CN108060117A - 一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物克隆方法领域，具体涉及一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。本发明方法主要包括在猪克隆胚胎的基础培养液中添加母猪的子宫液。本发明方法显著提高了克隆胚胎早期发育的囊胚率和囊胚内总细胞数。通过早期胚胎的转录组测序结果显示添加母猪子宫液培养使克隆胚胎与正常体内受精胚胎之间的差异表达基因数目减少。最为重要的是，通过添加母猪子宫液还提高了克隆胚胎的受体母猪的分娩率和窝均活仔数，表明本发明方法有效地提高了克隆胚胎体内发育的最终效率。

Description

一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法
技术领域
本发明涉及动物克隆方法领域，具体涉及一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。
背景技术
哺乳动物体细胞核移植技术是一项在农业和再生医学领域应用前景广泛的新技术，如2000年，Polejaeva等人首次报道了运用成体体细胞核移植制备出克隆猪；2004年，Lai&Prather公开了猪体细胞核移植技术的操作流程。自从世界首例体细胞克隆哺乳动物“Dolly”羊诞生以来，大量动物已经被成功克隆，体细胞核移植技术作为一种新的辅助生殖技术，在农业生产、生物医学和生物学基础研究等领域都有重要的应用价值，但体细胞克隆胚胎全期发育效率(出生克隆后代数/重构克隆胚胎数)远低于自然受精胚胎，过低的发育效率是目前阻碍该项技术应用主要的制约因素。目前，猪的克隆胚胎全期发育效率只有约0.5-1％，出生的克隆猪经常出现各种器官的发育异常，很难在正常饲养条件下生存下去。
体细胞核移植技术是目前唯一能够将已分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎，并且能够发育成动物个体的辅助生殖技术。影响该技术效率的因素包括供核细胞类型、受体卵母细胞的质量、核移植操作的方法和胚胎体外培养体系等。目前猪的克隆研究主要是应用于转基因猪制备和优秀种公猪的复制扩繁上，其中在转基因克隆中常用的是猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞，而优秀种公猪的克隆则通常用皮肤成纤维细胞。猪卵母细胞体外成熟的效率已较高，一般能超过80％。核移植操作流程中的各个技术环节方法已趋于标准化。
克隆胚胎的培养体系对于其正常生长代谢至关重要，优化猪的克隆胚胎体外培养体系一直是改善体细胞克隆胚胎发育效率的一个研究热点。包括对基础培养液，表观遗传修饰剂、生长因子、氨基酸和维生素等添加剂和氧分压等的探索，为建立稳定的猪克隆胚胎的最佳培养体系打下了良好的基础。
由于猪胚胎内含有大量的脂滴，对温度非常敏感，所以猪的胚胎是比较难于进行体外操作和培养的。目前使用广泛的猪胚胎基础培养液为NCSU23和PZM3两种，其主要成分均包括水、离子、能量物质、氨基酸、蛋白质及缓冲系统等，在猪的孤雌胚胎的早期培养能达到50％左右的囊胚率。为了寻找能够促进供核细胞染色质结构变得更利于重编程，擦除体细胞的表观遗传修饰标记和表观记忆，已有大量研究在克隆胚胎培养液中添加不同的DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等表观遗传修饰小分子物质，如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、曲古抑菌素、丙戊酸和维生素C，在促进克隆胚胎早期体外发育方面已有较好进展。虽然这十几年来，猪克隆操作流程和体外培养体系等均有所改进，但克隆效率并没有得到大幅度提升。至今困扰该项技术应用的最大因素仍在于克隆胚胎发育效率很低。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。
本发明采用以下技术方案：
一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法，包括在猪克隆胚胎的基础培养液中添加母猪的子宫液。
进一步的，所述方法中可采用所有品种的母猪的子宫液。
优选地，猪克隆胚胎的基础培养液是PZM3或NCSU23培养液。
进一步的，所述母猪的子宫液可选用在母猪鉴定为发情后第1-10天中任意时期采集的子宫液。
优选地，所述母猪的子宫液选为母猪鉴定为发情后第3-10天中任意时期采集的子宫液。
优选地，用于采集子宫液的母猪年龄为8-36月龄。
优选地，用于收集子宫液的母猪胎龄为1-5胎。
进一步的，所述方法中子宫液在克隆胚胎基础培养液中的添加体积浓度为0.2-10％。
优选地，子宫液在克隆胚胎基础培养液中的最佳体积浓度为1-5％。
进一步的，所述子宫液的添加时间为克隆胚胎电融合后，至克隆胚胎体外培养第七天；最佳为克隆胚胎电融合后加入子宫液处理持续至克隆胚胎体外培养第七天。
进一步的，所述克隆供核细胞是猪皮肤成纤维细胞。
本发明有益效果：
用于评价克隆胚胎体外发育效果的指标主要包括胚胎发育成囊胚的效率和单个囊胚内的平均总细胞数。衡量克隆胚胎发育效率的更准确的评价指标为最终出生猪的效率。本发明的目的是通过在猪克隆胚胎体外培养液中添加适宜体积浓度的母猪子宫液，以弥补目前常用的猪克隆胚胎培养液成分的缺陷，从而改善胚胎的体外培养效果，克服体外发育阻断，显著提高囊胚率和囊胚内总细胞数，调节早期胚胎的基因表达趋于正常，并最终提高克隆猪的出生效率。实施例的实验结果显示，本发明的方法使体外培养的猪克隆胚胎的囊胚率提高了21％，囊胚内总细胞数提高了30个，使克隆胚胎与正常体内受精胚胎之间的差异表达基因数量减少了604个，使受体母猪的分娩率从50％提高至83％，并且窝均活仔从3.3头提高至4头。
附图说明
图1是猪体细胞核移植具体操作步骤。(A:固定针固定卵母细胞和极体位置；B：去核针去除卵母细胞内极体及附近的胞质；C：挑选用于注核的供体细胞；D：将供体细胞注入卵周隙中)
图2荧光显微镜下观察发育至第六天的猪囊胚内总细胞数。(A:对照组囊胚的细胞核染色的典型形态；B：添加子宫液培养囊胚的细胞核染色的典型形态)
图3是添加母猪子宫液培养的克隆胚胎与正常体内受精胚胎的差异基因火山图，其中差异基因筛选标准为Padj<0.05。(UF_NT：添加子宫液培养的克隆胚胎组；IVV：正常体内受精胚胎组)
图4是常规培养的克隆胚胎与正常体内受精胚胎的差异基因火山图，其中差异基因筛选标准为Padj<0.05。(C_NT：常规培养的克隆胚胎组；IVV：正常体内受精胚胎组)
图5是添加母猪子宫液培养的克隆胚胎与常规培养的克隆胚胎的差异基因火山图，其中差异基因筛选标准为|log2(FoldChange)|≥2且Pval<0.05。(UF_NT：添加子宫液培养的克隆胚胎组；C_NT：常规培养的克隆胚胎组)
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术、条件或行业标准进行操作，或者按照产品说明书进行操作。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1本发明的提高猪克隆胚胎发育效率的方法
1：母猪子宫液的收集方法
在猪场选择1头年龄在24月龄的鉴定为发情后第5天的健康母猪屠宰后取出子宫，2小时之内运输至实验室。先用生理盐水清洗其表面，然后用剪刀把子宫沿输卵管伞部至子宫角剪开，用分子实验室用小型真空泵的胶管连接200μl移液枪头沿着母猪子宫内壁吸取子宫内膜表面的液体，并收集到15ml离心管中。通过此方法，一头母猪的子宫大约能收集到10-15ml子宫液。之后用0.2μm直径的过滤器过滤除菌。冻存至-80℃，有效期一年以上。以胚胎培养液中添加体积浓度1％的母猪子宫液来计算，1个500μl培养液的培养孔一般培养约40个胚胎，需要添加5μl子宫液。那么，10ml子宫液可用于培养约80000个克隆胚胎。
2：猪卵母细胞的体外成熟培养
从屠宰场收集猪卵巢，放入生理盐水中送回实验室。用注射器抽吸直径2-6mm卵泡中的液体。在实体显微镜下挑选卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体，39℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养42-44h。采用透明质酸酶去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞作为核移植受体。
3：猪皮肤成纤维细胞培养
简要无菌操作如下：将猪耳皮组织块剪碎，用DMEM(Gibco)清洗组织碎末后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养，5-7h后添加含10％胎牛血清的DMEM培养液，观察组织块周围细胞爬出情况，待细胞长至90％汇合时传代培养。用第3-5代的接触抑制的耳皮成纤维细胞作为核供体。
4：体细胞核移植方法
体细胞核移植操作是利用显微操作仪完成的，先采用盲吸法去除成熟卵母细胞核及第一极体，然后挑选表面光滑且大小适中的体细胞吸入注核针内，注入一个体细胞于卵周隙中(过程如图1)。150v/mm，100μs，2DC的直流电脉冲诱导融合并激活重构胚，39℃，低氧(5％O2+5％CO2+90％N2)的饱和湿度环境下培养。对照组培养于PZM3培养液中，实验组则在PZM3添加5种不同体积浓度(0.2％、1％、3％、5％和10％)的上述采集的母猪子宫液。
5：克隆胚胎发育情况观察
胚胎培养至48h和168h时记录卵裂数和囊胚数。在胚胎发育第7天收集囊胚，放入含10μg/ml Hoechst33342的DPBS染色10min后转移到载玻片上，轻盖上盖玻片使囊胚受压后膨大，用指甲油封片。荧光显微镜下观察囊胚内细胞数，染上色的点为囊胚内细胞的核(即图2中各视野中的灰色物质)。结果表明(表1)，添加5种不同体积浓度子宫液培养的克隆胚胎发育效率均比克隆组有所提高，其中添加体积浓度1％发情母猪子宫液培养的克隆胚胎的早期发育效率最高，与对照组相比，其囊胚率提高了21％，囊胚内细胞数增加了30个。
表1
组别 重构胚数 卵裂率 囊胚率 囊胚内细胞数
对照组 210 0.67±0.10 0.11±0.03c 45.67±9.98b
0.2％子宫液 192 0.64±0.06 0.14±0.02c 48.78±8.59b
1％子宫液 220 0.75±0.04 0.32±0.04a 75.96±15.54a
3％子宫液 195 0.71±0.08 0.29±0.05a 66.58±8.87a
5％子宫液 216 0.76±0.12 0.28±0.04ab 67.55±7.51a
10％子宫液 207 0.72±0.09 0.22±0.05b 49.55±6.42b
注：统计分析3次重复实验的数据，计算其平均值±标准差。同一列中的不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。
实施例2添加母猪子宫液培养的猪克隆胚胎基因表达和克隆效率检测
1：母猪子宫液的收集方法、猪卵母细胞的体外成熟培养、猪皮肤成纤维细胞培养和体细胞核移植方法的具体步骤与实施例1相同。
2：早期胚胎的基因表达比较分析
分别构建了70个对照组克隆胚和添加体积浓度1％的子宫液处理的克隆胚，培养48小时，分别挑选了5个分裂至4细胞阶段的克隆胚胎进行单个胚胎的转录组建库和测序。同时，用构建这些克隆胚的供体细胞来源的同一头公猪的精液配种了一头同品系的母猪，在配种后大约48小时屠宰取出母猪的子宫，运输至实验室。用止血钳固定子宫角前端，从输卵管伞部注入冲卵液DPBS，用导管在子宫角中间位置收集，用冲卵液过滤清洗，在体视显微镜下观察收集分裂至4细胞阶段的体内受精正常胚胎。用DPBS清洗3遍，再用链酶蛋白酶消化去除胚胎的透明带，挑选了形态较好的6个胚胎分别转移入不同管的胚胎裂解液中，进行单个胚胎的转录组建库、测序和分析。转录组测序后分析结果显示，添加子宫液培养使克隆胚胎的基因较常规培养的克隆胚胎差异表达基因总数目是590个，其中表达量显著升高的基因有357个，使其基因表达量显著降低的基因有233个(图5)。常规培养的克隆胚胎与正常体内受精胚胎的差异表达基因总数目是7410个，其中表达量显著升高的基因有4158个，表达量显著降低的基因有3252个(图3)。添加子宫液培养的克隆胚胎与正常体内受精胚胎的差异表达基因总数目是6806个，其中表达量显著升高的基因有3779个，表达量显著降低的基因有3027个(图4)；由此可见，添加子宫液培养使克隆胚胎与正常胚胎之间的差异表达基因数量减少了604个，表明该方法纠正了这些基因的异常表达，可能提高克隆胚胎的发育潜能。
3：添加母猪子宫液培养克隆胚胎的最终克隆效率验证
按照实施例一中所述方法构建克隆胚胎，对照组培养于PZM3培养液中，处理组则在PZM3中添加1％体积浓度的发情母猪子宫液。第二天将克隆胚分别移植到代孕母猪子宫内，对照组和处理组分别移植了6头，每头母猪大约移植200枚胚胎，之后统计代孕母猪的妊娠率及产仔情况(表2)。添加子宫液培养使受体母猪的分娩率从50％提高至83％，并且窝均活仔从3.3头提高至4头。表明，该方法有效提高了克隆胚胎体内发育的最终效率。
表2添加子宫液培养的处理组胚胎和对照组胚胎的克隆效率统计
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法，其特征在于，所述方法包括在猪克隆胚胎的基础培养液中添加母猪的子宫液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母猪包括所有品种的母猪。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母猪的子宫液为在母猪鉴定为发情后第1-10天中任意时期采集的子宫液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母猪的年龄为8-36月龄。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母猪的胎龄为1-5胎。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中在克隆胚胎的基础培养液中添加子宫液的体积浓度为0.2-10％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中在克隆胚胎的基础培养液中添加子宫液的体积浓度为1-5％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中猪克隆胚胎的基础培养液为常规的PZM3培养液或NCSU23培养液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述子宫液的添加时间为克隆胚胎电融合后，至克隆胚胎体外培养第七天。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆胚胎的供核细胞为猪皮肤成纤维细胞。
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