CN107119076A - 一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用，所述制备方法采用NOD‑Scid IL2rg‑/‑免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠)，敲除Foxnl基因或Fah基因。本发明通过在NSI小鼠上敲除Fah基因得到NSIF小鼠，所述NSIF小鼠可用于高效构建新型人源化小鼠模型，可用于肝脏生理和病理研究；本发明通过在NSI小鼠上敲除Foxn1基因得到NSIN小鼠，所述NSIN小鼠无体毛，免疫系统进一步缺陷，易于实体瘤的构建、监控和测量。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用。
背景技术
肝脏在人体发挥解毒和代谢外源化合物功能中占领着战略性的地位。由于小鼠饲养成本低、繁殖速度快、实验周期段短、遗传背景清晰、实验重复性高等优点，研究人员利用小鼠构建各种小鼠肝脏疾病模型，如肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化、肝癌等，进行肝脏疾病研究。但这些模型难以弥补人和小鼠存在巨大种属差异(例如，很多肝脏代谢酶具有种属特异性，一些人肝脏病毒如HBV、HCV等无法感染小鼠肝脏细胞)在这些模型上获得的研究成果或治疗药物无法在人体上重现相同效果。而利用人体肝脏细胞体外培养进行研究，则局限于人体原代细胞体外存活期限、冻存技术和无法重现体内器官协作。
于是，研究人员开展了肝脏人源化小鼠研究。肝脏人源化小鼠模型，即在可诱导肝脏损伤的免疫缺陷小鼠体内移植并重建人体肝脏组织或器官。肝脏人源化模型所使用的受体小鼠免疫缺陷程度越高，对异种、异体移植物的排斥则越小；且免疫细胞参与肝脏损伤引起的炎症反应，若免疫系统完善，则在诱导肝脏损伤而人源肝脏组织或器官未重建的同时加速肝脏衰竭，提高小鼠死亡率。此外，可控的诱导性小鼠肝脏细胞损伤对移植的人源肝脏细胞的生存、增殖和发育提供了足够的空间。
现有技术中最优的可诱导肝脏损伤的免疫缺陷小鼠：TK-NOG(ThymidineKinase即胸苷嘧啶激酶缺陷的NOD-Scid IL2rg-/-)免疫缺陷小鼠(MasamiHasegawa et al.,2013)、uPA-SCID(urokinase-type Plasminogen Activator即尿激酶纤维蛋白融酶原激活剂缺陷的Scid)免疫缺陷小鼠(Mercer et al.,2001)、FRG(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-)和FRGN(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-NOD)免疫缺陷小鼠(Hisaya Azuma et al.,2007；Elizabeth M.Wilson et al.,2014)。然而，TK转基因雄性小鼠不育，仅能通过杂合雌鼠和野生型雄鼠，无纯合小鼠品系，而uPA小鼠对供体肝脏细胞的要求非常高，且uPA基因缺失可引起迅速而严重的肝脏损伤，具有不可控的选择性。基于Fah基因敲除的肝脏诱导损伤小鼠，如FRG、FRGN，是目前应用最广泛、可控性最好、高移植效率的肝脏模型工具，可通过护肝药物NTBC(2-硝基-4-三氟甲苯-1，3环己二酮)控制Fah缺失诱导的肝脏损伤(Grompe et al.,1995；)。
然而，FRG和FRGN小鼠的免疫基因缺陷背景Rag2-/-IL2rg-/-和NODRag2-/-IL2rg-/-并非现有技术中免疫程度最高的，在构建肝脏人源化小鼠模型中，将会对外源的异种(人体)、异体细胞产生一定的排斥作用影响移植效率。Wei Ye et al.,Journal of Hematology&Oncology 2015报道发现NOD-scid IL2rg-/-小鼠的免疫缺陷程度最高，构建人源化小鼠模型的效果最好。基于NOD-scidIL2rg-/-免疫缺陷背景的Fah敲除小鼠将是最好的肝脏疾病人源化小鼠模型工具。然而，在探索该基因型小鼠研发上，研究人员却遇到了一系列困难。由于NOD((non-obese diabetic)小鼠基因背景复杂且自发非肥胖性糖尿病，在NOD小鼠上进行基因敲除可能会诱发致死或糖尿病病发(Baxter AG et al.,1995；Nichols J et al.,2009；)。再则，scid(Severe Combined Immunodeficiency Disease)小鼠Prkdc基因缺陷，DNA修复能力部分缺失，影响基因敲除工具脱靶后的基因修复，提高基因敲除小鼠的死亡率，且有研究人员发现NOD-scid Fah-/-小鼠在NTBC(肝脏保护药)停药之后，肝脏迅速衰竭，小鼠死亡(Blunt,T.et al.,1996)。而NOD-scid IL2rg的基因背景缺陷程度更高于NOD和NOD-scid小鼠。
此外，目前所有的高度免疫缺陷小鼠(缺失B、T、NK等免疫细胞)，包括NOD-Scid IL2rg-/-、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1-/-IL2rg-/-等，在构建肿瘤模型上都具有极高的效率，然而这些小鼠都有毛发，在利用活体成像等技术检测带有荧光标记(特别是荧光蛋白)的肿瘤细胞体内生长和分布时，毛发对于检测结果都具有严重的干扰。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用，所述免疫缺陷小鼠模型比现有的NSI或其他第三代免疫缺陷小鼠有更好的效果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基因敲除的方法，所述方法采用NOD-ScidIL2rg-/-免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠)，敲除Fah基因或Foxnl基因。
本发明中，通过在目前公认为免疫缺陷程度最高的免疫缺陷小鼠NOD-ScidIL2rg-/-背景下进行Fah基因敲除，获得可持续繁殖NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)小鼠品系，并利用NSIF小鼠构建了高嵌合率、高成功率的新型肝脏人源化小鼠模型(移植了人源肝脏等器官细胞或组织的人源化小鼠模型)，该模型可用于人体肝脏疾病(如脂肪肝、肝损伤、肝炎、肝癌等)的科学研究和治疗方法(如化药、生物制剂等)的疗效评估，以及用于药物分解代谢和毒性评估。
本发明中，通过在目前公认为免疫缺陷程度最高的免疫缺陷小鼠NOD-ScidIL2rg-/-背景下进行Foxn1基因敲除，获得了体毛发育缺陷(几乎无体毛)的高度免疫缺陷小鼠NSIN(NOD-Scid IL2rg-/-Foxn1-/-)。在无体毛的情况下，肿瘤受体小鼠或者带荧光标记细胞的受体小鼠更易于观察小鼠的细胞生长、发育、迁移情况，同时易于实体瘤的观察和大小量取；由于Foxn1基因在胸腺上皮细胞发育和淋巴生成中有着重要作用，而Foxn1基因缺陷将不仅将进一步防止NOD-Scid IL2rg-/-高度免疫缺陷小鼠随着年龄增长发生的概率性胸腺重生事件，而且由于Foxn1基因缺失跟原发性免疫缺陷程度有关，且在裸鼠中构建实体瘤模型相对于其它一代免疫缺陷小鼠效果更好。
优选地，所述Fah基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.1所示，所述Foxn1基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.2所示，。
所述核苷酸序列如下：
Fah：aagctgcatggaagg(SEQ ID NO.1)；
Foxn1：ggaagtgcctcttgtagggg(SEQ ID NO.2)。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的敲除Fah基因的方法，包括如下步骤：
(1)TALEN质粒的构建，获取TALEN mRNA；
(2)获取NSI小鼠受精卵，将步骤(1)得到的TALEN mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质，培养24h后，移植入假孕小鼠子宫，获得嵌合或杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠；
(3)将步骤(4)得到的嵌合或杂合NSIF免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIF免疫缺陷小鼠，杂合NSIF免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIF纯合免疫缺陷小鼠。
优选地，所述步骤(1)所述的TALEN质粒的构建包括如下步骤：根据Fah基因的靶点序列分别得到TALEN左臂识别结合序列和TALEN右臂识别结合序列，设计编码TALEN左臂和右臂重复序列，再将重复序列连接到TALEN表达载体上，获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN R(右臂)-X-pA质粒。
优选地，所述TALEN左臂识别结合序列为SEQ ID NO.3，所述TALEN右臂识别结合序列为SEQ ID NO.4；
TALEN左臂识别结合序列：5-aacttcatgggtctgggtc-3(SEQ ID NO.3)；
TALEN右臂识别结合序列：5-aaggatgctcttgcct-3(SEQ ID NO.4)。
优选地，所述TALEN mRNA的获取是按照试剂盒m MESSAGE SP6(Ambion)和E.coli Poly(A)Polymerase(NEB)的操作步骤进行。
优选地，步骤(2)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的TALEN mRNA的浓度为10-200ng/μL，例如可以是10ng/μL、11ng/μL、12ng/μL、13ng/μL、15ng/μL、18ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、35ng/μL、40ng/μL、45ng/μL、50ng/μL、55ng/μL、60ng/μL、65ng/μL、70ng/μL、75ng/μL、80ng/μL、85ng/μL、90ng/μL、100ng/μL、110ng/μL、120ng/μL、130ng/μL、140ng/μL、150ng/μL、160ng/μL、170ng/μL、180ng/μL、190ng/μL或200ng/μL，优选为12-100ng/μL，进一步优选为20ng/μL。
优选地，所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基为10-40mmol/L的HEPES，pH 7.0-8，非必需氨基酸为0.05-1mmol/L，必需氨基酸为0.1-2mmol/L，优选为20mmol/L的HEPES，pH 7.4-7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L。
优选地，所述敲除Fah基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L，谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L，葡萄糖浓度0.01-1mmol/L，优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度1mmol/L，葡萄糖浓度0.1mmol/L。
优选地，步骤(2)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚，例如可以是10枚、11枚、12枚、13枚、14枚、15枚、16枚、17枚、18枚、19枚或20枚，优选为10-15枚。
优选地，所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种。
优选地，所述敲除Foxnl基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠。
优选地，所述代养小鼠为ICR小鼠。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的基因敲除的方法敲除Fah基因后得到的NSIF小鼠模型。
第四方面，本发明提供一种免疫缺陷小鼠模型，所述小鼠模型在第三方面所述的NSIF小鼠的基础上进一步进行基因改造。
第五方面，本发明提供一种如第三方面或第四方面所述的小鼠模型作为肝脏疾病研究和/或肝脏人源化的模型鼠的用途。
第六方面，本发明提供一种敲除Foxnl基因的方法，包括如下步骤：
(1)构建Foxn1基因敲除的重组载体，体外转录gRNA；
(2)体外转录Cas9mRNA；
(3)获取NSI小鼠受精卵，将步骤(1)得到的gRNA和步骤(2)得到的Cas9mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质，培养24h后，移植入假孕小鼠子宫，获得杂合NSIN(NOD-scid IL2rg-/-Foxn1-/-)免疫缺陷小鼠；
(4)将步骤(3)得到的嵌合或杂合NSIN免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIN免疫缺陷小鼠，杂合NSIN免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIN纯合免疫缺陷小鼠。
本发明中，采用原核注射将得到的mRNA注入小鼠受精卵细胞，对原核注射过程中各种胚胎培养基进行了适合NSI胚胎的调整，提高胚胎原核注射的效率及注射后胚胎的恢复。
优选地，所述构建Foxn1基因敲除的重组载体的步骤包括：通过引物获得线性化guide DNA(L-gDNA)，再通过DNA连接酶连接到线性化L-pT7载体上，得到pT7-gDNA完整载体。
优选地，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6所示；
所述核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.5：5’-ATAGGN ggaagtgcctcttgtagggg GT-3’；
SEQ ID NO.6：5’-TAAAACN cccctacaagaggcacttccG-3’；
其中，所述N可代表A、T、G或C中的任意一个核苷酸。
优选地，所述gRNA体外转录包括如下步骤：以pT7-gDNA完整载体为模板，通过引物扩增gDNA基因片段，再进行体外转录获得gRNA。
优选地，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7-8所示；
SEQ ID NO.7：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’；
SEQ ID NO.8：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。
优选地，步骤(2)所述的体外转录Cas9mRNA包括如下步骤：使pcDNA3.3-hCas9载体线性化，回收线性化的pcDNA3.3-hCas9载体为体外转录的模板，以SP6聚合酶启动子在体外转录Cas9mRNA，Licl法回收带帽Cas9mRNA，加poly A，纯化后保存。
优选地，步骤(3)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的gRNA和Cas9mRNA的浓度为10-200ng/μL，例如可以是10ng/μL、11ng/μL、12ng/μL、13ng/μL、15ng/μL、18ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、35ng/μL、40ng/μL、45ng/μL、50ng/μL、55ng/μL、60ng/μL、65ng/μL、70ng/μL、75ng/μL、80ng/μL、85ng/μL、90ng/μL、100ng/μL、110ng/μL、120ng/μL、130ng/μL、140ng/μL、150ng/μL、160ng/μL、170ng/μL、180ng/μL、190ng/μL或200ng/μL，优选为12-100ng/μL，进一步优选为20ng/μL。
优选地，所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基10-40mmol/L的HEPES，pH 7.0-8，非必需氨基酸为0.05-1mmol/L，必需氨基酸为0.1-2mmol/L，优选为为20mmol/L的HEPES，pH 7.4-7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L。
优选地，所述敲除Foxn1基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L，谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L，葡萄糖浓度0.01-1mmol/L，优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度1mmol/L，葡萄糖浓度0.1mmol/L。
优选地，步骤(3)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚，例如可以是10枚、11枚、12枚、13枚、14枚、15枚、16枚、17枚、18枚、19枚或20枚，优选为10-15枚。
优选地，所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种。
优选地，所述敲除Foxnl基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠。
优选地，所述代养小鼠为ICR小鼠。
本发明中，敲除Foxn1和Fah基因的小鼠都采用NSI母鼠作为代孕母鼠，采用至少一次以上生产经验的ICR母鼠作为代养母鼠。采用NSI母鼠作为代孕母鼠是由于通过这种基因型的生长环境和体内微环境更适合该缺陷型的小鼠生长，可以提高存活率；而采用ICR母鼠作为代养母鼠，可以提高可哺乳率。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的基因敲除的方法敲除Foxnl基因后得到的NSIN小鼠模型。
第八方面，本发明提供一种免疫缺陷小鼠模型，所述小鼠模型在第七方面所述的NSIN小鼠的基础上进一步进行基因改造。
第九方面，本发明提供如第七方面或第八方面所述的小鼠模型作为肿瘤疾病研究的模型鼠的用途。
本发明中，作为优选技术方案，敲除Foxn1和Fah基因小鼠中的移植受精卵等胚胎操作所用培养基为20mmol/L的HEPES，pH 7.4-7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L。
所述敲除Foxn1和Fah基因小鼠中所述小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度1mmol/L，葡萄糖浓度0.1mmol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明免疫缺陷程度最高的免疫缺陷小鼠NOD-Scid IL2rg-/-背景下进行Foxn1基因敲除，获得了体毛发育缺陷(几乎无体毛)的高度免疫缺陷小鼠NSIN(NOD-Scid IL2rg-/-Foxn1-/-)模型，该小鼠模型无体毛，更易于观察小鼠的细胞生长、发育、迁移情况，同时易于实体瘤的观察和大小量取，还能防止高度免疫缺陷小鼠随着年龄增长发生的概率性胸腺重生事件；
(2)本发明在免疫缺陷小鼠NOD-Scid IL2rg-/-背景下进行Fah基因敲除，获得可持续繁殖NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)小鼠模型品系，Fah缺失可诱导肝脏衰竭，而免疫细胞参与后续的肝脏衰竭，NSIF免疫缺陷程度越高，则可缓解肝脏衰竭于可控范围，利用NSIF小鼠构建了高嵌合率、高成功率的新型肝脏人源化小鼠模型，该模型可用于人体肝脏疾病(如脂肪肝、肝损伤、肝炎、肝癌等)的科学研究和治疗方法(如化药、生物制剂等)的疗效评估，以及用于治疗方法分解代谢和毒性评估；
(3)本发明采用NSI小鼠代孕，ICR小鼠代养的方式培养NSIN和NSIF小鼠，提高了缺陷型小鼠的存活率和可哺乳率，且本发明采用原核注射的方式将获得的mRNA注入受精卵中，且通过对原核注射中各种胚胎培养基进行了适合NSI胚胎的调整，提高胚胎原核注射的效率及注射后胚胎的恢复。
附图说明
图1是本发明NSIN小鼠基因PCR酶切鉴定结果，其中WT为野生型，Foxn1+/-为杂合型，Foxn1-/-为纯合型；
图2是本发明NSIF小鼠基因PCR酶切鉴定结果，其中WT为野生型，Fah+/-为杂合型，Fah-/-为纯合型；
图3是本发明NSIF小鼠测序结果在NCBI上进行比对的结果；
图4是本发明检测肝损伤NSIF小鼠Fah蛋白的表达Western Blot结果图；
图5是本发明NSIF小鼠肝脏病理切片,其中，图5(A)为NSIF小鼠停止使用NTBC药物后的肝脏病理切片，图5(B)为NSIF小鼠正常使用NTBC药物后的肝脏病理切片；
图6是本发明NSIF小鼠停止使用NTBC药物后丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的表达水平；
图7是本发明NSIF小鼠停止使用NTBC药物后葡萄糖的表达水平；
图8是本发明NSIF小鼠肝脏移植/不移植C57BL/6小鼠肝脏并停止使用NTBC药物后小鼠体重变化，其中，NISF-NTBC+liver为移植了C57BL/6小鼠肝脏的NSIF小鼠，NSIF-NTBC为未移植肝脏的NSIF小鼠；
图9是本发明NSIF小鼠移植/不移植C57BL/6小鼠肝脏并停止使用NTBC药物后丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的表达水平，其中，NISF-NTBC+liver为移植了C57BL/6小鼠肝脏的NSIF小鼠，NSIF-NTBC为未移植肝脏的小鼠；
图10是本发明NSIF小鼠移植/不移植C57BL/6小鼠肝脏并停止使用NTBC药物后葡萄糖的表达水平，其中，NISF-NTBC+liver为移植了C57BL/6小鼠的肝脏，NSIF-NTBC为未移植肝脏的小鼠；
图11是Fah靶位点及TALEN左右臂结构示意图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明所有动物饲养、繁殖于SPF(Specific Pathogen Free)级别实验动物中心。
本发明NSI小鼠，基因型：NOD-scid IL2rg-/-，授权专利号：ZL201310229629.9。
实施例1：Cas9敲除体系质粒的构建
(1)靶点选择：利用ZiFiT Targeter Version网站设计遵循Cas9敲除靶点的GGN(17-18)NGG(N为任意碱基)的序列要求Cas9敲除的靶位点，并通过Ensembl/NCBI网站的“Blast”检索功能确定靶位点是基因组中的单一位点；
靶位点序列：ggaagtgcctcttgtagggg(SEQ ID NO.1)
靶点确认：依据打靶细胞的基因组设计扩增靶位点的高特异性引物，PCR扩增获得含靶位点片段；在靶位点中选择扩增片段唯一的限制性内切酶进行酶切电泳鉴定；酶切鉴定正确后，将PCR扩增产物送去测序鉴定；通过酶切、测序鉴定，确认打靶鉴定引物的特异性和酶切、测序鉴定的可行性；
(2)构建打靶载体pT7-gDNA
①基因合成分别与靶位点序列相同和互补的两条引物，即多聚核苷酸单链(Oligo)，分别为S Oligo和AS Oligo；按照下表将反应组分加入1.5mL EP管中，置于沸水中加热10分钟后，冷却至室温，瞬间离心，获得编码guide RNA(gRNA)的含粘性末端的、线性化guide DNA序列(即L-gDNA)备用；
S Oligo序列：5’-ATAGGN ggaagtgcctcttgtagggg GT-3’(SEQ ID NO.3)
AS Oligo序列：5’-TAAAACN cccctacaagaggcacttccG-3’(SEQ ID NO.4)
②通过限制性内切酶BbsI剪切空载体pMD18-T Simple(即pT7载体，带氨苄抗性)，获得含粘性末端的线性化空载体pMD18-T Simple，即L-pT7；
③通过DNA连接酶(如Takara公司Solution I)，将L-pT7和L-gDNA连接成完整载体pT7-gDNA，转化、涂板、挑单克隆、摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定、质粒测序，筛选测序正确质粒备用；
(3)gRNA体外转录
①以测序正确的pT7-gDNA质粒(1-30ng)为模版，以T7-S和Tracr-Rev为引物扩增gDNA基因片段，电泳、胶回收、溶解于30μL无(RNA)酶水中备用；
T7-S引物序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’(SEQ ID NO.5)
Tracr-Rev引物序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQ IDNO.6)
②通过体外转录试剂盒T7Kit(Ambion公司)将PCR扩增后的gDNA基因片段体外转录成gRNA，利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit试剂盒(Ambion公司)从转录体系中回收纯化体外转录的gRNA，用20μL无酶水溶解，-80℃保存备用。
(4)Cas9体外转录
①按照下列体系配置酶切反应液：用PmeI限制性内切酶剪切pcDNA3.3-hCas9(Cas9载体，Addgene NO.MLM3613)，使载体线性化，电泳、跑胶、回收，用20μL无酶水溶解备用；
②按照下列体系和步骤，用mMESSAGE mMACHINE T7Kit体外转录带帽的Cas9mRNA，电泳、跑胶、回收带帽Cas9mRNA。
③按照下列体系配置反应体系，在带帽Cas9mRNA上加上poly A，获得稳定而且翻译效率也更高的RNA；
④利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit试剂盒(Ambion公司)从转录体系中回收纯化体外转录的Cas9mRNA，用10-20μL无酶水溶解，-80℃保存备用。
实施例2：NSIN小鼠的构建和验证
(1)NSI小鼠超排：公鼠周龄：10-11周，雌鼠周龄：8周。母鼠于第一天13：00注射PMSG(7.5IU/只)，第三天13：00注射HCG(7.5IU/只)，第三天17：00每只雌鼠与2只雄鼠合笼，第四天8：00-9：00检查雌鼠阴道栓，从见栓雌鼠子宫获取NSI小鼠受精卵；
提供精子的NSI雄鼠和雌鼠的生产注意事项：NSI母代鼠与父代鼠(提供精子的NSI雄鼠和雌鼠的母代和父代)合笼见栓后，将父代鼠分出，放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠，以保证NSI母代鼠所产仔哺乳充足；
(2)将浓度20ng/μL gRNA和Cas9mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质(胚胎操作所有培养基为20mmol/L的HEPES，pH 7.4～7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L)，用小鼠胚胎培养基培养24小时后(培养基调整为：丙酮酸浓度提高至0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度调至1mmol/L，葡萄糖浓度调至0.1mmol/L)，移植入0.5dpc(二细胞期胚胎)假孕NSI母鼠输卵管壶腹部，每只小鼠移植受精卵数量为15；
代孕NSI鼠饲养注意事项：生产代孕母鼠的NSI母代鼠与父代鼠合笼见栓后，将父代鼠分出，放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠，代孕母鼠出生后7天，将同窝雄性仔取出，以保证代孕母鼠的哺乳期营养供给充足；
(3)移植受精卵后的母鼠与生产过一次以上的ICR母鼠同笼(1只代孕NSI母鼠与1只ICR母鼠)；
代孕母鼠产仔后，通过基因型鉴定(PCR扩增和测序)小鼠基因型，获得杂合NSIN(NOD-scid IL2rg-/-Foxn1-/-)免疫缺陷小鼠，通过进一步与NSI小鼠杂交获得NSIN纯合子，PCR结果如图1所示；
注意事项：由于纯合NSIN母鼠Foxn1缺失，乳腺发育不完全，无法良好哺乳NSIN幼仔，则NSIN品系的繁殖主要通过纯合的NSIN雄鼠与杂合的NSIN雌鼠交配繁殖后代；纯合NSIN无体毛，杂合NSIN有体毛；
从图1可以看出，纯合的NSIN小鼠Foxn1基因缺陷。
实施例3：TALEN质粒的构建
(1)利用TELAN Targeter软件对Fah基因CDS序列(NOD-scid IL2rg-/-小鼠背景)进行分析，从Fah基因CDS序列中筛选出特异性最高的基因位点作为TALEN靶点；
TALEN靶点序列：5-aagctgcatggaagg-3；
TALEN左臂识别结合序列：5-aacttcatgggtctgggtc-3；
TALEN右臂识别结合序列：5-aaggatgctcttgcct-3；
(2)根据靶向Fah基因的TALEN左臂、右臂所识别结合的序列、TALE识别编码原则，设计TALEN左臂和右臂序列，如图11所示：
TALEN左臂：AACTTCATGGGTCTGGGTCAAG；
TALEN右臂：AAGGATGCTCTTGCCTCCT；
(3)基因合成两侧含BsmBI(即Esp3I，Thermo Scientific公司，型号FD0454)限制性酶切位点的TALEN左臂、右臂重复序列，并通过BsmBI酶切、连接入TALEN表达载体pCAG-TALEN-X-pA(Addgene公司)，获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN L(右臂)-X-pA质粒；
(4)TALEN活性评估：体外检TALEN活性采用的是单链复性(Single-strand annealing，SSA)方法，SSA报告载体中报告基因为荧光素(Luciferase)基因，启动子为CMV。操作方法为24孔板293T细胞转染200ngTALENs表达质粒、50ng SSA报告质粒、10ng Renilla plasmid，1d后收集转染的细胞，并用Luciferase Cell Lysis Buffer(NEB)处理，检测荧光素酶活性，预测TALEN的切割活性；
(5)TALEN mRNA获取：TALENs质粒需要通过体外转录合成编码TALEN的m RNA并在末端加上poly(A)后进行胚胎胞质注射。TALEN m RNA体外转录和加多聚腺苷酸的实验过程是按照试剂盒m MESSAGE SP6(Ambion)和E.coli Poly(A)Polymerase(NEB)的操作步骤进行，方法简述如下：
①Not I酶切线性化TALENs质粒:取大提质粒得到的L-TALENs和R-TALENs质粒各15μg，37℃酶切过夜后，取0.2μL酶切产物上样至1％琼脂糖凝胶孔，分别以原质粒为对照，电泳确定线性化完全，用DNA回收试剂盒(DP214)回收酶切产物，并测定浓度；
②体外转录：冰上融解SP6m MESSAGE m MACHINE Kit(Ambion，AM1340)剂盒中的试剂，并短暂离心，Bufferr融解后放室温，其余溶液置于冰上，总体系设为10μL，加完样后将样品充分混匀，37℃孵育3h；
③加入0.5μL TURBO DNase，充分混匀后37℃孵育15min；
④RNA加Poly A尾修饰冰上解冻E.coil poly(A)polymerase试剂盒中的相关试剂，总体系设为50μL，按表体系加样，加完样后将样品充分混匀，37℃孵育45min。
⑤TALEN m RNA沉淀回收，利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit试剂盒(Ambion公司)从转录体系中回收纯化体外转录的Cas9RNA，用10-20μL无酶水溶解，-80℃保存备用。
实施例4：NSIF小鼠的构建和验证
(1)NSI小鼠超排：公鼠周龄：10-11周，雌鼠周龄：8周。母鼠于第一天13：00注射PMSG(7.5IU/只)，第三天13：00注射HCG(7.5IU/只)，第三天17：00每只雌鼠与2只雄鼠合笼，第四天8：00-9：00检查雌鼠阴道栓，从见栓雌鼠子宫获取NSI小鼠受精卵；
提供精子的NSI雄鼠和雌鼠的生产注意事项：NSI母代鼠与父代鼠(提供精子的NSI雄鼠和雌鼠的母代和父代)合笼见栓后，将父代鼠分出，放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠，以保证NSI母代鼠所产仔哺乳充足。
(2)将浓度20ng/μL TALEN左臂、右臂mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质(胚胎操作所有培养基为20mmol/L的HEPES，PH 7.4～7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L)，用小鼠胚胎培养基培养24小时后(培养基调整为：丙酮酸浓度提高至0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度调至1mmol/L，葡萄糖浓度调至0.1mmol/L)，移植入0.5dpc(二细胞期胚胎)假孕NSI母鼠输卵管壶腹部，每只小鼠优选移植受精卵数量为13枚；
代孕NSI鼠饲养注意事项：生产代孕母鼠的NSI母代鼠与父代鼠合笼见栓后，将父代鼠分出，放入拥有至少一次以上生产经验的ICR母鼠，代孕母鼠出生后7天，将同窝雄性仔取出，以保证代孕母鼠的哺乳期营养供给充足。
(3)移植受精卵后的母鼠与生产过一次以上的ICR母鼠同笼(1只代孕NSI母鼠与1只ICR母鼠)；
(4)代孕母鼠产仔后，通过基因型鉴定(PCR扩增和测序)小鼠基因型，获得杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠，通过进一步与NSI小鼠杂交获得NSIF纯合子，将NSIF测序结果在NCBI上比对，结果如图3所示，PCR电泳结果如图2所示；
注意事项：代孕母鼠饮用水(PH3.0，高压灭菌)中加入NTBC(终浓度：7.5mg/L)；母鼠产仔前一周需皮下注射NTBC(终浓度：7.5mg/L)120ul/只；母鼠产仔后，不足4周大的鼠仔须每天皮下注射NTBC 10-20uL/只，哺乳母鼠注射NTBC 120uL/只；
从图2和图3可以看出，测序结果和基因PCR扩增后电泳结果同时反映了NSIF小鼠基因组中Fah基因缺陷、不完整。
通过Western Blot检测NSIF小鼠肝脏中Fah蛋白表达(以NSI小鼠为阳性对照)，结果如图4所示，NSI表达Fah蛋白，NSIF小鼠中不表达Fah蛋白，证明Fah基因敲除成功。
实施例5：肝损伤动物模型的构建
(1)停止在NSIF小鼠日常饮用水中加入NTBC(且不注射NTBC)
(2)每天对-NTBC NSIF小鼠进行称重、记录，并通过绘制体重变化曲线，与饮用NTBC酸性水的NSIF小鼠对比，去除NTBC对NSIF小鼠体重变化的影响；
(3)NTBC停药40天后，将停止用药的小鼠与正常用药的小鼠肝脏的病理切片如图5(A)和图5(B)所示，抽取实验组小鼠外周血300mL，提取血清样品，检测其中的血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT，Alanine Aminotransferase)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST，Aspartate Aminotransferase)、葡萄糖(Glucose)水平，结果如图6-7所示；
从肝脏实物图和病理切片结果图5(A)和(B)可以看出NSIF小鼠停止给NTBC后，肝脏发生肉眼可见损伤，组织切片染色显示肝细胞坏死(A)；持续给药的小鼠肝脏细胞，未见明显肝脏损伤及肝细胞坏死情况(B)。表明NSIF小鼠可自发诱导肝脏损伤，而该损伤可通过基于NTBC药物予以缓解和控制，图6-7同样为该结果佐证；
图6-7可以看出，NSIF小鼠停止用NTBC药后，血清中丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的合成水平明显增加，而葡萄糖的合成水平明显下降。
实施例6：不同品系小鼠肝脏移植实验
(1)选择出生日期相差不超过一周、同性别的6只NSIF小鼠(选同一胎出生的)，分成两组(每组3只)，一组为NSIF-NTBC+Liver(即NSIF小鼠移植C57BL/6小鼠肝脏细胞后，逐渐停止NTBC用药)，一组为NSIF–NTBC(即不移植C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠，与NSIF-NTBC+Liver实验组同步进行NTBC逐渐停药)；
(2)二氧化碳法处死1只C57BL/6小鼠，取C57BL/6小鼠肝脏研磨、裂解红细胞，获取单肝脏细胞悬液(浓度为2×107细胞/mL)备用；
(3)通过静脉注射为每只NSIF-NTBC+Liver小鼠注射100μL步骤2中的C57BL/6小鼠单肝脏细胞悬液，即每只小鼠注射2×106细胞；
(4)小鼠肝脏细胞移植试验后，对两组实验小鼠停止NTBC用药，并每天为实验小鼠称重并记录重量，如图8所示；
(5)小鼠肝脏细胞移植40天后，抽取两组实验小鼠外周血300ml，提取血清样品，检测其中的血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT，Alanine Aminotransferase)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST，Aspartate Aminotransferase)、葡萄糖(Glucose)水平，如图9-10所示；
从图8可以看出，不移植C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠停止用药后，体重逐渐下降直至死亡，而移植了C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠体重于33天慢慢恢复。说明移植的不同品系的小鼠肝脏细胞可以在小鼠体内生长，并替代受体鼠肝脏功能。
从图9-10可以看出，不移植C57BL/6小鼠肝脏细胞的NSIF小鼠停止用药后血清中丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的合成水平明显增加，而葡萄糖合成水平明显下降。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基因敲除的方法，其特征在于，所述方法采用NOD-Scid IL2rg-/-免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠)，敲除Fah基因或Foxnl基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fah基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.1所示，所述Foxn1基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述敲除Fah基因包括如下步骤：
(1)TALEN质粒的构建，获取TALEN mRNA；
(2)获取NSI小鼠受精卵，将步骤(1)得到的TALEN mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质，培养24h后，移植入假孕小鼠子宫，获得嵌合或杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠；
(3)将步骤(2)得到的嵌合或杂合NSIF免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIF免疫缺陷小鼠，杂合NSIF免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIF纯合免疫缺陷小鼠；
优选地，所述步骤(1)所述的TALEN质粒的构建包括如下步骤：根据Fah基因的靶点序列分别得到TALEN左臂识别序列和TALEN右臂识别序列，设计TALEN左臂和右臂结构，再将重复序列连接到TALEN表达载体上，获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN R(右臂)-X-pA质粒；
优选地，所述TALEN左臂识别结合序列为SEQ ID NO.7，所述TALEN右臂识别结合序列为SEQ ID NO.8；
优选地，所述TALEN mRNA的获取包括如下步骤：
优选地，步骤(2)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的TALEN mRNA的浓度为10-200ng/μL，优选为12-100ng/μL，进一步优选为20ng/μL；
优选地，所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基为10-40mmol/L的HEPES，pH 7.0-8，非必需氨基酸为0.05-1mmol/L，必需氨基酸为0.1-2mmol/L，优选为20mmol/L的HEPES，pH 7.4-7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L；
优选地，所述敲除Fah基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L，谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L，葡萄糖浓度0.01-1mmol/L，优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度1mmol/L，葡萄糖浓度0.1mmol/L；
优选地，步骤(2)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚，优选为10-15枚；
优选地，所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种；
优选地，所述敲除Fah基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠；
优选地，所述代养小鼠为ICR小鼠。
4.一种如权利要求3所述的基因敲除的方法敲除Fah基因后得到的NSIF小鼠模型。
5.一种免疫缺陷小鼠模型，其特征在于，所述小鼠在权利要求4所述的NSIF小鼠的基础上进一步进行基因改造。
6.如权利要求4或5所述的小鼠模型作为肝脏疾病研究和/或肝脏人源化的模型鼠的用途。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述敲除Foxnl基因的方法包括如下步骤：
(1)构建Foxn1基因敲除的重组载体，体外转录gRNA；
(2)体外转录Cas9mRNA；
(3)获取NSI小鼠受精卵，将步骤(1)得到的gRNA和步骤(2)得到的Cas9mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质，培养24h后，移植入假孕小鼠子宫，获得嵌合或杂合NSIN(NOD-scid IL2rg-/-Foxn1-/-)免疫缺陷小鼠；
(4)将步骤(3)得到的嵌合或杂合NSIN免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交，获得更多杂合NSIN免疫缺陷小鼠，杂合NSIN免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIN纯合免疫缺陷小鼠；
优选地，所述构建Foxn1基因敲除的重组载体的步骤包括：通过引物获得线性化guide DNA(L-gDNA)，再通过DNA连接酶连接到线性化L-pT7载体上，得到pT7-gDNA完整载体；
优选地，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3-4所示；
优选地，所述gRNA体外转录包括如下步骤：以pT7-gDNA完整载体为模板，通过引物扩增gDNA基因片段，再进行体外转录获得gRNA；
优选地，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5-6所示；
优选地，步骤(2)所述的体外转录Cas9mRNA包括如下步骤：使pcDNA3.3-hCas9载体线性化，回收线性化的pcDNA3.3-hCas9载体为体外转录的模板，以SP6聚合酶启动子在体外转录Cas9mRNA，Licl法回收带帽Cas9mRNA，加poly A，纯化后保存；
优选地，步骤(3)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的gRNA和Cas9mRNA的浓度为10-200ng/μL，优选为12-100ng/μL，进一步优选为20ng/μL；
优选地，所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基10-40mmol/L的HEPES，pH 7.0-8，非必需氨基酸为0.05-1mmol/L，必需氨基酸为0.1-2mmol/L，优选为为20mmol/L的HEPES，pH 7.4-7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L；
优选地，所述敲除Foxn1基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L，谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L，葡萄糖浓度0.01-1mmol/L，优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度1mmol/L，葡萄糖浓度0.1mmol/L；
优选地，步骤(3)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚，优选为10-15枚；
优选地，所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种；
优选地，所述敲除Foxnl基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠；
优选地，所述代养小鼠为ICR小鼠。
8.一种如权利要求3所述的基因敲除的方法敲除Foxnl基因后得到的NSIN小鼠模型。
9.一种免疫缺陷小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型在权利要求8所述的NSIN小鼠的基础上进一步进行基因改造。
10.如权利要求4或5所述的小鼠模型作为肿瘤疾病研究的模型鼠的用途。
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