CN110184301A - 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过Tild‑CRISPR实现高效精确的靶向整合策略，具体地，本发明提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述反应体系包括：供体DNA，所述供体DNA为双链；Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体。本发明提供的靶向整合策略的基因编辑效率显著高于其他现有的基因编辑技术，且它对插入片段没有长度的限制。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种通过Tild-CRISPR实现高效精确的基因靶向整合系统及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法极大地促进了基因突变的细胞和组织的原位校正。然而，通过同源重组(HR)实现的精确敲入效率通常是比较低的。在以往的研究中，非同源末端连接(NHEJ)或微同源臂介导的末端连接(MMEJ)为基础的方法被报道称通过体内切割获得没有同源臂或者短同源臂(5-25bp)的转基因供体促进了斑马鱼和小鼠中CRISPR介导的靶向整合。
然而，针对最有用的带有条件性等位基因的转基因模型小鼠以及人类胚胎中的基因敲入还没有被这些新方法实现。一个使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的靶向策略Easi-CRISPR被报道称可以有效地获得带有条件性等位基因的小鼠(Quadros et al.,2017)。然而，使用ssDNA作为供体的Easi-CRISPR花费很大并且在插入片段上有长度限制(通常是小于1kb)。
因此，本领域迫切需要开发出一种可以用于小鼠以及人类的高效精确的基因靶向整合策略。
发明内容
本发明的目的就是提供一种通过Tild-CRISPR实现的高效精确的基因靶向整合策略。
在本发明的第一方面，提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述反应体系包括：
a)供体DNA，所述供体DNA为双链；
b)Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和
c)sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体；
其中，所述的供体DNA具有从5’到3’的式I结构：
E1-R1-L1-Z-L2-R2-E2 (I)
式中，
E1代表无或5’端酶切以后的残留序列；
R1代表5’端的同源臂；
L1为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
Z代表待整合的靶基因；
R2代表3’端的同源臂；
L2为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
E2代表无或3’端酶切以后的残留序列；
其中，所述的R1与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的R2与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。
在另一优选例中，所述的gRNA靶向结合于所述基因组的靶位点。
在另一优选例中，所述的gRNA和所述cas9蛋白对所述基因组的靶位点进行定点切割。
在另一优选例中，所述待整合的靶基因Z的序列长度为1bp-20kb。
在另一优选例中，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0-20bp，较佳地0-10bp，更佳地0-5bp，最佳地0bp。
在另一优选例中，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为100-2000bp，较佳地100-1500pb，更佳地200-1000bp，最佳地700-900bp。
在另一优选例中，所述同源臂R1的序列长度D1和同源臂R2的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)。
在另一优选例中，|D1-D2|/D1≤1/4，或|D1-D2|/D2≤1/4。
在本发明的第二方面，提供了一种基因靶向整合的方法，所述方法包括：
(i)提供一待基因靶向整合的细胞；和
(ii)将a)供体DNA；b)Cas9蛋白或其编码核酸；和c)sgRNA导入所述待整合的细胞内，进行基因整合，从而获得靶向基因整合的细胞。
在另一优选例中，所述细胞是体细胞、卵细胞、合子(受精卵细胞)。
在另一优选例中，所述的体细胞选自下组：神经细胞、免疫细胞(如T细胞、NK细胞)、内皮细胞、多能干细胞、专能干细胞、巨噬细胞。
在另一优选例中，所述导入方法是电转、显微注射。
在另一优选例中，所述方法是体外方法。
在另一优选例中，所述待整合的细胞是受精卵细胞。
在另一优选例中，所述导入方法是直接向单细胞内注入，所述注入的供体DNA为40-100ng/μl，Cas9mRNA为80-120ng/μl，sgRNA为30-70ng/μl。
在另一优选例中，所述方法是一种体外方法，所述方法是非诊断性和非治疗性的。
在本发明的第三方面，提供了一种用于基因靶向整合的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)第一容器以及位于第一容器内的供体DNA，所述供体DNA为双链；
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas9蛋白或其编码核酸或表达Cas9蛋白的第一表达载体；和
iii)第三容器以及位于第三容器内的sgRNA或表达sgRNA的第二表达载体。
在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器和第三容器中的任何二个或三个(或全部)可以是相同或不同容器。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Tild-CRISPR介导的小鼠胚胎的靶向整合数据。
图2显示了通过Tild-CRISPR在不同位点获得基因敲入小鼠的示意图，以及通过Tild-CRIPSR获得的基因编辑小鼠的序列分析。
图3显示了通过Tild-CRISPR获得Nr3c2和Lhx6条件性敲除小鼠。
图4显示了通过Tild-CRISPR方法在体内进行基因组编辑的示意图。
图5显示了Tild-CRISPR介导的人胚胎的靶向整合的结果。
图6显示了Tild-CRISPR介导的基因敲入示意图以及转基因靶向整合的不同靶向策略的比较。
图7Tild-CRISPR介导的小鼠胚胎的靶向整合在囊胚阶段的荧光图片和序列分析。
图8显示了Tild-CRISPR构建的Founder小鼠的基因型分离分析。
图9显示了Tild-CRISPR方法获得的Cdx2-p2A-mCherry小鼠的Southern Blot印迹分析。
图10显示了Tild-CRIPSR介导的靶向人OCT4基因整合的基因型分析。
图11显示了Tild-CRIPSR介导的靶向人OCT4基因整合的对等位基因的基因型分析。
图12显示了Tild-CRISPR介导的人类胚胎中的双靶向整合示意图、实验设计以及结果分析。
图13显示了Tild-CRISPR介导的人类单卵裂球中的双靶向整合的结果。
以上所有附图中，intron代表内含子，extron代表外显子。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次意外地发现了一种Tild-CRISPR(线性化dsDNA-CRISPR介导的靶向整合)靶向策略，通过体外PCR扩增或者精确酶切获得含有800bp同源臂的转基因供体，在小鼠胚胎、小鼠大脑以及人胚胎中实现了高效的DNA靶向整合。在此基础上完成了本发明。
术语
CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(sgRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统。
Tild-CRISPR机制(Targeted integration with linearized dsDNA-CRISPR)
在本发明的Tild-CRISPR靶向整合策略中，提供了一种含有长同源臂的线性化供体(即Tild供体)，这种供体是通过PCR扩增或者精确酶切获得的含有800bp同源臂的转基因供体；将Tild供体与Cas9mRNA以及single-guide RNA一起注射到小鼠受精卵中。本发明提供的Tild-CRISPR靶向整合策略相比于已有的基因靶向策略具有更高的DNA敲入效率；并且没有插入片段长度的限制，从0.8kb到6.0kb，都可以被精确地整合到不同的位点。
在本发明中，在CRISPR介导的基因组编辑中由转基因片段以及两边的800bp同源臂组成的线性化dsDNA供体是实现高效基因敲入的关键因素。与MMEJ(微同源臂介导的末端连接)或HMEJ(同源臂介导的末端连接)介导的方法相比，Tild-CRISPR跳过了转基因供体体内切割的步骤，因此导致了很高的基因敲入效率。正如图6所概括(图6)，因为Tild供体的片段与通过CRISPR介导的体内切割获得的MMEJ和HMEJ供体片段非常相似，所以可以推测MMEJ或HMEJ通路可能参与到Tild-CRISPR中。对于传统的HR供体，它是一个环状的质粒或者一个线性化的大量部分垃圾序列的供体，通过同源重组的方式实现转基因的敲入。
在一实施方案中，在小鼠胚胎中，MMEJ或HMEJ介导的靶向整合优于HR介导的靶向整合，因为HR的抑制剂对Tild-CRISPR介导的转基因整合没有效果。因此,通过CRISPR介导的体内切割移除或者通过限制性酶切除HR供体的垃圾序列可以促进转基因的靶向整合。使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的Easi-CRISPR策略，单链退火(SSA)因素可能是涉及到ssDNA供体介导的修复。
反应体系
本发明提供了一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，所述的反应体系包括：
a)供体DNA，所述供体DNA为双链；
b)Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和
c)sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体；
其中，所述的供体DNA具有从5’到3’的式I结构：
E1-R1-L1-Z-L2-R2-E2 (I)
式中，
E1代表无或5’端酶切以后的残留序列；
R1代表5’端的同源臂；
L1为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
Z代表待整合的靶基因；
R2代表3’端的同源臂；
L2为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
E2代表无或3’端酶切以后的残留序列；
其中，所述的R1与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的R2与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。
在本发明中，待整合的靶基因Z的序列长度可以是1bp-20kb。本发明的优点在于反应体系中供体DNA对于靶基因的序列长度相比于现有技术，不受明显限制。例如，其既可以实现靶基因的点突变，也可以向切割位点插入长达20kb的靶序列。本发明的供体DNA中靶基因的长度可以是1bp-20kb；更优选地，可以是0.5kb-10kb；在优选的实施方式中，可以是0.8kb-6.0kb。
在本发明中，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0-20bp，较佳地0-10bp，更佳地0-5bp，最佳地0bp。
在本发明中，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为100-2000bp，较佳地100-1500pb，更佳地200-1000bp，最佳地700-900bp。在另一实施方式中，所述同源臂R1的序列长度D1和同源臂R2的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)。在另一优选例中，|D1-D2|/D1≤1/4，或|D1-D2|/D2≤1/4。在本反应体系中，对两个同源臂的序列长度并不要求完全一致，其两者之间允许存在一定的长度差。
本发明的主要优点包括：
1)Tild-CRISPR方法的基因敲入效率显著高于其他现有的基因编辑技术，且它对插入片段没有长度的限制。
2)载体构建方便，可以用于多个系统，包括体外细胞，胚胎及体内组织细胞。
3)导入方式简便，可通过电转或者显微注射方式导入，适用于原代细胞导入，如血细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和NatalieSherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
1.小鼠
B6D2F1(C57BL/6X DBA2J)小鼠(7-8周)被用于受精卵收集。ICR雌鼠被用于受体。E14.5怀孕ICR小鼠用于子宫内的电转。动物的使用和照料都在中国科学院上海生命科学研究院动物伦理委员会的指导下。
2.人类受精卵的来源
这项研究使用的废弃的人类胚胎是由仁济医院提供的，经过上海交通大学仁济医院ART伦理委员会批准，并且得到了所有参与者的同意。
3.线性化供体的构建
为了构建Actb位点的Tild供体(转基因DNA两侧连接不同长度的同源臂),包含了800bpHAL-p2A-mCherry-800bpHAR的Actb-HR供体载体(Addgene编号no.97317)通过HindIII和Xho I两个限制性内切酶切割或者PCR扩增进行线性化处理，并且用胶回收试剂盒(Omega，D2500-02)纯化。
为了构建Actb位点的JS-2000供体(800bpHAL-转基因DNA-800bpHAR两侧连接2000bp的垃圾序列),包含了800bpHAL-p2A-mCherry-800bpHAR的Actb-HR供体载体(Addgene编号no.97317)通过限制性内切酶切割或者并且用胶回收纯化。为了构建Actb位点的JS-200和JS-800供体，以Actb-HR供体载体为模板，通过PCR扩增出含有不同长度垃圾序列的线性化供体。
为了构建人OCT4/GATA6位点的Tild供体，供体载体(800bpHAL-intron 4-exon 5-p2A-GFP-polyA-800bpHAR for Oct4,800bpHALp2A-mCherry-800bp HAR for GATA6)通过上面描述的PCR扩增以及胶回收纯化进行线性化处理。
4.ssDNA供体的构建
Actb位点的ssDNA供体是由Actb-HR供体载体通过之前描述的IvTRT方法制备的(Miura et al.,2015)。通过T7启动子和T7RNA聚合酶，使用mMESSAGE mMACHINE T7ULTRAkit(Life Technologies)进行体外转录。然后使用MEGAclear kit(Life Technologies)进行纯化。cDNA(ssDNA)由逆转录酶(Takara，2641A)合成并且RNA模板被RNsaeH降解(NEB，M0297)。
5.Cas9mRNA和sgRNA的生产
T7启动子通过PCR扩增px260加到Cas9编码区域，使用引物Cas9IVT_F和IVT_R(表S1)。纯化后的T7-Cas9 PCR产物被用作体外转录(IVT)的模板，使用mMESSAGE mMACHINET7ULTRA kit(Life Technologies)进行转录。T7启动子通过PCR扩增px330加到sgRNA模板上，引物在表S1中。以此为模板，选用MEGAshortscript T7kit(Life Technologies)进行sgRNA的体外转录。转录后的Cas9mRNA和sgRNA都使用MEGAclear kit(Life Technologies)进行回收纯化并用溶解在RNase-free水。
6.受精卵注射、胚胎培养和胚胎移植
对于小鼠基因编辑，选取7-8周龄的B6D2F1(C57BL/6 X DBA2J)雌鼠进行超排。每只腹腔注射5 IU孕母马血清促性腺激素(PMSG)，48小时后注射同等剂量的5IU人体绒毛膜促性腺激素(hCG)，然后立即与B6D2F1雄鼠交配。合子胚胎在注射hCG后的20h后从输卵管中进行收集。
对于受精卵注射，Cas9mRNA(100ng/μl)、sgRNA(50ng/μl)和一系列浓度的线性化供体(Tild-HA800，100or 25ng/μl；Tild-HA20，33ng/μl)混合，注射到可观察到明显原核的受精卵的胞质内。受精卵在含有5μg/ml细胞松弛素(CB)的HEPES-CZB操作液中，注射使用FemtoJet microinjector(Eppendorf)仪器，持续液流模式。注射后的胚胎在含氨基酸的KSOM培养基中，37℃、5％CO2的环境下培养至囊胚，随后进行荧光观察以及基因型鉴定。
对于Nu7026(Selleck)和SCR7(Selleck)处理，2mM Nu7026或不同浓度(1、2、4mM)的SCR7与Tild—CRISPR组分混合注射到受精卵的胞质中。对于咖啡因(Sigma Aldrich)处理，注射的受精卵在含有1mM咖啡因的KSOM培养基中培养1天，然后转移到新鲜的KSOM中。
为了获得基因敲入小鼠，注射后的受精卵培养至2-细胞阶段，然后25-30枚2-细胞胚胎移植至0.5天的ICR假孕母鼠的输卵管中。
7.胚胎和小鼠基因型分析
我们在体视显微镜下用玻璃管进行收集和转移单个胚胎。根据荧光选取单个胚胎并转移至单个PCR管中。3μl裂解液(0.1％tween20、0.1％TritonX-100和4μg/ml蛋白酶K)加入PCR管中。样本在56℃中反应30min，随后95℃5min热失活蛋白酶K。PCR扩增使用巢式引物(表S1)。ExTaq在95℃、3分钟的条件下被激活，然后第一轮PCR的程序为95℃30s，60℃30s和72℃1min，这样反复30个循环后，最终72℃延伸10min。第二轮PCR反应用上一轮的1μl PCR产物为模板，PCR反应体系与上一轮一样。最终的PCR产物切胶回收并且测序。
对于小鼠基因型分析，使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN，DP304-03)从小鼠脚趾或尾巴组织中提取基因组DNA。PCR使用可以扩增出正确靶向接合处的引物(表S1)。ExTaq在95℃、3分钟的条件下被激活，然后PCR的程序为95℃30s，60℃30s和72℃1min，这样反复38个循环后，最终72℃延伸10min。PCR产物切胶回收并且测序。
8.体外Cre重组
10μl的反应体系，包含300ng基因组DNA和2反应单位的重组Cre重组酶(NEB，M0298)，在缓冲体系中37℃孵育1h。1μl的Cre反应混合物被用作PCR的模板，使用基因特异的引物进行扩增。对于Nr3c2，引物F3和R3用于检测删除缺失的片段产物，而引物cF1和cF2用于检测环状产物。
9.子宫内电穿孔转染
子宫内电转的实验步骤均根据之前文献报道的进行操作(Takahashi et al.,2008)。用戊巴比妥钠(50mg/Kg，Sigma)麻醉E14.5怀孕母鼠。终浓度1μg/μl的表达Actb-sgRNA-spCas9-GFP的质粒与线性化供体(Tild-HA800，500ng/μl或250ng/μl；Tild-HA200，250ng/μl或125ng/μl)混合。作为对照，线性化的供体与表达Actb-sgRNA-GFP的质粒混合。质粒用0.005％fast green solution(Sigma)注射到小鼠胚胎的侧脑室。电转时，用仪器ECM830(BTX)，电压35V，时长50ms，间隔950ms电击5次。然后子宫角重新放回腹腔，让胚胎在子宫中继续发育至特定时间点。
10.小鼠免疫染色
免疫染色实验中，小鼠通过蠕动泵(Gilson)先用0.9％生理盐水，后用4％多聚甲醛进行心脏灌流，然后在4℃固定过夜。然后组织用30％的蔗糖脱水直到沉到管子底部。用Leica CM1950-Cryostat将大脑组织切成40μm的厚度。脑片用0.1M磷酸缓冲液(PB)洗三遍，然后用5％NGS稀释的一抗：goat anti-GFP(1:500，GeneTex)和rabbit anti-mCherry(1:3000，GeneTex)4℃孵育过夜。第二天，脑片用PB洗三遍，然后在回转式摇床上用二抗：FITC-AffiniPure donkey Anti-goat IgG(1:500，Jackson Immunoresearch)和Cy3-AffiniPuredonkey Anti-Rabbit IgG(1:500，Jackson Immunoresearch)室温孵育两小时。最后脑片用DAPI复染20分钟，在载玻片上用SlowFade Diamond Antifade Mountant(Life)进行封片。
11.人类卵子获取和精子准备
从卵泡液中迅速而准确地分离出卵母细胞复合体(COCs)在G-IVF(Vitrolife，Sweden)培养3小时。精液样本在卵母细胞获取的同一天收集，3-5天的禁欲后通过手淫获取。精液在37℃液化30分钟，然后通过传统的密度梯度法分离。在第二次离心后，精子被0.5ml的G-IVF覆盖并且孵育游泳30分钟。上清被用来进行受精的。患者在取卵前已经签署了剩余配子捐献的知情同意书。
12.体外受精(IVF)和人类胚胎转移
卵母细胞复合体COCs放置在4孔板中，以每个卵细胞大约100000活力精子的比例进行受精，选择三原核(3PN)胚胎进行后续实验。来自Vitrolife(G-IVF，G1，和G2；Scandinavicn IVF Science，Sweden)的连续培养基被用于所有的步骤。
13.人体胚胎注射和培养
对于人类胚胎注射，在体外受精IVF后的24小时，将Cas9mRNA(100ng/μl)，靶向Oct4和GATA6的sgRNAs(50ng/μl)和靶向Oct4和GATA6的Tild供体(30ng/μl)混合物共注到人的三原核胚胎的胞质中。胚胎在G1培养液中通过FemtoJet microinjector(Eppendorf)仪器的持续液流模式完成注射。注射后的胚胎在G2培养基中，37℃、5％CO2的环境下培养至囊胚，随后进行荧光观察以及基因型鉴定。
14.单细胞PCR
4-16细胞阶段的胚胎用台式酸acid Tyrode消化透明带，然后转移到0.25％的胰蛋白酶中，轻轻地吹打分离成单个的卵裂球。最后，卵裂球在CZB中冲洗8-10次然后转移到单个PCR管中。胚芽被洗了在CZB中，8到10次，然后分别转移到PCR管中。2μl裂解液(0.1％tween20、0.1％TritonX-100和4μg/ml蛋白酶K)加入PCR管中。样本在56℃中反应30min，随后95℃5min热失活蛋白酶K。裂解产物作为巢式PCR的模板，扩增使用巢式引物(表S1)。PCR产物切胶回收并且测序。
15.人类胚胎免疫染色
人胚胎先用0.9％生理盐水孵育，然后用4％多聚甲醛室温固定15min。接下来，胚胎用含有5％FBS的PBST封闭1小时，然后用一抗孵育：chicken anti-GFP(1:500，GeneTex)and rabbit anti-OCT4(1:3 000，GeneTex)4℃孵育过夜。第二天，胚胎用PB洗三遍，然后在回转式摇床上用二抗：488-AffiniPure goat Anti-chicken IgG(1:500，JacksonImmunoresearch)和Cy3-AffiniPure goat Anti-Rabbit IgG(1:500，JacksonImmunoresearch)室温孵育两小时。最后胚胎用DAPI复染15分钟，然后准备荧光观察。
16.Southern印迹分析
从Cdx2-p2A-mCherry小鼠中获得的10g基因组DNA被限制性内切酶EcoRI消化。被消化的基因组DNA通过0.8％琼脂凝胶分离并转移到Zeta-Probe GT Blotting Membranes(Bio-Rad，162-0196)。Southern印迹分析是用磷32放射性同位素系统。膜与内部mCherry探针进行杂交(SEQ ID NO:119，5’atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa3’)。内部mCherry探针预期的条带大小：WT＝N/A，Targeted＝4.2kb。
17.细胞培养和转染
小鼠胚胎干细胞(129/Sv x C57BL/6ES细胞)用2i培养基，成分为杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco，11965-02)、15％胎牛血清(FBS)(Gibco)、1000U/ml小鼠Lif、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1μM PD0325901和3μM CHIR99021。N2a细胞用DMEM(Gibco，11965-02)加上10％FBS(Gibco)进行培养。所有细胞都在5％CO2、37℃下培养。小鼠胚胎干细胞和N2a细胞用Lipofectamine3000试剂(Invitrogen)根据说明书的指导进行转染。六孔板的每个孔，使用的质粒总量为5μg(Cas9：供体＝1：1)。48小时后，转染阳性的小鼠胚胎干细胞和N2a细胞用BD FACS AriaII流式细胞仪分选并种至六孔板，进行后续培养和分析。
在小鼠的细胞和N2a细胞中，1μM SCR7(Selleck)和4mM咖啡因(Sigma Aldrich)在转染前1天分别加到培养基中并在转染后持续处理2天。
18.量化和统计分析
对神经元细胞内的相对效率进行量化，通过统计随机视野内GFP+细胞中mCherry+细胞比例来说明相对敲入效率。作为对照，线性化的供体与表达Actb-sgRNA-GFP的质粒混合。结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均数±标准差表示。数据点用黑点表示。*P<0.05，***P<0.001，不配对T检验。
对培养细胞中基因敲入效率进行量化，通过流式细胞术统计在所以细胞中mCherry+细胞比例来说明敲入效率。结果用平均数±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。
对于统计分析，所有的细胞系(mES细胞和N2a细胞，图6A)和神经元细胞(图4)的统计值被呈现为平均数±标准差。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，不配对T检验。所有的胚胎通过每个柱上的数字表明统计的胚胎(小鼠胚胎，图1C，图1F和图6B；人类胚胎，图5F)或卵裂球(图5E)总数。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，卡方检验。
实施例1：通过Tild-CRISPR方法在小鼠胚胎中进行基因组编辑
本实施例检测了提前在体外通过两个限制性酶酶切获得含有长同源臂的线性化供体(称为Tild供体)是否可以进一步提高基因敲入效率。将Tild供体的效率与两种其他常用类型的供体相比，一个是同源臂介导的末端连接(HMEJ)供体(sgRNA靶向位点加800bp同源臂)，另一个是HR供体(只含有800bp同源臂)(图1A)。在Actb基因的终止密码子处融合一个p2A-mCherry报告基因(图1A)。每种类型的转基因供体和Cas9mRNA，靶向Actb基因的sgRNA一起注入小鼠受精卵中，注射过的受精卵培养到囊胚(图1B)。敲入效率通过观察囊胚的mCherry荧光信号进行评估(图1B和S1A)。
结果如图，相比HMEJ供体(20.5％)和HR供体(0％)，可以观察到Tild供体获得更高比例的mCherry阳性囊胚(36.6％)(图1C和S1A)。
与传统的线性化HR供体(JS2000)相比，Tild供体在同源臂相邻位置不含有非同源序列。本发明人在Tild供体两端加上不同长度的JS(200bp、800bp和2000bp)(图1A)，以检测供体的非同源源序列(已知为“垃圾序列”,JS)是否会降低转基因整合的效率。结果显示，随着JS长度的增加，敲入效率从36.6％(没有JS)下降到4.9％(2000bp JS)(图1C)。此外，通过PCR扩增获得的含有长同源臂的转基因供体与酶切获得的Tild供体在Actb位点表现出相似的敲入效率(图1D)。同时也检测了一种有效的靶向策略Easi-CRISPR所使用的长单链DNA供体(Quadros et al.,2017)，结果只观察到相对较低的mCherry阳性囊胚率(12.7％)(图1C)。
在本实施例中，通过在靶向基因的最后一个外显子融合p2A-mCherry报告基因，还检测了其他一些位点处Tild-CRISPR介导的敲入效率，包括Nanog(多能性标记基因)，Sox2(多能性标记基因)，Cdx2(滋养外胚层标记基因)(图1E)。结果显示，在这三个位点中，相对于HR或HMEJ介导的方法，Tild介导的方法都展现出较高的敲入效率(图1F)。结果还显示，800bp同源臂供体的敲入效率一般高于20bp同源臂供体(图1F)。通过Tild-CRISPR获得的单个mCherry阳性囊胚的基因型分析显示在5’和3’连接处几乎所有的整合都是精确的符合读码框的整合(图7)。
本实施例还测试了Tild-CRISPR用于获得基因敲入小鼠的效率。将Tild-CRISPR处理后的胚胎移植到假孕的小鼠体内，可以成功地在6个不同的位点获得基因编辑的敲入小鼠，包括mCherry整合到Dbh位点(6/29)和Cdx2位点(31/57)，Cre整合到Sp8位点(10/35)，CAG-LSL-ChR2-Tdtomato(6.0kb)整合到Rosa26位点(2/29)和条件性floxed等位基因在Nr3c2位点(3/16)和Lhx6位点(4/12)(图2、3和表1)。这些基因编辑小鼠的精确整合通过DNA测序分析被证实(图2B、3C和3D)，以及所有的基因敲入小鼠都可以实现生殖系传递(表1和图8)。
另外，本实施例中，对Tild-CRISPR和HMEJ介导的方法获得的在Cdx2位点上整合mCherry的小鼠进行Southern Blot印迹分析。结果显示，使用mCherry内部探针，HMEJ介导的方法获得的7个分娩前被分离的胎儿中有2个，Tild-CRISPR介导的方法获得的8个小鼠中有2个，分别携带了额外的随机整合基因(图9)。相比于HMEJ介导的方法和HR介导的方法(Yang et al.,2013；Yao et al.,2017a)，Tild-CRISPR的随机插入比例并没有显著增加。
综上所述，这些结果表明Tild-CRISPR方法在小鼠胚胎中实现了高效的DNA整合。
实施例2：通过Tild-CRISPR方法在体内进行基因组编辑
在本实施例中，用Tild-CRISPR的方法在Actb基因插入一个p2A-mCherry。
通过子宫内胚胎电转的方法，将Tild载体转入E14.5小鼠大脑中(图4A和4B)。电转后7天，脑片被染色和统计。
结果显示，使用Tild-HA800载体电转的细胞中大约16％的细胞有mCherry表达(mCherry+/GFP+，相对效率)(图4C和4D)。相比之下，Tild-HA800，HMEJ和HR载体只有大约5％，9.5％±1.7％和0.8％±0.2％的细胞是mCherry阳性的(图4C和4D)。
综上所述，Tild-CRISPR在体内可以实现高效的DNA整合效率。
实施例3：通过Tild-CRISPR方法在人胚胎中进行基因组编辑
在本实施例中，检验了Tild-CRISPR在人类胚胎中DNA整合的效率。
首先，靶向Oct4(内细胞团(ICM)和外胚层(Epi)标记基因)插入一个荧光报告基因(图5A)。将Oct4-intron4-exon5-2A-GFP-polyA插到Oct4的intron4位点(图5A)。针对Oct4位点设计了三个sgRNAs，通过注射Cas9mRNA和每个sgRNA到人的三原核胚胎中测试sgRNAs的切割效率(图5A)。DNA测序分析显示Oct4-sgRNA#3展现出最高的切割活性(图5B)。因此，共注Oct4-sgRNA(50ng/μl)，Cas9mRNA(100ng/μl)，和Tild供体(60ng/μl)混合物到人的三原核胚胎(图5C)。做为对照组，HR供体(60ng/μl)和sgRNAs、Cas9一起注入到胚胎中。注射的胚胎在体外培养2天，在胚胎的4-16细胞时期，单个卵裂球从胚胎中分离出来用于基因型鉴定(图5C)。
结果显示，相比于HR介导的方法(在单卵裂球水平上，1/60；在整个胚胎水平上，1/9)，Tild-CRISPR显示了更高的基因敲入效率(在单卵裂球水平上，21/101；在整个胚胎水平上，10/14)(图5D到5F和S4)。精确整合通过Sanger测序被证实(图10)。
本实施例中还检测了Oct4敲入卵裂球中Oct4等位基因的NHEJ诱导突变或点突变情况(图5)。此外，将注射的胚胎培养到胚囊阶段，免疫染色显示GFP和内源OCT4共定位，表明Oct4位点GFP的整合是正确的(图5G)。
此外，本实施例中还验证了Tild-CRISPR实现转基因的双敲入的效率。将两个选择的靶向Oct4和GATA6的sgRNAs(每个50ng/μl)，Cas9mRNA(100ng/μl)和靶向Oct4和GATA6的Tild供体(每个50ng/μl)共同注射到人的三原核胚胎(图12)。将4-8细胞阶段的整个胚胎进行基因型鉴定，结果发现14个胚胎中有11个在Oct4和GATA6的5’和3’接合处是双阳性的(图12)。对4-16细胞阶段的卵裂球进行单细胞分析的结果显示，137个卵裂球中有4个是Oct4和GATA6双阳性的，因此排除了胚胎中的细胞是Oct4或GATA6单靶向整合嵌合体的可能性(图13)。
综上，Tild-CRISPR在获得基因敲入的人胚胎方面是一种有效的方法(图13)。
实施例4：Tild-CRISPR机制
在本实施例中，验证了Tild-CRISPR是否依赖于NHEJ和HR通路。
将靶向Actb整合p2A-mCherry的Tild载体转染进小鼠的ES细胞和N2a细胞，并且给予Scr7(NHEJ抑制剂)和咖啡因(HR抑制剂)处理。
结果显示，咖啡因大大降低了小鼠的ES细胞和N2a细胞中的基因敲入效率(图6A)。相比之下，Scr7提升了Tild-CRISPR在这些细胞中介导的基因敲入效率(图6A)。
我们也给予胚胎Scr7，Nu7026(另一种NHEJ抑制剂)，或咖啡因处理，结果显示Scr7或Nu7026抑制了Tild-CRISPR介导的基因敲入，但是咖啡因并没有明显的效果(图6B)。
综上所述，Tild-CRISPR介导的转基因整合可能同时被HR和NHEJ通路调控，这也说明了Tild-CRISPR拥有高效基因敲入效率的原因。
表1通过Tild-CRISPR介导的靶向整合获得基因敲入小鼠
表中，Cas9mRNA(100ng/μl)、sgRNA(50ng/μl)和供体(100ng/μl)共注射至受精卵里。注射的胚胎发育至2-细胞阶段后移植入受体体内，获得的新生小鼠进行基因型鉴定。*，胎儿在出生前被分离出来进行分析。N.D.,未确定的。
表2本发明中使用的引物
讨论
本发明提供了一个Tild-CRISPR策略(线性化dsDNA-CRISPR介导的靶向整合)，通过PCR扩增或者精确酶切获得含有800bp同源臂的转基因供体。与所有其他使用不同类型转基因供体的靶向策略相比，它的效率是最高的。这个方法是非常普适的，因为它已经被证明在9个位点有效，包括在小鼠胚胎中靶向四个位点(Actb，Nanog，Sox2，Cdx2)和在获得基因敲入小鼠中靶向6个位点(Cdx2，Dbh，Sp8，Nr3c2，Lhx6，Rosa26)。需要注意的是，HR供体包含很长的同源臂(通常是2-4kb)，在小鼠胚胎的某些研究通彻的位点，它偶尔能达到和Tild-CRISPR相当的效率。然而，质粒构建和靶向等位基因鉴定是一项费力的事情。相比使用长单链DNA(ssDNA)作为供体的靶向策略Easi-CRISPR，Tild-CRISPR有两个明显的优势。首先，Tild-CRISPR比Easi-CRISPR具有更高的DNA敲入效率，见图1。其次，对于Tild-CRISPR来说，没有插入片段长度的限制。各种各样的插入片段，从0.8kb到6.0kb，都可以被精确地整合到不同的位点。
此外，本发明的Tild-CRISPR在子宫内电转中显示了强健的DNA敲入能力。与HR或HMEJ介导的方法相比，Tild-CRISPR编辑效率更高。因此，Tild-CRISPR为其他系统的应用，如研究眼睛和肝脏的基因的生物学功能，提供了很大的可能性。同时基因编辑最近被用于研究人类胚胎发育和纠正病理基因突变((Fogarty et al.,2017；Ma et al.,2017)。Tild-CRISPR策略也许可以极大地促进人类胚胎的靶向基因编辑。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合
<130> P2018-0538
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
gccccgtaat gcagaagaag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
aggtagtgtt agtgcaggcc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
ctacgacgct gaggtcaaga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gcctaggttt ctggaggagt 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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aggcctggct gtcatgttta 20
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<211> 20
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tggagccgta catgaactga 20
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<211> 20
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cgaatgtcct gtcactctgc 20
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<211> 20
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tgaagcgcat gaactccttg 20
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<211> 20
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gccccgtaat gcagaagaag 20
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gaccctcccc ttcacatacc 20
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tcccacaacg aggactacac 20
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ctggcatcgg ttcatcatgg 20
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accggcggca accagaagaa ca 22
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tcaccttcag cttggcggtc 20
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<211> 21
<212> DNA
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caaccagaag aacagcccgg a 21
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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ggtctgggtg ccctcgtag 19
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gccccgtaat gcagaagaag 20
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gattctcggc agcctgattc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctacgacgct gaggtcaaga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
tcggcagcct gattccaata 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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acttggacag agaaagagcg att 23
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
tccatgtgca ccttgaagcg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaaaggtc cagtctacgc at 22
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<211> 20
<212> DNA
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tgaagcgcat gaactccttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gacggccccg taatgcagaa 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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tagcttgcaa ccagagaaga tgt 23
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<211> 20
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctacgacgct gaggtcaaga 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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cgacttccct tcaccataca ac 22
<210> 59
<211> 22
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaaaggtc cagtctacgc at 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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tgaagcgcat gaactccttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctacgacgct gaggtcaaga 20
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<211> 22
<212> DNA
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cgacttccct tcaccataca ac 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gatggggtta agtggtgggt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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caccttgaag cgcatgaact 20
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<211> 20
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cgtcccttcg gccctcaatc 20
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<211> 24
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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actcccttcc aaaaccatca aaga 24
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<212> DNA
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cgcttctgtg tgatggcaac ttc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gattgttcag cttacaccag gct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
tagggcctgc ggggtctatt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
caggctcgct cccgctgggc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
gtcgctgatt ggcttctttt c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
tatatgggct atgaactaat g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
cccgtttaaa cccgctgatc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
catgtggctc aataatgaaa t 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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cccagactat gaagtcttat g 21
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
ccactctgcc gccatgaata acttcgtata gc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
ttgagttgca atcaaataac ttcgtatagc 30
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
taggagagag ccttccataa cttcgtataa t 31
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
atgagtaccg aagacataac ttcgtataat g 31
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 80
ataccagctg ttgacagtgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gacctgtgcc atatatcaaa ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 82
agccagctca atgtgacttt act 23
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 83
cgagctgtga aatgcaaaaa tc 22
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 84
gagcccgaga tcgtgtatgc a 21
<210> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 85
tgaccgtcat cagcattagc 20
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 86
gggtcccccg cccctcataa cttcgtatag ca 32
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 87
ggtcaggagc gagtgataac ttcgtatagc 30
<210> 88
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 88
gatccccgct cccagcataa cttcgtataa t 31
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 89
tcctgggctc catatataac ttcgtataat 30
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 90
gctcactgac tcctcttgtc 20
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 91
ctgggggttc tatttggtgg g 21
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 92
ttacgtcgcc gtccagctc 19
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 93
ctctgcagat tctgaccgca t 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 94
ccttgctcac tggcccggga t 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 95
gggatcactc tcggcatgga c 21
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 96
aggtaacagc tacatggtga ct 22
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 97
gcctcgactg tgccttctag tt 22
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 98
aggcttttgg gaactagcct atc 23
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 99
cccgaaagag aaagcgaacc 20
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 100
tggatattcc catccctacc tcag 24
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 101
tgatcatggc agatagagga t 21
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 102
tggagccgta catgaactga 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 103
catggcagat agaggatgtt 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 104
tgaagcgcat gaactccttg 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 105
ctacgacgct gaggtcaaga 20
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 106
ctgcctgtgg gttagtcaca c 21
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 107
tcccacaacg aggactacac 20
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 108
tgttgttgca atttttccag cac 23
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 109
ctgggggttc tatttggtgg g 21
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 110
cagcttgccg gtggtgcaga tgaa 24
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 111
ctctgcagat tctgaccgca t 21
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 112
ttacgtcgcc gtccagctc 19
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 113
acttgggtat gagcattgga tatt 24
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 114
tggatattcc catccctacc tcag 24
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 115
tgatcatggc agatagagga t 21
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 116
tggagccgta catgaactga 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 117
catggcagat agaggatgtt 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 118
tgaagcgcat gaactccttg 20
<210> 119
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 119
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
Claims (10)
1.一种用于对基因组的靶位点进行基因靶向整合的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
a)供体DNA，所述供体DNA为双链；
b)Cas9蛋白或其编码核酸或表达所述Cas9蛋白的第一表达载体；和
c)sgRNA或表达所述sgRNA的第二表达载体；
其中，所述的供体DNA具有从5’到3’的式I结构：
E1-R1-L1-Z-L2-R2-E2 (I)
式中，
E1代表无或5’端酶切以后的残留序列；
R1代表5’端的同源臂；
L1为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
Z代表待整合的靶基因；
R2代表3’端的同源臂；
L2为无或选自下组的元件：连接序列、Loxp元件、或其组合；
E2代表无或3’端酶切以后的残留序列；
其中，所述的R1与所述基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的R2与所述基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。
2.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述待整合的靶基因Z的序列长度为1bp-20kb。
3.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述残留序列E1和E2的序列长度各自独立地为0-20bp，较佳地0-10bp，更佳地0-5bp，最佳地0bp。
4.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1和R2的序列长度各自独立地为100-2000bp，较佳地100-1500pb，更佳地200-1000bp，最佳地700-900bp。
5.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述同源臂R1的序列长度D1和同源臂R2的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)。
6.一种基因靶向整合的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)提供一待基因靶向整合的细胞；和
(ii)将a)供体DNA；b)Cas9蛋白或其编码核酸；和c)sgRNA导入所述待整合的细胞内，进行基因整合，从而获得靶向基因整合的细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞是体细胞、卵细胞、合子(受精卵细胞)。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述导入方法是直接向单细胞内注入，所述注入的供体DNA为40-100ng/μl，Cas9mRNA为80-120ng/μl，sgRNA为30-70ng/μl。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是一种体外方法，所述方法是非诊断性和非治疗性的。
10.一种用于基因靶向整合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
i)第一容器以及位于第一容器内的供体DNA，所述供体DNA为双链；
ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas9蛋白或其编码核酸或表达Cas9蛋白的第一表达载体；和
iii)第三容器以及位于第三容器内的sgRNA或表达sgRNA的第二表达载体。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110272900A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-09-24 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用 |
| CN111849986A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-30 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用 |
| CN113249407A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-08-13 | 上海南方模式生物科技股份有限公司 | 一种用于同源重组的载体及其应用 |
| CN114480386A (zh) * | 2021-04-07 | 2022-05-13 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 转人cd55基因大动物的构建方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105985982A (zh) * | 2015-02-12 | 2016-10-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 改造斑马鱼基因组的构建物及改造方法 |
| CN108866100A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-11-23 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种高效率的基因编辑方法 |
| CN109321584A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-02-12 | 华东师范大学 | 一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统 |
| CN110396523A (zh) * | 2018-04-23 | 2019-11-01 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种重复片段介导的植物定点重组方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8697359B1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| CN106191116B (zh) * | 2016-08-22 | 2019-10-08 | 西北农林科技大学 | 基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用 |
-
2018
- 2018-04-28 CN CN201810399266.6A patent/CN110184301B/zh active Active
-
2019
- 2019-04-25 WO PCT/CN2019/084372 patent/WO2019206236A1/zh active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105985982A (zh) * | 2015-02-12 | 2016-10-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 改造斑马鱼基因组的构建物及改造方法 |
| CN108866100A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-11-23 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种高效率的基因编辑方法 |
| CN109321584A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-02-12 | 华东师范大学 | 一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统 |
| CN110396523A (zh) * | 2018-04-23 | 2019-11-01 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种重复片段介导的植物定点重组方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XUAN YAO 等: "Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9", 《CELL RES.》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110272900A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-09-24 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用 |
| CN110272900B (zh) * | 2019-04-19 | 2024-03-26 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用 |
| CN111849986A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-30 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用 |
| CN114480386A (zh) * | 2021-04-07 | 2022-05-13 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 转人cd55基因大动物的构建方法 |
| CN113249407A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-08-13 | 上海南方模式生物科技股份有限公司 | 一种用于同源重组的载体及其应用 |
| CN113249407B (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-26 | 上海南方模式生物科技股份有限公司 | 一种用于同源重组的载体及其应用 |
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