CN105132426A

CN105132426A - 一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA

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Publication number: CN105132426A
Application number: CN201510605601.XA
Authority: CN
Inventors: 李文蓉; 张雪梅; 刘明军; 彭新荣; 刘晨曦; 林嘉鹏; 贺三刚; 吴阳升
Original assignee: Biotechnology Research Institute Of Xinjiang Academy Of Animal Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Institute Of Xinjiang Academy Of Animal Sciences
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-21
Also published as: CN105132426B

Abstract

本发明公开了一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。本发明提供了能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA，为序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸的RNA。本发明为绵羊功能基因研究提供了有效的技术工具。

Description

一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。

背景技术

基因组操作技术是近年基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。在动物育种领域，由于传统育种手段的增产潜力已经发挥到接近极限，利用高效稳定的基因组操作技术创新育种手段和提升现代动物育种效率和技术水平，对于育种新材料的创制和品种培育至关重要而且极为迫切。

近年来，科学家们根据细菌获得性免疫的原理，发明了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑新技术，不仅大大降低了对动物进行基因敲除、基因修饰的难度，更是将动物转基因技术由传统的随机整合推向了高度精确的基因组定向删除、突变或插入，开创了转基因动物生产的新时代。CRISPR/Cas9系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换20-30bp的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于ZFN和TALEN更加简单快捷，适合规模化、高通量的组装。相比ZFN和TALEN，Cas9介导的基因组编辑其靶标序列的特异性决定于一段小的与靶标序列互补的RNA。这种基于碱基互补配对原则的识别，相比较于蛋白质与DNA之间的相互作用要更加稳定和简单，能够实现一次操作同时突变两个以上基因或位点，大大提高了基因组编辑技术效率。

由于CRISPR/Cas9系统中发挥活性作用的核心部件为sgRNA和蛋白质，因此可以通过构建载体，体外转录获得RNA后，显微注射动物受精卵而获得打靶动物，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合。而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。也就是说，CRISPR/Cas9技术修饰的是一个物种自身的基因,采取mRNA或RNA作为基因打靶原材料，没有任何筛选用抗性基因，因而不存在生物安全性问题。而且，获得的最终产品是经过了遗传修饰的(通过转基因的方法定点修饰，因为这个系统是细菌里的,所以要靠转基因的方法转到动植物中)，但终产品里却可以不包含任何转基因的成分，大大提高了安全性。所以，在目前动植物新品种培育，尤其是转基因动物的制备中，CRISPR/Cas9介导的打靶系统被研究者广为采用。

成纤维细胞生长因子(FGFs)是一类调节细胞生长的多功能肽类生长因子。FGF5基因是FGF基因家族中的一员,在毛发生长周期中具有重要的调控作用。有研究表明，FGF5突变可以导致毛发生长周期中生长期的延长，从而使毛发的长度增加。近年来的研究表明FGF5基因可作为影响长毛兔产毛量潜在的主效基因，并且在狗、猫、羊等动物中检测FGF5基因的错义突变、多态性分析的研究，上述研究表明动物的长毛性状与FGF5基因的缺失突变相关。

传统的绵羊品种培育主要是通过基于表型选择的杂交改良等常规育种技术，在一定程度上取得了育种效果。但是常规育种周期长、预见性差、选择效率低，通过常规育种方法在品种改良上所获得的遗传增益日趋平缓，尤其在聚合高产、优质、抗逆等多个优良性状的品种选育方面进展不大，培育新品种的难度也越来越大，而且，在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高。新型的CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过人工设计的核酸酶，既能够在体内基因组的特定位点实现双链断裂而造成定点突变，也可以在基因组特定的多个位点同时造成双链断裂实现长片段序列的删除、翻转与重复，甚至定点的实现染色体之间的易位，能够实现一次操作同时突变两个以上基因或位点，大大缩短育种的时间，加快育种进程，有望实现优良基因重组和聚合，达到定向选育优质、高产动物新品种的目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。

本发明提供了一种能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA(sgRNA_FGF5-1)，为序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸的RNA。本发明的实施例中，所述sgRNA_FGF5-1具体可为序列表的序列4所示的RNA。

本发明还保护编码所述sgRNA_FGF5-1的DNA分子。编码所述sgRNA_FGF5-1的DNA分子具体可为序列表的序列3所示的DNA分子。

本发明还保护一种能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的靶向序列，为序列表的序列1自5’末端第335至354位核苷酸。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括所述的sgRNA。所述成套核酸分子还可包括Cas9mRNA。所述Cas9mRNA为编码序列表的序列6所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列7自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列7所示的RNA。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括所述的DNA分子。所述成套脱氧核糖核酸分子还可包括编码Cas9mRNA的DNA分子。所述Cas9mRNA为编码序列表的序列6所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列7自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列7所示的RNA。编码Cas9mRNA的DNA分子具体可为具有序列表的序列5自5’末端第24至4295位核苷酸的DNA分子，更具体可为序列表的序列5所示的分子。

本发明还保护一种特异性敲除绵羊FGF5基因的方法，是将所述能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA和Cas9mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊FGF5基因。所述Cas9mRNA为编码序列表的序列6所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列7自5’末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列7所示的RNA。所述共转染的方式具体可为共注射。所述绵羊细胞具体可为绵羊受精卵单细胞。

以上任一所述绵羊FGF5基因可为编码序列表的序列2所示的蛋白质的基因。以上任一所述绵羊FGF5基因具体可为序列表的序列1所示的DNA分子或序列表的序列1自5’末端第268至21110位核苷酸所示的DNA分子。

目前在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高，因此获得特异、高效的sgRNA成为绵羊基因组编辑培育的关键。本发明提供的sgRNA特异性较高且能够精确靶向修饰绵羊FGF5基因，实现基因突变。

本发明中，首次采用CRISPR/Cas9技术在绵羊受精卵中实现FGF5基因的精准修饰突变并获得基因编辑绵羊，利用这种方法不仅构建步骤简单，安全性高，而且大大降低了昂贵的实验成本和缩短实验周期，实现了绵羊优良基因重组和聚合，为绵羊大规模功能基因的分析和验证带来了希望，也为目前和今后绵羊分子细胞工程育种提供安全、精准的新方法。

本发明中，将sgRNA和Cas9mRNA显微注射动物受精卵，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合，而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在于生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。

本发明将新的CRISPR/Cas9基因组编辑技术与显微注射技术相结合，不仅使绵羊打靶效率更高更准确，而且在一个世代内首次实现了绵羊双基因敲除，大大促进了绵羊产肉、产毛双性能的改良，为绵羊新品种培育提供了更为广阔的空间和更有效的技术工具。

附图说明

图1为限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒后的1％琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为1kbDNAMarker。

图2为体外转录产物sgRNA_FGF5-1和sgRNA_FGF5-2的凝胶电泳图；泳道M为RNAMarker,泳道1和2依次为sgRNA_FGF5-1和sgRNA_FGF5-2。

图3为Cas9体外酶切法检测FGF5-sgRNA靶点效率的酶切电泳结果，泳道1和2分别为sgRNA_FGF5-1和sgRNA_FGF5-2相应的酶切电泳结果，泳道DNA为411bp的FGF5DNA片段，泳道M为DNAMarker。

图4为采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对进行PCR扩增的PCR扩增产物的电泳图；泳道M为1kbDNAMarker。

图5为Cas9mRNA的凝胶电泳图；泳道M为RNAMarker。

图6为绵羊胚胎FGF5基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；图6-A中，1F-37F为试验处理组各个样本靶标基因FGF5的PCR扩增产物，Con为注射Nuclease-freewater发育的囊胚，CK为水对照，泳道M为150bpDNAMarker；图6-B中，1F-37F为试验处理组各个样本靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因FGF5的非T7EN1酶切产物，泳道M为150bpDNAMarker。

图7为突变胚胎的编辑形式；黑色方框中碱基序列为sgRNA序列，下划线GGG为FGF5基因Cas9打靶的PAM序列。

图8为羔羊FGF5基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；图8-A为试验处理组出生的29只羔羊靶标基因FGF5的PCR扩增产物和对照处理组出生的羔羊(Con)，泳道M为150bpDNAMarker；图8-B中为试验处理组出生的29只羔羊靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因FGF5的非T7EN1酶切产物；泳道M为150bpDNAMarker。

图9为死亡羔羊GM003不同组织FGF5基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；图9-A为羔羊GM003不同组织中靶标基因FGF5的PCR扩增产物，Con为非基因编辑羊尾组织，泳道M为150bpDNAMarker；图9-B为羔羊GM003不同组织中靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Con为非基因编辑羊尾组织，泳道M为150bpDNAMarker。

图10为死亡羔羊GM1135不同组织FGF5基因巣式PCR产物和T7EN1酶切的电泳图；图10-A为羔羊GM1135不同组织中靶标基因FGF5的PCR扩增产物，Con为非基因编辑羊尾组织，泳道M为150bpDNAMarker；图10-B为羔羊GM1135不同组织中靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Positive为靶标基因FGF5的T7EN1酶切产物，Negative为靶标基因FGF5的非T7EN1酶切产物，泳道M为150bpDNAMarker。

图11A为突变羔羊的编辑形式；图11-B为死亡羔羊不同组织的编辑形式；黑色方框中序列为sgRNA序列，下划线GGG为FGF5基因Cas9打靶的PAM序列。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，详见《分子克隆(第三版)》。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。px330质粒：Addgene公司，货号为42330。RNA纯化试剂盒：LifeTechnologies公司，货号为AM1908。

实施例中的相关引物的核苷酸序列见表1(各引物均为单链DNA分子)。

表1FGF5基因相关引物的核苷酸序列

引物	序列(5’to 3’)
		FGF5-CF1	caccgAGAAGCGCCTCGCACCCAAA
FGF5-CR1	aaacTTTGGGTGCGAGGCGCTTCTc
		FGF5-CF2	caccgCCTCTCGGTGGCAGCCGGTC
FGF5-CR2	aaacGACCGGCTGCCACCGAGAGGc
		FGF5-TF1	ttaatacgactcactatagAGAAGCGCCTCGCACCCAAA
FGF5-TR1	AAAAGCACCGACTCGGTGCC
		FGF5-TF2	ttaatacgactcactatagCCTCTCGGTGGCAGCCGGTC
FGF5-TR2	AAAAGCACCGACTCGGTGCC
		FGF5-F1	TACGGAGCCCAGAACCAACCC
FGF5-R1	GACAGGTTCTGGAGGAGAGCA
		FGF5-R2	TATTGGCTTCGTGGGAGCCA

实施例1、制备sgRNA和Cas9mRNA

一、设计绵羊FGF5基因靶序列以及识别靶序列的sgRNA

绵羊FGF5基因全长序列如序列表的序列1所示，自5’末端第268至270位核苷酸为起始密码子，第21108至21110位核苷酸为终止密码子,第328至629位核苷酸为外显子1。绵羊FGF5基因编码的蛋白质如序列表的序列2所示。

设计2条sgRNA针对绵羊FGF5基因的靶序列(该靶序列在绵羊FGF5基因的外显子1上)，见表1中FGF5-TF1和FGF5-TF2中斜体部分。

二、制备sgRNA_FGF5

1、用限制性内切酶BbsI酶单酶切px330质粒，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳(酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳图见图1)，然后回收并纯化线性化的质粒。

2、将步骤1的纯化产物进行去磷酸化。

3、将引物FGF5-CF1和引物FGF5-CR1退火，得到两端均为粘末端的双链DNA分子。

4、将步骤2的产物与步骤3得到的双链DNA分子连接，得到重组质粒。

5、以步骤4得到的重组质粒为模板，采用FGF5-TF1和FGF5-TR1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列3所示。

6、取步骤5得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒(T7Kit，LifeTechnologies公司，货号为AM1354)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到sgRNA_FGF5-1。sgRNA_FGF5-1的凝胶电泳图见图2。sgRNA_FGF5-1如序列表的序列4所示。

7、参照步骤1至6，

利用引物FGF5-CF1、FGF5-CR1、FGF5-TF1、FGF5-TR1制备sgRNA_FGF5-1；

利用引物FGF5-CF2、FGF5-CR2、FGF5-TF2、FGF5-TR2制备sgRNA_FGF5-2。

8、采用Cas9体外酶切法检测gRNA靶点效率试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司，货号为VK007-10-VK007-22)在体外无细胞系统对作用FGF5靶序列的2条sgRNA(sgRNA_FGF5-1和sgRNA_FGF5-2)的突变效率进行评估预测,结果见图3，筛选到效果最好的sgRNA_FGF5-1。

四、制备Cas9mRNA

1、以px330质粒为模板，采用Cas9-F(下划线标注T7启动子)和Cas9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(4311bp)。PCR扩增产物的电泳图见图4。经测序，PCR扩增产物如序列表的序列5所示。序列表的序列5中，自5’末端第24-4295为Cas9的开放阅读框。编码序列表的序列6所示的Cas9蛋白。

Cas9-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3’；

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒(LifeTechnologies公司的T7UltraKit,货号为AM1345)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒纯化回收，得到Cas9mRNA。Cas9mRNA的凝胶电泳图见图5。Cas9mRNA如序列表的序列7所示。Cas9mRNA自5’末端第7至4278位核苷酸为编码区。

实施例2、sgRNA/Cas9mRNA突变效率检测

一、绵羊受精卵的获得

1、卵母细胞的成熟

从屠宰场采集绵羊卵巢(卵巢来自哈萨克羊)，用生理盐水灭菌清洗3-4次，抽取卵母细胞，用成熟液洗涤3-4次，然后滴入平衡好的成熟液滴(成熟液滴的体积为75-78μl，每滴滴入25-30枚卵母细胞)，放入含5％CO₂的38.6℃培养箱中培养(以下培养箱培养均为该相同条件)。

平衡成熟液：将成熟液滴在培养箱中放置2h。成熟液：TCM199培养液+体积百分含量为10％的FBS+0.05IU/mlFSH+0.05IU/mlLH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素。

2、卵母细胞的体外受精

(1)将体外成熟24-26h的卵母细胞取出，用0.1％透明质酸酶轻轻吹打以除去颗粒细胞，再用受精液洗涤3次，然后放入平衡好的受精液滴内(每个受精液滴为50-70μl体外受精液，放入20-30枚卵母细胞)。

平衡受精液：将受精液滴在培养箱中放置3-4h。受精液：SOF液+体积百分含量为20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素。SOF液：含6.29mg/mlNaCl、0.534mg/mlKCl、0.162mg/mlKH₂PO₄、0.6μl/ml乳酸钠、0.089mg/mlMgSO₄、2.1mg/mlNaHCO₃、0.0357mg/ml丙酮酸钠和0.299mg/mlCaCL₂·2H₂O，溶剂为水。

(2)取冷冻的精液(精液来自哈萨克羊)，水浴解冻，移入平衡好的受精液中，放入培养箱中20-25min(有活力的精子会向上游)，然后吸取上部的精液，以1500rpm的转速离心4-5min，弃去上清液，得到精子沉淀(进行精子计数)。

(3)将步骤(2)得到的精子加入完成步骤(1)的受精液滴中，使精子的浓度为(2-4)×10⁶个/ml，38.6℃静置孵育12-18h，用平衡好的培养液反复吹吸受精卵，然后按50-70枚/孔的密度移入四孔培养板内。

平衡好的培养液的制备方法：将培养液在培养箱中，放置3-4h。培养液：SOF液+3mg/mlBSA。

受精后48h统计卵裂率，第8d统计囊胚率。

二、单细胞期受精卵的显微注射

1、将实施例1制备的sgRNA_FGF5-1和Cas9mRNA混合(用Nuclease-freeWater调整终浓度分别为25ng/μL和100ng/μL)。

2、试验处理：采用NIKON公司的显微注射仪将步骤1得到的混合液注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内(每个受精卵注射80-100pL混合液)，置于培养箱中培养。对照处理：采用NIKON公司的显微注射仪将Nuclease-freeWater注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵胞质内，置于培养箱中培养。

3、胚胎中靶基因编辑效率检测

(1)胚胎样品收集

步骤2中培养7d后，取胚胎，用PBS缓冲液洗涤2遍，然后置于5μL裂解液中，瞬时离心后37℃孵育3h。裂解液：溶剂为Tris-HCl(50mM、pH8.0)，含0.5％(V/V)TritonX-100和1mg/mLProteinaseK。

(2)PCR扩增

以步骤(1)的裂解产物为模板进行巢式PCR。第一轮PCR扩增采用FGF5-F1和FGF5-R1组成的引物对，第二轮PCR扩增采用FGF5-F1和FGF5-R2组成的引物对，巣式PCR产物的电泳图见图6-A(片段长度为411bp)。

(3)T7核酸内切酶(T7E1)鉴定

分别将步骤(2)得到的对照组和处理组PCR产物等量混合，进行变性退火，形成异源杂交双链。退火程序：95℃10min；85℃、75℃、65℃、55℃、45℃、35℃、25℃各1min(降温速率0.3℃/s)；10℃Pause。

在退火产物中加入T7E1酶(NEB)，37℃孵育30min，酶切产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。

结果见图6-B，处理组中发生突变的样品出现两种片段(大约140bp和271bp)，而未发生突变的样品和对照组仅一种片段(411bp)。T7EN1酶切结果表明(见表2)：绵羊胚胎发生FGF5基因删除/插入突变效率为37.4％，且基因敲除对绵羊胚胎发育无致死性，证明DNA分子被Cas9和sgRNA特异性编辑。

表2CRISPR/Cas9靶向删除FGF5基因mRNA显微注射绵羊体外胚胎结果

注：2cell、4cell、8cell、>16cell均代表胚胎发育的不同阶段，具体如下：2cell代表2细胞时期、4cell代表4细胞时期、8cell代表8细胞时期，>16cell代表16细胞时期以后。

(4)TA克隆测序比对

将上述酶切为阳性的PCR产物分别克隆至pMD-19T载体，随机挑取9-11个单克隆测序来精确定位突变位点。发生突变的胚胎的编辑形式见表3(突变类型指的是存在几种突变形式)和图7(序列后的注释形式为“n/m”，n表示该编辑形式数量，m表示所挑取的单克隆总数)。分析结果表明：在绵羊胚胎中能高效特异地靶向修饰FGF5基因，98个单克隆中79个克隆发生了突变且切割位点均毗邻PAM序列，这79个突变克隆中包含16种突变形式，其突变类型主要以18bp、107bp碱基删除为主。

表3CRISPR/Cas9靶向删除FGF5基因胚胎单克隆测序比对结果

胚胎编号	突变数/总克隆数	突变类型	突变形式	胚胎阶段
					9F43	10/10	2	-107；-107,-3	囊胚
9F44	0/10	0	/	囊胚

9F45	9/9	2	-6；-25,+4	囊胚
					9F46	10/10	2	-13；-10,+8	囊胚
9F47	10/11	3	-1,-13,-18	囊胚
					9F48	10/10	2	-66；-66,+4	囊胚
9F49	9/9	2	-19,-39	囊胚
					9F50	6/9	2	-18,-32	囊胚
9F74	5/10	1	-28	桑葚胚
					9F75	10/10	2	-12；-26,+1	桑葚胚
合计:10	79/98＝81％	/	16	/

实施例3、基因编辑羊的生产

1、实验羊选择

选取体况优良、无繁殖疾病且在2-4岁的新疆细毛羊做供体母羊。选取体重在50kg以上，年龄为2-4岁，膘情好、无繁殖疾病的阿勒泰羊做受体母羊。选取体重在70-85kg，精液检测优良且在1-3岁纯种新疆细毛羊做采精公羊。

2、同期发情与超数排卵

绵羊发情周期内，供体母羊阴道放入CIDR阴道栓，放入CIDR阴道栓的第10天开始以递减的方式连续注射FSH(中国宁波三生公司)，每隔12h注射一次，共3天，总剂量为240单位/只，在第12天早上取出CIDR栓,清洗阴道，并肌肉注射PG0.1mg(中国宁波三生公司)。撤栓12h后开始用公羊试情，早晚各试情一次，间隔12h，供体母羊发情时注射LH200IU/只(中国宁波三生公司)。

受体母羊与供体母羊同步埋植CIDR，在供体母羊撤栓前12h撤除CIDR，每只注射330IUPMSG(中国宁波三生公司)，撤栓12h后每天早晚各2次用试情公羊试情，详细记录发情时间。

3、人工授精

人工采精公羊的精液,镜检,活率达0.8以上方可用于输精。对发情12-19h的供体母羊进行人工授精。

4、原核胚的获得

供体母羊输精后19-21h,手术法从输卵管中冲取原核胚。挑选出胞质均匀、形态规则、完整且致密的未卵裂的原核胚(单细胞期)。

5、将实施例1制备的sgRNA_FGF5-1和Cas9mRNA混合(用Nuclease-freeWater调整终浓度分别为25ng/μL和100ng/μL)。

6、试验处理：采用NIKON公司的显微注射仪将步骤5得到的混合液注射入步骤4得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内(每个受精卵注射80-100pL混合液)，置于培养箱中培养。

7、胚胎移植及妊娠检测

原核胚卵裂至2-4细胞时，将胚胎移植到同期发情处理的受体母羊的输卵管中，每侧输卵管移植1-2枚胚胎，移植60天后对受体母羊进行B超妊娠诊断。

8、靶向删除MSTN、FGF5基因编辑羊的鉴定

(1)DNA提取及PCR扩增

羔羊出生后一周左右，采集羔羊尾组织样品，提取基因组DNA，用FGF5-F1和FGF5-R2组成的引物对进行PCR扩增。PCR产物的电泳图见图8-A(片段长度为411bp)。

采集2只死亡羔羊的组织样品(分别采集耳组织、尾组织、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮肤、肱二头肌)，提取基因组DNA，用FGF5-F1和FGF5-R2组成的引物对进行PCR扩增。死亡羔羊GM003PCR产物的电泳图见图9-A。死亡羔羊GM1135PCR产物的电泳图见图10-A。

(2)T7核酸内切酶(T7E1)鉴定

方法同实施例2的步骤二的3的(3)。

羔羊出生后一周左右，采集羔羊尾组织样品的T7E1鉴定结果见图8-B。

死亡羔羊GM003的T7E1鉴定结果见图9-B。死亡羔羊GM1135的T7E1鉴定结果见图10-B。

(3)PCR产物测序及TA克隆测序比对

方法同实施例2的步骤二的3的(4)。

T7EN1酶切及测序结果表明(见表4)：在生产的29只羔羊中有17只羔羊发生FGF5基因删除/插入突变,阳性率高达58.62％，且目前长势良好。

表4CRISPR/Cas9靶向删除FGF5基因mRNA显微注射生产基因编辑绵羊结果统计

发生突变的羔羊测序的结果见图11(序列后的注释形式为“n/m”，n表示该编辑形式数量，m表示所挑取的单克隆总数)。图11A为突变羔羊的编辑形式；图11-B为死亡羔羊不同组织的编辑形式。挑取T7EN1酶切阳性的17只羔羊共计617个单克隆测序，结果表明：发生FGF5基因突变的位置均毗邻PAM序列，包含21种突变形式，其突变类型主要以28bp碱基删除为主,其次为32bp碱基删除，最长删除片段为48bp；在两只死亡羔羊的不同组织均发生了FGF5基因突变，且突变类型也以28bp碱基删除为主，表明不同组织中FGF5基因突变类型具有一致性。

Claims

1.能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA，为序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸的RNA。

2.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA为序列表的序列4所示的RNA。

3.编码权利要求1中所述sgRNA的DNA分子。

4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为序列表的序列3所示的DNA分子。

5.一种能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的靶向序列，为序列表的序列1自5’末端第335至354位核苷酸。

6.一种特异性敲除绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求1或2所述的sgRNA。

7.一种特异性敲除绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求1或2所述的sgRNA和Cas9mRNA。

8.一种特异性敲除绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求3或4所述的DNA分子。

9.一种特异性敲除绵羊FGF5基因的成套核酸分子，包括权利要求3或4所述的DNA和编码Cas9mRNA的DNA分子。

10.一种特异性敲除绵羊FGF5基因的方法，是将权利要求1或2所述的sgRNA和Cas9mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊FGF5基因。