CN102460162A - 体内扩增人肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了一种使用还有延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的免疫缺陷小鼠，在体内扩增人肝细胞的方法。所述方法包括将人肝细胞移植到免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中，将IL-1R拮抗剂给予所述小鼠，并允许所述肝细胞扩增。或者，所述方法包括将人肝细胞移植到免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中，其中所述小鼠还有IL-1R缺陷，并允许所述肝细胞扩增。所述方法还允许将所述人肝细胞连续移植到第二级、第三级、第四级或其他小鼠中。

Description

体内扩增人肝细胞的方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2010年1月20日提交的美国临时申请No.61/296,774和2009年5月1日提交的美国临时申请No.61/174,791的优先权益，这些临时申请在此以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本公开涉及一种用于扩增肝细胞(例如人肝细胞)的方法，具体来说涉及利用免疫缺陷且Fah缺陷小鼠扩增肝细胞的方法。
致谢政府支持
本发明是在国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的课题编号DK051592的政府支持下作出。美国政府在本发明中拥有一定权利。
背景技术
肝是异生化合物(包括医用药物)代谢的重要位点。因为许多肝酶是种属特异性的，因此必需使用培养的原代人肝细胞或它们的微粒体级分，来评估候选药物的代谢(Brandon et al.，Toxicol.Appl.Pharmacol.189：233-246，2003；Gomez-Lechon et al.，Curr.Drug Metab.4：292-312，2003)。尽管微粒体肝细胞级分可用于阐释某些代谢功能，但其他的测试依赖于活的肝细胞。例如，某些化合物诱导肝酶，因此它们的代谢随着时间而变化。为了分析酶的诱导，肝细胞不仅必须是活的，而且必须是完全分化和有功能的。
对于药物代谢和其他研究来说，通常将肝细胞从遗体器官供体分离，并运送到要进行测试的场所。遗体来源的肝细胞的状态(存活性和分化状态)差异很大，许多细胞制品的质量勉强合格。高质量人肝细胞的可获得性受到了下述事实的进一步妨碍，即它们不能在组织培养中大量扩增(Runge et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.274：1-3，2000；CascioS.M.，Artif.Organs 25：529-538，2001)。在铺板后，细胞存活，但是不分裂。来自容易获得的哺乳动物物种(例如小鼠)的肝细胞，不适合于大多数药物测试研究，因为它们具有不同的成套代谢酶，并在诱导研究中以不同方式应答。永生的人肝细胞(肝细胞瘤)或胎儿成肝细胞不足以代替完全分化的成年细胞。在微生物学领域中的研究也需要人肝细胞。许多人病毒(例如引起肝炎的病毒)不能在任何其他细胞类型中复制。
由于这些限制，非常需要扩增原代人肝细胞的方法。因此，本文提供了用于扩增人肝细胞的强力系统。
发明内容
本文描述了免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其可以应用于多种目的，包括用于从其他物种(特别是人)扩增肝细胞，并且作为人肝脏疾病的动物模型，所述肝脏疾病包括肝硬化、纤维化、肝细胞癌(HCC)和肝感染。
本文提供了一种体内扩增人肝细胞的方法。所述方法包括将人肝细胞移植到免疫缺陷且延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷小鼠中，允许所述肝细胞扩增，并任选收集人肝细胞。在数个实施方案中，为了提高移植物移入效率，对所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠给予IL-1R拮抗剂，或者所述小鼠还有IL-1R缺陷。
在一些实施方案中，在移植人肝细胞过程中和/或之后对所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠给予IL-1R拮抗剂。
在一些实施方案中，所述小鼠的免疫缺陷是由于遗传突变、免疫抑制或它们的组合引起的。
还提供了一种通过以下方式选择可有效治疗人肝脏疾病的试剂的方法：将候选试剂给予免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并评估所述候选试剂对所述肝脏疾病的效果，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂。一种或多种所述肝脏疾病的体征或症状的改善表示所述候选试剂可有效治疗所述肝脏疾病。
还提供了一种通过以下方式选择可有效治疗人肝脏病原体感染的试剂的方法：将候选试剂给予移植人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并评估所述候选试剂对所述肝脏感染的效果，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，且其中所述移植的人肝细胞被所述肝脏病原体感染。
还提供了一种通过以下方式选择可有效治疗肝硬化的试剂的方法：将候选试剂给予移植人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并评估所述候选试剂对所述小鼠肝硬化的至少一种诊断标记的效果。在该方法中，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂。还提供了一种通过以下方式选择可有效治疗HCC的试剂的方法：将候选试剂给予移植人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并评估所述候选试剂对所述小鼠HCC的效果，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂。
还提供了一种评估外源性试剂在体内对人肝细胞效果的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将所述外源性试剂给予免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并测量所述小鼠肝功能的至少一种标记物，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂。
还提供了评估用于肝的基因治疗方案和载体(包括基因表达和基因敲除载体)；药物代谢、药代动力学、效力、毒性和安全性；以及人遗传性肝脏疾病的方法。这类方法可以利用移植人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，或者可以利用在此类小鼠中扩增并从其收集的人肝细胞，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂。
本发明的上述和其他目标、特征和优点通过以下详细说明将更加清晰，所述详细说明参考附图给出。
附图说明
图1A是显示了在用人肝细胞进行移入(engraftment)和再殖(repopulation)后，三重突变FRG小鼠(#471)和两只杂合子同窝仔畜(#469，#470)的相对重量的图。FRG小鼠在移植后6周维持了其体重；但是，Il2rg基因杂合子同窝仔畜持续地减重。NTBC只在第一和第四周施用，其用阴影指示。图1B是凝胶的数字照片，显示了来自肝细胞-受体肝脏的基因组DNA上人Alu序列的PCR扩增产物。只有FRG小鼠是阳性的。图1C-E是显示了野生型(C)、Fah-/-(D)和人源化小鼠肝脏(E)中的FAH酶活性的图片。FAH底物浓度在野生型小鼠肝脏中下降了，但是使用Fah-/-小鼠肝时没有变化。人源化小鼠肝脏显示出充足的酶活性。图1F是再殖的小鼠肝脏中FAH免疫染色的数字照片，显示出超过80％的肝细胞是FAH阳性的(由深染色和较大箭头指示)。小箭头区别指示了FAH阴性细胞。图1G是相同肝切片的H&E染色的数字照片，显示了人肝细胞嗜曙红性较低(由箭头指示)。原始放大倍数×200。
图2A-H是来自嵌合体小鼠的组织学和免疫组织化学组织切片的数字照片。图2A是数字照片，显示了FAH阳性人肝细胞被整合到小鼠肝脏组织中，并且不扰乱受体肝脏的微观结构。图2B是数字照片，显示了高度再殖的嵌合肝脏也保留了正常的结构。图2C和2D是H&E染色的数字照片，显示了人肝细胞簇嗜曙红性较低。图2E是数字照片，显示了对FAH染色的系列切片。图2F是数字照片，显示了对HepPar染色的系列切片。图2G是来自高度再殖小鼠的肾脏切片的数字照片，显示出即使在移植后4个月，也没有肾小管或肾小球破坏。图2H是数字照片，显示了脾脏中FAH阳性的人肝细胞。原始放大倍数×100(图2C)，×200(图2A、2B、2E、2F和2G)，×400(图2D和2H)。
图3A是一系列凝胶切片，显示了来自嵌合小鼠肝脏的RT-PCR产物。人ALB、FAH、TAT、TF、TTR和UGT1A1基因在嵌合小鼠肝(#697和#785)中表达。人肝细胞和小鼠肝细胞被分别用作阳性和阴性对照。图3B(正常作图)和图3C(对数作图)是显示了使用ELISA测定的原代肝细胞受体的血液人白蛋白浓度的图。所述系统的阈值浓度为大约0.005μg/ml。图3D(正常作图)和图3E(对数作图)是显示了次级受体的人白蛋白浓度的图。对数作图显示了白蛋白浓度的倍增时间是大约一周。
图4A是示意图，显示了从原代细胞开始(在最左侧的深色框中)的连续的移植流程。深色框指示了再殖的连续受体，白色框指示未被移植的小鼠。只有1/4的初级受体被再殖，但是所有的6个次级受体都被移植了。图4B是凝胶的数字照片，显示了来自连续移植的受体肝脏的Alu序列的PCR扩增产物。图4C-E是通过FAH免疫细胞化学分析的肝细胞的数字照片，证明了来自第三级小鼠的培养肝细胞中超过70％对FAH是阳性的。图4F-H是组织切片的数字照片，显示了连续移植的小鼠肝脏的FAH免疫组织化学。初级(F)、次级(G)和第三级(H)受体肝脏均通过人肝细胞进行了再殖。
图5A-C是嵌合小鼠肝细胞的抗小鼠白蛋白抗体和抗FAH抗体免疫细胞化学的数字照片。大多数来自嵌合肝脏的肝细胞是小鼠白蛋白或FAH单一阳性的。图5D-F是嵌合小鼠肝细胞的抗人白蛋白抗体和抗FAH抗体免疫细胞化学的数字照片。大多数肝细胞是人白蛋白和FAH双重阳性的。原始放大倍数×100。图5G-5L是显示了嵌合小鼠肝细胞的流式细胞术分析的图。使用了FITC结合的抗HLA A、B、C抗体和PE结合的抗H-2Kb抗体。显示了针对HLA-A、B、C的对照人肝细胞(G)；针对HLA-A、B、C的对照小鼠肝细胞(I)；针对H-2Kb的对照人肝细胞(H)；针对H-2Kb的对照小鼠肝细胞(J)；以及来自两个高度嵌合小鼠的肝细胞(K和L)，它们各自对于HLA或H-2Kb是阳性的。
图6A和6B是显示了乙氧基9-羟基-3-异吩噁唑酮-O-脱乙基酶(CYP1A1依赖)的代谢(A)，以及睾酮向6-β-羟基睾酮的转化(CYP3A4介导的)(B)的图。分析了来自三只具有不同的人肝细胞再殖水平(M79010％；M69730％；M78560％)的小鼠的培养肝细胞。图6C是描绘了通过定量RT-PCR测定的与药物代谢、运输和缀合相关的人特异性基因的mRNA水平的图。人药物代谢基因的比例是成年人肝细胞特有的。
图7A-7H是描绘了在来自三只具有不同的人肝细胞再殖水平(M79010％；M69730％；M78560％)的小鼠的肝细胞中，肝脏特异性基因和参与肝细胞中药物代谢的基因的基础基因表达水平的图。图7A是三个样品中针对小鼠肌动蛋白mRNA标准化的肝脏特异性基因的基础表达条形图。图7B-7H是响应于β-萘黄酮(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif)而对参与药物代谢的mRNA的诱导的条形图，相对于在未诱导的培养物中的诱导。显示的是CYPA4(B)，CYP2B6(C)，CAR(核激素受体)(D)，MDR1(转运蛋白)(E)，MRP(F)，BSEP(转运蛋白)(G)，以及PXR(核激素受体)(H)。CYP3A4被苯巴比妥的诱导甚至比在酶的水平上更显著。
图8是从人源化FRG小鼠分离的肝细胞的FACS图。细胞以抗人CD46抗体和抗小鼠肝细胞(HC)表面标记物抗体共染色。大多数(＞85％)肝细胞是人的。
序列表
在随附的序列列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用了核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码，正如在37C.F.R.1.822中定义的。每个核酸序列只显示了一条链，但是应该理解对所显示的链的任何引用也包含了互补链。
序列表以ASCII文本文件——2010年4月16日生成的附件C/St.25文本文件，17KB——提交，该文本文件以引用的方式纳入本文。
在随附的序列列表中：
SEQ ID NO：1和2是用于扩增人Alu序列的PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：3是人ALB的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：4是人ALB的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：5是小鼠Alb的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：6是小鼠Alb的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：7是人TAT的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：8是人TAT的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：9是人TF的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：10是人TF的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：11是人FAH的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：12是人FAH的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：13是人TTR的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：14是人TTR的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：15是人UGT1A1的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：16是人UGT1A1的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：17和18分别是人IL-1RA的核酸和氨基酸序列(在2003年1月24日以GenBank登记号No.NM 000577.3登记)。
SEQ ID NO：19和20分别是小鼠IL-1RA的核酸和氨基酸序列(在2007年4月6日以GenBank登记号No.NM 001039701登记)。
SEQ ID NO：21是阿那白滞素(anakinra)的氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
AAV         腺相关病毒
ALB         白蛋白
ALT         丙氨酸氨基转移酶
AST         天冬氨酸氨基转移酶
BNF         β-萘黄酮
CMV         巨细胞病毒
DAB         二氨基联苯胺
ELISA       酶联免疫吸附测定法
EROD        乙氧基9-羟基-3-异吩噁唑酮-O-脱乙基酶
ES          胚胎干细胞
FACS        荧光激活细胞分选术
FAH         延胡索酰乙酰乙酸水解酶
FISH        荧光原位杂交
FITC        异硫氰酸荧光素
FRG         Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-三重突变体小鼠
H&E         苏木精和伊红
HBV         乙型肝炎病毒
HCV         丙型肝炎病毒
HLA        人白细胞抗原
HT1        1型遗传性酪氨酸血症
IL-1       白细胞介素-1
IL-1R      白细胞介素-1受体
IL-1RA     白细胞介素-1受体拮抗剂
IL-1RAP    白细胞介素-1受体辅助蛋白
IL-2Rγ    白细胞介素-2受体γ
iPS        诱导多能干
IPSC       诱导多能干细胞
MHC        主要组织相容性复合物
mTOR       雷帕霉素的哺乳动物靶
NOD        非肥胖糖尿病
NTBC       2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮
PB         苯巴比妥
PBS        磷酸盐缓冲盐水
PCR        聚合酶链式反应
PE         藻红蛋白
PFU        噬斑形成单位
RAG        重组酶活化基因
Rif        利福平
RT-PCR     反转录聚合酶链式反应
SA         琥珀酰丙酮
SCID       重度联合免疫缺陷
TAT        酪氨酸氨基转移酶
TF         转铁蛋白
TTR        运甲状腺素蛋白
UGT1A1     UDP葡萄糖醛酸转移酶1家族，多肽A1
uPA        尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂
II.术语和方法
除非特别指明，技术术语按照常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，published by OxfordUniversity Press，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，published by Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(ed.)，MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，publishedby VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了便于浏览本发明的各种不同实施方案，提供了下面对具体术语的解释：
给药：通过任何有效途径向受试者提供或给予试剂，例如治疗剂。示例性给药途径包括但不限于注射(例如皮下、肌肉、真皮内、腹膜内和静脉)、口服、管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
抑制或阻止肝脏疾病发生的药剂：当给予FRG小鼠、FpmRG小鼠或其他类型的Fah缺陷小鼠时，在所述小鼠中阻止、延迟或抑制肝脏疾病发生的化合物或组合物。肝脏疾病或肝功能障碍的特征为多种体征或症状中的任何一种，包括但不限于肝组织学的改变(例如坏死、炎症、纤维化、发育异常或肝癌)，肝特异性酶和其他蛋白(例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白)的水平的改变，或肝总体衰竭(generalized liver failure)。在一个实施方案中，抑制肝脏疾病的试剂是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。
羊水细胞：在胚胎周围的羊水中发现的细胞。
阿那白滞素：白细胞介素-1(IL-1)受体拮抗剂。阿那白滞素可通过竞争性抑制IL-1对IL-1受体的结合阻断天然IL-1的生物学活性，IL-1受体在多种组织和器官中表达。IL-1在对炎症刺激的应答中产生，并介导多种生理学应答，包括炎症反应和免疫反应。阿那白滞素是从经遗传修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)培养物制备的重组的、非糖基化形式的人IL-1RA(IL-1受体拮抗剂)。阿那白滞素蛋白质有153个氨基酸，具有大约17.3kD的分子量，与天然人IL-IRA(SEQ ID NO：18)的不同之处在于它在其氨基末端具有单个甲硫氨酸残基(阿那白滞素的氨基酸序列在本文中列出为SEQ ID NO：21)。阿那白滞素还被称为KINERETTM。
拮抗剂：抵消另一种化合物的效应的化合物(例如药物、蛋白质或小分子)。在一些情况下，拮抗剂结合于具体的细胞受体，但不引发生物学反应。
抗体：包含一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质(或蛋白质复合物)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们相应地分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
基本的免疫球蛋白(抗体)结构单元一般是四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻链”(大约25kDa)和一条“重链”(大约50-70kDa)。每条链的N-末端界定了大约100到110个或以上氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。
本文中使用的术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及许多已充分表征的片段。例如，与靶蛋白(或蛋白质或融合蛋白中的表位)结合的Fabs、Fvs以及单链Fvs(scFvs)，也是该蛋白(或表位)的特异性结合剂。这些抗体片段定义如下：(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体而得到完整的轻链和一条重链的一部分而产生；(2)Fab′，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后还原产生完整的轻链和重链的一部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab′片段；(3)(Fab′)2，通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后不进行还原而获得的抗体的片段；(4)F(ab′)2，通过两个二硫键连接在一起的两个Fab′片段的二聚体；(5)Fv，遗传工程的片段，含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；以及(6)单链抗体，含有轻链可变区和重链可变区的遗传工程分子，所述轻链可变区和重链可变区通过适合的肽接头连接成遗传融合的单链分子。制造这些片段的方法是常规的(参见，例如Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，CSHL，NewYork，1999)。
用于本公开内容的方法的抗体可以是单克隆的或多克隆的。仅举例来说，单克隆抗体可以用鼠类杂交瘤按照Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256：495-97，1975)或其衍生方法制备。单克隆抗体生产的详细步骤记载在Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，CSHL，New York，1999中。
抗原：可以在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收至动物中的组合物。抗原可与具有特异性体液免疫或细胞免疫性的产物反应。“病原体特异性抗原”是抗原，例如由病原体(例如病毒、细菌或寄生虫)表达的在受试者中可引发免疫反应的蛋白质。
硫唑嘌呤(azathioprine)：作为嘌呤合成抑制剂的免疫抑制剂，抑制细胞特别是白细胞增殖。该免疫抑制剂经常用于治疗自身免疫病或器官移植排斥。它是一种前药，在体内转化成活性代谢物6-巯基嘌呤(6-MP)和硫代肌苷酸。硫唑嘌呤由多个一般制造商(generic manufacturer)制备，以及具有商品名(Salix的AzasanTM；GlaxoSmithKline的ImuranTM；AzamunTM；和ImurelTM)。
B细胞：一种类型的淋巴细胞，在体液免疫应答中发挥重要作用。B细胞的基本功能是制造针对可溶性抗原的抗体。B细胞是获得性免疫系统的必要组分。
生物样品或样品：获自受试者的细胞、组织或体液，例如外周血、血清、血浆、脑脊液、骨髓、尿、唾液、组织活检切片(biopsy)、手术标本和尸检材料的样品。
肝硬化：是指一组慢性肝脏疾病，特征在于失去正常的微观小叶结构，并且以结缔组织的纤维束再生性地替换坏死的组织，这最终使该器官收缩并分成不规则小结。肝硬化具有长潜伏期，之后通常突然腹疼和肿胀，伴有呕血、坠积性水肿或黄疸。在后期，可能有腹水、明显黄疸、门静脉高血压、静脉曲张和中枢神经系统障碍，最终导致肝昏迷。
收集：本文中使用的“收集”扩增的人肝细胞，是指从已经注射过分离的人肝细胞的小鼠(也被称为受体小鼠)取出扩增的肝细胞的过程。收集任选地包括将肝细胞与其他细胞类型分离开。在一个实施方案中，从Fah缺陷小鼠的肝脏收集扩增的人肝细胞。在某些实施例中，从FRG小鼠或FpmRG小鼠的肝脏收集扩增的人肝细胞。
白细胞介素受体的共同γ链(Il2rg)：编码白细胞介素受体的共同γ链的基因。Il2rg是许多白介素的受体成分，所述白介素包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15(Di Santo et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：377-381，1995)。Il2rg缺陷的动物表现出B细胞和T细胞减少，并缺乏自然杀伤细胞。Il2rg也被称为白细胞介素-2受体γ链。
冷冻保存的：本文使用的“冷冻保存的”是指通过冷却到较低的零下温度(例如77K或-196℃(液氮的沸点))来保存或维持的细胞或组织。在这些低温下，任何生物活性(包括导致细胞死亡的生物化学反应)都被有效停止。
环孢菌素A：作为土壤真菌雪白白僵霉菌(Beauveria nivea)产生的具有11个氨基酸的非核糖体环肽的免疫抑制剂化合物。环孢菌素A可在器官和组织移植中用于预防移植排斥。环孢菌素A也被称为环孢菌素A(cyclosporine)和环孢素(ciclosporin)。
降低的肝功能：用于度量肝的健康或功能的许多参数中任何一个的异常变化。降低的肝功能在本文中也被称为“肝功能障碍”。肝功能可以通过本技术领域中公知的许多手段中的任何一种进行评价，例如但不限于检查肝组织学和测量肝酶或其他蛋白质。例如，肝功能障碍可以由肝的坏死、炎症、纤维化、氧化损伤或发育异常所指示。在某些情况下，肝功能障碍由肝癌指示，例如肝细胞癌。可以被测试以评估肝功能障碍的肝酶和蛋白质的实例，包括但不限于丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白。肝功能障碍也可以导致肝总体衰竭。用于测试肝功能的方法在本技术领域中是众所周知的，例如由Grompe等(Genes Dev.7：2298-2307，1993)和Manning等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：11928-11933，1999)所讲述的。
缺陷：本文中使用的“Fah缺陷”或“Fah中的缺陷”是指动物(例如小鼠)在Fah中含有突变，导致了Fah mRNA表达和/或功能性FAH蛋白的显著减少或不存在。本文使用的术语功能性FAH蛋白“丧失表达”不是仅指完全丧失表达，而且还包括功能性FAH蛋白表达的显著降低，例如降低约80％、约90％、约95％或约99％。在一个实施方案中，Fah缺陷的动物在Fah基因中含有纯合型中断，例如纯合型缺失。中断包括例如插入、缺失、一个或多个点突变，或者它们的任意组合。作为一个实例，一种纯合的缺失是在Fah的外显子5中。在另一个实施方案中，Fah缺陷的动物在Fah基因中含有一个或多个点突变。适合的Fah点突变的实例在本技术领域中是已知的(参见例如Aponte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(2)：641-645，2001)。类似地，“IL-1R缺陷”或“IL-1R中的缺陷”是指包含IL-1R突变的动物例如小鼠，所述突变导致IL-1R mRNA表达和/或功能性IL-1R蛋白显著减少或丧失。IL-1R敲除小鼠以前已有记载(参见例如Norman et al.，Ann.Surg.223(2)：163-169，1996；Glaccum et al.，J.Immunol.159：3364-3371，1997)，并可市购获得，例如来自The JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。另外，Rag1缺陷、Rag2缺陷和Il2rg缺陷是指这样的动物，即分别包含Rag1、Rag2和Il2rg突变，导致mRNA表达或功能性蛋白质的产生显著降低或丧失。Rag1、Rag2和Il2rg敲除小鼠以前已有记载，并可市购获得。
消除：减少或除去。本文中使用的“巨噬细胞消除”是指清除、除去、减少或杀死动物中的巨噬细胞的过程。已经被消除巨噬细胞的动物，不必完全不含巨噬细胞，但是至少表现出巨噬细胞数量的减少或活性的降低。在一个实施方案中，巨噬细胞消除导致功能性巨噬细胞减少了至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％或100％。
中断：本文使用的基因“中断”是指任何插入、缺失或点突变，或者它们的任意组合。在一些实施方案中，所述中断可导致mRNA表达和/或功能性蛋白质部分或完全丧失。
胚胎干(ES)细胞：从发育中的胚泡的内部细胞团分离的多能细胞。ES细胞是多能细胞，意味着它们可以产生身体中存在的所有细胞(骨骼、肌肉、脑细胞等)。用于产生鼠类ES细胞的方法可见于美国专利No.5,670,372。用于产生人ES细胞的方法可见于美国专利No.6,090,622、PCT公布No.WO 00/70021和PCT公布No.WO 00/27995。本文还考虑诱导多能干细胞(iPS细胞)，这是通过诱导某些基因(例如OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28、Klf4和/或c-Myc)表达从非多能细胞(例如成年体细胞)以人工方法得到的一种多能干细胞类型(Yu et al.，Science318(5858)：1917-1920，2007；Takahashi et al.，Cell131(5)：861-872，2007)。迄今，已经报道了来自小鼠(Okita et al.，Nature 448(7151)：313-317，2007)、人(Yu et al.，Science 318(5858)：1917-1920，2007；Takahashi et al.，Cell131(5)：861-872，2007)、大鼠(Li et al.，Cell Stem Cell4(1)：16-19，2009)、猴子(Liu et al.，Cell Stem Cell3(6)：587-590，2008)和猪(Esteban et al.，J.Biol.Chem.Epub April 21，2009)的iPS细胞。
移入：将细胞或组织植入到动物中。本文中使用的人肝细胞移入受体小鼠中，是指人肝细胞在注射后开始被植入到受体小鼠中的过程。移入的人肝细胞能够在受体小鼠中扩增。正如本文所述，“显著的移植”是指在受体小鼠中，肝脏中至少大约1％的肝细胞是人的。“高度移植的”小鼠，是其肝脏中至少大约60％的肝细胞是人的小鼠。但是，移植效率可以更高，例如所述小鼠肝脏中至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％或至少大约95％的肝细胞是人肝细胞。
扩增：增加数量。本文中使用的“扩增”人肝细胞，是指允许细胞分裂发生，使得人肝细胞的数量增加的过程。正如本文所述，使人肝细胞在受体小鼠中扩增至少大约4周、至少大约6周、至少大约8周、至少大约12周、至少大约16周、至少大约20周、至少大约24周或至少大约28周。在一个实施方案中，使人肝细胞扩增最多达大约6个月。在其他实施方案中，允许所述人肝细胞扩增最长达约8、约10或约12个月。通过扩增产生的人肝细胞的数量可以是不同的。在一个实施方案中，扩增产生了至少1千万、至少2千万、至少3千万、至少4千万或至少5千万个肝细胞。假设最初注射了1百万个肝细胞，并且有大约10％移入，则肝细胞扩增可以在大约10倍到大约500倍的范围内。在一些实施方案中，人肝细胞在受体小鼠中的扩增，导致增加了至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍或至少1000倍。
FK506：FK506也被称为他克莫司(tacrolimus)或藤霉素(fujimycin)，是一种免疫抑制药物。FK506是一种23元大环内酯，最初在包含筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)的日本土样的发酵液中发现。该化合物经常用在同种异体器官移植后，以减少患者免疫系统的活性并降低器官排斥的风险。FK506可降低T细胞和白细胞介素-2活性。它还被以局部用制剂形式用于治疗骨髓移植后的严重特应性皮炎(湿疹)、严重顽固性葡萄膜炎和皮肤病症白癜风。
氟达拉滨(fludarabine)：抑制DNA合成的嘌呤类似物。氟达拉滨经常被用作化学治疗药，用于治疗多种血液学恶性病。
FRG小鼠：在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、重组酶活化基因2(Rag2)和白细胞介素受体的共同γ链(Il2rg)基因中具有纯合缺失的突变小鼠。在本文中也被称为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-。本文中使用的Fah、Rag2和Il2rg基因中的纯合缺失，是指在含有所述突变的小鼠中不表达功能性FAH、RAG-2和IL-2Rγ蛋白。
FpmRG小鼠：在重组酶活化基因2(Rag2)、和白细胞介素受体的共同γ链(Il2rg)基因中具有纯合缺失，以及在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)中具有纯合点突变的突变小鼠。在FpmRG小鼠的Fah基因中的点突变，导致了mRNA中的错误拼接和外显子7的丢失(Aponte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：641-645，2001)。在本文中也称为Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-。本文中使用的Rag2和Il2rg基因中的纯合缺失，是指在含有突变的小鼠中不表达功能性RAG-2和IL-2Rγ蛋白。此外，在Fah基因中具有纯合点突变的小鼠，不表达功能性FAH蛋白。
延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)：催化酪氨酸分解代谢最后一步的代谢酶。具有Fah基因的纯合缺失的小鼠表现出改变的肝脏mRNA表达和严重的肝功能障碍(Grompe et al.，Genes Dev.7：2298-2307，1993)。Fah基因中的点突变还已被证明可引起肝衰竭和产后致死(postnatallethality)(Aponte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(2)：641-645，2001)。Fah缺陷的人会形成肝脏疾病1型遗传性酪氨酸血症(HT1)并形成肝衰竭。Fah缺陷可导致延胡索酰乙酰乙酸(强氧化剂)积累，这最终可导致Fah缺陷的肝细胞的细胞死亡。因此，Fah缺陷动物可以以来自包括人的其他物种的肝细胞再殖。
逐渐降低：本文中使用的“逐渐降低”NTBC的剂量，是指随着时间、例如经过几天时间减少施用于Fah缺陷小鼠的NTBC剂量的过程。在一个实施方案中，NTBC剂量在大约6天的时间内逐渐降低，其中剂量以大约1或2天的间隔降低，使得在大约1周后，不再给予NTBC。NTBC的逐渐降低可以在更短或更长的时间过程中进行，剂量减少之间的时间间隔也可以更短或更长。
肝脏病原体：是指可感染肝细胞的任何病原体，例如细菌、病毒或寄生病原体。在一些实施方案中，所述肝脏病原体是“嗜肝病毒”(靶向肝的病毒)，例如HBV或HCV。
肝细胞癌(HCC)：HCC是肝脏的原发性恶性病，一般出现在具有由病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化引起的炎性肝的患者中。
肝细胞：一种细胞类型，占肝脏细胞质质量的70-80％。肝细胞参与蛋白质合成，蛋白质储存和碳水化合物转化，胆固醇、胆汁盐和磷脂的合成，以及外源和内源物质的解毒、修饰和排泄。肝细胞也引发胆汁的形成和分泌。肝细胞制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血因子的凝血酶原组，并且是脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、补体和糖蛋白合成的主要位点。此外，肝细胞具有代谢、解毒和灭活外源化合物(例如药物和杀虫剂)以及内源化合物(例如类固醇)的能力。
1型遗传性酪氨酸血症(HT1)：酪氨酸血症是一种代谢错误，通常是先天的，其中身体不能有效降解酪氨酸。HT1是该病症的最严重形式，并且是由人15号染色体上Fah基因编码的延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)的不足引起。FAH是在降解酪氨酸需要的5个酶系列中的最后一个。HT1的症状通常出现在生命最初几个月，包括无法增加体重和无法以预期速度生长(发育停滞)、腹泻、呕吐、皮肤泛黄和眼睛发白(黄疸)、元白菜样气味和出血倾向增加(特别是鼻出血)。HT1可以导致肝衰竭和肾衰竭、影响神经系统的问题和肝癌风险增加。
杂合的：在相应染色体基因座具有不同等位基因。例如，对于具体基因突变杂合的动物在所述基因的一个等位基因有突变，但另一个没有突变。
纯合的：在一个或多个基因座处具有同样的等位基因。本文中使用的“对于中断纯合”，是指生物体在基因的两个等位基因具有同样的中断(例如插入、缺失或点突变)。
免疫缺陷：缺乏免疫系统的至少一种必需功能。本文中使用的“免疫缺陷”小鼠是缺乏免疫系统的特定组分或缺乏免疫系统的特定组分的功能的小鼠。在一个实施方案中，免疫缺陷小鼠缺乏功能性B细胞、T细胞和/或NK细胞。在另一个实施方案中，免疫缺陷小鼠还缺乏巨噬细胞。在一些实施方案中，“免疫缺陷小鼠”包含一个或多个如下遗传改变：Rag1-/-、Rag2-/-、Il2rg-/-、SCID、NOD和裸鼠。免疫缺陷小鼠株系是本领域中公知的，并且可市购获得，例如来自杰克逊实验室(The JacksonLaboratory)(Bar Harbor，ME)或Taconic(Hudson，NY)。在一些实施方案中，免疫缺陷小鼠是已经被给予一种或多种免疫抑制剂的小鼠。
免疫抑制剂：可降低免疫系统一个或多个方面的功能或活性的任何化合物，例如体液或细胞免疫系统或者补体系统的组分。在本发明的具体实施方案中，所述免疫抑制剂为FK506、环孢霉菌A、氟达拉滨、麦考酚酯(mycophenolate)、泼尼松(prednisone)、雷帕霉素(rapamycin)或硫唑嘌呤，或者它们的结合物。
已知免疫抑制剂包括但不限于：(1)抗代谢药物，例如嘌呤合成抑制物(例如硫唑嘌呤和麦考酚酸)、嘧啶合成抑制剂(例如来氟米特(leflunomide)和特立氟胺(teriflunomide))和抗叶酸素(如甲氨喋呤)；(2)大环内酯类，例如FK506、环孢菌素A和吡美莫司(pimecrolimus)；(3)TNF-α抑制剂，例如酞胺哌啶酮(thalidomide)和雷利度胺(lenalidomide)；(4)IL-1受体拮抗剂例如阿那白滞素；(5)雷帕霉素哺乳动物靶(mTOR)抑制剂，例如雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、deforolimus、依维莫司(everolimus)、temsirolimus、佐他莫司(zotarolimus)和biolimus A9；(6)皮质类固醇类，例如泼尼松；和(7)针对许多细胞或血清靶中任一个的抗体。
示例性细胞靶和它们各自的抑制化合物包括但不限于补体成分5(例如依库珠单抗(eculizumab))、肿瘤坏死因子(TNF)(例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)、阿非莫单抗(afelimomab)和戈利木单抗(golimumab))；IL-5(例如美泊利单抗(mepolizumab))；IgE(例如奥马珠单抗(omalizumab))；BAYX(例如奈瑞莫单抗(nerelimomab))；干扰素(例如法拉莫单抗(faralimomab))；IL-6(例如艾西莫单抗(elsilimomab))；IL-12和IL-13(例如来金珠单抗(lebrikizumab)和优特克单抗(ustekinumab))；CD3(例如莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab))；CD4(例如克立昔单抗(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)和扎木单抗(zanolimumab))；CD11a(例如依法利珠单抗(efalizumab))；CD18(例如厄利珠单抗(erlizumab))；CD20(例如阿托珠单抗(afutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、帕利珠单抗(pascolizumab))；CD23(例如鲁昔单抗(lumiliximab))；CD40(例如替奈昔单抗(teneliximab)、托利珠单抗(toralizumab))；CD62L/L-选择蛋白(例如阿塞珠单抗(aselizumab))；CD80(例如加利昔单抗(galiximab))；CD147/basigin(例如加维莫单抗(gavilimomab))；CD154(例如鲁利单抗(ruplizumab))；BLyS(例如贝利单抗(Belimumab))；CTLA-4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab))；CAT(例如柏替木单抗(bertilimumab)、乐地单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab))；整联蛋白(例如那他珠单抗(natalizumab))；IL-6受体(例如托珠单抗(Tocilizumab))；LFA-1(例如奥度莫单抗(odulimomab))；以及IL-2受体/CD25(例如巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、伊诺莫单抗(inolimomab))。
其他免疫抑制剂包括阿佐莫单抗(zolimomab aritox)、阿托木单抗(atorolimumab)、西利珠单抗(cedelizumab)、达利珠单抗(dorlixizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、gantenerumab、gomiliximab、马司莫单抗(maslimomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、希普利珠单抗(siplizumab)、他利珠单抗(talizumab)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白；CTLA-4抑制剂(例如阿贝西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept))；阿柏西普(aflibercept)；来伐西普(alefacept)；列洛西普(rilonacept)；以及TNF抑制剂(例如依那西普(etanercept))。
免疫抑制：是指降低免疫系统活性或功能的作用。免疫抑制可以通过给予免疫抑制剂化合物实现，或者可以是疾病或病症的效应(例如，由HIV感染引起或由于遗传缺陷引起的免疫抑制)。
白细胞介素-1(IL-1)：术语“IL-1”包括IL-1α和IL-1β。IL-1α是一种参与多种免疫反应、炎症性过程和血细胞生成的多效细胞因子。IL-1α由单核细胞和巨噬细胞以前蛋白形式产生，该前蛋白响应于细胞损伤而经蛋白水解加工并释放，从而诱导凋亡。IL-1β由活化巨噬细胞以前蛋白形式产生，该前蛋白被胱天蛋白酶1蛋白水解加工成其活性形式。IL-1β是炎症应答的重要介导物，参与多种细胞活性，包括细胞增殖、分化和凋亡。
诱导多能干细胞(IPSC)：通过诱导某些基因表达而从非多能细胞(通常是成体细胞)以人工方法获得的多能干细胞类型。IPSC可以来自于任何生物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，IPSC产生自小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、猪、牛、非人灵长类或人。例如，人源IPSC。
IPSC在许多方面类似于ES细胞，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、活嵌合体形成以及潜能和分化能力。用于产生IPSC的方法是本领域中已知的。例如，IPSC一般是通过将某些干细胞相关基因(例如Oct-3/4(Pouf51)和Sox2)转染至非多能细胞(例如成体成纤维细胞)中生成。转染可以病毒载体(例如反转录病毒、慢病毒或腺病毒)实现。例如，细胞可以使用反转录病毒系统以Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转染，或者使用慢病毒系统以OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转染。在3-4周后，少量转染的细胞开始在形态学和生物化学上变得与多能干细胞相似，并且一般通过形态学选择、倍增时间或者通过报道基因和抗生素选择进行分离。在一个实例中，通过Yu et al.(Science 318(5854)：1224，2007)或Takahashiet al.(Cell 131(5)：861-72，2007)的方法生成来自成体细胞的IPSC。IPSC也被称为iPS细胞。
感染负荷(infectious load)：是指受试者中或来自所述受试者的样品中具体病原体的量。感染负荷可以使用本领域中已知的多种方法的任一种测量。所选的方法将根据待检测病原体的类型和可用于检测所述病原体的试剂而变化。例如，感染负荷还可以通过确定所述病原体滴度进行测量，用于确定所述病原体滴度的方法将根据待检测的病原体而变化。例如，一些病毒的滴度可以通过进行噬菌斑测定法进行定量。在一些实例中，感染负荷是通过定量样品中病原体特异性抗原的量进行测量。在其他实例中，感染负荷是通过定量样品中病原体特异性核酸分子的量进行测量。定量包括确定数量值，或者可以是相对值。
白细胞介素-1受体(IL-1R)：属于白细胞介素1受体家族的细胞因子受体。该蛋白是IL-1α、IL-1β和白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)的受体。它是参与多种细胞因子诱导的免疫应答和炎症应答的重要介导物。术语“IL-1R”一般包括I型IL-1R和II型IL-1R。在本公开内容的上下文中，“IL-1R”是指I型IL-1R。
IL-1R拮抗剂(IL-1RA)：可结合于IL-1R或IL-1R辅助蛋白并抑制IL-1R介导的活化的分子。IL-1R拮抗剂(IL-1RA)也是具体蛋白质的名称，所述具体蛋白质是可与细胞表面上与IL-1的相同受体结合的IL-1细胞因子家族成员。所述IL-1RA蛋白可抑制IL-1α和IL-1β活性，并调节多种IL-1相关的免疫应答和炎症应答。IL-1RA也被称为IRAP、IL1RA、IL-1ra3和IL1RN。
白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAP)：该基因编码一种IL-1受体辅助蛋白。IL-1通过在细胞膜上与IL-1R和IL-1RAP形成复合体，可在感染、组织损伤或应激过程中诱导急性期和促炎症蛋白质的合成。IL-1RAP的可变剪接可产生编码两种不同的同种型——一种是膜结合的，一种是可溶的——的两种转录物变体。IL-1RAP也被称为IL1R3、IL-1RAcP和IL1RAP。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器)已经基本上被与所述组分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物组分——即其他染色体的和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器——分开或从中纯化出来。已“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸。
“分离的肝细胞”是指已经从具体的来源(例如器官供体)获得的肝细胞。在一些实施方案中，“分离的肝细胞”是已经从供者体内取出的肝细胞。在一些实施方案中，“分离的肝细胞”是悬浮液中的肝细胞，或组织块中包含的肝细胞。在具体的实例中，分离的肝细胞是与其他细胞类型基本上分离或从中纯化出来的肝细胞，或者从其他组织类型(例如脂肪组织或纤维组织)中纯化出来的肝细胞。
巨噬细胞：组织中源自于被称为单核细胞的特定白细胞的一种细胞。单核细胞和巨噬细胞都是吞噬细胞，在脊椎动物的非特异性防御(或先天免疫)以及特异性防御(或细胞介导的免疫)中都发挥作用。它们的功能是作为静止或运动细胞吞噬(吞没然后消化)细胞碎片和病原体，并刺激淋巴细胞和其他免疫细胞对病原体作出响应。
雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)抑制剂：可抑制mTOR的表达或活性的分子。mTOR抑制剂包括但不限于小分子、抗体、肽和核酸抑制剂。例如，mTOR抑制剂可以是可抑制mTOR的激酶活性或者可抑制mTOR与配体结合的分子。mTOR的抑制剂还包括可下调mTOR表达的分子。本领域中已知很多mTOR抑制剂，包括雷帕霉素(西罗莫司)。
麦考酚酯：通常用于防止同种异体移植物排斥的免疫抑制剂。该药通常口服或静脉内给药。麦考酚酯源自真菌匍匐茎青霉菌(Penicilliumstoloniferum)。前药形式——吗替麦考酚酯(Mycophenolate mofetil)在肝脏中被代谢成活性部分麦考酚酸。它可抑制肌苷一磷酸脱氢酶，该酶可控制B和T淋巴细胞增殖中使用的嘌呤合成的从头途径中鸟嘌呤一磷酸的合成速率。麦考酚酸通常以商品名CellCeptTM(吗替麦考酚酯；Roche)和MyforticTM(麦考酚钠(mycophenolate sodium)；Novartis)市售。
自然杀伤(NK)细胞：一种形式的细胞毒性淋巴细胞，构成了先天免疫系统的主要成分。NK细胞在肿瘤和病毒感染细胞的宿主排斥中发挥了主要作用。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠：是指遗传上倾向于自发形成自身免疫性胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的小鼠。对IDDM的易感性是多基因的，环境对基因外显率有很强效应。所述NOD品系在Shionogi ResearchLaboratories in Aburahi，Japan(Makino et al.，“Establishment of thenon-obese diabetic(NOD)mouse，”In Current Topics in Clinical andExperimental Aspects of Diabetes Mellitus.Elsevier，Amsterdam，pages25-32，1985；Makino et al.，Exp.Anim.29：1-8，1980)开发。
NTBC(2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮)：4-羟基-苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的抑制剂。HPPD可催化4-羟基苯基丙酮酸转化成尿黑酸——酪氨酸分解代谢中的第二步。以NTBC进行的处理可在该步骤处阻断酪氨酸分解代谢通路，并阻止蓄积琥珀酰丙酮——在Fah缺陷人和动物中蓄积的病症特异性代谢物。
裸鼠：是指具有以下遗传突变的小鼠品系：所述遗传突变可造成胸腺劣化或缺乏，导致由于T细胞数目大大减少而抑制免疫系统。所述小鼠的表型外观是无体毛。裸鼠的叉头框N1(forkhead box N1)(Foxn1)基因有自发缺失。
泼尼松：作为有效免疫抑制剂的合成皮质类固醇。它经常用于治疗某些炎性疾病、自身免疫病和癌症，以及治疗或预防器官移植排斥。泼尼松通常口服，但可以通过肌内注射或静脉注射送递。它是可被肝脏转化成泼尼松龙(prednisolone)的前药，泼尼松龙是有活性的药物并且也是类固醇。
雷帕霉素：已知具有免疫抑制和抗增殖性质的化合物。雷帕霉素也称为西罗莫司，是最初作为细菌吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的产物而被发现的大环内酯。雷帕霉素可结合并抑制mTOR的活性。
受体：本文使用的“受体小鼠”是已用本文描述的分离的人肝细胞注射的小鼠。一般而言，一部分(百分率可以不同)人肝细胞移入到受体小鼠中。在一个实施方案中，受体小鼠是免疫缺陷小鼠，它还有Fah缺陷。在另一个实施方案中，受体小鼠是Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠，它还有Fah缺陷。在另一个实施方案中，受体小鼠是FRG小鼠。在另一个实施方案中，受体小鼠是FpmRG小鼠。在其他实施方案中，受体小鼠是以IL-1R拮抗剂处理的FRG小鼠，或者是还有IL-1R缺陷的FRG小鼠。
重组酶活化基因1(Rag1)：参与活化免疫球蛋白V(D)J重组的基因。RAG1蛋白参与DNA底物识别，但稳定的结合和切割活性还需要RAG2。
重组酶活化基因2(Rag2)：参与免疫球蛋白与T细胞受体位点重组的基因。Rag2基因缺陷的动物不能进行V(D)J重组，导致完全失去功能性T细胞和B细胞(Shinkai et al.，Cell 68：855-867，1992)。
连续移植：用于体内扩增人肝细胞的过程，其中收集在第一级小鼠中扩增的肝细胞，并例如通过注射，移植到第二级小鼠中进行进一步扩增。连续移植可以进一步包括第三级、第四级或更多级的小鼠(Overturfet al.，Am.J.Pathol.151：1078-9107，1997)。
重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠：是指不能进行V(D)J重组并因此缺乏功能性T细胞和B细胞的小鼠品系。SCID小鼠活化补体系统的一些组分的能力也受损。SCID小鼠是Prkdcscid突变纯合的。
干细胞：具有产生未改变的子细胞(自身更新；细胞分裂产生了至少一个与亲代细胞完全相同的子代细胞)和产生特化的细胞类型(潜能)的独特能力的细胞。干细胞包括但不限于胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖(EG)细胞、种系干(GS)细胞、人间充质干细胞(hMSC)、脂肪组织来源的干细胞(ADSC)、多能成体祖细胞(MAPC)、多能成体种系干细胞(maGSC)和不受限制的体干细胞(USSC)。干细胞在体内的功能是替换在动物的正常生命期间被破坏的细胞。一般来说，干细胞可以不受限制地分裂。在分裂后，干细胞可以保持为干细胞、变成前体细胞或进入终末分化。前体细胞是可以产生至少一种给定细胞类型的完全分化的有功能细胞的细胞。一般来说，前体细胞可以分裂。分裂后，前体细胞可以保持为前体细胞，或可以进入终末分化。在一个实施方案中，干细胞产生肝细胞。
T细胞：一种类型的白细胞、或淋巴细胞，在细胞介导的免疫中发挥中心作用。T细胞与其他类型的淋巴细胞(例如B细胞和NK细胞)的差别在于，在它们的细胞表面上存在被称为T细胞受体(TCR)的特异性受体。胸腺一般被认为是T细胞发育的主要器官。
治疗剂：当被适当地给予受试者时能够诱导所需治疗或预防效果的化合物、小分子或其他组合物，例如反义化合物、抗体、蛋白酶抑制剂、激素、趋化因子或细胞因子。本文使用的“候选试剂”是选择用于进行筛查以确定它是否能够作为具体疾病或病症的治疗剂而发挥功能的化合物。
滴度：在本公开内容的上下文中，滴度是指样品中具体病原体的量。
毒素：在本公开内容的上下文中，“毒素”是指任何有毒物质，包括任何化学毒素或生物毒素。
转基因：被导入到生物体的细胞或基因组中的外源核酸序列。
转基因动物：非人动物(通常为哺乳动物)具有非内源的(异源的)核酸序列作为染色体外元件存在于其一部分细胞中，或稳定地整合在其种系DNA中(即在其大多数或所有细胞的基因组序列中)。通过例如按照本技术领域中公知的方法对宿主动物的胚胎或胚胎干细胞进行遗传操作，将异源核酸导入到这样的转基因动物的种系中。“转基因”意指这样的异源核酸，例如表达构建物形式的异源核酸(例如用于产生“敲入”转基因动物)，或者在插入到靶基因中或附近后导致靶基因的表达降低的异源核酸(例如用于产生“敲除”转基因动物)。“敲除”基因意味着改变所述基因的序列，导致所述靶基因的功能降低，优选地使得靶基因的表达是不可检测到的或极少。转基因敲除动物可以包含对靶基因的杂合敲除或对靶基因的纯合敲除。“敲除”也包括条件性敲除，其中所述靶基因的改变可以在以下情况下才发生，在例如将该动物暴露于促进靶基因改变的物质后、导入促进所述靶基因位点处的重组的酶(例如Cre-lox系统中的Cre)后、或使用其他在出生后引导所述靶基因改变的方法后。
移植或进行移植：是指将器官、组织或细胞从一个受试者移入至另一个受试者或至相同受试者的另一区域的过程。
尿激酶：也被称为尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)，尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶。尿激酶最初从人尿液中分离，但是存在于几种生理位置中，例如血流和细胞外基质中。主要的生理学底物是血纤维蛋白溶酶原，它是丝氨酸蛋白酶血纤维蛋白溶酶的无活性酶原形式。血纤维蛋白溶酶的活化触发了蛋白水解级联，它根据生理环境参与血栓溶解或细胞外基质降解。在本文提供的方法的一个实施方案中，在肝细胞注射之前将尿激酶给予受体小鼠。在某些实施方案中，尿激酶是人尿激酶。在某些实施方案中，人尿激酶是分泌形式的尿激酶。在某些实施方案中，人尿激酶是经修饰的、非分泌形式的尿激酶(参见美国专利No.5,980,886)。
载体：允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中的复制和/或整合能力的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或多种选择性标记基因或其他遗传元件。整合载体能够将其自身整合到宿主核酸中。表达载体是含有必要的调控序列以允许插入的基因转录和翻译的载体。在本文描述的一个实施方案中，所述载体含有编码尿激酶(例如人尿激酶)的序列。在一个实施方案中，载体是质粒载体。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，例如腺病毒载体或腺伴随病毒(AAV)载体。
除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语，都与具有本发明所属技术领域中的普通专业人员所通常理解的意义同样的意义。除非上下文明确表明相反，单数形式的“一”、“一个”和“所述”包括复数的指称物。同样地，单词“或”意在包括“和”，除非上下文明确表明相反。因此，“包含A或B”意味着包括A、或B、或者A和B。此外，应该理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量值，都是近似值且仅供描述。尽管与本文描述的相似的或等价的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但下面描述了适合的方法和材料。所有在本文中提到的的出版物、专利申请、专利和其他参考文献，在此以引用方式全文纳入本文。在有冲突的情况下，以本发明的说明(包括术语的解释)为准。此外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的，不打算进行限制。
III.几个实施方案的概述
本文提供了强有力的体内扩增肝细胞的方法。虽然本文中示例了人肝细胞，但也可以扩增来自其他物种的肝细胞，包括来自大鼠、狗、猫、牛、马、猪和非人灵长类动物例如狒狒、黑猩猩和猕猴的肝细胞。所述方法包括将分离的人肝细胞移植到酪氨酸分解代谢酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)表达缺陷的免疫缺陷小鼠中，其中(i)所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者(ii)所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂(在本文中称为“受体小鼠”)。
使人肝细胞在受体小鼠中扩增一段时间，该时间足以使人肝细胞扩增。扩增的准确时间长度可以通过常规实验凭经验确定。在一些实施方案中，使人肝细胞扩增最长达6个月，最长达8个月，最长达10个月或最长达12个月。在其他实施方案中，使人肝细胞扩增至少约2周，至少约4周，至少约6周，至少约8周，至少约12周，至少约16周，至少约20周，至少约24周或至少约28周。肝细胞扩增的程度可以变化。在某些实施方案中，人肝细胞在受体小鼠中的扩增，导致增加了至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍或至少约1000倍。
在一些实施方案中，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠包含Fah基因的纯合中断(homozygous disruption)，使得所述中断导致功能性FAH蛋白表达的丧失。功能性FAH蛋白表达丧失不必是表达完全失去。在一些实例中，功能性FAH蛋白表达的丧失是表达失去约80％、约90％、约95％或约99％。Fah基因中断包括例如Fah基因中的插入、缺失或点突变，或者它们的多种或组合。在具体实例中，所述中断包含Fah基因中的缺失。
在一些实施方案中，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠缺乏功能性T细胞、B细胞和NK细胞。所述小鼠的免疫缺陷可以是由于遗传改变、免疫抑制或它们的组合引起的。
由于遗传改变而导致免疫缺陷的免疫缺陷小鼠可以包括任何遗传改变或遗传改变组合，其使得所述小鼠在体液免疫或细胞免疫性中的至少一个方面受损。例如，所述免疫缺陷小鼠可以具有选自例如以下的一种或多种遗传改变：Rag1缺陷、Rag2缺陷、Il2rg缺陷、SCID突变、NOD基因型或裸鼠突变。
在一些实施方案中，所述免疫缺陷小鼠为Rag2-/-IL2rg-/-小鼠。在其他实施方案中，所述免疫缺陷小鼠为Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠。在一些实例中，所述免疫缺陷小鼠为NOD/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠或NOD/Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠。在一些实施方案中，所述Fah缺陷小鼠包含Fah的纯合缺失。在其他实施方案中，所述Fah缺陷小鼠包含Fah中的一个或多个点突变，使得所述蛋白质的功能和/或产生大大减少。因此，在一些实施方案中，所述小鼠为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠、Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠、NOD/Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠或NOD/Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠。在具体实例中，所述小鼠为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。在其他实施方案中，所述小鼠为Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)小鼠。
所述小鼠的免疫缺陷还可以由于免疫抑制引起。通常，免疫抑制是通过将一种或多种免疫抑制剂给予所述小鼠，从而诱导免疫缺陷而实现。所述免疫抑制剂或免疫抑制剂结合物可以选自本领域中已知或本文公开的任何免疫抑制剂(例如参见术语和方法部分)。本文考虑使用的免疫抑制剂包括降低免疫系统(例如体液系统、细胞系统或补体系统)的一个或多个方面的活性或功能的任何化合物。
在一些实施方案中，所述一种或多种免疫抑制剂选自FK506、环孢菌素A、氟达拉滨、麦考酚酯、泼尼松、雷帕霉素或硫唑嘌呤，或者它们的结合物。
可以使用任何合适的送递途径(例如通过口服或腹膜内注射)将所述免疫抑制剂给予所述小鼠。在具体实例中，所述免疫抑制剂为FK506。在一些情况下，FK506在饮用水中口服给予。合适的剂量是本领域中已知的，并且可以由受过训练的医生确定。例如，FK506可以以7.5mg/L的剂量在饮用水中连续给予，产生大约1μg/克/天的剂量。然而，其他合适剂量包括约2.0至约15mg/L，例如约2.0、约3.0、约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0、约10.0、约11.0、约12.0、约13.0、约14.0或约15.0mg/L。
在一些实例中，所述免疫抑制剂为环孢菌素A。环孢菌素A可以在例如饮用水中给予，例如以约10至约100mg/kg/天的浓度给予。在一些情形中，环孢菌素A以约30至约70mg/kg/天(例如约50mg/kg/天)的浓度在饮用水中给药。
在一些实例中，所述免疫抑制剂为氟达拉滨。通常，氟达拉滨通过每天腹膜内注射给药。然而，可以以更高或更低频率给药，例如一天两次，隔天一次或每周一次。示例性氟达拉滨剂量包括100mg/kg/天至约500mg/kg/天。在具体实例中，所述剂量为约150至约250mg/kg/天，例如约200mg/kg/天。
在其他实施方案中，对所述小鼠给予免疫抑制剂的结合物，例如，FK506、环孢菌素A、氟达拉滨、硫唑嘌呤、麦考酚酯和泼尼松中的两种或多种。在一些实例中，所述免疫抑制剂的结合物包括FK506、麦考酚酯和泼尼松。在其他实例中，所述免疫抑制剂的结合物可包括环孢菌素A、麦考酚酯和泼尼松。在其他实例中，所述免疫抑制剂的结合物可包括雷帕霉素、麦考酚酯和泼尼松。在其他实例中，所述免疫抑制剂的结合物可包括硫唑嘌呤、FK506和泼尼松。在其他实例中，所述免疫抑制剂的结合物可包括硫唑嘌呤、环孢菌素A和泼尼松。在其他实例中，所述免疫抑制剂的结合物可包括雷帕霉素、硫唑嘌呤和泼尼松。
为了提高移入效率，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠还有IL-1R缺陷，或者被给予IL-1R拮抗剂。在其中所述小鼠为IL-1R表达缺陷的一些实施方案中，所述小鼠是Il1r1基因中断纯合的，使得所述中断导致功能性IL-1R蛋白表达的丧失。功能性IL-1R蛋白表达的丧失不必是表达完全丧失。在一些实例中，功能性IL-1R蛋白表达的丧失是表达丧失约80％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，所述中断包括Il1r1基因中的插入、缺失或者一个或多个点突变。在一些实例中，所述小鼠为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠、Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠、NOD/Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠或NOD/Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠。
在一些实施方案中，所述免疫缺陷和Fah缺陷小鼠被给予IL-1R拮抗剂。给予所述小鼠的IL-1R拮抗剂可以是可抑制IL-1R活性的任何化合物，例如核酸分子、多肽、抗体或小分子。在一些实施方案中，所述IL-1R拮抗剂为阿那白滞素。在其他实施方案中，所述IL-1R拮抗剂为IL-1RA，例如具有本文以SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20形式列出的氨基酸序列的IL-1RA或者其变体或衍生物。在一些情形中，在肝细胞被移植至所述小鼠中的同时或近乎同时递送所述IL-1R拮抗剂。另外的IL-1R拮抗剂剂量可以在注入肝细胞后给予。
IL-1R拮抗剂可以以单个剂量或以多个剂量给药。在使用多个剂量时，给药方案可以变化。例如，可以每小时、每日两次、每日一次、隔日或每周一次给予IL-1R拮抗剂。在具体实例中，每日给予所述IL-1R拮抗剂。每日给药可以进行两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天或更长时间。在一个实例中，每日送递所述IL-1R拮抗剂，持续七天。在另一个实例中，每日送递所述IL-1R拮抗剂，持续三天。
IL-1R拮抗剂的合适剂量将依赖于所使用化合物的类型和给药途径而变化。在一些实施方案中，所述IL-1R拮抗剂为阿那白滞素。在具体实例中，阿那白滞素的总剂量(不论作为单个剂量给药或是分开多个剂量给药)为约0.2、约0.4、约0.6、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20mg。在一些实例中，阿那白滞素的总剂量为约10至约20mg，例如约12至约16mg。在具体实例中，阿那白滞素的剂量为约14mg。在其他实例中，阿那白滞素的总剂量为约0.2至约6mg，例如约0.4至约2mg，或约1至约3mg。
可以使用任何合适的给药途径将所述IL-1R拮抗剂给予所述小鼠。在一些实施方案中，所述IL-1R拮抗剂通过注射给药。例如所述IL-1R拮抗剂是通过皮下注射、肌内注射、真皮内注射、腹膜内注射或静脉注射给药。
在本文描述的方法的一个实施方案中，在肝细胞注射之前，向所述Fah缺陷小鼠给予抑制、延迟或阻止所述小鼠中肝脏疾病发生的试剂。试剂可以是本技术领域中已知的抑制肝脏疾病的任何化合物或组合物。一种这样的药剂是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。给予NTBC以调控所述Fah缺陷小鼠中肝脏疾病的发生。剂量、用药时间表以及给药方法，可以根据需要进行调整，以阻所述止Fah缺陷小鼠中的肝功能障碍。
在一些实施方案中，NTBC给药剂量为约0.01mg/kg/天至约2.0mg/kg/天。在一个实施方案中，NTBC给药剂量为约1.0mg/kg/天至约2.0mg/kg/天，例如约1.4mg/kg/天至约1.8mg/kg/天。在一个实例中，NTBC给药剂量为约1.6mg/kg/天。在一个实施方案中，NTBC给药剂量为约0.01mg/kg/天至约0.50mg/kg/天。在另一个实施方案中，NTBC给药剂量为约0.05mg/kg/天至约0.10mg/kg/天，例如约0.05mg/kg/天、约0.06mg/kg/天、约0.07mg/kg/天、约0.08mg/kg/天、约0.09mg/kg/天或约0.10mg/kg/天。NTBC可以在注射人肝细胞之前和/或肝细胞注射后选定的时间段给予。根据需要，在肝细胞扩增期间，NTBC可以撤销或重新给予。在一个实施方案中，在肝细胞注射前和肝细胞注射后至少约3天，向所述Fah缺陷小鼠给予NTBC。在另一个实施方案中，在肝细胞注射前和肝细胞注射后至少约6天，向所述Fah缺陷小鼠给予NTBC。在一个方面，NTBC的剂量在肝细胞注射后的6天时间过程中逐渐降低。
NTBC可以通过任何适合的手段施用，例如但不限于在饮用水中、在食物中或通过注射给药。在一个实施方案中，在肝细胞注射前在饮用水中给予的NTBC浓度是约1至约8mg/L，例如约1mg/L，约2mg/L，约3mg/L，约4mg/L，约5mg/L，约6mg/L，约7mg/L或约8mg/L。在另一个实施方案中，在肝细胞注射前在饮用水中给予的NTBC浓度是约1至约2mg/L，例如约1.0mg/L，约1.2mg/L，约1.4mg/L，约1.6mg/L，约1.8mg/L或约2.0mg/L。
本文公开了一种体内扩增人肝细胞的方法，包括将人肝细胞移植(例如通过注射)至免疫缺陷且Fah缺陷小鼠(也称为受体小鼠)，将IL-1R拮抗剂给予所述小鼠并允许所述人肝细胞扩增。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述小鼠收集所述扩增的人肝细胞。或者，所述扩增人肝细胞的方法包括将人肝细胞移植至免疫缺陷、Fah缺陷且IL-1R缺陷小鼠(该类型小鼠也是“受体小鼠”)，并允许所述人肝细胞扩增。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述小鼠收集所述扩增的人肝细胞。
在一些实施方案中，移植至所述受体小鼠中的人肝细胞为分离的人肝细胞。在其他实施方案中，所述人肝细胞作为肝组织的一部分被移植。
可以使用本领域中已知的任何合适方法移植所述肝细胞。在一个实施方案中，所述人肝细胞被移植(例如通过注射)至所述受体小鼠的脾脏中。在另一个实施方案中，从所述受体小鼠的肝脏收集所述扩增的人肝细胞。
还提供了体内扩增人肝细胞的方法，其中在注射人肝细胞之前，向受体小鼠施用编码尿激酶基因的载体。在一个实施方案中，尿激酶基因是人尿激酶。野生型的尿激酶是分泌的蛋白。因此，在某些实施方案中，人尿激酶是分泌形式的尿激酶(Nagai et al.，Gene 36：183-188，1985)。人尿激酶(分泌形式)的序列在本技术领域中是已知的，例如但不限于GenBank登记号No.AH007073(1993年8月3日登记)、D11143(1996年5月9日登记)、A18397(1994年7月21日登记)、BC002788(2003年8月19日登记)、X02760(1993年4月21日登记)、BT007391(2003年5月13日登记)、NM 002658(2004年10月1日登记)和X74039(1994年2月20日登记)。
在某些实施方案中，人尿激酶是经修饰的、非分泌形式的尿激酶。例如，Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.92：6210-6214，1995)描述了通过在尿激酶的羧基末端插入编码内质网滞留信号的序列，或通过用氨基末端RR滞留信号(Strubin et al.，Cell 47：619-625，1986；Schutze等，EMBO J.13：1696-1705，1994)和通过间隔肽从膜II型蛋白Iip33分离的跨膜锚蛋白(Strubin et al.，Cell 47：619-625，1986)代替pre-uPA信号肽，产生了非分泌形式的尿激酶。非分泌形式的尿激酶也记载在美国专利No.5,980,886中。
所述编码尿激酶的载体，可以是任何类型的适合于送递到小鼠中并能够表达尿激酶基因的载体。这样的载体包括病毒载体或质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体。在另一个实施方案中，所述载体是AAV载体。编码尿激酶的载体可以通过本技术领域中已知的任何适合的手段给予。在一个实施方案中，所述载体通过静脉内给予。在一个方面，所述载体通过眼球后注射给予。所述编码尿激酶的载体可以在注射人肝细胞之前的任何时间给予。一般而言，所述载体被给予以使得有足够的时间使尿激酶表达。在一个实施方案中，所述载体在肝细胞注射前24至48小时给予。
本文还提供了体内扩增人肝细胞的方法，其中在注射人肝细胞之前，对所述受体小鼠进行了巨噬细胞消除。在一个实施方案中，在巨噬细胞消除之前，向所述受体小鼠给予编码尿激酶的载体。在另一个实施方案中，在巨噬细胞消除后，向所述受体小鼠给予编码尿激酶的载体。在另一个实施方案中，没有向所述巨噬细胞消除的受体小鼠给予编码尿激酶的载体。可以使用本技术领域中公知的许多方法中的任何一种从所述受体小鼠消除巨噬细胞，例如通过使用化学物质或抗体。例如，可以通过给予拮抗剂(例如有毒物质、包括C12MDP)或改变巨噬细胞发育、功能和/或存活性的抗体，来除去巨噬细胞。拮抗剂的给药是通过公知的技术来进行，包括使用脂质体，例如在欧洲专利No.1552740中描述的。含有氯膦酸盐(clodronate)的脂质体也可以用于消除巨噬细胞，正如由van Rijn等(Blood 102：2522-2531，2003)所描述的。
在一些实施方案中，被移植至所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中的人肝细胞是分离的人肝细胞。在一些实施方案中，所述人肝细胞被作为肝组织移植物的一部分移植。所述分离的人肝细胞可以从许多不同来源中的任何一个中获得。在一个实施方案中，人肝细胞从器官供体的肝脏分离。在另一个实施方案中，人肝细胞从外科手术切除物分离。在另一个实施方案中，人肝细胞来源自干细胞，例如胚胎干细胞、iPS细胞、间充质来源的干细胞、脂肪组织来源的干细胞、多能成体祖细胞、不受限制的体干细胞或组织特异性肝脏干细胞，其可存在于肝脏本身、胆囊、肠或胰脏中。在另一个实施方案中，人肝细胞来源自单核细胞或羊水细胞，因此在体外获得了干细胞或祖细胞以产生肝细胞。在另一个实施方案中，人肝细胞在注射前冷冻保存。
本文还提供了在Fah缺陷的受体小鼠中连续移植人肝细胞的方法。所述方法包括从第一级受体小鼠收集扩增的人肝细胞，并进一步在第二、第三、第四级或更多级的受体小鼠中扩增所述肝细胞(Overturf etal.，Am.J.Pathol.151：1078-9107，1997)。可以使用许多技术中的任何一种从小鼠收集人肝细胞。例如，可以按照下面实施例中的描述，通过灌注小鼠肝脏，然后温和切碎，来收集肝细胞。此外，可以使用众所周知的方法将肝细胞与其他细胞类型、组织和/或碎片分离开，例如通过使用特异性地识别人细胞或人肝细胞的抗体。这样的抗体包括但不限于与I类主要组织相容性抗原特异性结合的抗体，例如抗人HLA-A、B、C抗体(Markus et al.，Cell Transplantation 6：455-462，1997)。然后可以通过盘选(利用了连接至固体基质的单克隆抗体)、荧光激活的细胞分选术(FACS)、磁珠分离等，来分离抗体结合的肝细胞。可选的收集肝细胞的方法在本技术领域中是公知的。
在一些实施方案中，本文提供的方法还包括从所述小鼠收集生物样品。例如，生物样品可以是生物流体、细胞或组织样品。在一些实例中，所述生物样品是流体样品，例如血液或尿样。在一些情形中，所述方法包括从所述受体小鼠收集扩增的人肝细胞，并且进一步从所述小鼠收集生物样品，例如血液或尿样。
还提供了一种选择可有效治疗人肝脏疾病的试剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂；并且(ii)评估所述候选试剂对所述肝脏疾病的效果。所述肝脏疾病的一种或多种体征或症状的改善表示所述候选试剂可有效治疗所述肝脏疾病。在一些实施方案中，所述肝脏疾病为肝脏感染、纤维化、肝硬化或肝癌，例如HCC。
还提供了一种选择可有效治疗人肝脏病原体感染的试剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠的移植的人肝细胞被所述肝脏病原体感染；并且(ii)评估所述候选试剂对所述肝脏感染的效果。与给予所述候选试剂之前所述Fah缺陷小鼠的感染负荷相比，所述肝脏病原体的感染负荷的降低表示所述候选试剂可有效治疗所述肝脏病原体感染。
在一些实施方案中，通过测量获自所述小鼠的样品中的病原体滴度来确定所述感染负荷。在一些实施方案中，通过测量获自所述小鼠的样品中的病原体特异性抗原来确定所述感染负荷。在一些实施方案中，通过测量获自所述小鼠的样品中的病原体特异性核酸分子来确定所述感染负荷。在一些实施方案中，所述肝脏病原体为嗜肝病毒，例如HBV或HCV。
还提供了一种选择可有效治疗肝硬化的试剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，并且其中所述免疫缺陷和Fah缺陷小鼠还已被给予可诱导所述小鼠中发生肝硬化的化合物；并且(ii)评估所述候选试剂对所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠肝硬化的至少一种诊断标记物的效果，其中所述肝硬化的至少一种诊断标记物选自AST、ALT、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白。与给予所述候选试剂之前的所述Fah缺陷小鼠相比，在所述Fah缺陷小鼠中AST、ALT、胆红素或碱性磷酸酶减少或白蛋白增加表示所述候选试剂可有效治疗肝硬化。
还提供了一种选择可有效治疗肝细胞癌(HCC)的试剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠还已被给予可诱导所述小鼠中发生HCC的化合物或者已经被移植恶性肝细胞；并且(ii)评估所述候选试剂对所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中HCC的效果。与给予所述候选试剂之前的所述小鼠相比，所述小鼠肿瘤生长或肿瘤体积降低表示所述候选试剂可有效治疗HCC。
还提供了一种评估外源性试剂在体内对人肝细胞效果的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)将所述外源性试剂给予移植有人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂；并且(ii)测量所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中肝功能的至少一种标记物，其中所述肝功能的至少一种标记物选自AST、ALT、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白。与给予所述外源性试剂之前的所述小鼠相比，在所述小鼠中AST、ALT、胆红素或碱性磷酸酶增加或白蛋白减少表示所述外源性试剂有毒性。在一些实施方案中，所述外源性试剂为已知毒素或疑似的毒素。
IV.白细胞介素-1受体(IL-1R)拮抗剂
本文公开了给予IL-1R拮抗剂可显著增强具有Fah功能性缺失的免疫缺陷小鼠中的人肝细胞移入。因此，本文提供了用于在免疫缺陷/Fah缺陷小鼠中移入并扩增人肝细胞的方法，其中在一些实施方案中，所述方法包括对所述小鼠给予IL-1R拮抗剂。本文考虑使用可作为IL-1R拮抗剂发挥功能的任何化合物，例如核酸分子、多肽、抗体或小分子。还考虑使用还有IL-1R缺陷的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠。
本文使用的术语“IL-1受体拮抗剂”是指任何这样的分子，即它们可结合于IL-1R或IL-1R辅助蛋白(IL-1RAP)并干扰IL-1R介导的活化，例如通过抑制或阻断IL-1R和IL-1RAP的相互作用或IL-1和IL-1R的相互作用。在一些实施方案中，所述IL-1R拮抗剂为阿那白滞素。在其他实施方案中，所述IL-1R拮抗剂可为IL-1RA(例如本文分别以SEQ ID NO：18和20形式列出的人或小鼠IL-1RA)或其功能性变体，例如IL-1RA的保守变体。在其他实施方案中，所述IL-1R拮抗剂为特异性针对IL-1R的抗体(例如特异性针对I型IL-1R的抗体)、特异性针对IL-1RAP的抗体、可结合于I型IL-1R的肽或可结合于IL-1RAP的肽。
IL-1R拮抗剂——包括IL-1RA以及其变体或衍生物——以前已有记载(参见，例如PCT公开文本No.WO 91/08285；WO 91/17184；WO92/16221；WO 93/21946；WO 94/06457；WO 94/21275；WO 94/21235；WO 94/20517；WO 96/22793；WO 97/28828；和WO 99/36541；美国专利No.5,075,222和6,599,873；6,268,142；6,168,791；6,159,460；6,090,775；6,063,600；6,036,978；6,054,559；5,922,573；5,863,769；5,858,355；5,863,769；5,508,262；6,013,253；和6,399,573；以及美国专利申请公开文本No.2004/0076991和2005/0282752)。
对本发明，术语“IL-1RA”包括其中IL-1RA的氨基酸已被缺失、插入或置换的IL-1RA的修饰形式。本领域技术人员可以了解，可以在IL-1RA的氨基酸序列(例如本文列出为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20的氨基酸序列)中制造许多缺失、插入和置换的组合，条件是所产生的分子有生物活性(例如具有抑制IL-1R的能力)。
术语“IL-1受体拮抗剂”还包括包含IL-1RA的融合蛋白。示例性融合蛋白包括Fc-IL-1RA和本领域中描述的其他融合分子(参见例如美国专利申请公开文本No.2007/0248597和美国专利No.6,294,170)。
在一些实施方案中，所述IL-1R拮抗剂为特异性针对I型IL-1R(IL-1RI)的抗体。IL-1RI抗体的实例在本领域中有记载(参见例如美国专利申请公开文本No.2004/0097712)并可从多个来源购买。其他的IL-1RI抗体可依照公知的方法产生。本文使用的“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子或抗体片段，例如Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(scFv)和二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)。抗体可以是例如嵌合抗体、鼠抗体或人源化抗体。多克隆抗体和单克隆抗体均被考虑用于本发明的方法。
在一些实施方案中，将编码IL-1R拮抗剂的核酸分子送递至受体小鼠中。在一些实施方案中，所述核酸分子编码阿那白滞素。在其他实施方案中，所述核酸分子编码IL-1RA或者IL-1RA的变体或衍生物。在具体实例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19。在一些情形中，所述核酸分子包含载体，例如质粒或病毒载体。用于送递异源核酸序列的合适质粒或病毒载体在本领域中是已知的并在本文下文有描述(例如下文描述用于送递尿激酶的那些载体)。
V.用于扩增人肝细胞的遗传修饰的小鼠
几个团队已经尝试了在啮齿动物中移入和扩增原代人肝细胞(美国专利No.6,509,514；PCT公布No.WO 01/07338；美国公布No.2005-0255591)。Dandri等(Hepatology 33：981-988，2001)首先报道了成功地用人肝细胞再殖小鼠肝脏。从那以后，其他团队报道了将人肝细胞成功地移入小鼠。在所有这些研究中，使用的动物是在白蛋白启动子的转录控制下表达尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)的转基因小鼠(Sandgren et al.，Cell 66：245-256，1991)。uPA的过表达引起了代谢中断，导致了小鼠肝细胞的细胞死亡，而不影响不表达所述转基因的移植的人肝细胞。将alb-uPA转基因在各种不同免疫缺陷背景上杂交以防止对人细胞的排斥(Tateno et al.，Am.J.Pathol.165：901-912，2004；Katoh et al.，J.Pharm.Sci.96：428-437，2007；Turriniet al.，Transplant.Proc.38：1181-1184，2006)。
尽管在这些模型中已经报道了高达90％的移入水平，但所述系统有几个主要的缺点，阻止了其广泛使用。首先，所述alb-uPA转基因在生命的早期阶段会变得失活或丢失。因此，必需在非常早(14日龄)移植人细胞并使用对所述转基因纯合的小鼠。这种狭窄的移植时间窗口严重限制了该模型的灵活性。其次，所述转基因的自发失活产生了转基因阴性的、健康的小鼠肝细胞库。这些回复体鼠类肝细胞，在再殖过程中与人细胞有效地竞争。因此，不可能在人细胞连续移植后再殖次级受体。第三，在该模型中，肝脏疾病发作非常早，从而降低了所述转基因小鼠的生存力。因此，难以培育出足够数量的实验动物。此外，所述转基因小鼠具有出血的倾向，增加了手术中的死亡率。最后，alb-uPA转基因动物一旦再殖人细胞超过50％后，将发生肾脏疾病。据认为，这是由于人补体对肾上皮的作用而引起的。为了获得非常高的人移入水平，必需用抗补体蛋白酶抑制剂处理所述移植的小鼠(Tateno et al.，Am.J.Pathol.165：901-912，2004)。因为这许多限制，非常需要更强有力的用于扩增人肝细胞的系统。
本文描述了高度有效的体内扩增人肝细胞的方法，其使用了具有独特的基因缺失组合的遗传修饰小鼠。人肝细胞在小鼠肝中的成功移入和扩增，需要具有某种程度的肝功能障碍的免疫缺陷小鼠。已经在多种不同类型的免疫缺陷小鼠(包括RAG-2敲除或SCID小鼠)中，用人肝细胞再殖了小鼠肝脏，这两种小鼠都缺乏B细胞和T细胞(美国专利No.6,509,514；PCT公布No.WO 01/07338；美国公布No.2005-0255591)。为了实现肝功能障碍，将免疫缺陷小鼠与尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)转基因小鼠杂交。uPA在小鼠肝脏中的表达，使得小鼠肝细胞产生了生长劣势，促进了移植的人肝细胞的扩增(PCT公布No.WO 01/07338)。为了避免对uPA转基因的限制，对Fah缺陷小鼠分析了它们允许人肝细胞扩增的能力。FAH是催化酪氨酸分解代谢的最后一步的代谢酶。具有Fah基因的纯合缺失的小鼠，表现出改变的肝脏mRNA表达和严重的肝功能障碍(Grompe et al.，Genes Dev.7：2298-2307，1993)。
本文公开了缺乏T细胞、B细胞和NK细胞的Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)三重突变小鼠。Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠在本技术领域中是已知的(Traggiai et al.，Science 304：104-107，2004；Gorantla et al.，J.Virol.57：2700-2712，2007)。
正如在下面的实施例中描述的，人肝细胞在FRG小鼠中的移入和扩增令人吃惊地高效。例如，可以用1百万个分离的人肝细胞注射FRG小鼠。假设效率为10％，十万个人肝细胞移入到所述受体小鼠中。那么，扩增后从FRG小鼠的平均产量是大约8千万到大约1亿2千万个人肝细胞，这相当于人肝细胞增加800至1200倍。FRG小鼠也可以用于人肝细胞的连续移植。连续移植可以包括多级小鼠，可以使得每级小鼠中人肝细胞扩增至少大约1000倍。
含有Fah缺陷的任何免疫缺陷小鼠都适合于本文描述的方法。在一个实施方案中，小鼠是在Fah中也有缺陷的Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠。在另一个实施方案中，所述小鼠为Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠。在其他实施方案中，所述小鼠为NOD/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠或NOD/Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠。虽然本文中描述了一些具体的遗传改变组合，本文还考虑可导致免疫缺陷的其他遗传改变组合。例如，其他遗传改变包括SCID突变、裸鼠突变和NOD基因型。
所述Fah缺陷小鼠可以含有例如Fah的纯合缺失，或Fah的一个或多个点突变。Fah缺陷(例如通过点突变或纯合缺失)导致了FahmRNA表达和/或功能性FAH蛋白的显著减少，或不存在。除了FRG小鼠之外，本文描述了对Fah基因中的点突变纯合的免疫缺陷小鼠(Rag2-/-/Il2rg-/-)(在本文中称为FpmRG小鼠)，也是用于人肝细胞体内移入和扩增的适合小鼠。本文还考虑免疫缺陷、Fah缺陷且IL-1R缺陷小鼠的使用。IL-1R缺陷小鼠以前已有记载(参见例如Norman et al.，Ann.Surg.223(2)：163-169，1996；Glaccum et al.，J.Immunol.159：3364-3371，1997)并可从杰克逊实验室(Bar Harbor，ME)市购(例如品系B6；129S1-Il1r1tm1Roml/J和B6.129S7-Il1r1tm1Imx/J)。
VI.人肝细胞的分离和送递
使用Fah缺陷小鼠进行人肝细胞体内扩增的显著优点，是使用源自于各种不同来源的人肝细胞移入小鼠的能力。任何合适的人肝细胞或肝细胞前体/祖细胞的来源都可在本发明的方法中用于移植至Fah缺陷小鼠中。正如在下面的实施例中描述的，人肝细胞可以源自于遗体捐献者或肝切除物，或者可以从商业来源获得。此外，正如本文显示，FRG小鼠可以使用来自于所有年龄的供体的人肝细胞或使用冷冻保存的肝细胞成功地移植。在人肝细胞的分离和移植之间通常存在延迟(一般为1到2天)，这可能导致肝细胞的存活力较差。但是，即使当用存活力有限的肝细胞移入时，FRG小鼠系统也能够扩增人肝细胞。
分离人肝细胞的方法在本技术领域中是众所周知的。例如，从器官供体或肝切除物分离人肝细胞的方法，记载在PCT公布No.WO2004/009766和WO 2005/028640，以及美国专利No.6,995,299和6,509,514中。肝细胞可以从经皮获取的或通过腹部外科手术获取的肝脏活检切片(biopsy)获得。用于移植到受体小鼠(例如FRG小鼠)中的人肝细胞，通过本技术领域中任何已知的便利方法从人肝组织分离。可以将肝脏组织以机械或酶法分散，以提供单细胞悬液，或可以使用完整人肝脏组织的碎片。例如，通过常规的胶原酶灌注(Ryan etal.，Meth.Cell Biol.13：29，1976)，然后进行低速离心，将肝细胞从供体组织分离。然后可以通过不锈钢筛网过滤，随后进行密度梯度离心，来纯化肝细胞。可选地，其他的用于富集肝细胞的方法也可以使用，例如荧光激活的细胞分选术、盘选、磁珠分离、在离心力场中淘洗，或本技术领域中公知的任何其他方法。可以使用类似的肝细胞分离方法，从受体小鼠肝脏收集被扩增的人肝细胞。
或者，可以使用Guguen-Guillouzo等(Cell Biol.Int.Rep.6：625-628，1982)描述的技术来制备人肝细胞。简单来说，分离肝或其一部分，并将套管导入门静脉或门脉分支。然后经套管对肝脏组织进行灌注：使用无钙缓冲液，然后使用在溶于HEPES缓冲液中的氯化钙溶液(例如大约0.075％氯化钙)中含有胶原酶(例如大约0.025％胶原酶)的酶溶液，以每分钟30到70毫升的流速在37℃下进行灌注。将灌注过的肝脏组织切碎成小块(例如大约1立方毫米)。在与上述相同的缓冲液中在37℃下酶法消化大约10-20分钟，同时轻轻搅拌，以产生细胞悬液。通过将所述细胞悬液通过60-80微米的尼龙筛网进行过滤，收集释放的肝细胞。然后将收集到的肝细胞在pH7.0的冷HEPES缓冲液中使用缓慢离心法洗涤，以除去胶原酶和细胞碎片。非实质细胞可以通过甲泛葡胺(metrizamide)梯度离心(参见美国专利No.6,995,299)来除去。
人肝细胞可以从新鲜组织(例如在死亡后数小时内获得的组织)或新鲜冷冻的组织(例如冷冻和维持在或低于0℃下的新鲜组织)获得。所述人组织优选地没有可检测的病原体，在形态学和组织学方面正常，并且基本无疾病。用于移入的肝细胞可以是最近分离的，例如在几小时内，或者如果所述细胞维持在适合的储存介质中，可以在较长的时期后进行移植。在下面实施例中描述的一种这样的介质是VIASPANTM(用于保存腹内器官的通用主动脉冲洗液和冷藏溶液；也被称为威斯康辛大学溶液(University of Wisconsin solution)或UW)。在移植之前，肝细胞也可以被冷冻保存。冷冻保存肝细胞的方法在本技术领域中是公知的，记载在美国专利No.6,136,525中。
除了从器官供体或肝切除物获得人肝细胞之外，用于移入的细胞也可以是在移植到受体动物中后，发育或分化成能够扩增的人肝细胞的人干细胞或肝细胞前体细胞。已经从内胚泡细胞团(Thomson et al.，Science 282：1145-1147，1998)和发育中的生殖细胞(Shamblott et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726-13731，1998)中分离了具有ES细胞性质的人细胞，并且已经产生了人胚胎干细胞(参见美国专利No.6,200,806)。正如在美国专利No.6,200,806中公开的，ES细胞可以从人或非人灵长类产生。还可以获得从人或非人灵长类细胞诱导的iPS(参见例如Yu er al.，Science 318(5858)：1917-1920，2007；Takahashi etal.，Cell 131(5)：861-872，2007；Liu et al.，Cell Stem Cell 3(6)：587-590，2008)。一般来说，灵长类ES细胞是在存在ES细胞培养基的情况下，在鼠类胚胎成纤维细胞的汇合层上分离。ES培养基一般由80％的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；无丙酮酸，高葡萄糖配方，Gibco BRL)，以及20％的胎牛血清(FBS；Hyclone)，0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)，1％非必需氨基酸储液(Gibco BRL)构成。ES细胞与成年人中存在的定向“多能”干细胞相比，区别特点包括ES细胞能够在培养中无限期地维持未分化状态的能力，以及ES具有发育成每种不同细胞类型的潜力。人ES(hES)表达SSEA-4，这是被特异性单克隆抗体识别的糖脂细胞表面抗原(参见例如Amit et al.，Devel.Biol.227：271-278，2000)。
源自于人间充质干细胞(hMSC)的人肝细胞也可用于本文描述的方法中。将骨髓来源的hMSC连续暴露于肝原性因子，导致干细胞分化成具有肝细胞性质的细胞(参见Snykers et al.，BMC Dev Biol.7：24，2007；Aurich et al.，Gut.56(3)405-15，2007)。骨髓来源的间充质干细胞和脂肪组织来源的干细胞(ADSC)的肝原性分化也已被描述(参见Talens-Visconti et al.，World J Gastroenterol.12(36)：5834-45，2006)。人肝细胞也可以从单核细胞产生。Ruhnke等(Transplantation 79(9)：1097-103，2005)描述了从终末分化的外周血单核细胞产生肝细胞样(NeoHep)细胞。NeoHep细胞在形态学、肝细胞标志物的表达、各种分泌和代谢功能，以及药物解毒活性方面，与原代人肝细胞类似。此外，源自于羊水细胞的人肝细胞，也可以用在本文描述的方法中。
人ES细胞系已有，并可用于本文公开的方法中。人ES细胞也可以源自于体外受精(IVF)胚胎的植入前胚胎。对未使用过的人IVF产生的胚胎进行实验，在许多国家(例如新加坡和英国)是允许的，条件是所述胚胎小于14日龄。只有高质量的胚胎适合于ES分离。用于将单细胞人胚胎培养成扩增的囊胚泡的现有的确定培养条件，已经被描述(参见Bongso et al.，Hum Reprod.4：706-713，1989)。人胚胎与人输卵管细胞的共培养，导致产生了高的胚泡质量。在细胞共培养或在改进的确定成分培养基中生长的源自于IVF的扩增人胚泡，允许分离人ES细胞(参见美国专利No.6,200,806)。
在一个实施方案中，通过移植(例如通过注射)到脾脏中，将人肝细胞送递到受体小鼠。肝细胞可以通过其他手段送递，例如通过注射到肝实质或门静脉中。注射到受体小鼠中的人肝细胞的数量可以是不同的。在一个实施方案中，注射了约105到约107个人肝细胞。在另一个实施方案中，注射了约5×105到约5×106个人肝细胞。在一个示例性实施方案中，注射了约106个人肝细胞。
VII.Fah缺陷小鼠及其用途
本文公开的Fah缺陷小鼠可以用于多种研究和治疗目的。例如，免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中扩增的肝细胞(例如人肝细胞)可以用于研究药物代谢和毒性，以及肝脏病原体感染。虽然本文中示例了人肝细胞，但也可以在Fah缺陷小鼠中扩增来自其他物种的肝细胞，包括来自大鼠、狗、猫、牛、猪、马和非人灵长类动物(例如狒狒、黑猩猩和猕猴)的肝细胞。Fah缺陷小鼠中扩增的人肝细胞可以在需要重建肝脏疗法的受试者中用于重建人肝脏。另外，以人肝细胞重建的Fah缺陷小鼠可作为肝脏疾病(例如HCC、肝硬化和肝感染)的动物模型。Fah缺陷小鼠以及在Fah缺陷小鼠中扩增的肝细胞的示例性用途在下文进一步讨论。
A.人肝细胞的扩增及其医学用途
本公开内容考虑到了在受体小鼠中扩增并从其中收集的人肝细胞，作为人肝细胞的来源，用于在需要肝脏重建疗法的受试者中进行肝脏重建的用途。通过导入肝细胞在患者中重建肝组织，是患有急性肝衰竭患者的潜在的治疗性选择，也可以作为在肝移植前的暂时处理，或作为对患有单一性代谢缺陷(isolated metabolic deficiencies)的患者的确定性治疗(Bumgardner et al.，Transplantation 65：53-61，1998)。肝细胞重建可以用于例如导入遗传修饰的肝细胞以进行基因疗法，或用于替换由于疾病、物理或化学损伤或肿瘤而引起的肝细胞损失(美国专利No.6,995,299)。此外，扩增的人肝细胞可用于放置在人造肝脏辅助装置中。从Fah缺陷小鼠收集人肝细胞的方法以及所扩增人肝细胞的医学用途会在下文更详细地描述。
1.从Fah缺陷小鼠收集人肝细胞
可以使用本技术领域在已知的许多技术中的任何一种，从受体小鼠收集人肝细胞。例如，可以将小鼠麻醉，将导管插入门静脉或下腔静脉。然后可以用适合的缓冲液(例如无钙且无镁，添加有0.5mM EGTA和10mM HEPES的EBSS)对肝进行灌注，然后进行胶原酶处理(例如使用添加有0.1mg/ml胶原酶XI和0.05mg/ml DNase I的EBSS溶液)。可以将所述肝脏轻缓地切碎，通过尼龙筛网(例如顺续通过70μm和40μm的尼龙筛网)进行过滤，然后离心并清洗细胞。
可以使用本技术领域中任何公知的技术，将从受体小鼠收集的人肝细胞与非人细胞或其他污染物(例如组织或细胞碎片)分离开。例如，这样的方法包括使用与人肝细胞选择性结合的抗体。这样的抗体包括但不限于特异性地结合I类主要组织相容性抗原的抗体，例如抗人HLA-A、B、C抗体(Markus et al.，CellTransplantation 6：455-462，1997)或CD46。特异性针对人细胞或人肝细胞的抗体，可以用于各种不同的技术中，包括FACS、盘选或磁珠分离。或者，可选择性地结合小鼠细胞的抗体可以用于除去污染小鼠细胞，从而富集人肝细胞。FACS使用了多种颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道和阻抗通道，以及其他更复杂水平的检测，来分离或分选抗体结合的细胞(参见美国专利No.5,061,620)。磁性分离涉及了使用顺磁性颗粒，它们：1)与人特异性抗体缀合；2)与能够结合人特异性抗体的检测抗体缀合；或3)与能够与生物素化抗体结合的亲和素结合。盘选涉及与固相基质(例如琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜或塑料培养皿结合)的单克隆抗体。被所述抗体结合的细胞，可以通过简单地将所述固相载体与所述样品物理分离，而从所述样品中分离出来。
从Fah缺陷小鼠收集的肝细胞可以例如冷冻保存备用，或者铺板于组织培养物中用于运输和以后使用。
2.人肝重建
Fah缺陷小鼠提供了一种增殖人肝细胞的系统，所述人肝细胞可以用于重建人肝脏，替代或辅助肝脏移植。如今，患有肝脏疾病的患者可能必须等待很长时间，才能获得适合移植的器官。在移植后，患者终生需要以免疫抑制剂进行治疗，目的是避免对所述供体肝脏的排斥。用于增殖患者自身细胞的方法可以提供功能性肝脏组织的来源，这不需要免疫抑制来维持存活。因此，本文公开的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠可以用于重建患肝脏疾病和/或肝衰竭的受试者的肝脏，使用的是已经在所述Fah缺陷小鼠中扩增的其自身肝细胞——包括从患者特定干细胞产生的细胞，或者来自供体的肝细胞。
通过导入肝细胞(也称为“肝细胞移植”)在患者中重建肝脏组织，是患急性肝衰竭患者的潜在的治疗性选择，也可以作为肝脏移植前的暂时处理，或作为对患有单一性代谢缺陷的患者的确定性治疗(Bumgardner et al.，Transplantation 65：53-61，1998)。实现治疗性肝脏重建的一个主要障碍是宿主对移植肝细胞的免疫排斥，该现象(其中宿主和供体细胞的遗传和表型不同)称为“同种异体移植物排斥”。免疫抑制剂在防止同种异体移植物排斥中仅部分地取得成功(Javregui et al.，Cell Transplantation 5：353-367，1996；Makowka et al.，Transplantation 42：537-541，1986)。在Fah缺陷小鼠中扩增的人肝细胞还可用于基因治疗应用。在最广意义上，将这类肝细胞移植至人宿主中以改正遗传缺陷。所述传代的肝细胞不必，但可以源自于将作为所述移植物受体的同一个体。
在一些实施方案中，在Fah缺陷小鼠中扩增的人肝细胞可用于在受试者中重建肝脏组织，作为肝移植的前奏或替代方案。作为非限制性实例，患有进行性肝脏变性的受试者(例如由酒精中毒引起)可以作为随后在Fah缺陷小鼠中扩增的肝细胞的供体。肝细胞的数目相对于最初获自所述受试者并且被移植至所述Fah缺陷小鼠中的数目被扩增。在扩增后，所述人肝细胞可以从所述Fah缺陷小鼠分离，并且可以用于重建所述受试者的肝脏功能。在Fah缺陷小鼠中扩增肝细胞不仅可用于增加肝细胞数目，而且可用于选择性地除去患有传染性或恶性疾病的肝细胞。具体而言，受试者可以患有病毒性肝炎，其中一些但非全部肝细胞被感染，并且感染的肝细胞可以通过所述细胞表面中或上的病毒抗原的存在情况鉴定。在这类实例中，可以从所述受试者收集肝细胞，并且可以选出非感染细胞在一只或多只Fah缺陷小鼠中扩增，例如通过FACS。同时，可以进行攻击步骤以清除患者中的感染。在治疗后，可以用在所述一只或多只Fah缺陷小鼠中扩增的肝细胞重建所述受试者的肝脏组织。类似的方法可以用于从患有肝恶性肿瘤(例如HCC)的患者选择性地传代非恶性细胞。
B.Fah缺陷小鼠作为肝脏疾病模型
动物中的Fah缺陷可导致类似于人疾病1型遗传性酪氨酸血症(HT1)的疾病表型。为了防止致死，用NTBC维持Fah缺陷动物以防止肝机能障碍(当动物未以表达FAH的人肝细胞再殖时)，然而对NTBC剂量的滴定可用于促进HT1型表型(包括HCC、纤维化和肝硬化)发生。另外，以人肝细胞再殖的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠可以使用例如转化剂、毒剂或通过引入恶性人肝细胞而被诱导形成肝脏疾病。因此，本文公开的Fah缺陷小鼠可用于研究多种肝脏疾病，包括HCC和肝硬化。
在一些实施方案中，本文公开的Fah缺陷小鼠可用作人肝脏疾病的动物模型。Fah缺陷小鼠可用作由例如暴露于毒素、感染性疾病或恶性肿瘤或者由遗传缺陷(即导致HT1的Fah缺陷)引起的肝脏疾病的模型。Fah缺陷小鼠可作为模型的人遗传性肝脏疾病的实例包括但不限于高胆固醇血症、高甘油三酸酯血症、高草酸盐尿、苯丙酮尿症、枫糖尿症、糖原贮积病、溶酶体贮积病(例如高歇氏病(Gaucher′s disease))和任何先天代谢缺陷。所公开的模型系统可以用于更好地理解具体肝脏疾病，以及用于鉴定可以阻止、延缓或逆转疾病过程的试剂。
在一些情形中，如果所述Fah缺陷小鼠被用作因毒素引起的肝脏疾病的模型，用NTBC维持所述Fah缺陷小鼠，以在人肝细胞在肝脏中充分再殖之前防止肝机能障碍。产生最接近地模拟相应人病症所需的毒剂量可以通过使用暴露于增量所述毒剂的大量Fah缺陷小鼠确定。毒剂的实例包括但不限于乙醇、对乙酰氨基酚、苯妥英、甲基多巴、异烟肼(isoniazid)、四氯化碳、黄磷和鬼笔环肽。在一些情形中，所述Fah缺陷小鼠在不存在人肝细胞的情况下(但存在NTBC或其他类似化合物的情况下)被用作评估毒素作用的模型。在其他实例中，所述Fah缺陷小鼠被以人肝细胞移植，以评估所述毒素对人肝细胞的效应。在这些实例中，不必用NTBC维持所述Fah缺陷小鼠。一般而言，允许人肝细胞扩增至所述人肝细胞群规模达到大量(例如已接近最大值)的程度，然后将所述Fah缺陷小鼠暴露于所述毒剂。
在一些其中Fah缺陷小鼠在不存在人肝细胞的情况下用作恶性肝脏疾病(例如HCC或肝癌)的模型的实施方案中，所述Fah缺陷小鼠被给予足够高剂量的NTBC以防止由于肝功能障碍引起死亡，同时足够低以允许HCC或其他肝恶性肿瘤形成。或者，可用可防止任何肝脏机能障碍的NTBC剂量维持所述Fah缺陷小鼠，所述恶性肿瘤可以通过暴露于转化剂或者通过引入恶性细胞产生。另一种选择是移植人肝细胞并诱导HCC，例如通过使用转化剂，或者以恶性人肝细胞移植所述小鼠。因此，在一些实例中，所述Fah缺陷小鼠在不存在人肝细胞的情况下被用作恶性肝脏疾病模型。在其他实例中，所述Fah缺陷小鼠被以人肝细胞移植，以评估所述人细胞的恶性肝脏疾病。在这些实例中，不必用NTBC维持所述Fah缺陷小鼠。所述转化剂或恶性细胞可以随初始人肝细胞植入而引入，或者在所述人肝细胞已经开始在宿主动物中增殖后引入。在转化剂的情形中，可以优选地在人肝细胞活跃地增殖时给予所述试剂。
转化剂的实例包括黄曲霉毒素、二甲基亚硝胺，以及包含0.05-0.1％w/w DL-乙基硫氨酸的无胆碱饮食(Farber and Sarma，1987，in Concepts and Theories in Carcinogenesis，Maskens et al.，eds，Elsevier，Amsterdam，pp.185-220)。这类转化剂可全身给予动物或者局部给予肝脏自身。可以将恶性细胞直接接种于肝脏中。
C.Fah缺陷小鼠作为肝脏感染模型
在Fah缺陷小鼠中扩增的并从其中收集的人肝细胞，也可用于各种不同的微生物学研究。许多病原体(例如细菌、病毒和寄生物)只能够在人宿主或原代人肝细胞中复制。因此，具有足够的原代人肝细胞来源，对于这些病原体的研究来说是关键的。扩增的人肝细胞可用于病毒感染或复制的研究，或用于鉴定调节肝脏疾病毒感染的化合物的研究。使用原代人肝细胞研究肝脏病毒的方法，描述在例如欧洲专利No.1552740、美国专利No.6,509,514和PCT公布No.WO 00/17338中。肝脏病毒实例包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和巨细胞病毒(CMV)。可感染肝脏的寄生物的实例例如疟疾致病因子(疟原虫(Plasmodium)种，包括镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和诺尔斯疟原虫(Plasmodiumknowlesi))和利什曼病致病因子(利什曼原虫属(Leishmania)种，包括杜利什曼原虫(L.donovani)、婴儿利什曼原虫(L.infantum)、恰加斯利什曼原虫(L.chagasi)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)、委内瑞拉利什曼原虫(L.venezuelensis)、热带利什曼原虫(L.tropica)、硕大利什曼原虫(L.major)、埃塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)、巴西利什曼原虫(L.(V.)braziliensis)、圭亚那利什曼原虫(L.(V.)guyanensis)、巴拿马利什曼原虫(L.(V.)panamensis)和秘鲁利什曼原虫(L.(V.)peruviana))。
除了使用在Fah缺陷小鼠中扩增的人肝细胞进行微生物研究之外，所述Fah缺陷小鼠本身还可以作为肝脏病原体感染的动物模型。例如，以人肝细胞再殖的Fah缺陷小鼠可被用肝脏病原体感染，并且可用于筛查用于治疗所述感染的候选试剂。候选试剂包括来自许多化学物类别中任一类别的任何化合物，例如小有机化合物。候选试剂还包括生物分子，例如核酸分子(包括反义寡核苷酸、小干扰RNA、微小RNA、核酶、短发夹RNA、表达载体等)、肽和抗体、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们的衍生物、结构类似物或结合物。
候选试剂可以获自多种来源，包括合成或天然化合物库。例如，有多种方式用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括表达随机寡核苷酸和寡肽。或者，可获得或容易地产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。另外，天然或合成方法产生的库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物化学方法修饰，并且可用于产生组合库。可以对已知药理学试剂进行定向或随机化学修饰(例如酰化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等)以产生结构类似物。
下文讨论了使用Fah缺陷小鼠来研究HCV和HBV感染，以及评估用于治疗这些感染的候选试剂。然而，所述方法可以应用于任何目的肝脏病原体。在一个实施方案中，Fah缺陷小鼠被用于鉴定可抑制病毒感染、减少病毒复制并且/或者改善HBV或HCV感染引起的一种或多种症状的试剂。通常，将所述候选试剂给予所述Fah缺陷小鼠，并且相对于对照评估所述候选试剂的效果。例如，可以将所述候选试剂给予HCV感染的Fah缺陷小鼠，并且可以将所治疗动物的病毒滴度(例如通过对血清样品的RT-PCR测量)与治疗之前的所述动物和/或未治疗的HCV感染动物的病毒滴度比较。以候选试剂治疗后的感染动物病毒滴度的可检测降低表示所述试剂有抗病毒活性。
可以以适合用于送递所述候选试剂的任何方式给予所述试剂。例如，可以通过注射(例如通过静脉内注射、肌内注射、皮下注射或直接注射至靶组织)、口服或者通过任何其他合适方式给予所述候选试剂。在一些情形中，所述体内筛查将涉及接受不同量和浓度的所述候选试剂的多个Fah缺陷小鼠(从无试剂至接近可安全送递至所述动物的量的上限的试剂量)，并且可以包括以不同的制剂和路径送递所述试剂。候选试剂可以单独地或者以两种或多种的组合的形式给药，特别是在给予试剂组合可产生协同效应的情况下。
可以使用本领域中已知多种方法的任一种评估所述候选试剂的活性。例如，如果所述Fah缺陷小鼠被嗜肝病原体(例如HBV或HCV)感染，可以通过对血清样品检查病原体(例如测量病毒滴度)或者与所述病原体存在有关的标记物(例如病原体特异性蛋白质或编码核酸)的存在情况评估所述试剂的效果。用于检测和评估病毒感染存在情况和严重性的定性和定量方法是本领域中公知的。在一个实施方案中，可以通过对血清样品和/或组织切片检查病毒抗原(例如HBV表面抗原(HBsAg)或HBV核心抗原(HbcAg))的存在情况评估试剂抗HBV感染的活性。在另一个实施方案中，可以通过对血清样品检查病毒核酸(例如HCV RNA)的存在情况评估试剂抗病毒感染的活性。例如，可以通过以下方法检测HCV RNA：例如反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR或分支DNA(bDNA)测定法；通过RT-PCR检测负链RNA(HCV的复制中间体)；或者测序病毒RNA以随治疗进行检测病毒基因组的突变/移位(“准种进化”)。可选地，或者另外地，可对宿主肝脏进行或组织活检并进行原位RT-PCR杂交，以直接显示组织切片中病毒颗粒量的任何定性或定量变化。可选地，或者另外地，可以安乐处死所述宿主，对肝脏组织学检查所述试剂造成的感染和/或毒性体征。
Fah缺陷小鼠还可以被用于对候选疫苗筛查其防止或减轻嗜肝病原体引起的感染的能力。通常，疫苗是在给药后，可帮助所述宿主启动抗所述靶病原体的免疫反应的试剂。所引发的体液、细胞或体液/细胞免疫反应可以有利于抑制病原体(所述疫苗是针对其开发的)的感染。本公开内容中特别关注这样的疫苗，即其可诱发抑制嗜肝病原体(例如微生物、病毒或寄生病原体)——特别是病毒病原体例如HBV和/或HCV——感染和/或肝内复制的免疫反应。
为了评估候选疫苗，将所述Fah缺陷小鼠以人肝细胞移植，以用人肝细胞再殖所述小鼠肝脏。对有效疫苗的筛查类似于上文描述的筛查方法。在一些实施方案中，将所述候选疫苗给予所述Fah缺陷小鼠，然后以所述嗜肝脏病原体接种。在一些情形中，通过以下方式给予所述候选疫苗：提供单次推注(例如腹膜内或肌肉注射、外用或口服)，任选地随后进行一次或多次加强免疫。免疫反应的诱导可以通过本领域中公知方法检测抗原/疫苗特异性的B和T细胞应答来进行评估。然后用所述嗜肝病原体攻击所述免疫的Fah缺陷小鼠。一般而言，用滴度递增的病原体攻击多个免疫的动物。然后对所述动物观察感染的形成，并评估感染的严重性(例如通过评估存在的病原体的滴度，或者检查人肝细胞功能参数)。可显著降低所述病原体感染并且/或者显著降低攻击后产生的疾病的严重性的候选疫苗被鉴定为有活力的疫苗。
D.药理学、毒性和基因治疗研究
在Fah缺陷小鼠中扩增并从其收集的Fah缺陷小鼠和/或人肝细胞可用于评估任何药物化合物(例如小分子、生物制品、环境和生物毒素或基因送递系统)对人肝细胞基因表达的改变。
正如在下面的实施例中描述的，在从受体小鼠收集的扩增的人肝细胞中，检测了参与药物缀合和解毒的基因(包括几种肝细胞转运蛋白的基因)的表达。最近的研究显示了这些缀合途径(Kostrubsky et al.，Drug.Metab.Dispos.28：1192-1197，2000)和肝细胞转运蛋白(Kostrubsky et al.，Toxicol.Sci.90：451-459，2006)在预测药物毒性中发挥的关键作用。除了对外源药物(例如利福平、PB或BNF)引起的CYP诱导的正常人应答，在FRG小鼠中扩增的人肝细胞对核激素受体转录因子、缀合途径和主要转运蛋白的表达，也允许对这些基因产物在人药物代谢和毒性中的作用进行体内评估。
人源化FRG小鼠显示人典型的血脂谱，具有显著较高的LDL胆固醇含量(参见表4)，而对照小鼠显示小鼠血的典型高HDL含量。人源化FRG小鼠因此可用于测试抗高脂血症药物和抗动脉粥样硬化医药。人源化FRG小鼠的胆囊中显示人胆汁酸组成(参见表3)。这表示这些小鼠可用于测定正常和生物异源性代谢物的胆汁分泌。
例如，在Fah缺陷小鼠中扩增并从其收集的人肝细胞可用于评估人细胞中具体化合物的毒性。测试分离的肝细胞中化合物毒性的方法是本领域中公知的，记载于例如PCT公开文本No.WO2007/022419中。类似地，移植有人肝细胞的Fah缺陷小鼠可以用于评估外源性试剂的毒性。在一些实施方案中，所述外源性试剂是已知毒素或疑似的毒素。
在一些实施方案中，移植有人肝细胞(或在Fah缺陷小鼠中扩增并从其收集的人肝细胞)的Fah缺陷小鼠被用于评估药物代谢和药物动力学的多个参数中的任一个。例如，可以进行研究来评估药物代谢；体内药物/药物相互作用；药物半衰期；排泄/清除途径；尿、粪便、胆汁、血液或其他体液中的代谢产物；细胞色素p450诱导；肠肝再循环；以及酶/转运蛋白诱导。
在一些实施方案中，移植有人肝细胞(或在Fah缺陷小鼠中扩增并从其收集的人肝细胞)的Fah缺陷小鼠可用于评估化合物——包括治疗剂或候选试剂(例如小分子或生物制品)、环境或生物毒素或者基因送递系统——的毒理学和安全性。例如，可以评估人肝细胞的细胞周期增殖，例如以确定暴露于所述化合物后患癌症的风险。还可以评估对肝细胞的毒性，例如通过组织学、凋亡指数、肝功能试验等。还可以进行肝细胞代谢的分析，例如在感染稳定的同位素前体后分析代谢产物。
还可以在移植有人肝细胞的Fah缺陷小鼠中评估具体药物的效力。这类药物包括例如治疗高脂血症/动脉粥样硬化、肝炎和疟疾的药物。
在一些实施方案中，移植有人肝细胞(或在Fah缺陷小鼠中扩增并从其收集的人肝细胞)的Fah缺陷小鼠被用于研究基因治疗方案和载体。例如，可以评估以下的参数：基因送递载体(包括病毒和非病毒载体)的转导效率；遗传物质(genetic payload)的整合频率和定位(整合部位分析)；遗传物质的功能性(基因表达水平、基因敲除效率)；以及遗传物质的副作用(体内人肝细胞基因表达或蛋白组学的分析)。例如，已有报道称在对患有家族性高胆固醇血症的患者的基因治疗中使用转染的肝细胞(Grossman et al.Nat.Genet.6：335，1994)。
VIII.编码尿激酶的载体
在本文描述的方法的一些实施方案中，在人肝细胞移植之前，向Fah缺陷小鼠给予编码尿激酶的载体。在一个实施方案中，尿激酶(也被称为尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA))是分泌形式的人尿激酶。在另一个实施方案中，尿激酶是经修饰的、非分泌形式的尿激酶(参见美国专利No.5,980,886)。任何类型的适合于在小鼠中表达尿激酶的载体都可以考虑。这样的载体包括质粒载体或病毒载体。适合的载体包括但不限于DNA载体、腺病毒载体、反转录病毒载体、假型反转录病毒载体、AAV载体、长臂猿白血病病毒载体、VSV-G、VL30载体、脂质体介导的载体，等等。在一个实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体可以源自于任何适合的腺病毒，包括任何腺病毒血清型(例如但不限于Ad2和Ad5)。腺病毒载体可以是第一、第二、第三和/或第四代腺病毒载体或无内容(gutless)腺病毒载体。非病毒载体可以由不同结构的质粒、磷脂、脂质体(阳离子或阴离子)构成。在另一个实施方案中，病毒载体是AAV载体。AAV载体可以是本技术领域中已知的任何适合的AAV载体。
编码尿激酶的病毒和非病毒载体在本技术领域中是众所周知的。例如，编码人尿激酶的腺病毒载体记载于美国专利No.5,980,886以及Lieber et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(13)：6210-4，1995)中。美国专利申请公布No.2005-176129和美国专利No.5,585,362描述了重组腺病毒载体，美国专利No.6,025,195公开了用于肝脏特异性表达的腺病毒载体。美国专利申请公布No.2003-0166284描述了用于目标基因(包括尿激酶基因)的肝脏特异性表达的腺伴随病毒(AAV)载体。美国专利Nos.6,521,225和5,589,377描述了重组AAV载体。PCT公布No.WO0244393描述了含有人尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂基因的病毒和非病毒载体。能够高水平表达人尿激酶基因的表达载体公开在PCT公布No.WO 03087393中。
编码尿激酶的载体可以任选包含表达控制序列，包括适合的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子(即ATG)、用于内含子以及维持该基因的正确阅读框以允许mRNA正确翻译的剪接信号，以及终止密码子。一般来说，表达控制序列包括启动子——足以指导转录的最小序列。
表达载体可以包含复制起点、启动子，以及允许对转化的细胞进行表型筛选的特定基因(例如抗生素抗性盒式元件)。一般来说，表达载体将包含启动子。启动子可以是诱导型的或组成型的。启动子可以是组织特异性的。适合的启动子包括胸苷激酶启动子(TK)、金属硫蛋白I、多角体蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶、β-肌动蛋白或其他启动子。在一个实施方案中，启动子是异源启动子。
在一个实施例中，编码尿激酶的序列位于所需启动子的下游。任选地还包含增强子元件，它一般可以位于载体上任何位置而仍然具有增强效应。但是，活性增加的量，一般将随着距离而减小。
编码尿激酶的载体可以通过各种不同的途径给予，包括但不限于静脉内、腹膜内或经门静脉进行血管内输注。所给予的载体的量可以改变，并且可以使用常规的实验来确定。在一个实施方案中，以约1×108至约1×1010噬斑形成单位的剂量向FRG小鼠给予编码尿激酶的腺病毒载体。在一个优选实施方案中，所述剂量是约5×109噬斑形成单位。
在一个示例性实施方案中，向FRG小鼠给予编码人尿激酶的腺病毒载体。与其他类型的病毒载体相比，腺病毒载体具有几个优点，例如它们可以被生产为具有非常高滴度的感染性颗粒；它们可感染很多种类的细胞；它们将可基因有效地转移到没有在分裂的细胞中；以及它们很少整合到客体基因组中，这避免了由于插入性诱变导致的细胞转化的风险(Douglas and Curiel，Scienceand Medicine，March/April 1997，pages 44-53；Zern andKresinam，Hepatology：25(2)，484-491，1997)。可用于编码尿激酶的代表性的腺病毒载体由Stratford-Perricaudet等(J.Clin.Invest.90：626-630，1992)，Graham和Prevec(In Methods inMolecular Biology：Gene Transfer and Expression Protocols 7：109-128，1991)，以及Barr等(Gene Therapy，2：151-155，1995)进行了描述。
提供了下面的实施例以说明某些具体特点和/或实施方案。这些实施例不应该被解释为将本发明局限于所描述的具体特点或实施方案。
实施例
实施例1：Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠的产生
许多不同策略可以应用于产生免疫缺陷小鼠，包括例如通过给予免疫抑制药物或者通过引入一种或多种遗传改变。该实施例描述遗传改变的免疫缺陷小鼠的产生。
为了产生完全缺乏T细胞、B细胞和NK细胞、但是没有DNA修复缺陷的免疫缺陷Fah-/-小鼠品系，产生了Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。将雄性Fah-/-129S4小鼠(Grompe et al.，Genes Dev.7：2298-2307，1993)与雌性Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠(Taconic)进行杂交。所有动物都用含有浓度为1.6mg/L的2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)的饮用水维持(Grompe et al.，Nat.Genet.70：453-460，1995)。为了证实每只动物的基因型，对从脚趾组织分离的200ng基因组DNA进行了基于PCR的基因分型(Grompe et al.，Genes Dev.7：2298-2307，1993；Traggiai et al.，Science 304：104-107，2004)。
FRG小鼠，如果在它们的饮用水中持续提供NTBC，能够生长良好并完全可育。肉眼观察FRG小鼠的肝脏在尺寸和形状上是正常的，组织学检查显示出常规Fah-/-小鼠与FRG小鼠之间没有差异。与常规Fah-/-小鼠相同，NTBC撤销在FRG小鼠中导致了逐渐的肝细胞损伤，并最终在4-8周后死亡(Overturf et al.，Nat.Genet.12：266-273，1996)。
实施例2：组织学和移入检测分析
组织学和免疫细胞化学
FAH免疫组织化学按照以前的描述进行(Wang et al.，Am.J.Pathol.161：565-574，2002)。简单来说，将固定在pH 7.4的10％磷酸盐缓冲的福尔马林中的肝脏和肾脏组织，在100％乙醇中脱水，并在58℃下包埋在石蜡中。将去石蜡的4μm切片用苏木精和曙红染色。对于免疫组织化学来说，将切片用3％H2O2的甲醇溶液进行处理，用于阻断内源性过氧化物酶。在用第一抗体孵育之前，也进行了亲和素和生物素阻断。将切片用抗FAH兔抗体或HepPar抗体(DAKO)在室温孵育2小时。然后用HRP缀合的第二抗体孵育。信号通过二氨基联苯胺(DAB)检测。
FAH酶测定法
将延胡索酰乙酰乙酸用来自受体肝脏的胞质肝级分孵育，消失速度(disappearance speed)是在330nm处通过分光光度法测量。野生型和Fah-/-肝脏被分别用作阳性和阴性对照。延胡索酰乙酰乙酸是通过酶法从尿黑酸制备(Knox et al.，Methods Enzymol.2：287-300，1955)。
Alu序列的基因组PCR
基因组DNA使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)从肝分离。人Alu序列按照标准程序，使用下列引物通过PCR扩增：5′-GGCGCGGTGGCTCACG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTC-3′(SEQ ID NO：2)。
肝细胞特异性基因表达的RT-PCR
总RNA是使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)从肝分离。互补DNA是通过反转录酶，使用oligo-dT引物合成。表1中显示的引物用于人或小鼠特异性cDNA扩增。
表1
用于扩增肝细胞特异性基因的RT-PCR引物
Figure GDA0000130865010000541
人白蛋白测量
每周一次，从左隐静脉使用肝素处理过的取血毛细管收集少量血液。在用Tris缓冲的盐水稀释1000或10000×后，使用人白蛋白ELISA定量试剂盒(Bethyl)，按照制造商的方案测量人白蛋白浓度。
荧光免疫细胞化学
将来自人源化小鼠肝脏的肝细胞悬浮在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中，并在1型胶原包被的6孔板上铺板。将贴壁的细胞用4％低聚甲醛固定15分钟，用5％脱脂乳封闭。1/200稀释的兔抗FAH抗体、山羊抗人白蛋白抗体(Bethyl)、山羊抗小鼠白蛋白抗体(Bethyl)被用作第一抗体。ALEXATMFluoro 488抗山羊IgG抗体(Invitrogen)或ALEXATM Fluoro 555抗兔IgG抗体(Invitrogen)被用作第二抗体。照片是用AXIOVERTTM 200显微镜，通过Nikon数字相机捕获。
FACS分析
在将受体的肝脏离解后，将实质细胞在4℃下与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗人人白细胞抗原(HLA)-A、B、C抗体(BDPharmingen)和藻红蛋白(PE)缀合的抗小鼠H2-K(b)抗体(BDPharmingen)孵育30分钟。然后将它们用PBS清洗两次，使用FACS CALIBURTM(Becton Dickinson)流式细胞仪进行分析。FITC缀合的和PE缀合的IgG被用作阴性对照(参见图8)。
荧光原位杂交
总基因组DNA探针是通过总小鼠和人基因组DNA的切口平移产生。Cy3-dUTP的掺入是按照制造商的建议(Invitrogen)进行。最终的探针浓度是200ng/μl。将带有贴壁细胞的载玻片用100mg/ml的RNase在37℃处理1小时，并用2×SSC冲洗3次，每次3分钟。在洗涤步骤后，将载玻片在70％、90％和100％乙醇中脱水，每种溶液中3分钟。将染色体在70％甲酰胺/2×SSC中，在75℃下变性3分钟，然后在冰冷的70％、90％和100％乙醇中脱水，每种溶液中3分钟。将探针混合物在75℃变性10分钟，在37℃预杂交30分钟。将探针涂敷到载玻片上，在37℃下于加湿箱中孵育过夜。杂交后的洗涤由三次在50％甲酰胺/2×SSC中的3分钟冲洗，以及三次在PN缓冲液(0.1M Na2HPO4，0.1MNaH2PO4，pH 8.0，2.5％NONIDETTM P-40)中的3分钟冲洗组成，都在45℃下进行。然后将载玻片用烟酸己可碱(Hoechst)(0.2μg/ml)复染，盖上盖玻片，在UV荧光(Zeiss)下观察。
实施例3：人肝细胞的分离和冷冻保存
按照以前描述的程序，从不用于肝脏移植的供体肝脏中分离了人肝细胞(Strom et al.，Cell Transplant.15：S 105-110，2006)。简单来说，将肝脏组织用添加有0.5mM EGTA(Sigma)和HEPES(Cellgro)的不含钙和镁的Hanks平衡盐溶液(Cambrex)灌注，然后用Eagle′s基本必需培养基(Cambrex)中的100mg/L胶原酶XI(Sigma)和50mg/L脱氧核糖核酸酶I(Sigma)通过现有的血管系统进行消化。将所述细胞用添加有7％牛血清(Hyclone)的Eagle′s基本必需基本培养基以50×g洗涤3次，每次2分钟。将沉淀的肝细胞转移到冷的VIASPANTM中(用于保存腹内器官的通用主动脉冲洗液和冷藏溶液；也被称为威斯康辛大学溶液(University of Wisconsin solution)或UW)。
将运输的肝细胞以每毫升5×106个肝细胞转移到添加有10％胎牛血清和10％二甲亚砜的VIASPANTM溶液中。将冻存管用纸巾厚厚包裹，在-80℃储存1天，最后转移到液氮中。对于融化来说，将细胞在37℃水浴中快速再加热，并逐渐加入DMEM，以使DMSO浓度变化的速度最小化。
实施例4：用人肝细胞再殖FRG小鼠肝
已经证明尿激酶过表达在几种系统中增强了肝细胞的移入(Lieber et al.，Hum.Gene Ther.6：1029-1037，1995)。因此，进行了实验以确定在人肝细胞移植之前给予表达尿激酶的腺病毒是否有益。表达分泌形式的人尿激酶(尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂；uPA)的腺病毒载体，以前已经描述过(Lieber et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：6210-6214，1995和美国专利No.5,980,886)。
分离供体肝细胞，并在分离后24-36小时进行移植。在大多数情况下，所述细胞在运输过程中保存在VIASPANTM溶液中，并保持在4℃下。但是，在两个实验中，移植了冷冻保存的肝细胞。供体肝细胞的存活性和质量是高度可变的，铺板效率在10％到60％的范围内。
对于移植来说，使用了下面的通用步骤。在移植前24-48小时，对成年(6至15周龄的)雄性和雌性FRG小鼠静脉内(眶后)注射uPA腺病毒(每只小鼠5×109噬斑形成单位(PFU))。通过27号针，脾内注射含有1百万个活的人肝细胞(通过锥虫蓝排斥确定)的100μl Dulbecco改良的必需培养基。在接下来的6天内逐渐撤销NTBC(第0-2天1.6mg/L；第3-4天0.8mg/L；第5-6天0.4mg/L)，并在移植一周后完全撤销。停止NTBC两周后，对动物重新使用所述药物5天，然后再次撤销。
在三个独立的移植中，在首先接受uPA腺病毒的受体中观察到了人肝细胞在FRG小鼠中的初级移入。因此，在大多数随后的移植实验中，使用了uPA预处理的方案。
总的来说，在引入uPA腺病毒方案后，来自9个不同供体的人肝细胞被成功地使用，没有发生移入失败的情况。其中，7个分离自脑死亡器官供体的肝脏，两个分离自外科手术肝切除物。供体年龄的范围在1.2到64岁之间(表2)。
表2
每个肝细胞供体的移入结果总结
在所有实验中，使用该方案时，至少一个受体明显被人肝细胞移入(＞1％人细胞)，无论使用哪个细胞批次。移入通过不同的方法得到了证明，包括组织学、DNA分析、酶测定法以及在后面实验中的人血清白蛋白。在由白蛋白水平监测的移植中，43个初级受体中的17个(39.5％；范围为12到67％)被再殖(表2和图3)。其中，7个被高度再殖(30-90％)，并获得了＞1mg/ml的白蛋白水平。不仅来自遗体肝脏的肝细胞，而且来自肝脏切除物的肝细胞，均被移入了。此外，冷冻保存的细胞也被成功地植入了。
在高度移入的小鼠(＞30％再殖)中，被移植的FRG小鼠的重量在第二次NTBC撤销期间稳定，但是少数Il2rg杂合的免疫缺陷同胎仔畜(Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-)移入同样细胞后持续地减重(图1A)。在三重突变小鼠中的这种体重的稳定，表明移植的人肝细胞代替了患病的Fah-/-受体肝细胞的功能。在体重完全稳定后(在最初移植后2-3个月)，收获受体的肝脏。从宏观来说，FRG肝脏在形状和重量上正常，没有肉眼可见的小结。对人特异性AluDNA序列进行的基因组PCR，在FRG受体肝脏中是阳性的，而Il2rg杂合子都是阴性的(图1B)。为了直接证实再殖细胞的肝细胞功能，分析了FAH酶活性(Knox et al.，Methods Enzymol.2：287-300，1955)。
受体小鼠肝脏具有相当量的FAH酶活性，等于或超过正常小鼠肝脏(图1C-E)。因为FAH专门表达在完全分化的肝细胞中，这表明移植的人肝细胞，当移入到小鼠肝脏中时，不是去分化的或异常的。FAH的免疫染色证实，超过70％的肝实质被FAH阳性人肝细胞再殖(图1F和图1G)。
使用另外的受体肝脏进行了组织学和免疫组织化学检查(图2A和图2B)。FAH阳性人肝细胞显示出完全整合到受体肝脏的结构中。在几个受体中，移入的肝细胞占据了超过80％的实质，而不扰乱受体肝脏的组织结构(图2B、2E和2F)。无性系扩增的人肝细胞可以通过尺寸以及通过它们的苍白细胞质，而在形态学上与小鼠肝细胞清楚地区分(图2C和图2D)。人肝细胞的尺寸相对较大，它们的细胞质看起来明亮，可能是因为如以前报道的糖原积累(Meuleman et al.，Hepatology 41：847-856，2005)。FAH阳性的肝细胞对于HepPar抗体也是阳性的，该抗体特异性标记人肝细胞，但是不标记小鼠对应物(图2E和图2F)。相反，FAH阴性区域显示出坏死性炎症并包含发育异常的肝细胞，其与在撤销NTBC后常规Fah-/-小鼠中的发现一致。
为了检查再殖的人肝细胞是否表达成熟的肝细胞特异性基因，对从受体肝脏提取的信使RNA进行了RT-PCR。人白蛋白(ALB)、FAH、转铁蛋白(TF)、运甲状腺素蛋白(TTR)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和UGT1A1基因在受体肝脏中大量表达(图3A、图6C和图7)。通过测量人白蛋白的血液浓度，也评估了肝细胞的功能性。使用了特异性用于人白蛋白的ELISA试剂盒，检测阈值是0.05μg/ml，使用1∶100稀释的样品。人白蛋白在移植到初级受体中后4到10周时被首次检测到。尽管最初在水平上存在某些波动，但随后浓度相对稳定地持续增加另外几周(图3B和图3C)。
为了进一步评估嵌合小鼠中人肝细胞的功能性，将人源化小鼠的胆汁酸组成和脂蛋白谱与正常的人和小鼠的胆汁和脂蛋白谱进行比较。如下文所示，具有人源化水平的小鼠的胆汁组成类似于人胆汁(表3)，并且人源化小鼠具有类似于人的高LDL和胆固醇水平(表4)。存在脱氧胆酸是人胆汁特有的，β-鼠胆酸水平比正常小鼠胆汁中低很多。胆固醇水平在人源化小鼠中高得多，该增加可能归结于LDL胆固醇。
表3
再殖小鼠的胆汁酸分析
  小鼠   DCA   CDCA/α-muri   CA   UDCA   β-muri   ％人
  T1   1.7   3.4   94.1   0   0.77   75
  T2   1.5   0.9   91.7   0   5.87   25
  T3   2.7   2.6   85.9   0.41   8.33   10
  T4   0   0   91.4   0   8.6   1
  T5   1.3   5.6   79.7   0.62   12.8   90
  T6   0   0   82.2   0   17.8   20
  T7   1.1   0   80.5   0   18.5   1
  T8   0   0   73.1   0   26.9   15
  T9   0.6   9.6   54.3   1.7   33.7   15
  T10   0   4.0   60.7   0.65   34.7   1
  C1   0   5   53.9   0   41.1   对照
  C2   0   1.0   56.9   0   42.0   对照
DCA＝脱氧胆酸；CDCA＝鹅脱氧胆酸；UDCA＝熊脱氧胆酸；β-muri＝β-muri[3β-3-H]胆酸。
表4
人源化FRG小鼠的脂质谱
  动物   胆固醇   HDL   LDL   甘油三酯
  C1   89   46   13   150
  C2   72   46   10   138
  C3   70   43   8   122
  T1   511   68   212   95
  T2   166   80   97   94
  T3   129   46   40   214
  T4   191   74   102   74
在非移植对照(C1-C3)和高度人源化(＞70％)FRG小鼠(T1-T4)中测量脂质。
为了保持高度再殖的小鼠长期存活，可能需要药理学蛋白酶抑制剂；由供体肝细胞产生的人补体可能损伤受体肾脏(参见Tateno et al.，Am.J.Pathol.165：901-912，2004)。因此，对几只(n＝3)高度再殖的小鼠进行了长期的观察。这些小鼠在撤销NTBC 4个月时没有损失体重，它们的人白蛋白浓度保持稳定。此外，它们的肾脏在收获时在宏观上和组织学上是正常的(图2G)。
实施例5：人肝细胞的连续移植
以前描述的肝脏异体再殖模型的一个限制是不能进一步扩增移入的人肝细胞。为了测试在FRG小鼠系统中连续移植的可行性，对高度再殖的初级受体的肝脏(大约70％人细胞)进行灌注，并且使用标准的胶原酶消化方法收集实质肝细胞。
将用人细胞再殖的小鼠麻醉，用24号导管对门静脉或下腔静脉进行插管。使用添加有0.5mM EGTA和10mM HEPES的不含钙和镁的EBSS对肝灌注5分钟。将所述溶液替换为添加有0.1mg/ml胶原酶XI(sigma)和0.05mg/ml DNase I(sigma)的EBSS，灌注10分钟。将所述肝脏在第二种溶液中轻轻切碎，连续地通过70μm和40μm的尼龙筛网进行过滤。在150×g下离心5分钟后，将沉淀进一步以50×g清洗两次，每次2分钟。通过锥虫蓝排斥实验评估细胞的数量和存活性。
将悬浮在100μl DMEM中的1百万个活细胞，通过27号针注射到受体脾脏中。在不分离Fah阳性人和Fah阴性小鼠肝细胞的情况下将肝细胞移植到次级FRG受体中。与用于初级移入的细胞相反，通过该方式收获的人肝细胞的存活性＞80％，它们可以容易地贴壁在胶原包被的培养板上(图4C-E)。在移入次级受体后，以同样的方式继续进行所述连续移植，植入到第三级和第四级受体中。在每一代中，一些但不是所有受体小鼠的血液人白蛋白变得高度阳性(图4A)。在连续移植受体中高度再殖小鼠的百分率较高(17/28，与7/43相比)，白蛋白增加的速度也更一致(图3E)。这可能表明肝细胞的连续传代富集了最可移植的人肝细胞，或者它可能仅仅反映了从供体小鼠新鲜收获的细胞的较高质量和存活性。对来自白蛋白阳性小鼠的肝脏样品的基因组PCR，显示出在每一代中均存在人DNA(图4B)。由人肝细胞进行的肝脏再殖也由针对FAH的荧光免疫染色所证实(图4C-E)。组织学检查显示出移入的人肝细胞在每一代中形态学上均相似，并且是明显的FAH阳性(图4F-4H)。
实施例6：肝细胞再殖不是细胞融合的结果
最近在尿激酶转基因小鼠中用灵长类细胞进行的肝再殖的报道，证明了细胞融合可能潜在地造成了表观上的“肝细胞再殖”(Okamura et al.，Histochem.Cell Biol.125：247-257，2006)。因为在该研究中使用了uPA转基因小鼠，这些发现提出了在其他小鼠肝脏人源化的报道中，细胞融合也是其机理的可能性。造血细胞与肝细胞之间的细胞融合，也已经在Fah缺陷小鼠中观察到(Wang et al.，Nature 422：897-901，2003)。小鼠和人细胞之间的细胞融合将极大地降低人源化小鼠肝脏的药物应用价值。为了证实再殖的肝细胞在起源上确实是人的，进行了针对人或小鼠特异性白蛋白和FAH的双重免疫染色。大多数(＞95％)的小鼠白蛋白阳性肝细胞对FAH确实是阴性的，大多数FAH阳性肝细胞对小鼠白蛋白是阴性的(图5A-5C)。另一方面，几乎所有(＞90％)的人白蛋白阳性肝细胞也是FAH阳性的，而剩余的肝细胞是双重阴性的(图5D-5F)。
白蛋白是分泌蛋白质，因此通过从其他细胞摄取异源白蛋白，细胞可以显示出抗体阳性。为了进一步证实没有细胞融合，将人和小鼠抗主要组织相容性复合物(MHC)抗体用于流式细胞术。每种抗体均被证实是种属特异性的(图5G-5J)。在高度再殖的肝脏中，没有发现对这两个物种的表面标志物都呈阳性的肝细胞(图5K和图5L)。
最后，使用人和小鼠全基因组探针在来自高度再殖的移植受体上进行了荧光原位杂交(FISH)。将来自高度再殖的初级(嵌合小鼠#531)和第三级(嵌合小鼠#631)小鼠的肝细胞，与人或小鼠总基因组DNA进行杂交。记录了对人探针或鼠类探针阳性的细胞的百分率(表5)。对照是纯的人和小鼠肝细胞，或人和小鼠肝细胞的等量混合物。如果在嵌合肝脏中发现的人细胞是细胞融合的产物，许多肝细胞将对人和小鼠探针是双重阳性的，因此对小鼠和人DNA阳性的细胞的百分率将超过100％。反之，则百分率的总和很近似于100％，这与在人和鼠类肝细胞的混合物中的情况一样。此外，在高度再殖小鼠的脾脏中检测到了人肝细胞(图2H)，尽管事实上脾脏不含能够用作人细胞的融合配体的鼠类肝细胞。因此，双重阳性细胞(融合产物)不占人细胞的主要部分。
表5
在再殖肝细胞中检测人和小鼠DNA
Figure GDA0000130865010000621
综上，这些结果表明融合事件如果发生的话，也是罕见的；即使在进行连续移植时，绝大多数的再殖细胞也是纯粹人来源的。因此，在FRG小鼠中扩增的人肝细胞只具有人的遗传和生物化学性质。
实施例7：人源化小鼠中药物代谢的功能表征
检查了嵌合小鼠中人肝脏特异性基因的基础表达和诱导。按照Kostrubsky等(DrugMetab.Dispos.27：887-894，1999)和Wen等(Drug Metab.Dispos.30：977-984，2002)的描述，对培养的肝细胞分别进行了的睾酮代谢和乙氧基9-羟基-3-异吩噁唑酮-O-脱乙基酶(EROD)活性的评估。RNA分离、cDNA合成和实时PCR是按照Komoroski等(Drug Metab.Dispos.32：512-518，2004)的描述进行。引物从Applied Biosystems获得，特异性针对人CYP1A1(Hs00153120_ml)、CYP1A2(Hs00167927_ml)、CYP3A4(Hs00430021_ml)、CYP3A7(Hs00426361_al)、CYP2B6(Hs00167937_gl)、CYP2D6(Hs00164385_al)、多药抗性相关蛋白MRP2(Hs00166123_ml)、胆盐输出泵BSEP(Hs00184829_ml)、CAR(Hs00231959_ml)、白蛋白(Hs00609411_ml)、HNF4α(Hs00230853_ml)、亲环蛋白(Cyclophillin)(Hs99999904_ml)和小鼠肌动蛋白(Ma00607939_sl)。
建立了分离的肝细胞培养物，并暴露于细胞色素P450基因的原型诱导剂(prototypical inducer)。结果证明，细胞色素(CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A7)、转运蛋白(BSEP、MRP2)和药物缀合酶(UGT1A1)的基础基因表达水平，与在培养的正常成年人肝细胞中发现的完全一样(图6C，图7)。此外，由化合物(例如β-萘黄酮(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif))诱导的基因模式，与从正常人细胞所预计的相同。除了人药物代谢基因的mRNA表达水平之外，还测量了人CYP1A和3A家族成员的酶活性。已知在人肝脏中，乙氧基9-羟基-3-异吩噁唑酮-O-脱乙基酶(EROD)活性由CYP1A1和1A2介导。结果显示，在人源化小鼠肝脏细胞中，EROD活性通过在先暴露于BNF而被特异地、强有力地诱导(图6A)。相反，在先暴露于PB或利福平，则特异地诱导了睾酮转化成6-β-羟基睾酮，这是CYP3A4介导的代谢的特异性量度(图6B)。因此，在这些标准药物代谢测定法中，来自再殖FRG肝脏的肝细胞与正常的人成年肝细胞不能区分开。
实施例8：在肝细胞再殖之前消除巨噬细胞
初级移入没有在100％的FRG受体小鼠中发生，即使预先给予尿激酶腺病毒。有可能是在FRG小鼠中存在的正常数量肝巨噬细胞，因此通过促进先天免疫应答限制了人细胞移入。
为了消除可能的巨噬细胞引发的免疫应答，在人肝细胞移植之前对FRG小鼠进行了巨噬细胞消除。巨噬细胞消除可以使用多种本技术领域中公知的方法中的任何一种来实现，包括化学消除(Schiedner et al.，Mol.Ther.7：35-43，2003)或通过使用抗体(McKenzie et al.，Blood 106：1259-1261，2005)。巨噬细胞也可以使用含有氯膦酸盐的脂质体(van Rijn et al.，Blood102：2522-2531，2003)进行消除。其他用于消除巨噬细胞的化合物和组合物，记载在美国专利公布No.2004-0141967和PCT公布No.WO 02/087424中。在消除巨噬细胞后，使用人肝细胞，按照在本文前面的实施例中描述的方法，对FRG小鼠进行移植或连续移植。
实施例9：在FpmRG小鼠中移入人肝细胞
FRG小鼠在Fah基因的外显子5中含有缺失(FahΔ外显子5)。为了证实人肝细胞可以被移入任何Fah缺陷的模型中，并在其中扩增，制备了在Fah中含有点突变的小鼠品系。这些小鼠被称为Fah点突变(Fahpm)小鼠，在Fah基因中具有点突变，导致了在Fah mRNA中的错误剪接并失去外显子7(Aponte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：641-645，2001)。在Fahpm小鼠和FahΔ外显 子5小鼠之间没有检测到表型的差异。
将Fahpm小鼠与Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠杂交(如在实施例1中所述)以产生纯合的Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)三重突变小鼠。按照在实施例4中描述的方法，用人肝细胞移植两组Fahpm小鼠。在肝细胞移植前大约24-48小时，小鼠接受uPA腺病毒的静脉内注射(眶后)。为了进行比较，平行地用人肝细胞移植FRG小鼠。在移植后2至3个月，在Fahpm小鼠的外周血中检测到了显著高水平的(23μg/ml)人血清白蛋白。这些人血清白蛋白的血液水平，与在同时移植的FRG小鼠中发现的水平相似。
这些结果表明，Fahpm小鼠可以用人肝细胞再殖到与FRG小鼠同样的程度。因此，人源化的肝脏再殖不是具有FahΔ外显子5突变的FRG小鼠独有的，而是可以用任何品系的Fah缺陷小鼠实现。
实施例10：使用IL-1R拮抗剂以增强FRG小鼠中人肝细胞的移入
使用上文(例如在实施例4中)描述的人肝细胞再殖方法，很少达到多于50％的小鼠肝脏人源化。甚至在移植一百万个人肝细胞后，人白蛋白的血清水平最初仍检测不到，表明在再殖早期阶段中大多数人肝细胞消失。
研究了阻断所述IL-1R的活化是否可以消除巨噬细胞活化，并因此阻止对移植的人肝细胞的破坏。阿那白滞素是一种重组人IL-1R拮抗剂(Amgen)，被FDA批准用于严重关节炎。阿那白滞素给药可阻断炎症应答通路，并且如下文所证明的，对肝细胞再殖有积极影响。
将来自同一批次的一百万个人肝细胞脾内注射至六只FRG小鼠中。在三只小鼠中，在手术过程中腹膜内给予阿那白滞素(2mg)，然后每天一次给予另外六个剂量(总剂量＝7天内14mg)。在移植后一个月，通过ELISA测量血液人白蛋白。以阿那白滞素治疗显著增强了肝细胞再殖。未接受阿那白滞素的三只小鼠中的两只未检测到人白蛋白，并且在三只小鼠的一只中检测到浓度3μg/ml的阿那白滞素。所有三只阿那白滞素处理的小鼠都具有高得多的白蛋白水平(130、165和200μg/ml)。
另外的实验验证了这些初始结果。下文表6显示了来自三次独立测试的结果。将遗传上相同的小鼠组以相同批次的人细胞注射，并且不用阿那白滞素处理(Con)或者用阿那白滞素处理(Ana)。使用了不同阿那白滞素给药方案，并且测试了不同的给药长度。高剂量阿那白滞素(Hi)为2mg/小鼠/天，低剂量(lo)为0.4mg/小鼠/天。每天注射药物，维持3天(×3)或7天(×7)。通过ELISA测量血液人白蛋白水平，以确定人再殖的程度。
表6
以阿那白滞素处理的FRG小鼠的肝再殖
Figure GDA0000130865010000661
以阿那白滞素处理的小鼠始终具有高出许多的再殖水平。仅以阿那白滞素处理的小鼠达到毫克/毫升程度的血液水平。平均而言，阿那白滞素处理致使再殖提高大约100倍。总之，高剂量(2mg/天)产生了最为一致的结果。
这些结果证明，对于移植人肝细胞后高度人源化FRG小鼠的百分数，用阿那白滞素处理显著高于不进行处理。为了测试药物代谢和一些病毒学应用，以人细胞进行的肝脏再殖必须超过70％。因此，对于多种研究和治疗目的，需要增加再殖效率。另外，阿那白滞素处理可以增加人临床肝细胞移植的效率，并使得它成为临床上更有效的步骤。
考虑到可应用本发明的原理的许多可能实施方案，应理解，所举例说明的实施方案仅是本发明的优选实例，不应被看作限制本发明的范围。而且，本发明的范围由下文权利要求书限定。我们因此将我们的发明要求为在这些权利要求的范围和主旨内。
Figure IDA0000128653030000011
Figure IDA0000128653030000031
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Figure IDA0000128653030000061
Figure IDA0000128653030000071
Figure IDA0000128653030000081

Claims (49)

1.一种体内扩增人肝细胞的方法，包括：
将人肝细胞移植至免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中，其中(i)所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者(ii)所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂；并且
允许所述人肝细胞扩增，从而扩增所述人肝细胞。
2.权利要求1的方法，其中允许所述人肝细胞扩增至少约2周、至少约4周、至少约8周、至少约12周、至少约16周、至少约20周、至少约24周或至少约28周。
3.权利要求1或2的方法，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠在所述Fah基因中包含纯合中断，使得所述中断导致功能性FAH蛋白表达的丧失。
4.权利要求3的方法，其中所述中断包括在所述Fah基因中的插入、缺失或者一个或多个点突变。
5.权利要求4的方法，其中所述中断包括所述Fah基因中的缺失。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠缺乏功能性T细胞、B细胞和NK细胞。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述小鼠的免疫缺陷是由遗传改变、免疫抑制或者它们的组合引起的。
8.权利要求7的方法，其中所述小鼠的免疫缺陷是由于遗传改变引起的，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠包含选自如下的遗传改变：重组酶活化基因1(Rag1)缺陷、重组酶活化基因2(Rag2)缺陷、白细胞介素-2受体γ链(Il2rg)缺陷、SCID突变、非肥胖性糖尿病(NOD)基因型、裸小鼠突变和它们的组合。
9.权利要求8的方法，其中所述小鼠为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠、Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠、NOD/Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠或NOD/Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-小鼠。
10.权利要求9的方法，其中所述小鼠为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠。
11.权利要求7的方法，其中所述免疫缺陷是由于免疫抑制引起的，所述小鼠被给予一种或多种免疫抑制剂以诱导所述免疫缺陷。
12.权利要求11的方法，其中所述一种或多种免疫抑制剂选自：FK506、环孢菌素A、氟达拉滨、麦考酚酯、泼尼松、雷帕霉素和硫唑嘌呤以及它们的结合物。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述小鼠有IL-1R表达缺陷。
14.权利要求13的方法，其中所述小鼠是对Il1r1基因中断纯合的，使得所述中断导致功能性IL-1R蛋白表达的丧失。
15.权利要求14的方法，其中所述中断包括所述Il1r1基因中的插入、缺失或者一个或多个点突变。
16.权利要求15的方法，其中所述小鼠为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠、Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠、NOD/Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠或NOD/Fah-/-/Rag1-/-/Il2rg-/-/Il1r1-/-小鼠。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂。
18.权利要求17的方法，其中所述IL-1R拮抗剂为阿那白滞素。
19.权利要求18的方法，其中阿那白滞素以每天约0.2至约6mg的剂量给药。
20.权利要求18或19的方法，其中阿那白滞素被给药约5至约10天。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述小鼠在进行肝细胞移植前被给予2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。
22.权利要求21的方法，其中所述NTBC以约0.05mg/kg/天至约2.0mg/kg/天的剂量给药。
23.权利要求21或22的方法，其中所述NTBC在饮用水中给药。
24.权利要求23的方法，其中在进行肝细胞移植前在饮用水中给药的NTBC浓度是约1至约8mg/L。
25.权利要求21或22的方法，其中所述NTBC在食物中给药。
26.权利要求21或22的方法，其中所述NTBC通过注射给药。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中在移植所述人肝细胞前向所述小鼠给予编码人尿激酶的载体。
28.权利要求27的方法，其中所述载体被静脉内给予。
29.权利要求27或28的方法，其中在进行肝细胞移植前约24-48小时给予所述载体。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中移植所述人肝细胞包括将所述人肝细胞注射至所述小鼠的脾脏或门静脉中。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中移植至所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中的人肝细胞是分离的人肝细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述人肝细胞分离自器官供体的肝脏，分离自外科手术切除物或者源自干细胞、单核细胞或羊水细胞。
33.权利要求32的方法，其中在进行注射之前所述肝细胞被冷冻保存。
34.权利要求1-33中任一项的方法，还包括从所述小鼠收集所述人肝细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述人肝细胞收集自所述小鼠的肝脏。
36.权利要求34或35的方法，还包括通过连续移植扩增所收集的人肝细胞。
37.权利要求1-36中任一项的方法，还包括从所述小鼠收集生物样品。
38.权利要求37的方法，其中所述生物样品为血液、尿、细胞或组织样品。
39.一种选择可有效用于治疗人肝脏疾病的试剂的方法，包括：
(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂；并且
(ii)评估所述候选试剂对所述肝脏疾病的效果，其中所述肝脏疾病的一种或多种体征或症状的改善表示所述候选试剂可有效用于治疗所述肝脏疾病。
40.权利要求39的方法，其中所述人肝脏疾病是人肝脏病原体感染，并且所述方法包括：
(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠的移植人肝细胞被所述肝脏病原体感染；并且
(ii)评估所述候选试剂对所述肝脏感染的效果，其中与给予所述候选试剂之前所述Fah缺陷小鼠中的感染负荷相比，所述肝脏病原体的感染负荷的降低表示所述候选试剂可有效用于治疗所述肝脏病原体的感染。
41.权利要求40的方法，其中通过测量从所述小鼠获得的样品中的病原体滴度来确定所述感染负荷。
42.权利要求40的方法，其中通过测量从所述小鼠获得的样品中的病原体特异性抗原来确定所述感染负荷。
43.权利要求40的方法，其中通过测量从所述小鼠获得的样品中的病原体特异性核酸分子来确定所述感染负荷。
44.权利要求40-43中任一项的方法，其中所述肝脏病原体为嗜肝病毒。
45.权利要求44的方法，其中所述嗜肝病毒为HBV或HCV。
46.权利要求39的方法，其中所述人肝脏疾病为肝硬化，并且所述方法包括：
(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠已被给予可诱导所述小鼠中发生肝硬化的化合物；并且
(ii)评估所述候选试剂对所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中肝硬化的至少一种诊断标记物的效果，其中所述肝硬化的至少一种诊断标记物选自AST、ALT、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白，并且其中与给予所述候选试剂之前的所述Fah缺陷小鼠相比，所述Fah缺陷小鼠中AST、ALT、胆红素或碱性磷酸酶的减少或白蛋白的增加表示所述候选试剂可有效用于治疗肝硬化。
47.权利要求39的方法，其中所述人肝脏疾病为肝细胞癌(HCC)，并且所述方法包括：
(i)将候选试剂给予移植有人肝细胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠已被给予可诱导所述小鼠发生HCC的化合物或者已被移植恶性肝细胞；并且
(ii)评估所述候选试剂对所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中HCC的效果，其中与给予所述候选试剂之前的所述小鼠相比，所述小鼠中肿瘤生长或肿瘤体积的减少表示所述候选试剂可有效用于治疗HCC。
48.一种评估外源性试剂在体内对人肝细胞效果的方法，包括：
(i)将所述外源性试剂给予移植有人肝细胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠还有IL-1R表达缺陷，或者所述小鼠被给予IL-1R拮抗剂；并且
(ii)测量所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中肝功能的至少一种标记物，其中所述肝功能的至少一种标记物选自AST、ALT、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白，并且其中与给予所述外源性试剂之前的所述小鼠相比，所述小鼠中AST、ALT、胆红素或碱性磷酸酶的增加或白蛋白的减少表示所述外源性试剂有毒性。
49.权利要求48的方法，其中所述外源性试剂为已知的毒素或疑似的毒素。
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