JP5497639B2 - 生体内でヒト肝細胞を増大させる方法 - Google Patents
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Description
本願は、2007年6月5日に出願された米国暫定特許出願第60/933,432号の利益を主張するものであり、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所からの授与番号DK051592に基づいて、米国政府の支援でもってなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
生体内でヒト肝細胞を増大させる方法であって、
i)単離されたヒト肝細胞をRag2 −/− /Il2rg −/− マウスに移植するステップであって、前記マウスが、Fahの発現が欠損している、ステップと、
ii)前記ヒト肝細胞を、少なくとも約2週間増大させるステップと、
iii)前記マウスからヒト肝細胞を採取するステップと、を含む、方法。
(項目2)
前記マウスが、前記Fah遺伝子において、欠失に対してホモ接合体である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記マウスが、Fah −/− /Rag2 −/− /Il2rg −/− (FRG)マウスである、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記マウスが、前記Fah遺伝子において、点変異に対してホモ接合体である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記マウスが、Fah pm /Rag2 −/− /Il2rg −/− (F pm RG)マウスである、項目4に記載の方法。
(項目6)
ヒトウロキナーゼをコード化するベクターが、前記ヒト肝細胞を注入する前に、前記マウスに投与される、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、項目6〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、項目6〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記ベクターが、静脈内投与される、項目6〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記ベクターが、肝細胞注入の約24〜48時間前に投与される、項目6〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記マウスに、肝細胞注入前に、2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3 シクロヘキサンジオン(NTBC)が投与される、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記NTBCが、約0.05mg/kg/日から約0.10mg/kg/日の用量で投与される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約3日間、NTBCがさらに投与される、項目13または項目14に記載の方法。
(項目16)
前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約6日間、NTBCがさらに投与される、項目13または項目14に記載の方法。
(項目17)
NTBCの前記用量が、肝細胞注入後、6日間の過程にわたり漸減される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記NTBCが、飲料水内投与される、項目13〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
肝細胞注入前、飲料水内投与されるNTBCの濃度が、約1mg/Lから約8mg/Lである、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記NTBCが、食物内投与される、項目13〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記NTBCが、注入することにより投与される、項目13〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記ヒト肝細胞が、少なくとも約6週間、増大可能である、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記ヒト肝細胞が、最長約6ヶ月間、増大可能である、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記単離されたヒト肝細胞が、前記マウスの脾臓または門脈に注入される、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記増大されたヒト肝細胞は、前記マウスの肝臓から採取される、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記ヒト肝細胞が、臓器ドナーの肝臓から単離された、または外科的切除術から単離された、または幹細胞もしくは単球もしくは羊膜細胞に由来した、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記肝細胞は、注入前、凍結保存された、項目26に記載の方法。
(項目28)
肝細胞注入前、前記FRGマウスからマクロファージを減損させるステップをさらに含む、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
マクロファージを減損させるステップが、化学的減損を含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
マクロファージを減損させるステップが、マクロファージに特異的に結合する抗体の使用を含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
連続移植により採取されたヒト肝細胞を増大させるステップをさらに含む、項目1〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的FAH、RAG−2、およびIL−2Rγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Fah、Rag2、およびIl2rg遺伝子において、前記欠失または1つもしくは複数の点変異に対して、ホモ接合体であり、前記マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞は、前記マウスにおいて、増大させることができる、遺伝子組み換えマウス。
(項目33)
前記欠失または点変異が、B細胞、T細胞、およびNK細胞の完全喪失をもたらす、項目32に記載のマウス。
(項目34)
前記マウスが、FRGマウスである、項目32または33に記載のマウス。
(項目35)
前記マウスが、F pm RGマウスである、項目32または33に記載のマウス。
(項目36)
前記マウスが、ヒトウロキナーゼを発現する、項目32〜35のいずれか1項に記載のマウス。
(項目37)
前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、項目36に記載のマウス。
(項目38)
前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、項目36に記載のマウス。
(項目39)
ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化する導入遺伝子の取り込みに起因する、項目36〜38のいずれか1項に記載のマウス。
(項目40)
ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化するベクターの投与に起因する、項目36〜38のいずれか1項に記載のマウス。
(項目41)
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、項目40に記載のマウス。
(項目42)
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、項目40に記載のマウス。
AAV アデノ随伴ウイルス
ALB アルブミン
ALT アラニン・アミノトランスフェラーゼ
AST アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
BNF ベータナフトフラボン
DAB ジアミノベンジジン
ELISA 酵素免疫測定法
EROD エトキシレソルフィン−O−デエチラーゼ
FACS 蛍光活性化細胞分類
FAH フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ
FISH 蛍光原位置ハイブリダイゼーション
FITC フルオレセインイソチオシアネート
FRG Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/−三重変異体マウス
HLA ヒト白血球抗原
IL−2Rγ インターロイキン2受容体γ
MHC 主要組織適合性複合体
NTBC 2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3 シクロヘキサンジオン
PB フェノバルビタール
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PE フィコエリトリン
PFU プラーク形成単位
RAG リコンビナーゼ活性化遺伝子
Rif リファンピシン
RT−PCR 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
TAT チロシンアミノ転移酵素
TF トランスフェリン
TTR トランスサイレチン
UGT1A1 UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1
uPA ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子
II. 用語
別途記載のない限り、技術用語は、従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Pressより出版、1994(ISBN0−19−854287−9)、Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0−632−02182−9)、およびRobert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.より出版、1995(ISBN1−56081−569−8)において見出すことができる。
生体内でヒト肝細胞を増大させる着実な方法を本明細書に提供する。該方法は、チロシン異化酵素、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ(Fah)が欠損している免疫不全マウスに単離されたヒト肝細胞を移植するステップを含む。一実施形態において、該免疫不全マウスは、Rag2−/−/Il2rg−/−マウスである。一実施形態において、該Fah欠損マウスは、Fahのホモ接合体欠失を含む。別の実施形態において、該Fah欠損マウスは、タンパク質の機能、および/または作製が実質的に低下するように、Fahにおいて、1つもしくは複数の点変異を含む。本明細書に記載されるように、Fah、リコンビナーゼ活性化遺伝子2(Rag2)、およびインターロイキン受容体の共通γ鎖(Il2rg)が欠損した三重変異体マウスは、生体内でヒト肝細胞を増大させるための十分な生体内系を提供する。一部の実施形態において、該マウスは、Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/−(FRG)マウスである。一部の実施形態において、該マウスは、Fahpm/Rag2−/−/Il2rg−/−(FpmRG)マウスである。
いくつかのグループは、齧歯動物において、一次ヒト肝細胞を生着および増大しようとした(米国特許第6,509,514号、PCT公開第WO 01/07338号、米国公開第2005−0255591号)。Dandriら(Hepatology 33:981−988,2001)が、ヒト肝細胞を用いてマウス肝臓の再増殖の成功を初めて報告した。その後、他のグループは、マウスにおいて、成功を収めたヒト肝臓細胞の生着を報告している。これらの研究のすべてにおいて、使用された動物は、アルブミンプロモータの転写制御下で、ウロキナーゼプラミノーゲン活性化因子(uPA)を発現する、トランスジェニック動物であった(Sandgren et al.Cell 66:245−256,1991)。uPAの過剰発現は、代謝破壊を引き起こし、移植されたヒト肝細胞に影響を及ぼすことなく、マウス肝細胞の細胞死をもたらし、それは導入遺伝子を発現しない。該alb−uPA導入遺伝子は、様々な免疫不全のバックグラウンドと交錯し、ヒト細胞の拒絶を阻止した(Tateno et al.Am.J.Pathol.165:901−912,2004、Katoh et al.J.Pharm.Sci.96:428−437,2007、Turrini et al.Transplant.Proc.38:1181−1184,2006)。
ヒト肝細胞の生体内の増大のためにFah欠損マウスを用いることの有意な利点は、様々な源から採取したヒト肝細胞を該マウスに生着する能力である。下述の実施例に記載されるように、ヒト肝細胞は、死体ドナーまたは肝臓切除術から採取し得る、または市販の源から得ることができる。さらに、本明細書に示されるように、FRGマウスに、すべての年齢のドナーからのヒト肝細胞、または凍結保存された肝細胞を、うまく移植することができる。多くの場合、ヒト肝細胞の単離と移植との間の遅延(一般に、1〜2日)があり、これは該肝細胞の生存能力の低下をもたらし得る。しかしながら、該FRGマウス系は、限定された生存能力がある肝細胞を生着した場合でさえ、ヒト肝細胞を増大させることができる。
ヒト肝細胞は、当技術分野で知られているいくつかの技法のうちのいずれかを用いて、受容マウスから採取することができる。例えば、マウスは、麻酔することができ、門脈または下大静脈に、カテーテルを用いてカニューレを挿入した。該肝臓は、その後、適切な緩衝液(0.5mM EGTAおよび10mM HEPESが追加された無カルシウムおよび無マグネシウムEBSS)で潅流し、次いで、該肝臓にコラゲナーゼ処理(例えば、0.1mg/ml コラゲナーゼXIおよび0.05mg/ml DNase Iが追加されたEBSSからなる溶液を用いて)を行うことができる。該肝臓は、徐々に細分化し、ナイロン製のメッシュで濾過(70μmと40μmのナイロン製のメッシュでの連続等)し、次いで、遠心分離し、該細胞の洗浄を行った。受容マウスから採取したヒト肝細胞は、当技術分野で周知の任意の技法を用いて、非ヒト細胞または他の混入物質(組織または細胞残屑等)から分離することができる。例えば、このような方法は、ヒト肝細胞に選択的に結合する抗体を用いるステップを含む。このような抗体としては、抗ヒトHLA−A、B、Cのような、クラスI主要組織適合性抗原に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない(Markus et al.Cell Transplantation 6:455−462,1997)。ヒト細胞またはヒト肝細胞に対して特異的な抗体は、FACS、またはパンニング、または磁気ビーズ分離を含む、様々な異なる技法に使用することができる。FACSは、他のさらに高度な検出レベルのうちで、複数の色チャネル、ローアングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、およびインピーダンスチャネルを利用して、抗体が結合した細胞を分離または分類する(米国特許第5,061,620号参照)。磁気分離は、1)ヒト特異抗体と接合する、または2)ヒト特異抗体と結合することができる検出抗体と接合する、または3)ビオチン化抗体と結合することができるアビジンと接合する、常磁性粒子の使用を含む。パンニングは、アガロースビーズ、またはポリスチレンビーズ、または中空糸膜、またはプラスチック製のペトリ皿のような、固体マトリックスに結合したモノクローナル抗体を含む。該抗体で結合した細胞は、試料から固体支持体を単に物理的に分離することにより試料から単離させることができる。
免疫不全、かつFah欠損マウスはまた、ヒト肝臓疾患に対するモデル系として使用することもできる。ヒト肝細胞を生着したFah欠損をさらに含む、Rag2−/−/Il2rg−/−マウスを含む、これらのマウス(例えば、FRGまたはFpmRGマウス等)は、例えば、毒素への暴露、感染症、遺伝病、または悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、様々な異なる病因に起因する肝臓疾患のモデルを作製するために使用することができる。ヒト肝細胞を生着し、再構成したFah欠損マウスは、これらの疾患の理解をより深め、疾患経過を予防、または遅延、または逆行し得る薬剤を同定するために、使用することができる。例えば、該Fah欠損マウスは、遺伝子治療ベクターを試験するために使用することができる。着目遺伝子治療用ベクターは、Fah欠損マウスに投与することができ、生着されたヒト肝細胞におけるベクターの効果を評価することができる。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Fah欠損マウスに、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼをコード化するベクターが投与される。一実施形態において、該ウロキナーゼ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)としても知られる)は、分泌型のヒトウロキナーゼである。別の実施形態において、該ウロキナーゼは、修飾された、非分泌型のウロキナーゼである(米国特許第5,980,886号参照、参照することにより本明細書に組み込まれる)。マウスにおけるウロキナーゼの発現に適した任意の型のベクターが企図される。このようなベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む。適したベクターとしては、DNAベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、AAVベクター、テナガザル白血病のベクター、VSV−G、VL30ベクター、リポソーム媒介ベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、該ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。該アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス血清型を含む、任意の適したアデノウイルスに由来し得る(Ad2およびAd5等であるが、これらに限定されない)。アデノウイルスベクターは、第1、第2、第3、および/または第4世代のアデノウイルスベクター、またはアデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた(gutless)アデノウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、プラスミド、ホスホリン脂質、異なる構造のリポソーム(陽イオンおよび陰イオン)により構成することができる。別の実施形態において、該ウイルスベクターは、AAVベクターである。該AAVベクターは、当技術分野で知られている任意の適したAAVベクターであり得る。
免疫不全Fahノックアウトマウスのいくつかの株を作製した。Fah突然変異体をヌード、nod/scidまたはRag1−/−バックグラウンドと交錯することは、不成功であった。T細胞、B細胞、およびNK細胞が完全に欠如するが、DNA修復欠損のない、免疫不全Fah−/−マウス株を作製するために、Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/−(FRG)マウスを作製した。オスFah−/−129S4マウス(Grompe et al.Genes Dev.7:2298−2307,1993)を、メスRag2−/−/Il2rg−/−マウス(Taconic)と交配させた。すべての動物に、1.6mg/Lの濃度で、2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3 シクロヘキサンジオン(NTBC)を含有する飲料水を与えてすべての動物を維持した(Grompe et al.Nat.Genet.10:453−460,1995)。各動物の遺伝子型を確認するために、PCRベースの遺伝子タイピングを、足指組織から単離した200ngのゲノムDNAに実行した(Grompe et al.Genes Dev7:2298−2307,1993、Traggiai et al.Science 304:104−107,2004)。
組織学および免疫細胞化学
FAH免疫組織化学を、前述のように行った(Wang et al.Am.J.Pathol.161:565−574,2002)。簡潔に述べると、pH7.4で、10%リン酸緩衝ホルマリン中で固定された肝臓組織および腎臓組織は、100%エタノール中で脱水され、58℃で、パラフィンワックスに包埋された。脱パラフィン処理した4μmの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学のために、切片は、3%H2O2を含むメタノールで、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングのために処理した。また、アビジンおよびビオチンブロッキングは、一次抗体でインキュベーションする前に、行なった。切片は、室温で2時間、抗FAHウサギ抗体またはHepPar抗体(DAKO)でインキュベートし、次いで、HRPに接合した二次抗体でインキュベートした。シグナルは、ジアミノベンジジン(DAB)により検出した。
フマリルアセト酢酸は、受容者の肝臓からの細胞質の肝臓分画とともにインキュベートし、消失速度を、330nmで分光学的に測定した。野生型およびFah−/−肝臓はそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。フマリルアセト酢酸は、ホモゲンチジン酸から酵素的に調製した(Knox et al.Methods Enzymol.2:287−300,1955)。
ゲノムDNAは、DNeasy組織キット(Qiagen)を用いて、肝臓から単離した。ヒトAlu配列は、以下のプライマー5’−GGCGCGGTGGCTCACG−3’(配列番号1)および5’−TTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTC−3’(配列番号2)を用いた標準手順に従って、PCRにより増幅した。
総RNAは、Rneasyミニキット(Qiagen)を用いて、肝臓から単離した。相補的DNAは、オリゴdTプライマーを用いて逆転写酵素により合成した。表1に示されるプライマーは、ヒトまたはマウス特異的cDNA増幅のために使用した。
少量の血液を、ヘパリン化された毛細血管を有する左側の伏在静脈から1週間に1回採取した。トリス緩衝食塩水で1,000倍または10,000倍希釈した後、ヒトアルブミン濃度は、製造業者のプロトコルに従って、ヒトアルブミンELISA Quantitation Kit(Bethyl)を用いて測定した。
ヒト化マウス肝臓からの肝細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で懸濁し、コラーゲン型1被覆6ウェルプレート上に播種した。付着した細胞を、4%パラホルムアルデヒドで、15分間固定し、5%スキムミルクでブロックした。ウサギ抗FAH、ヤギ抗ヒトアルブミン(Bethyl)、ヤギ抗マウスアルブミン(Bethyl)を、1/200の希釈で、一次抗体として使用した。ALEXA(登録商標)フルオロ488抗ヤギIgG(Invitrogen)またはALEXA(登録商標)フルオロ555抗ウサギIgG(Invitrogen)を、二次抗体として使用した。該画像は、Nikonのデジタルカメラを用いることによりAXIOVERT(登録商標)200顕微鏡で捕捉した。
受容者の肝臓の解離後、実質細胞を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)接合した抗ヒトヒト白血球抗原(HLA)−A、B、C(BD Pharmingen)、およびフィコエリトリン(PE)を接合した抗マウスH2−K(b)(BD Pharmingen)抗体と共に、4℃で30分間インキュベートした。その後、これらをPBSで2回洗浄し、FACS CALIBUR(登録商標)(Becton Dickinson)フローサイトメーターで解析した。FITCを接合したIgGおよびPEを接合したIgGを、負の対照として使用した。
全ゲノムDNAプローブは、全マウスゲノムDNAおよび全ヒトゲノムDNAのニックトランスレーション法により作製した。Cy3−dUTPの取り込みは、製造業者の推奨(Invitrogen)に従って実行した。最終プローブ濃度は、200ng/μlであった。付着した細胞のあるスライドを、37℃で1時間、100mg/mlのRnaseで処理し、2X SSC中で3回(1回3分間)洗浄した。洗浄ステップ後、スライドを、70%、90%、および100%エタノール中で、3分間、それぞれ脱水した。染色体を、75℃で3分間、70%ホルムアミド/2X SSC中で変性し、次いで、冷70%、90%、および100%エタノールで3分間、それぞれ脱水した。プローブカクテルを、75℃で10分間変性し、37℃で30分間あらかじめハイブリダイズした。プローブを、スライドに適用し、湿潤チャンバ中で、37℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、50%ホルムアミド/2X SSC中で3回の3分洗浄、PN緩衝液(0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4、pH8.0、2.5% NONIDET(登録商標)P−40)中で3回の3分洗浄において、すべて45℃で行われた。スライドは、その後、紫外線蛍光(Zeiss)下で、ヘキスト(0.2ug/ml)で対比染色し、カバースリップをかぶせ、観察した。
ヒト肝細胞は、前述の手順に従って、肝臓移植手術のために使用されないドナー肝臓から単離した(Strom et al. Cell Transplant.15:S105−110,2006)。簡潔に述べると、肝臓組織を、0.5mM EGTA(Sigma)およびHEPES(Cellgro)が追加された無カルシウムおよび無マグネシウムのハンクス液(Cambrex)で潅流し、次いで、既存の脈管構造を通してイーグル最小必須培地(Cambrex)中で、100mg/LのコラゲナーゼXI(Sigma)および50mg/LのデオキシリボヌクレアーゼI(Sigma)を用いて消化した。該細胞を、イーグル最小必須培地と7%小ウシ血清(Hyclone)で、50xgで2分間、3回洗浄した。ペレット化された肝細胞は、冷VIASPAN(登録商標)(腹腔内臓器の保存用の汎用大動脈洗浄および保冷液、ウィスコンシン大学液、またはUWとも称される)に移した。
ウロキナーゼの過剰発現は、いくつかの系において、肝細胞生着を強化することが示されている(Lieber et al.Hum.Gene Ther.6:1029−1037,1995)。したがって、実験を行い、ヒト肝細胞の移植手術前、ウロキナーゼを発現するアデノウイルスの投与が有益であるかどうかを判定した。分泌型のヒトウロキナーゼ(ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子;uPA)を発現するアデノウイルスベクターは、先に説明されている(Lieber et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:6210−6214,1995および米国特許第5,980,886号参照、参照することによって本明細書に組み込まれる)。
前述の肝臓異種再増殖モデルの限界のうちの1つは、生着されたヒト肝細胞をさらに増大させる能力の低下である。該FRGマウス系において、連続移植の実行可能性を試験するために、高度に再増殖した一次受容者の肝臓(約70%ヒト細胞)を潅流し、実質肝細胞を、標準コラゲナーゼ消化プロトコルを用いて採取した。
キメラマウスにおける、ヒト肝臓特異的遺伝子の基底の発現および誘導を、検査した。培養された肝細胞におけるテストステロン代謝およびエトキシレソルフィン−O−デエチラーゼ(EROD)活性の評価を、それぞれ、Kostrubskyら(Drug Metab. Dispos.27:887−894,1999)、およびWenら(Drug Metab.Dispos.30:977−984,2002)に記載されるように実行した。RNA単離、cDNA合成、およびリアルタイムPCRを、Komoroskiら(Drug Metab.Dispos.32:512−518,2004)に記載されるように実行した。Applied Biosystemsから得られたプライマーは、ヒトCYP1A1(Hs00153120_m1)、CYP1A2(Hs00167927_m1)、CYP3A4(Hs00430021_m1)、CYP3A7(Hs00426361_a1)、CYP2B6(Hs00167937_g1)、CYP2D6(Hs00164385_a1)、多剤体制関連タンパク質MRP2(Hs00166123_m1)、胆汁塩輸出ポンプBSEP、(Hs00184829_m1)、CAR(Hs00231959_m1)アルブミン(Hs00609411_m1)、HNF4α(Hs00230853_m1)、シクロフィリン(Hs99999904_m1)、およびマウスアクチン(Ma00607939_s1)に対して特異的であった。
単離された肝細胞の培養物を、構築し、シトクロムP450遺伝子の原型誘導物質に暴露した。該結果は、シトクロム(CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A7)、輸送(BSEP、MRP2)、および薬物抱合酵素(UGT1A1)の基底遺伝子発現レベルは、培養された正常成熟ヒト肝細胞に見られる、まさにそのものであった(図6c、図7)。さらに、ベータナフトフラボン(BNF)、フェノバルビタール(PB)、およびリファンピシン(Rif)のような化合物により誘発された遺伝子型は、正常ヒト細胞から予期されたとおりであった。ヒト薬物代謝遺伝子のmRNA発現レベルに加えて、ヒトCYP1Aおよび3Aファミリーメンバーの酵素活性を測定した。エトキシレソルフィン−O−デエチラーゼ活性(EROD)は、ヒト肝臓において、CYP1A1および1A2により媒介されることが知られている。該結果は、EROD活性が、ヒト化マウス肝臓細胞において、BNFへの事前暴露により特異的かつ堅牢的に誘導されたことを示す(図6a)。逆に、PBまたはリファンピシンへの事前暴露は、CYP3A4を介した代謝の特異的測定である6−ベータ−ヒドロキシルテストステロンへのテストステロンの転換を特異的に誘導した(図6b)。したがって、再増殖したFRG肝臓からの肝細胞は、これらの標準薬物代謝アッセイにおいて、正常成熟ヒト肝細胞との区別がつかなかった。
一次生着は、ウロキナーゼアデノウイルスの事前投与を行っても、100%のFRG受容マウスで生じなかった。FRGマウスにおいて、正常数存在する肝臓マクロファージは、先天性免疫反応を促進することにより、ヒト細胞生着を限定することが可能である。
FRGマウスは、Fah遺伝子のエクソン5(FahΔexon5)に欠失を含む。ヒト肝細胞を、Fah欠損の他のモデルにおいて、生着および増大し得ることを確認するために、Fah遺伝子に点変異を含むマウス株を作製した。Fah点変異(Fahpm)マウスと呼ばれる、これらのマウスは、ミススプライシングを起させFah mRNAにおいて、エクソン7の喪失を生じさせる該Fah遺伝子に点変異を有する(Aponte et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:641−645,2001、参照することにより本明細書に組み込まれる)。表現型における差異は、FahpmマウスとFahΔexon5マウスとの間で検出されなかった。
添付の配列表に記載される核酸およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語、およびアミノ酸の三文字コードを示す。各核酸配列の1本鎖のみを示すが、該相補鎖は、表示された該鎖に言及するときは常にそれに含まれるものとして理解する。添付の配列表において、
配列番号1および2は、ヒトAlu配列を増幅するためのPCRプライマーの核酸配列である。
配列番号9は、ヒトTF順方向RT−PCRプライマーの核酸配列である。
Claims (44)
- 生体内でヒト肝細胞を増大させる方法であって、
i)ヒト肝細胞をRag2−/−/Il2rg−/−マウスに移植するステップであって、前記マウスが、Fahの発現が欠損している、ステップと、
ii)前記ヒト肝細胞を、少なくとも約2週間増大させるステップと、
を含む、方法。 - 前記マウスが、前記Fah遺伝子において、欠失に対してホモ接合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記マウスが、Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/−(FRG)マウスである、請求項2に記載の方法。
- 前記マウスが、前記Fah遺伝子において、点変異に対してホモ接合体である、請求項1に記載の方法。
- 前記マウスが、Fahpm/Rag2−/−/Il2rg−/−(FpmRG)マウスである、請求項4に記載の方法。
- ヒトウロキナーゼをコード化するベクターが、前記ヒト肝細胞を注入する前に、前記マウスに投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターが、静脈内投与される、請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターが、肝細胞注入の約24〜48時間前に投与される、請求項6〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マウスに、肝細胞注入前に、2−(2−ニトロ−4−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル)−1,3 シクロヘキサンジオン(NTBC)が投与される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NTBCが、約0.05mg/kg/日から約0.10mg/kg/日の用量で投与される、請求項13に記載の方法。
- 前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約3日間、NTBCがさらに投与される、請求項13または請求項14に記載の方法。
- 前記マウスに、肝細胞注入後、少なくとも約6日間、NTBCがさらに投与される、請求項13または請求項14に記載の方法。
- NTBCの前記用量が、肝細胞注入後、6日間の過程にわたり漸減される、請求項16に記載の方法。
- 前記NTBCが、飲料水内投与される、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 肝細胞注入前、飲料水内投与されるNTBCの濃度が、約1mg/Lから約8mg/Lである、請求項18に記載の方法。
- 前記NTBCが、食物内投与される、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NTBCが、注入することにより投与される、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、少なくとも約6週間、増大可能である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、最長約6ヶ月間、増大可能である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、前記マウスの脾臓または門脈に注入される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増大されたヒト肝細胞を前記マウスの肝臓から採取するステップをさらに含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト肝細胞が、臓器ドナーの肝臓から単離された、または外科的切除術から単離された、または幹細胞もしくは単球もしくは羊膜細胞に由来した、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記肝細胞は、注入前、凍結保存された、請求項26に記載の方法。
- 肝細胞注入前、前記FRGマウスからマクロファージを減損させるステップをさらに含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- マクロファージを減損させるステップが、化学的減損を含む、請求項28に記載の方法。
- マクロファージを減損させるステップが、マクロファージに特異的に結合する抗体の使用を含む、請求項28に記載の方法。
- 連続移植により採取されたヒト肝細胞を増大させるステップをさらに含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子組み換えマウスであって、そのゲノムは、欠失または点変異が、機能的FAH、RAG−2、およびIL−2Rγタンパク質の発現の喪失をもたらすような、Fah、Rag2、およびIl2rg遺伝子において、前記欠失または1つもしくは複数の点変異に対して、ホモ接合体であり、前記マウスは、免疫不全であり、肝機能の低下を示し、ヒト肝細胞は、前記マウスにおいて、増大させることができる、遺伝子組み換えマウス。
- 前記欠失または点変異が、B細胞、T細胞、およびNK細胞の完全喪失をもたらす、請求項32に記載のマウス。
- 前記マウスが、FRGマウスである、請求項32または33に記載のマウス。
- 前記マウスが、FpmRGマウスである、請求項32または33に記載のマウス。
- 前記マウスが、ヒトウロキナーゼを発現する、請求項32〜35のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記ウロキナーゼが、分泌型のウロキナーゼである、請求項36に記載のマウス。
- 前記ウロキナーゼが、非分泌型のウロキナーゼである、請求項36に記載のマウス。
- ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化する導入遺伝子の取り込みに起因する、請求項36〜38のいずれか1項に記載のマウス。
- ヒトウロキナーゼの発現が、ヒトウロキナーゼをコード化するベクターの投与に起因する、請求項36〜38のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項40に記載のマウス。
- 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項40に記載のマウス。
- 前記ヒト肝細胞が単離されている、請求項1に記載の方法。
- 前記マウスからヒト肝細胞を採取するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
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