝多位点性的。

实施例4piggyBac转座子系统与普通质粒获得绿色荧光单克隆细胞团的效率对比

在实施例2筛选单细胞克隆团的同时，分别以piggyBac转座子系统和普通EGFP质粒pT2AL200R175-CAGGS-EGFP（life technology）转染猪胎儿成纤维细胞，步骤与第2步筛选单细胞克隆团相同，验证获得阳性细胞克隆团的效率，结果如图5所示。

从图5可以看出，piggyBac转座子系统获得的阳性细胞克隆团数比普通EGFP质粒pT2AL200R175-CAGGS-EGFP效率要高30倍，证明本发明中piggyBac转座子系统具有很高的整合效率，能提高转基因动物的制备效率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种piggyBac转座子表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以SEQ ID NO:5的质粒为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，PCR扩增出序列为SEQ ID NO:3的含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；

(2)、分别用SalI酶切步骤1的loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养，提取阳性克隆的质粒，SalI进行酶切鉴定，得到piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列为SEQ ID NO:4。

2.根据权利要求1所述的piggyBac转座子表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的反应程序为：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35个循环；72℃10min。

3.权利要求1或2所述的构建方法构建得到的piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列为SEQ ID NO:4。

4.一种piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将权利要求3所述的表达载体与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；

(2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到piggyBac转座子的转基因猪。

5.根据权利要求4所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述共转染的步骤为：

（1）、把表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000μL

I中，混匀；

（2）、加入7μL用前混匀的PLUS^TMReagents，混匀后静置5min；

（3）、加入21μL用前混匀的Lipofectamine^TMLTX，混匀后静置30min；

（4）、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μL DMEM，再把上述（3）的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。

6.根据权利要求4或5所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。

7.根据权利要求4或5所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为：

转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500μg/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39℃，5%CO₂，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。

8.权利要求4-7任一项所述的构建方法构建得到的piggyBac转座子的转基因猪。

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