ES2895937T3 - Método de expansión de hepatocitos humanos in vivo - Google Patents

Abstract

Un método de expansión de hepatocitos humanos in vivo, que comprende: i) trasplantar hepatocitos humanos aislados en un ratón Rag2-/-/Il2rg-l-, en donde el ratón es deficiente para la expresión de Fah; ii) permitir a los hepatocitos humanos expandirse durante al menos dos semanas; y iii) recolectar hepatocitos humanos del ratón, en donde el ratón es homocigoto para deleciones o una o más mutaciones puntuales en el gen Fah.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de expansión de hepatocitos humanos in vivo

Campo

Esta divulgación está dirigida a un método para expandir hepatocitos humanos, específicamente a métodos que utilizan ratones inmunodeficientes para expandir hepatocitos humanos.

Antecedentes

El hígado es el sitio principal para el metabolismo de compuestos xenobióticos, incluidos los medicamentos. Debido a que muchas enzimas hepáticas son específicas de la especie, es necesario evaluar el metabolismo de los fármacos candidatos mediante el uso de hepatocitos humanos primarios cultivados o su fracción microsomal (Brandon y otros Toxicol. Appl. Pharmacol. 189:233-246, 2003; Gomez-Lechon y otros Curr. DrugMetab. 4:292-312, 2003). Mientras que las fracciones de hepatocitos microsomales pueden usarse para dilucidar algunas funciones metabólicas, otras pruebas dependen de los hepatocitos vivos. Algunos compuestos, por ejemplo, inducen enzimas hepáticas y, por tanto, su metabolismo cambia con el tiempo. Para analizar la inducción enzimática, los hepatocitos no solo deben ser viables, sino también completamente diferenciados y funcionales.

Para el metabolismo de fármacos y otros estudios, los hepatocitos típicamente se aíslan de donantes de órganos cadavéricos y se envían al lugar donde se realizarán las pruebas. La afección (viabilidad y estado de diferenciación) de los hepatocitos de fuentes cadavéricas es muy variable y muchas preparaciones de células son de calidad mínima. La disponibilidad de hepatocitos humanos de alta calidad se ve obstaculizada aún más por el hecho de que no pueden expandirse significativamente en cultivo de tejidos (Runge y otros Biochem. Biophys. Res. Commun.

274:1-3, 2000; Cascio S.M., Artif. Organs 25:529-538, 2001). Después de la siembra en placa, las células sobreviven, pero no se dividen. Los hepatocitos de especies de mamíferos fácilmente disponibles, tales como el ratón, no son adecuados para la prueba de fármacos porque tienen un complemento diferente de enzimas metabólicas y responden de manera diferente en los estudios de inducción. Las células hepáticas humanas inmortales (hepatomas) o los hepatoblastos fetales tampoco son un reemplazo adecuado para las células adultas completamente diferenciadas. Los hepatocitos humanos también son necesarios para estudios en el campo de la microbiología. Muchos virus humanos, tales como los que causan hepatitis, no pueden replicarse en ningún otro tipo de célula. El documento EP1496110 divulga un método de proliferación de hepatocitos humanos que comprende trasplantar hepatocitos humanos en un ratón uPA-Tg/SCID que padece hepatopatía inmunodeficiente. El ratón trasplantado con hepatocitos humanos se administra al menos una vez con un inhibidor del complemento. Un ratón descendiente obtenido al cruzar el ratón que sufre de ratón con hepatopatía inmunodeficiente uPA-Tg/SCID y un ratón transgénico con factor de aceleración de la descomposición (DAF/CD55) se utiliza como el ratón con hepatopatía inmunodeficiente para el trasplante de hepatocitos humanos. Azuma y otros, Nat Biotechnol, v25, N0. 8, pp 903-910, 2007 divulga la expansión de hepatocitos humanos en ratones Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-.

Dadas estas limitaciones, los métodos de expansión de hepatocitos humanos primarios son muy deseables. Por tanto, en el presente documento, se proporciona un sistema robusto para expandir hepatocitos humanos.

Resumen

La invención se define en las reivindicaciones. En el presente documento se proporciona un método de expansión de hepatocitos humanos in vivo. El método incluye inyectar hepatocitos humanos aislados en un ratón inmunodeficiente, lo que permite expandir los hepatocitos y recolectar los hepatocitos humanos.

En varias modalidades, los hepatocitos humanos se administran a un ratón receptor inmunodeficiente, en donde el ratón es además deficiente en fumarilacetoacetato hidrolasa (Fah). En algunas modalidades, el ratón es un ratón Fah-1- /Rag2-/-/Il2rg-1-(FRG). En otras modalidades, el ratón es un ratón Fahpm/Rag2-/- /Il2rg-/-(P mRG). En algunas modalidades de los métodos, se administra al ratón un vector que codifica la uroquinasa humana antes de la inyección de los hepatocitos humanos. En otras modalidades, los macrófagos se agotan del ratón antes de la inyección de hepatocitos.

En algunos ejemplos, los hepatocitos humanos se expanden en el ratón receptor, tal como el ratón FRG o el ratón FpmRG, durante al menos aproximadamente dos semanas. Los hepatocitos humanos expandidos se recogen del ratón receptor. En una modalidad, los hepatocitos humanos aislados se inyectan en el bazo del ratón receptor y los hepatocitos humanos expandidos se recolectan del hígado del ratón. Los hepatocitos recolectados se pueden introducir en otro ratón receptor, tal como un ratón FRG o un ratón FpmRG, para una mayor expansión. Por tanto, el método se puede usar repetidamente para una expansión adicional de los hepatocitos humanos.

En una modalidad de los métodos proporcionados en el presente documento, al ratón deficiente de Fah se le administra un agente que inhibe, previene o retrasa el desarrollo de enfermedad hepática antes de la inyección de hepatocitos. Uno de dichos agentes es 2-(2-nitro-4-trifluoro-metil-benzoil)-1,3 ciclohexanodiona (NTBC). La NTBC, u otro agente adecuado, puede administrarse por cualquier medio adecuado, que incluye, pero limitado a, en el agua de bebida, en la comida o mediante inyección. La NTBC se administra opcionalmente durante al menos aproximadamente tres días hasta al menos aproximadamente seis días después de la inyección de hepatocitos.

En varias modalidades, los hepatocitos humanos se obtienen de un donante de órganos o de una resección quirúrgica del hígado. En algunas modalidades, los hepatocitos humanos se derivan de una célula madre. En modalidades adicionales, los hepatocitos humanos se crioconservan antes de la inyección. En modalidades adicionales, los hepatocitos humanos son de una línea celular de hepatocitos.

También se proporciona en el presente documento un ratón modificado genéticamente cuyo genoma es homocigoto para deleciones o mutaciones puntuales en los genes Fah, Rag2 e Il2rg, de manera que las deleciones o mutaciones puntuales dan como resultado la pérdida de expresión de las proteínas FAH, RAG-2 e IL-2Ry funcionales, en donde el ratón es inmunodeficiente y presenta una función hepática disminuida, y en donde los hepatocitos humanos pueden expandirse en el ratón. En una modalidad, las deleciones dan como resultado la pérdida completa de linfocitos B, linfocitos T y células NK. En otra modalidad, el ratón expresa uroquinasa humana.

Las características y ventajas anteriores y otras de esta descripción serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias modalidades que proceden con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1a es un gráfico que muestra el peso relativo de un ratón FRG triple mutante (#471) y dos compañeros de camada heterocigotos (#469, #470) después del injerto y repoblación por hepatocitos humanos. El ratón FRG mantuvo su peso 6 semanas después del trasplante; sin embargo, los compañeros de camada heterocigotos del gen Il2rg perdieron peso continuamente. La NTBC se administró solo en la primera y cuarta semana, lo que se indica mediante el sombreado. La Figura 1b es una imagen digital de un gel que muestra los productos de amplificación por PCR de la secuencia Alu humana en ADN genómico de hígados de receptores de hepatocitos. Solo los ratones FRG fueron positivos. Las Figuras 1c-e son gráficos que muestran la actividad de la enzima FAH en hígado de ratón de tipo salvaje (Figura 1c), Fah (-/-) (Figura 1d) y humanizado (Figura 1e). La concentración de sustrato FAH disminuyó en el hígado de ratón de tipo salvaje, pero no cambió con el hígado de ratón Fah-/-. El hígado de ratón humanizado mostró una amplia actividad enzimática. La Figura 1f es una imagen digital de la inmunotinción de FAH en un hígado de ratón repoblado que muestra que más del 80 % de los hepatocitos son positivos para FAH (indicado por la tinción oscura y las flechas grandes). La flecha pequeña marca las células FAH negativas. La Figura 1g es una imagen digital de la tinción H&E de la misma sección de hígado, que muestra que los hepatocitos humanos son menos eosinófilos (indicado por la flecha). Aumento original x200.

Las Figuras 2a-h son imágenes digitales de cortes de tejido histológico e inmunohistoquímico de ratones quiméricos. La Figura 2a es una imagen digital que muestra que los hepatocitos humanos positivos para FAH se integraron en tejido de hígado de ratón y no alteraron la microestructura del hígado del receptor. La Figura 2b es una imagen digital que muestra que los hígados quiméricos altamente repoblados también retuvieron la estructura normal. Las Figuras 2c y 2d son imágenes digitales de tinciones H&E que muestran que los grupos de hepatocitos humanos son menos eosinófilos. La Figura 2e es una imagen digital que muestra secciones en serie teñidas para FAH. La Figura 2f es una imagen digital que muestra secciones en serie teñidas para HepPar. La Figura 2g es una imagen digital de una sección de riñón de un ratón altamente repoblado que no muestra destrucción tubular o glomerular incluso 4 meses después del trasplante. La Figura 2h es una imagen digital que muestra hepatocitos humanos FAH positivos en el bazo. Aumento original x100 (Figura 2c), x200 (Figuras 1a, 2b, 2e, 2f y 2g), x400 (Figuras 2d y 2h).

La Figura 3a es una serie de secciones de gel que muestran productos de RT-PCR de hígado de ratón quimérico. Los genes humanos ALB, FAH, TAT, TF, TTR y UGTlAI se expresaron en hígados de ratones quiméricos ((#697 y #785). Se usaron hepatocitos humanos y hepatocitos de ratón como control positivo y negativo, respectivamente. La Figura 3b (trazado normal) y la Figura 3c (trazado logarítmico) son gráficos que muestran la concentración de albúmina humana de sangre de receptores de hepatocitos primarios mediante el uso de ELISA. La concentración umbral del sistema es de aproximadamente 0,005 pg/ml. La Figura 3d (trazado normal) y la Figura 3e (trazado logarítmico) son gráficos que muestran la concentración de albúmina humana de receptores secundarios. El trazado logarítmico muestra que el tiempo de duplicación de la concentración de albúmina es de aproximadamente una semana.

La Figura 4a es un esquema que muestra el esquema de trasplante en serie que comienza con células primarias (recuadro oscuro en el extremo izquierdo). Los recuadros oscuros indican receptores en serie repoblados y los recuadros blancos indican ratones no injertados. Solo se repoblaron 1/4 de los receptores primarios, pero se injertaron los 6 receptores secundarios. La Figura 4b es una imagen digital de un gel que muestra productos de amplificación de PCR de secuencia Alu de hígados de receptores trasplantados en serie. Las Figuras 4c-e son imágenes digitales de hepatocitos analizadas por inmunocitoquímica de FAH que demuestran que más del 70 % de los hepatocitos cultivados de un ratón terciario fueron positivos para FAH. Las Figuras 4f-h son imágenes digitales de secciones de tejido que muestran la inmunohistoquímica de FAH de hígado de ratones trasplantados en serie. Los hígados del receptor primario (Figura 4f), secundario (Figura 4g) y terciario (Figura 4h) fueron repoblados por hepatocitos humanos.

Las Figuras 5a-c son imágenes digitales de inmunocitoquímica anti-albúmina de ratón y anti-FAH de hepatocitos quiméricos de ratón. La mayoría de los hepatocitos de hígado quimérico fueron albúmina de ratón o FAH simple positivo. Las Figuras 5d-f son imágenes digitales de inmunocitoquímica anti-albúmina humana y anti-FAH de hepatocitos quiméricos de ratón. La mayoría de los hepatocitos fueron albúmina humana y FAH doble positivo. Ampliación original x100. Las Figuras 5g-l son gráficos que muestran el análisis citométrico de flujo de hepatocitos de ratones quiméricos. Se usaron anti-HLA A, B, C conjugados con FITC y anti-H-2Kb conjugado con PE. Se muestran hepatocitos humanos controles contra HLA-A, B, C (Figura 5g); hepatocitos de ratón controles contra HLA-A, B, C (Figura 5i); hepatocitos humanos controles contra H-2Kb (Figura 5h); hepatocitos de ratón controles contra H-2Kb (Figura 5j) y hepatocitos de dos ratones altamente quiméricos (Figura 5k y Figura 5l), que fueron individualmente positivos para HLA o H-2Kb.

Las Figuras 6a y 6b son gráficos que muestran el metabolismo de la etoxirresorufina-O-deetilasa (dependiente de CYP1A1) (Figura 6a) y la conversión de testosterona a 6-beta-hidroxiltestosterona (mediada por CYP3A4) (Figura 6b). Se analizaron los hepatocitos cultivados de tres ratones con diferentes niveles de repoblación de hepatocitos humanos (M790 al 10 %; M697 al 30 % y M785 al 60 %). La Figura 6c es un gráfico que representa los niveles de ARNm de genes específicos humanos relevantes para el metabolismo, transporte y conjugación de fármacos, determinados por RT-PCR cuantitativa. Las proporciones de los genes del metabolismo de fármacos humanos son típicas de los hepatocitos humanos adultos.

Las Figuras 7a-h son gráficos que representan los niveles de expresión génica basal de genes específicos de hígado y genes implicados en el metabolismo de fármacos en hepatocitos de tres ratones con diferentes niveles de repoblación de hepatocitos humanos (M790 al 10 %; M697 al 30 % y M785 al 60 %). La Figura 7a es un gráfico de barras de la expresión basal de genes específicos de hígado en las tres muestras, normalizada al ARNm de actina de ratón. Las Figuras 7b-h son gráficos de barras de inducción de ARNm implicados en el metabolismo de fármacos en respuesta a beta-naftoflavona (BNF), fenobarbital (PB) y rifampicina (Rif), en relación con la inducción en cultivos no inducidos. Se muestran CYP3A4 (Figura 7b); CYP2B6 (Figura 7c); CAR (receptor de hormonas nucleares) (Figura 7d); MDR1 (transportador) (Figura 7e); MRP (Figura 7f); BSEP (transportador) (Figura 7g) y PXR (receptor de hormonas nucleares) (Figura 7h). La inducción de CYP3A4 por fenobarbital fue incluso más sorprendente que a nivel enzimático.

Listado de secuencias

Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos enumeradas en la lista de secuencias adjuntas se muestran mediante el uso de abreviaturas de letras estándar para las bases nucleotídicas, y un código de tres letras para los aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero la cadena complementaria se entiende como incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. En el listado de secuencias adjunta:

Las SEQ ID NO: 1 y 2 son las secuencias de ácido nucleico de los cebadores de PCR para amplificar secuencias Alu humanas.

La SEQ ID NO 3 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de ALB humana.

La SEQ ID NO 4 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de ALB humana.

La SEQ ID NO 5 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de Alb de ratón.

La SEQ ID NO 6 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de Alb de ratón.

La SEQ ID NO 7 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de TAT humana.

La SEQ ID NO 8 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de TAT humana.

La SEQ ID NO 9 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de TF humana.

La SEQ ID NO 10 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de TF humana.

La SEQ ID NO 11 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de FAH humana.

La SEQ ID NO 12 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de FAH humana.

La SEQ ID NO 13 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de TTR humana.

La SEQ ID NO 14 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de TTR humana.

La SEQ ID NO 15 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR directa de UGT1A1 humana. La SEQ ID NO 16 es la secuencia de ácido nucleico del cebador de RT-PCR inversa de UGT1A1 humana.

Descripción detallada

I. Abreviaturas

AAV Virus adenoasociado

ALB Albúmina

ALT Alanina aminotransferasa

AST Aspartato aminotransferasa

BNF Beta-naftoflavona

DAB Diaminobencidina

ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

EROD Etoxirresorufina-O-deetilasa

FACS Clasificación celular activada por fluorescencia

FAH Fumarilacetoacetato hidrolasa

FISH Hibridación fluorescente in situ

FITC Isotiocianato de fluoresceína

FRG Ratones triple mutantes Fah-I-IRag2-I-IIl2rg-1-HLA Antígeno leucocitario humano

IL-2R_y Receptor gamma de interleucina-2

MHC Complejo mayor de histocompatibilidad

NTBC 2-(2-nitro-4-trifluoro-metil-benzoil)-1,3 ciclohexanodiona

PB Fenobarbital

PBS Solución salina tamponada con fosfato

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PE Ficoeritrina

PFU Unidades formadoras de placa

RAG Gen activador de recombinasa

Rif Rifampicina

RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

TAT Tirosina aminotransferasa

TF Transferrina

TTR Transtiretina

UGT1A1 Familia de UDP glucuronosiltransferasa 1, polipéptido A1

uPA Activador de plasminógeno de uroquinasa

II. Términos

A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamín Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y otros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (iSb N 0-632-02182-9) y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar la revisión de las diversas modalidades de esta invención, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

Agente que inhibe o previene el desarrollo de la enfermedad hepática: un compuesto o composición que cuando se administra a un ratón FRG, un ratón P mRG u otro tipo de ratón deficiente de Fah, previene, retrasa o inhibe el desarrollo de la enfermedad hepática en el ratón. La enfermedad hepática o disfunción hepática se caracteriza por cualquiera de una serie de signos o síntomas, que incluyen, pero no se limitan a, una alteración en la histología hepática (tales como necrosis, inflamación, displasia o cáncer hepático), una alteración en los niveles de enzimas hepáticas específicas y otras proteínas (tales como aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, bilirrubina, fosfatasa alcalina y albúmina) o insuficiencia hepática generalizada. En una modalidad, el agente que inhibe la enfermedad hepática es 2-(2-nitro-4-trifluoro-metil-benzoil)-1,3 ciclohexanodiona (NTBC).

Amniocito: una célula encontrada en el líquido amniótico que rodea al embrión.

Anticuerpo: una proteína (o complejo de proteínas) que incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o genes de fragmentos de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como también la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez se convierten en las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. La unidad estructural básica de inmunoglobulina (anticuerpo) es generalmente un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par que tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Los términos "cadena ligera variable" (V^l) y "cadena pesada variable" (V^h) se refieren, respectivamente, a estas cadenas ligera y pesada.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpos" incluye inmunoglobulinas intactas, así como también una serie de fragmentos bien caracterizados. Por ejemplo, los Fab, Fv y Fv de cadena única (SCFv) que se unen a la proteína diana (o epítopo dentro de una proteína o proteína de fusión) también serían agentes de unión específicos para esa proteína (o epítopo). Estos fragmentos de anticuerpos se definen como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de unión al antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo producida por digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo obtenido al tratar el anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo; (3) (Fab')², el fragmento del anticuerpo obtenido al tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción posterior; (4) F(ab')² , un dímero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces disulfuro; (5) Fv, un fragmento modificado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y (6) anticuerpo de cadena única, una molécula modificada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unida por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena única fusionada genéticamente. Los métodos para hacer estos fragmentos son rutinarios (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1999).

Los anticuerpos para usar en los métodos de esta divulgación pueden ser monoclonales o policlonales. Simplemente a modo de ejemplo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas murinos de acuerdo con el método clásico de Kohler y Milstein (Nature 256:495-97, 1975) o métodos derivados de los mismos. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales se describen en Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1999.

Linfocito B: un tipo de linfocito que desempeña un papel importante en la respuesta inmune humoral. La función principal de los linfocitos B es producir anticuerpos contra antígenos solubles. Los linfocitos B son un componente esencial del sistema inmune adaptativo.

Recolectar: cómo se usa en el presente documento, "recolectar" hepatocitos humanos expandidos se refiere al proceso de eliminar los hepatocitos expandidos de un ratón que se ha inyectado con hepatocitos humanos aislados (también denominado ratón receptor). La recolección incluye opcionalmente la separación de los hepatocitos de otros tipos celulares. En una modalidad, los hepatocitos humanos expandidos se recolectan del hígado de un ratón deficiente de Fah. En algunos ejemplos, los hepatocitos humanos expandidos se recolectan del hígado de un ratón FRG o un ratón FpmRG.

Cadena ^y común del receptor de interleucina (Il2rg): un gen que codifica la cadena gamma común de receptores de interleucina. La Il2rg es un componente de los receptores para una serie de interleucinas, que incluyen IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15 (Di Santo y otros Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92:377-381, 1995). Los animales deficientes en Il2rg presentan una reducción de los linfocitos B y T y carecen de células asesinas naturales.

Criopreservado: cómo se usa en el presente documento, "criopreservado" se refiere a una célula o tejido que se ha preservado o mantenido mediante enfriamiento a bajas temperaturas bajo cero, tal como 77 K o -196 °C (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). A estas bajas temperaturas, se detiene efectivamente cualquier actividad biológica, que incluye las reacciones bioquímicas que conducirían a la muerte celular.

Disminución de la función hepática: un cambio anormal en cualquiera de una serie de parámetros que miden la salud o función del hígado. La función hepática disminuida también se denomina en el presente documento como "disfunción hepática." La función hepática puede evaluarse por cualquiera de una serie de medios bien conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, examen de histología hepática y medición de enzimas hepáticas u otras proteínas. Por ejemplo, la disfunción hepática puede estar indicada por necrosis, inflamación, daño oxidativo o displasia del hígado. En algunos casos, la disfunción hepática está indicada por cáncer hepático, tal como el carcinoma hepatocelular. Los ejemplos de enzimas y proteínas hepáticas que pueden probarse para evaluar la disfunción hepática incluyen, pero no se limitan a, alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), bilirrubina, fosfatasa alcalina y albúmina. La disfunción hepática también puede resultar en insuficiencia hepática generalizada. Los procedimientos para evaluar la función hepática son bien conocidos en la técnica, tal como los enseñados por Grompe y otros (Genes Dev. 7:2298-2307, 1993) y Manning y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:11928-11933, 1999).

Deficiente: cómo se usa en el presente documento, "deficiente de Fah" o "deficiente en Fah" se refiere a un animal, tal como un ratón, que comprende una mutación en Fah, que da como resultado una disminución sustancial o la ausencia de la expresión del ARNm Fah y/o proteína FAH funcional. En una modalidad, el animal deficiente de Fah comprende deleciones homocigóticas en el gen Fah. Como ejemplo, la deleción homocigótica está en el exón 5 de Fah. En otra modalidad, el animal deficiente en Fah comprende una o más mutaciones puntuales en el gen Fah. Se conocen en la técnica ejemplos de mutaciones puntuales de Fah adecuadas (véase, por ejemplo, Aponte y otros Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98(2):641-645, ^{2 0} O¹.

Agotar: Reducir o eliminar. Como se usa en el presente documento, "agotamiento de macrófagos" se refiere al proceso de eliminar, remover, reducir o matar macrófagos en un animal. Un animal al que se ha agotado de macrófagos no está necesariamente desprovisto por completo de macrófagos, pero al menos presenta una reducción en el número o la actividad de los macrófagos. En una modalidad, el agotamiento de macrófagos da como resultado al menos un 10 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 90 % o un 100 % de reducción en macrófagos funcionales.

Injerto: Para implantar células o tejidos en un animal. Como se usa en el presente documento, el injerto de hepatocitos humanos en un ratón receptor se refiere al proceso de implantación de hepatocitos humanos en el ratón receptor después de la inyección. Los hepatocitos humanos injertados son capaces de expandirse en el ratón receptor. Como se describe en el presente documento, "injerto significativo" se refiere a un ratón receptor en donde al menos aproximadamente el 1 % de los hepatocitos en el hígado son humanos. Un ratón "altamente injertado" es uno que tiene un hígado en donde al menos aproximadamente el 30 % de los hepatocitos son humanos. Sin embargo, la eficiencia del injerto puede ser mayor, tal como al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 % de los hepatocitos en el hígado de ratón son hepatocitos humanos.

Células madre embrionarias (ES): células pluripotentes aisladas de la masa celular interna del blastocisto en desarrollo. Las células ES son células pluripotentes, lo que significa que pueden generar todas las células presentes en el cuerpo (huesos, músculos, células cerebrales, etc.). Los métodos para producir células ES murinas pueden encontrarse en la Patente de Estados Unidos No. 5,670,372.

Expandir: Para aumentar en cantidad. Como se usa en el presente documento, "expandir" los hepatocitos humanos se refiere al proceso de permitir que se produzca la división celular de manera que aumente el número de hepatocitos humanos. Como se describe en el presente documento, se permite que los hepatocitos humanos se expandan en un ratón receptor durante al menos aproximadamente cuatro semanas, al menos aproximadamente seis semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, al menos aproximadamente 24 semanas o al menos aproximadamente 28 semanas. En una modalidad, se permite que los hepatocitos humanos se expandan durante hasta aproximadamente 6 meses. El número de hepatocitos humanos que resulta de la expansión puede variar. En una modalidad, la expansión da como resultado al menos 10 millones, al menos 20 millones, al menos 30 millones, al menos 40 millones o al menos 50 millones de hepatocitos. Al suponer que se inyectan inicialmente un millón de hepatocitos y aproximadamente un 10 % de injerto, la expansión de los hepatocitos puede variar desde aproximadamente 10 veces hasta aproximadamente 500 veces. En algunas modalidades, la expansión de hepatocitos humanos en un ratón receptor da como resultado un aumento de al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces, al menos 250 veces, al menos 300 veces, al menos 400 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces.

Ratón FRG: un ratón mutante que tiene deleciones homocigóticas en la fumarilacetoacetato hidrolasa (Fah), el gen activador de recombinasa 2 (Rag2) y la cadena y común de los genes del receptor de interleucina (Il2rg). También se conoce en el presente documento como Fah-l-/Rag2-l-/Il2rg-1-. Como se usa en el presente documento, las deleciones homocigóticas en los genes Fah, Rag2 e Il2rg indican que no se expresa la proteína FAH, RAG-2 e IE-2Ry funcional en ratones que comprenden las mutaciones.

Ratón FpmRG: un ratón mutante que tiene deleciones homocigóticas en el gen activador de recombinasa 2 (Rag2) y la cadena y común de los genes del receptor de interleucina (Il2rg) y mutaciones puntuales homocigóticas en la fumarilacetoacetato hidrolasa (Fah). La mutación puntual en el gen Fah de los ratones FpmRG da como resultado un corte y empalme incorrecto y la pérdida del exón 7 en el ARNm (Aponte y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98:641-645, 2001). También denominado en el presente documento como Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-1-. Como se usa en el presente documento, las deleciones homocigóticas en los genes Rag2 e Il2rg indican que no se expresa la proteína RAG-2 e IL-2Ry funcional en ratones que comprenden las mutaciones. Además, los ratones que tienen mutaciones puntuales homocigóticas en el gen Fah no expresan la proteína FAH funcional.

Fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH): una enzima metabólica que cataliza la última etapa del catabolismo de la tirosina. Los ratones que tienen una deleción homocigótica del gen Fah presentan una expresión alterada del ARNm del hígado y una disfunción hepática grave (Grompe y otros Genes Dev. 7:2298-2307, 1993). También se ha demostrado que las mutaciones puntuales en el gen Fah causan insuficiencia hepática y letalidad posnatal (Aponte y otros Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98(2):641-645, 2001).

Reducido gradualmente: cómo se usa en el presente documento, "reducir gradualmente" la dosis de NTBC se refiere al proceso de disminuir la dosis de NTBC administrada a ratones deficientes de Fah a lo largo del tiempo, tal como en el transcurso de varios días. En una modalidad, la dosis de NTBC se reduce gradualmente durante un período de aproximadamente seis días, en donde la dosis se reduce a intervalos de aproximadamente uno o dos días de manera que después de aproximadamente una semana, ya no se administra NTBC. La reducción gradual en NTBC puede realizarse durante un período de tiempo más corto o más largo y los intervalos de tiempo entre disminuciones de dosis también pueden ser más cortos o más largos.

Hepatocito: un tipo de célula que constituye el 70-80 % de la masa citoplasmática del hígado. Los hepatocitos están implicados en la síntesis de proteínas, almacenamiento de proteínas y transformación de carbohidratos, síntesis de colesterol, sales biliares y fosfolípidos, y desintoxicación, modificación y excreción de sustancias exógenas y endógenas. El hepatocito también inicia la formación y secreción de bilis. Los hepatocitos fabrican albúmina sérica, fibrinógeno y el grupo de la protrombina de factores de coagulación y son el sitio principal para la síntesis de lipoproteínas, ceruloplasmina, transferrina, complemento y glicoproteínas. Además, los hepatocitos tienen la capacidad de metabolizar, desintoxicar e inactivar compuestos exógenos tales como fármacos e insecticidas y compuestos endógenos tales como esteroides.

Homocigoto: que tiene alelos idénticos en uno o más loci. Como se usa en el presente documento, "homocigoto para deleciones" se refiere a un organismo que tiene deleciones idénticas de ambos alelos de un gen.

Inmunodeficiente: carece de al menos una función esencial del sistema inmune. Como se usa en el presente documento, un ratón "inmunodeficiente" es uno que carece de componentes específicos del sistema inmune o que carece de la función de componentes específicos del sistema inmune. En una modalidad, un ratón inmunodeficiente carece de linfocitos B, linfocitos T y/o células NK funcionales. En otra modalidad, un ratón inmunodeficiente carece además de macrófagos.

Aislado: un hepatocito "aislado" se refiere a un hepatocito que se ha obtenido de una fuente particular, tal como un donante de órganos, y sustancialmente separado o purificado de otros tipos de células.

Macrófago: una célula dentro de los tejidos que se origina de glóbulos blancos específicos denominados monocitos. Los monocitos y macrófagos son fagocitos, que actúan tanto en la defensa inespecífica (o inmunidad innata) como en la defensa específica (o inmunidad mediada por células) de los animales vertebrados. Su función es fagocitar (engullir y luego digerir) los desechos celulares y los patógenos, ya sea como células estacionarias o móviles y estimular a los linfocitos y otras células inmunes para que respondan al patógeno.

Célula asesina natural (NK): una forma de linfocito citotóxico que constituye un componente principal del sistema inmune innato. Las células NK juegan un papel importante en el rechazo del huésped tanto de tumores como de células infectadas por virus.

Receptor: cómo se usa en el presente documento, un "ratón receptor" es un ratón al que se le han inyectado los hepatocitos humanos aislados descritos en el presente documento. Típicamente, una parte (el porcentaje puede variar) de los hepatocitos humanos se injerta en el ratón receptor. En una modalidad, el ratón receptor es un ratón inmunodeficiente que es además deficiente en Fah. En otra modalidad, el ratón receptor es un ratón Rag2-1-/Il2rg-1- que es además deficiente en Fah. En otra modalidad, el ratón receptor es un ratón FRG. En otra modalidad, el ratón receptor es un ratón FpmRG.

Gen activador de recombinasa 2 (Rag2): un gen implicado en la recombinación de inmunoglobulinas y loci de receptores de linfocitos T. Los animales deficientes en el gen Rag2 no pueden someterse a la recombinación V(D)J, lo que resulta en una pérdida completa de linfocitos T y linfocitos B funcionales (Shinkai y otros Cell 68:855-867, 1992).

Trasplante en serie: el proceso para expandir hepatocitos humanos in vivo en que los hepatocitos expandidos en un primer ratón se recolectan y trasplantan, tal como mediante inyección, a un ratón secundario para su posterior expansión. El trasplante en serie puede incluir además ratones terciarios, cuaternarios o adicionales.

Célula madre: célula que tiene la capacidad única de producir células hijas inalteradas (autorrenovación; la división celular produce al menos una célula hija que es idéntica a la célula madre) y de dar lugar a tipos de células especializadas (potencia). Las células madre incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias (ES), células germinales embrionarias (EG) no humanas, células madre de línea germinal (GS) no humanas, células madre mesenquimatosas humanas (hMSC), células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), células progenitoras adultas multipotentes (MAPC), células madre de línea germinal adultas multipotentes (maGSC) y células madre somáticas no restringidas (USSC). El papel de las células madre in vivo es reemplazar las células que se destruyen durante la vida normal de un animal. Generalmente, las células madre pueden dividirse sin límite. Después de la división, la célula madre puede permanecer como una célula madre, convertirse en una célula precursora o proceder a la diferenciación terminal. Una célula precursora es una célula que puede generar una célula funcional completamente diferenciada de al menos un tipo de célula determinado. Generalmente, las células precursoras pueden dividirse. Después de la división, una célula precursora puede ser aún una célula precursora o puede proceder a la diferenciación terminal. En una modalidad, las células madre dan lugar a hepatocitos.

Linfocito T: tipo de glóbulo blanco o linfocito que desempeña un papel central en la inmunidad mediada por células. Los linfocitos T se distinguen de otros tipos de linfocitos, como los linfocitos B y las células NK, por la presencia de un receptor especial en su superficie celular que se llama receptor de linfocitos T (TCR). Generalmente se cree que el timo es el órgano principal para el desarrollo de los linfocitos T.

Transgén: una secuencia exógena de ácidos nucleicos introducida en una célula o en el genoma de un organismo.

Animal transgénico: un animal no humano, generalmente un mamífero, que tiene una secuencia de ácido nucleico no endógena (heteróloga) presente como un elemento extracromosómico en una parte de sus células o integrado de manera estable en su línea germinal de ADN (es decir, en la secuencia genómica de la mayoría o de todas sus células). El ácido nucleico heterólogo se introduce en la línea germinal de dichos animales transgénicos mediante manipulación genética de, por ejemplo, embriones o células madre embrionarias del animal huésped de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Un "transgén" se refiere a dicho ácido nucleico heterólogo, tal como, ácido nucleico heterólogo en forma de un constructo de expresión (tal como para la producción de un animal transgénico con "genes activados") o un ácido nucleico heterólogo que tras la inserción dentro o adyacente a un gen diana da como resultado una disminución en la expresión del gen diana (tal como para la producción de un animal transgénico con "genes inactivados"). Un "gen inactivado" de un gen significa una alteración en la secuencia del gen que da como resultado una disminución de la función del gen diana, preferentemente de manera que la expresión del gen diana sea indetectable o insignificante. Los animales transgénicos con genes inactivados pueden comprender una inactivación heterocigótica de un gen diana o una inactivación homocigótica de un gen diana. Los "genes inactivados" también incluyen genes inactivados condicionales, en los que puede producirse una alteración del gen diana tras, por ejemplo, la exposición del animal a una sustancia que promueve la alteración del gen diana, la introducción de una enzima que promueve la recombinación en el sitio del gen diana (por ejemplo, Cre en el sistema Cre-lox), u otro método para dirigir la alteración del gen diana postnatalmente.

Vector: una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de un ácido nucleico extraño sin interrumpir la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula huésped. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector puede incluir, además, uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Un vector de integración es capaz de integrarse a sí mismo en un ácido nucleico del huésped. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y traducción del gen o genes insertados. En una modalidad descrita en el presente documento, el vector comprende una secuencia que codifica uroquinasa, tal como uroquinasa humana. En una modalidad, el vector es un vector plasmídico. En otra modalidad, el vector es un vector viral, tal como un vector de adenovirus o un vector de virus adenoasociado (AAV).

Uroquinasa: También denominada activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA), la uroquinasa es una serina proteasa. La uroquinasa se aisló originalmente de la orina humana, pero está presente en varios lugares fisiológicos, como el torrente sanguíneo y la matriz extracelular. El sustrato fisiológico primario es el plasminógeno, que es una forma zimógena inactiva de la serina proteasa plasmina. La activación de la plasmina desencadena una cascada proteolítica que, en dependencia del entorno fisiológico, participa en la trombólisis o degradación de la matriz extracelular. En una modalidad de los métodos proporcionados en el presente documento, se administra uroquinasa a un ratón receptor antes de la inyección de hepatocitos. En algunas modalidades, la uroquinasa es uroquinasa humana. En algunas modalidades, la uroquinasa humana es la forma secretada de uroquinasa. En algunas modalidades, la uroquinasa humana es una forma modificada, no secretada de uroquinasa (véase, la Patente de Estados Unidos No. 5,980,886).

A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente el experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Los términos singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, "que comprende A o B" significa que incluye A, o B, o A y B. Debe entenderse además que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan a modo de descripción. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

III. Resumen de varias modalidades

En el presente documento se proporciona un método robusto de expansión de hepatocitos humanos in vivo. El método comprende trasplantar hepatocitos humanos aislados en un ratón inmunodeficiente que es deficiente en la enzima catabólica de tirosina fumarilacetoacetato hidrolasa (Fah). En una modalidad, el ratón inmunodeficiente es un ratón Rag2~/iIl2rg~/~. En una modalidad, el ratón deficiente de Fah comprende una deleción homocigótica de Fah. En otra modalidad, el ratón deficiente de Fah comprende una o más mutaciones puntuales en Fah, de manera que la función y/o producción de la proteína se reduce sustancialmente. Como se describe en el presente documento, un ratón triple mutante deficiente para Fah, gen activador de recombinasa 2 (Rag2) y la cadena gamma común del receptor de interleucina (Il2rg), proporciona un sistema in vivo eficaz para expandir hepatocitos humanos in vivo. En algunas modalidades, el ratón es un ratón Fah~/~/Rag2~/iIl2rg '/~ (FRG). En algunas modalidades, el ratón es un ratón Fahpm/Rag2-/1Il2rg-/-(P mRG).

En el presente documento se divulga un método de expansión de hepatocitos humanos in vivo que comprende trasplantar hepatocitos humanos aislados, tal como mediante inyección, en un ratón inmunodeficiente y deficiente de Fah (también denominado ratón receptor), permitir a los hepatocitos humanos expandirse durante al menos aproximadamente dos semanas y recolectar los hepatocitos humanos expandidos del ratón. Los hepatocitos pueden trasplantarse mediante el uso de cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En una modalidad, los hepatocitos humanos aislados se trasplantan, tal como mediante inyección, en el bazo del ratón receptor. En otra modalidad, los hepatocitos humanos expandidos se recolectan del hígado del ratón receptor. Se permite expandir los hepatocitos humanos en el ratón receptor durante un período de tiempo suficiente para permitir la expansión de los hepatocitos humanos. El período preciso de tiempo para la expansión puede determinarse empíricamente con experimentación rutinaria. En una modalidad, se permite expandir los hepatocitos humanos durante hasta seis meses. En otra modalidad, se permite expandir los hepatocitos humanos durante al menos aproximadamente cuatro semanas, al menos aproximadamente seis semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, al menos aproximadamente 24 semanas o al menos aproximadamente 28 semanas. El grado de expansión de los hepatocitos puede variar. En algunas modalidades, la expansión de hepatocitos humanos en un ratón receptor da como resultado un aumento de al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 150 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 250 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces.

También se proporciona un método de expansión de hepatocitos humanos in vivo en donde a un ratón receptor se le administra un vector que codifica un gen uroquinasa antes de la inyección de los hepatocitos humanos. En una modalidad, el gen uroquinasa es uroquinasa humana. La uroquinasa de tipo salvaje es una proteína secretada. Por tanto, en algunas modalidades, la uroquinasa humana es una forma secretada de uroquinasa (Nagai y otros, Gene 36:183-188, 1985). Las secuencias para uroquinasa humana (forma secretada) son conocidas en la técnica, tal como, pero sin limitarse a, los números de acceso de GenBank AH007073 (depositado el 3 de agosto de 1993), D11143 (depositado el 9 de mayo de 1996), A18397 (depositado el 21 de julio de 1994), BC002788 (depositado el 19 de agosto de 2003), X02760 (depositado el 21 de abril de 1993), BT007391 (depositado el 13 de mayo de 2003), NM_002658 (depositado el 1 de octubre de 2004) y X74039 (depositado el 20 de febrero de 1994).

En algunas modalidades, la uroquinasa humana es una forma no secretada modificada de uroquinasa. Por ejemplo, Lieber y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. 92:6210-6214, 1995) describen formas no secretadas de uroquinasa generadas al insertar una secuencia que codifica una señal de retención del retículo endoplásmico en el extremo carboxilo terminal de la uroquinasa, o al reemplazar el péptido señal pre-uPA con la señal de retención RR amino terminal (Strubin y otros, Cell 47:619-625, 1986; Schutze y otros, EMBO J. 13:1696-1705, 1994) y el ancla transmembrana separada por un péptido espaciador de la proteína de membrana II Iip33 (Strubin y otros, Cell 47:619-625, 1986). Las formas no secretadas de uroquinasa también se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5,980,886.

El vector que codifica la uroquinasa puede ser cualquier tipo de vector adecuado para el suministro a un ratón y capaz de expresar el gen de uroquinasa. Dichos vectores incluyen vectores virales o vectores plasmídicos. En una modalidad, el vector es un vector de adenovirus. En otra modalidad, el vector es un vector de AAV. El vector que codifica la uroquinasa puede administrarse mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En una modalidad, el vector se administra por vía intravenosa. En un aspecto, el vector se administra mediante inyección retroorbital. El vector que codifica la uroquinasa puede administrarse en cualquier momento antes de la inyección de los hepatocitos humanos. Típicamente, el vector se administra para dejar tiempo suficiente para que se exprese la uroquinasa. En una modalidad, el vector se administra de 24 a 48 horas antes de la inyección de hepatocitos.

Se proporciona además en el presente documento un método de expansión de hepatocitos humanos in vivo en donde el ratón receptor está agotado de macrófagos antes de la inyección de los hepatocitos humanos. En una modalidad, al ratón receptor se le administra un vector que codifica uroquinasa antes del agotamiento de los macrófagos. En otra modalidad, al ratón receptor se le administra un vector que codifica uroquinasa después del agotamiento de los macrófagos. En otra modalidad, al ratón receptor agotado de macrófagos no se le administra un vector que codifica uroquinasa. Los macrófagos pueden eliminarse del ratón receptor mediante el uso de uno cualquiera de una serie de métodos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, mediante el uso de una sustancia química o un anticuerpo. Por ejemplo, los macrófagos pueden eliminarse mediante la administración de un antagonista, tal como una sustancia tóxica, que incluye C12MDP, o anticuerpos que alteran el desarrollo, la función y/o la viabilidad de los macrófagos. La administración de antagonistas se realiza mediante técnicas bien conocidas, que incluyen el uso de liposomas, tal como se describe en la Patente Europea No. 1552740. Los liposomas que contienen clodronato también pueden usarse para agotar los macrófagos como se describe en van Rijn y otros (Blood 102:2522-2531, 2003).

En una modalidad de los métodos descritos en el presente documento, antes de la inyección de hepatocitos, al ratón deficiente de Fah se le administra un agente que inhibe, retrasa o previene el desarrollo de la enfermedad hepática en el ratón. El agente puede ser cualquier compuesto o composición conocida en la técnica para inhibir la enfermedad hepática. En dicho agente hay 2-(2-nitro-4-trifluoro-metil-benzoil)-1,3 ciclohexanodiona (NTBC). Se administra NTBC para regular el desarrollo de la enfermedad hepática en el ratón deficiente de Fah. La dosis, el programa de administración y el método de administración pueden ajustarse según sea necesario para prevenir la disfunción hepática en el ratón deficiente de Fah. En una modalidad, la NTBC se administra a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg/día a aproximadamente 0,50 mg/kg/día. En otra modalidad, la NTBC se administra a una dosis de aproximadamente 0,05 mg/kg/día a aproximadamente 0,10 mg/kg/día, tal como aproximadamente 0,05 mg/kg/día, aproximadamente 0,06 mg/kg/día, aproximadamente 0,07 mg/kg/día, aproximadamente 0,08 mg/kg/día, aproximadamente 0,09 mg/kg/día o aproximadamente 0,10 mg/kg/día. La NTBC puede administrarse antes de la inyección de hepatocitos humanos y/o un período de tiempo seleccionado después de la inyección de hepatocitos. La NTBC pueden retirarse o volver a administrar según sea necesario durante el tiempo de expansión de los hepatocitos. En una modalidad, al ratón deficiente de Fah se le administra NTBC antes de la inyección de hepatocitos y durante al menos aproximadamente tres días después de la inyección de hepatocitos. En otra modalidad, al ratón deficiente de Fah se le administra NTBC antes de la inyección de hepatocitos y durante al menos aproximadamente seis días después de la inyección de hepatocitos. En un aspecto, la dosis de NTBC se reduce gradualmente en el transcurso de un período de seis días después de la inyección de hepatocitos. La NTBC puede administrarse por cualquier medio adecuado, tal como, pero limitado a, en el agua de bebida, en la comida o mediante inyección. En una modalidad, la concentración de NTBC administrada en el agua potable antes de la inyección de hepatocitos es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 mg/L, tal como aproximadamente 1 mg/L, aproximadamente 2 mg/L, aproximadamente 3 mg/L, aproximadamente 4 mg/L, aproximadamente 5 mg/L, aproximadamente 6 mg/L, aproximadamente 7 mg/L o aproximadamente 8 mg/L. En otra modalidad, la concentración de NTBC administrada en el agua potable antes de la inyección de hepatocitos es de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/L, tal como aproximadamente 1,0 mg/L, aproximadamente 1,2 mg/L, aproximadamente 1,4 mg/L, aproximadamente 1,6 mg/L, aproximadamente 1,8 mg/L o aproximadamente 2,0 mg/L.

Los hepatocitos humanos aislados pueden obtenerse de una cualquiera de una serie de fuentes diferentes. En una modalidad, los hepatocitos humanos se aislaron del hígado de un donante de órganos. En otra modalidad, los hepatocitos humanos se aislaron de una resección quirúrgica. En otra modalidad, los hepatocitos humanos se derivaron de una célula madre, tal como una célula madre embrionaria, una célula madre derivada de mesenquimales, una célula madre derivada de tejido adiposo, una célula progenitora adulta multipotente o una célula madre somática no restringida. En otra modalidad, los hepatocitos humanos se derivaron de monocitos o amniocitos, por lo que se obtiene una célula madre o célula progenitora in vitro para producir hepatocitos. En otra modalidad, los hepatocitos humanos se criopreservaron antes de la inyección.

Se proporciona además en el presente documento un método de trasplante en serie de hepatocitos humanos en el ratón receptor deficiente de Fah. El método comprende recolectar los hepatocitos humanos expandidos de un primer ratón receptor y expandir además los hepatocitos en un segundo, tercer, cuarto o más ratón receptor. Los hepatocitos humanos pueden recolectarse de un ratón mediante el uso de una cualquiera de una serie de técnicas. Por ejemplo, los hepatocitos pueden recolectarse al perfundir el hígado del ratón, seguido de un triturado suave, como se describe en los ejemplos siguientes. Además, los hepatocitos pueden separarse de otros tipos de células, tejidos y/o desechos mediante el uso de métodos bien conocidos, tales como mediante el uso de un anticuerpo que reconoce específicamente células humanas o hepatocitos humanos. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan а, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno principal de histocompatibilidad de clase I, tal como anti-HLA-A, B, C (Markus y otros Cell Transplantation 6:455-462, 1997). Los hepatocitos unidos a anticuerpos pueden separarse luego mediante cribado (que utiliza un anticuerpo monoclonal unido a una matriz sólida), clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), separación mediante perlas magnéticas o similares. Los métodos alternativos de recolección de hepatocitos son bien conocidos en la técnica.

También se proporciona en el presente documento un ratón modificado genéticamente cuyo genoma es homocigoto para deleciones o mutaciones puntuales en los genes Fah, Rag2 e Il2rg, de manera que las deleciones o mutaciones puntuales dan como resultado la pérdida de expresión de las proteínas FAH, RAG-2 e IL-2R y funcionales, en donde el ratón es inmunodeficiente y presenta una función hepática disminuida, y en donde los hepatocitos humanos pueden expandirse en el ratón. En una modalidad, las deleciones dan como resultado la pérdida completa de linfocitos B, linfocitos T y células NK. En otra modalidad, el ratón expresa uroquinasa. En una modalidad, la uroquinasa es uroquinasa humana. En un aspecto, la expresión de uroquinasa da como resultado la incorporación de un transgén que codifica uroquinasa. En otro aspecto, la expresión de uroquinasa da como resultado la administración de un vector que codifica uroquinasa, tal como una forma secretada o no secretada de uroquinasa. El vector que codifica la uroquinasa puede ser cualquier tipo de vector adecuado para el suministro a un ratón y capaz de expresar el gen de uroquinasa. En una modalidad, el vector es un vector de adenovirus. En otra modalidad, el vector es un vector de A^a V. En algunas modalidades, el ratón es un ratón FRG. En algunas modalidades, el ratón es un ratón FpmRG.

IV. Cepa de ratón genéticamente modificada para la expansión de hepatocitos humanos

Varios grupos han intentado injertar y expandir hepatocitos humanos primarios en roedores (Patente de Estados Unidos No. 6,509,514; Publicación de PCT No. WO 01/07338; Publicación de EE.UU. No. 2005-0255591). Dandri y otros (Hepatology 33:981-988, 2001) fueron los primeros en informar sobre la repoblación exitosa de hígados de ratón con hepatocitos humanos. Desde entonces, otros grupos han informado sobre el injerto exitoso de células hepáticas humanas en ratones. En todos estos estudios, los animales usados fueron animales transgénicos que expresan el activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) bajo el control transcripcional de un promotor de albúmina (Sandgren y otros Cell 66:245-256, 1991). La sobreexpresión de uPA provoca una alteración metabólica que conduce a la muerte celular de los hepatocitos de ratón sin afectar a los hepatocitos humanos trasplantados, que no expresan el transgén. El transgén alb-uPA se cruzó sobre varias informaciones previa de inmunodeficientes para evitar el rechazo de las células humanas (Tateno y otros Am. J. Pathol. 165:901-912, 2004; Katoh y otros J. Pharm. Sci. 96:428-437, 2007; Turrini y otros Transplant. Proc. 38:1181-1184, 2006).

Si bien se han informado niveles de injerto de hasta el 70 % en estos modelos, el sistema tiene varias desventajas importantes que han impedido el uso generalizado. Primero, el transgén alb-uPA se inactiva o se pierde temprano en la vida. Por esta razón, es necesario trasplantar células humanas muy temprano (14 días de edad) y usar ratones que sean homocigotos para el transgén. Esta estrecha ventana de tiempo de trasplante restringe severamente la flexibilidad del modelo. Segundo, la inactivación espontánea del transgén crea un conjunto de hepatocitos de ratón sanos, negativos al transgén. Estos hepatocitos murinos revertidos compiten eficazmente con las células humanas durante la repoblación. Por tanto, no es posible repoblar receptores secundarios tras el trasplante en serie de células humanas. Tercero, la enfermedad hepática tiene un inicio muy temprano en este modelo, lo que reduce la viabilidad de los ratones transgénicos. En consecuencia, es difícil criar un número suficiente de animales de experimentación. Además, los ratones transgénicos tienen una tendencia al sangrado que aumenta la mortalidad durante la cirugía. Finalmente, los animales transgénicos alb-uPA desarrollan enfermedad renal una vez que la repoblación con células humanas supera el 50 %. Se cree que esto se debe a la acción del complemento humano sobre el epitelio renal. Para obtener niveles muy altos de injerto humano es necesario tratar a los ratones trasplantados con un inhibidor de la proteasa anticomplemento (Tateno y otros Am. J. Pathol. 165:901-912, 2004). Debido a estas muchas limitaciones, es muy deseable un sistema más robusto para expandir los hepatocitos humanos.

En el presente documento se describe un método altamente eficaz para expandir hepatocitos humanos in vivo mediante el uso de un ratón modificado genéticamente que tiene una combinación única de deleciones de genes. El injerto y la expansión exitosos de los hepatocitos humanos en el hígado de ratón requieren un ratón inmunodeficiente con cierto grado de disfunción hepática. Los hígados de ratón se han repoblado con hepatocitos humanos en una variedad de diferentes tipos de ratones inmunodeficientes, que incluyen los ratones con genes inactivados para RAG-2 o SCID, los cuales carecen de linfocitos B y linfocitos T (Patente de Estados Unidos No. б, 509,514; Publicación de PCT No. WO 01/07338; Publicación de EE.UU. No. 2005-0255591). Para lograr la disfunción hepática, se cruzaron ratones inmunodeficientes con ratones transgénicos con activador de plasminógeno de uroquinasa (uPA). La expresión de uPA en el hígado del ratón crea una desventaja de crecimiento para los hepatocitos del ratón, lo que facilita la expansión de los hepatocitos humanos trasplantados (Publicación de PCT No.

WO 01/07338). Para evitar las limitaciones del transgén uPA, se analizaron los ratones deficientes de Fah para su capacidad de permitir la expansión de los hepatocitos humanos. La FAH es una enzima metabólica que cataliza la última etapa del catabolismo de la tirosina. Los ratones que tienen una deleción homocigótica del gen Fah presentan una expresión alterada del ARNm del hígado y una disfunción hepática grave (Grompe y otros Genes Dev. 7:2298-2307, 1993).

Cuando la mutación Fah se cruzó con información previa de desnudos o Rag1-1-(Mombaerts y otros Cell 68:869-877, 1992), la repoblación del hígado de ratón con hepatocitos humanos no tuvo éxito, probablemente debido al rechazo inmune. Al cruzar ratones deficientes de Fah con ratones NOD/SCID (Dick y otros Stem Cell 15:199-203, 1997) produjeron ratones en los que se observó un injerto ocasional de hepatocitos humanos; sin embargo, estos animales desarrollaron insuficiencia hepática rápida, posiblemente debido al defecto de reparación del ADN de rotura de doble cadena presente en ratones SCID. Se divulga en el presente documento que ratones triple mutantes Fah-l-/Rag2/-/Il2rg-/-(FRG) carecen de linfocitos T, linfocitos B y células NK. Los ratones Rag2-/-/Il2rg-/- son conocidos en la técnica (Traggiai y otros Science 304:104-107, 2004; Gorantla y otros J. Virol. 81:2700-2712, 2007).

Como se describe en los ejemplos siguientes, el injerto y la expansión de hepatocitos humanos es sorprendentemente muy eficaz en ratones FRG. Por ejemplo, un ratón FRG puede inyectarse con un millón de hepatocitos humanos aislados. Al suponer una eficacia del 10 %, 100 000 hepatocitos humanos se injertan en el ratón receptor. Un rendimiento medio de un ratón FRG después de la expansión es de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 millones de hepatocitos humanos, lo que equivale a un aumento de 300 a 450 veces en los hepatocitos humanos. Los ratones fRg también pueden usarse para el trasplante en serie de hepatocitos humanos. El trasplante en serie puede implicar múltiples ratones y puede resultar en al menos aproximadamente 150 veces la expansión de hepatocitos humanos por ratón.

Cualquier ratón inmunodeficiente que comprenda una deficiencia de Fah es adecuado para los métodos descritos en el presente documento. En una modalidad, el ratón es un ratón Rag2-/-/Il2rg-/- que también es deficiente en Fah. El ratón deficiente de Fah puede comprender, por ejemplo, deleciones homocigóticas en Fah, o una o más mutaciones puntuales en Fah. La deficiencia de Fah (tal como mediante mutación puntual o deleción homocigótica) da como resultado una disminución sustancial o la ausencia de expresión del ARNm de Fah y/o proteína FAH funcional. Además del ratón FRG, se describe en el presente documento que un ratón inmunodeficiente (Rag2-/-/Il2rg-/-) homocigótico para una mutación puntual en el gen Fah (denominado en el presente documento ratón FpmRG) también es un ratón adecuado para el injerto y la expansión de hepatocitos humanos in vivo.

V. Aislamiento y liberación de hepatocitos humanos

Una ventaja significativa de usar ratones deficientes de Fah para la expansión in vivo de hepatocitos humanos es la capacidad de injertar los ratones con hepatocitos humanos derivados de una variedad de fuentes. Como se describe en los ejemplos siguientes, los hepatocitos humanos pueden derivarse de donantes de cadáveres o resecciones de hígado, o pueden obtenerse de fuentes comerciales. Además, como se muestra en el presente documento, los ratones fRg pueden trasplantarse con éxito con hepatocitos humanos de donantes de todas las edades o con hepatocitos criopreservados. A menudo hay un retraso (típicamente de 1 a 2 días) entre el aislamiento de los hepatocitos humanos y el trasplante, lo que puede resultar en una mala viabilidad de los hepatocitos. Sin embargo, el sistema de ratón ^f R^g es capaz de expandir hepatocitos humanos incluso cuando se injertan con hepatocitos de viabilidad limitada.

Los métodos para aislar hepatocitos humanos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para aislar hepatocitos humanos de donantes de órganos o resecciones hepáticas se describen en las Publicaciones de PCT Nos. WO 2004/009766 y WO 2005/028640 y Patente de Estados Unidos Nos. 6,995,299 y 6,509,514. Los hepatocitos pueden obtenerse de una biopsia de hígado tomada por vía percutánea o mediante cirugía abdominal. Los hepatocitos humanos para trasplante en un animal receptor, tal como un ratón FRG, se aíslan del tejido hepático humano mediante uno cualquiera método conveniente conocido en la técnica. El tejido hepático puede disociarse mecánica o enzimáticamente para proporcionar una suspensión de células individuales, o pueden usarse fragmentos de tejido hepático humano intacto. Por ejemplo, los hepatocitos se aíslan del tejido del donante mediante perfusión rutinaria de colagenasa (Ryan y otros Meth. Cell Biol. 13:29, 1976) seguido de centrifugación a baja velocidad. A continuación, los hepatocitos pueden purificarse al filtrar a través de una malla de acero inoxidable, seguido de centrifugación en gradiente de densidad. Alternativamente, pueden usarse otros métodos para enriquecer hepatocitos, tales como, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia, cribado, separación mediante perlas magnéticas, elutriación dentro de un campo centrífugo o cualquier otro método bien conocido en la técnica. Pueden usarse métodos de aislamiento de hepatocitos similares para recolectar hepatocitos humanos expandidos del hígado de ratón receptor.

Alternativamente, los hepatocitos humanos pueden prepararse mediante el uso de la técnica descrita por Guguen-Guillouzo y otros (Cell Biol. Int. Rep. 6:625-628, 1982). En resumen, se aísla un hígado o una parte del mismo y se introduce una cánula en la vena porta o en una rama porta. A continuación, el tejido hepático se perfunde, a través de la cánula, con un tampón sin calcio seguido de una solución enzimática que contiene colagenasa (tal como aproximadamente 0,025 % de colagenasa) en una solución de cloruro de calcio (tal como aproximadamente 0,075 % de cloruro de calcio) en tampón HEPES a una caudal de entre 30 y 70 mililitros por minuto a 37 °C. El tejido hepático perfundido se tritura en trozos pequeños (tal como de aproximadamente 1 milímetro cúbico). La digestión enzimática continúa en el mismo tampón que se describió anteriormente durante aproximadamente 10-20 minutos con agitación suave a 37 °C para producir una suspensión celular. Los hepatocitos liberados se recolectan al filtrar la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60-80 micrómetros. Los hepatocitos recogidos pueden lavarse luego en tampón HEPES frío a pH 7,0 mediante el uso de centrifugación lenta para eliminar la colagenasa y los restos celulares. Las células no parenquimatosas pueden eliminarse mediante centrifugación en gradiente de metrizamida (véase, la Patente de Estados Unidos No. 6,995,299).

Los hepatocitos humanos pueden obtenerse a partir de tejido fresco (tal como tejido obtenido a las pocas horas de la muerte) o tejido recién congelado (tal como tejido fresco congelado y mantenido a 0 °C o aproximadamente). Preferentemente, el tejido humano no tiene patógenos detectables, es normal en morfología e histología y está esencialmente libre de enfermedades. Los hepatocitos usados para el injerto pueden aislarse recientemente, tal como, dentro de unas pocas horas, o pueden trasplantarse después de períodos de tiempo más largos si las células se mantienen en medios de almacenamiento apropiados. Uno de dichos medios descritos en los ejemplos siguientes es VIASPAN™ (una solución universal de lavado aórtico y almacenamiento en frío para la conservación de órganos intraabdominales; también denominada solución de la Universidad de Wisconsin, o UW). Los hepatocitos también pueden criopreservarse antes del trasplante. Los métodos de criopreservación de hepatocitos son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 6,136,525.

Además de obtener hepatocitos humanos de donantes de órganos o resecciones hepáticas, las células usadas para el injerto pueden ser células madre humanas o células precursoras de hepatocitos que, tras el trasplante en el animal receptor, se desarrollan o se diferencian en hepatocitos humanos capaces de expansión. Como se divulga en la Patente de Estados Unidos No. 6,200,806, las células ES pueden producirse a partir de primates humanos y no humanos. Generalmente, las células ES de primates se aíslan en una capa confluente de fibroblasto embrionario murino en presencia de medio de células ES. El medio ES generalmente consiste en 80 % de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; sin piruvato, formulación alta en glucosa, Gibco BRL), con 20 % de suero fetal bovino (FBS; Hyclone), 0,1 mM de p-mercaptoetanol (Sigma), 1 % de reserva de aminoácidos no esenciales (Gibco BRL). Las características distintivas de las células ES, en comparación con las células madre "multipotenciales" comprometidas presentes en los adultos, incluyen la capacidad de las células ES para mantener un estado indiferenciado indefinidamente en cultivo, y el potencial que tienen las células ES para convertirse en diferentes tipos de células. Las ES humanas (hES) expresan SSEA-4, un antígeno de superficie celular glicolípido reconocido por un anticuerpo monoclonal específico (véase, por ejemplo, Amit y otros, Devel. Biol. 227:271-278, 2000).

Los hepatocitos humanos derivados de células madre mesenquimales humanas (hMSC) también pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento. La exposición secuencial de hMSC derivadas de la médula ósea a factores hepatogénicos da como resultado la diferenciación de las células madre en células con propiedades de hepatocitos (véase, Snykers y otros BMC Dev Biol. 7:24, 2007; Aurich y otros Gut. 56(3):405-15, 2007). También se ha descrito la diferenciación hepatogénica de las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea y las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) (véase, Talens-Visconti y otros World J Gastroenterol.

12(36):5834-45, 2006). Los hepatocitos humanos también pueden generarse a partir de monocitos. Ruhnke y otros (Transplantation 79(9):1097-103, 2005) describen la generación de células similares a hepatocitos (NeoHep) a partir de monocitos de sangre periférica diferenciados terminalmente. Las células NeoHep se asemejan a los hepatocitos humanos primarios con respecto a la morfología, la expresión de marcadores de hepatocitos, diversas funciones secretoras y metabólicas y actividades de desintoxicación de fármacos. Además, los hepatocitos humanos derivados de amniocitos también pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento.

Existen líneas de células ES humanas y pueden usarse en los métodos divulgados en el presente documento. En una modalidad, los hepatocitos humanos se administran a ratones receptores mediante trasplante, tal como mediante inyección, en el bazo. Los hepatocitos pueden administrarse mediante otros medios, tales como mediante inyección en el parénquima hepático o en la vena porta. El número de hepatocitos humanos inyectados en un ratón receptor puede variar. En una modalidad, se inyectan aproximadamente 105 a aproximadamente 107 hepatocitos humanos. En otra modalidad, se inyectan de aproximadamente 5 x 105 a aproximadamente 5 x 106 hepatocitos humanos. En una modalidad ilustrativa, se inyectan aproximadamente 106 hepatocitos humanos.

VI. Uso de hepatocitos humanos expandido en ratones deficientes de Fah

Los hepatocitos humanos pueden recolectarse de ratones receptores mediante el uso de cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede anestesiarse a los ratones y canular la vena porta o la vena cava inferior con un catéter. A continuación, el hígado puede perfundirse con un tampón apropiado (tal como un EBSS sin calcio y magnesio suplementado con EGTA 0,5 mM y HEPES 10 mM), seguido de un tratamiento con colagenasa (por ejemplo, mediante el uso de una solución de EBSS suplementada con 0,1 mg/ml de colagenasa XI y 0,05 mg/ml de ADNasa I). El hígado puede triturarse suavemente y filtrar a través de una malla de nailon (tal como secuencialmente a través de una malla de nailon de 70 pm y 40 pm), seguido de centrifugación y lavado de las células.

Los hepatocitos humanos recolectados de ratones receptores pueden separarse de células no humanas u otros contaminantes (tales como tejido o restos celulares) mediante el uso de cualquier técnica bien conocida en la técnica. Por ejemplo, tales métodos incluyen el uso de un anticuerpo que se une selectivamente a hepatocitos humanos. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno principal de histocompatibilidad de clase I, tal como anti-HLA-A, B, C (Markus y otros Cell Transplantation 6:455-462, 1997). Los anticuerpos específicos para células humanas o hepatocitos humanos pueden usarse en una variedad de técnicas diferentes, que incluyen FACS, cribado o separación mediante perlas magnéticas. La FACS emplea una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, y canales de impedancia, entre otros niveles más sofisticados de detección, para separar o clasificar células (véase, la Patente de Estados Unidos No. 5,061,620) unido por el anticuerpo. La separación magnética implica el uso de partículas paramagnéticas que: 1) se conjugan con los anticuerpos específicos humanos; 2) se conjugan con anticuerpos de detección que son capaces de unirse a los anticuerpos específicos humanos; o 3) se conjugan con avidina que puede unirse a anticuerpos biotinilados. El cribado implica un anticuerpo monoclonal unido a una matriz sólida, tal como perlas de agarosa, perlas de poliestireno, membranas de fibra hueca o placas Petri de plástico. Las células que están unidas por el anticuerpo pueden aislarse de una muestra simplemente al separar físicamente el soporte sólido de la muestra.

Como se describe en los ejemplos siguientes, la expresión de genes implicados en la conjugación y desintoxicación de fármacos, que incluye varias de las proteínas transportadoras de hepatocitos, se detectó en hepatocitos humanos expandidos recolectados de ratones receptores. Estudios recientes han demostrado el papel fundamental que desempeñan estas vías de conjugación (Kostrubsky y otros Drug. Metab. Dispos. 28:1192-1197, 2000) y proteínas transportadoras de hepatocitos (Kostrubsky y otros Toxicol. Sci. 90:451-459, 2006) para predecir la toxicidad de los fármacos. Junto con una respuesta humana normal a la inducción de CYP por fármacos exógenos, tal como rifampicina o PB, o BNF, la expresión de los factores de transcripción del receptor de hormona nuclear, las vías de conjugación y las principales proteínas transportadoras por los hepatocitos humanos expandidos en ratones FRG permiten la evaluación del papel de estos productos génicos en el metabolismo y la toxicidad de fármacos humanos, in vivo. Los métodos para probar la toxicidad de compuestos en hepatocitos aislados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Publicación de PCT No. WO 2007/022419.

La presente divulgación contempla además el uso de hepatocitos humanos expandidos y recolectados de ratones receptores como fuente de hepatocitos humanos para la reconstitución del hígado en un sujeto que necesite dicha terapia. La reconstitución de tejido hepático en un paciente mediante la introducción de hepatocitos es una posible opción terapéutica para pacientes con insuficiencia hepática aguda, ya sea como tratamiento temporal antes del trasplante de hígado o como un tratamiento definitivo para pacientes con deficiencias metabólicas aisladas (Bumgardner y otros Transplantation 65: 53-61, 1998). La reconstitución de hepatocitos puede usarse, por ejemplo, para introducir hepatocitos modificados genéticamente para terapia génica o para reemplazar los hepatocitos perdidos como resultado de una enfermedad, lesión física o química o neoplasia maligna (Patente de Estados Unidos No. 6,995,299). Por ejemplo, se ha informado del uso de hepatocitos transfectados en la terapia génica de un paciente que padece hipercolesterolemia familiar (Grossman y otros Nat. Genet. 6: 335, 1994). Además, pueden usarse hepatocitos humanos expandidos para poblar dispositivos de asistencia hepática artificiales.

Los hepatocitos humanos expandidos y recolectados de ratones FRG también son útiles para una variedad de estudios microbiológicos. Una serie de virus patógenos, que incluye el virus de la hepatitis C y el virus de la hepatitis B, solo se replicarán en un huésped humano o en hepatocitos humanos primarios. Por lo tanto, tener una fuente suficiente de hepatocitos humanos primarios es fundamental para los estudios de estos patógenos. Los hepatocitos humanos expandidos pueden usarse para estudios de infección viral y replicación o para estudios para identificar compuestos que modulan la infección de virus hepáticos. Los métodos de uso de hepatocitos humanos primarios para estudios de virus hepáticos se describen en la Patente Europea No. 1552740, Patente de Estados Unidos No.

6,509,514 y Publicación de PCT No. WO 00/17338.

VII. Uso de ratones deficientes de Fah como sistema modelo para la enfermedad hepática humana

Los ratones inmunodeficientes, deficientes de Fah también pueden usarse como un sistema modelo para la enfermedad hepática humana. Estos ratones, que incluyen ratones Rag2~l~/Il2rg~l~ que además comprenden deficiencia de Fah (tal como, por ejemplo, ratones FRG o FpmRG) injertados con hepatocitos humanos, pueden usarse para crear modelos de enfermedad hepática resultante de una variedad de causas diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, exposición a una toxina, enfermedad infecciosa, enfermedad genética o neoplasia maligna. Pueden usarse ratones deficientes de Fah injertados y reconstituidos con hepatocitos humanos para comprender mejor estas enfermedades e identificar agentes que pueden prevenir, retrasar o revertir los procesos de la enfermedad. Por ejemplo, pueden usarse ratones deficientes de Fah para probar vectores de terapia génica. Puede administrarse un vector de terapia génica de interés al ratón deficiente de Fah y pueden evaluarse los efectos del vector sobre los hepatocitos humanos injertados.

De manera similar, los ratones deficientes de Fah que comprenden hepatocitos humanos pueden usarse para seleccionar compuestos, tales como toxinas o agentes farmacéuticos, por su efecto sobre los hepatocitos humanos en un entorno in vivo. Un agente sospechoso de causar o contribuir a una enfermedad hepática puede seleccionarse al administrar una cantidad eficaz de un agente a un ratón deficiente de Fah y evaluar el efecto del agente sobre la función de las células humanas injertadas. Como ejemplo, puede usarse un ratón deficiente de Fah para identificar un agente que inhibe o previene la infección mediante un patógeno hepatotrófico. Para identificar dicho agente, un ratón deficiente de Fah puede exponerse o inocularse con un patógeno, seguido o precedido por la administración de un agente de prueba. A continuación, el ratón puede evaluarse en busca de signos de infección y, opcionalmente, compararse con ratones de control que no han sido tratados con el agente y/o no se han infectado por el patógeno.

Cuando se va a usar un ratón deficiente de Fah como modelo de enfermedad hepática causada por una toxina, los hepatocitos humanos inyectados deben injertarse y dejar que se expandan durante un período de tiempo adecuado antes de la exposición al agente tóxico. La cantidad de tiempo requerido para la expansión de los hepatocitos puede determinarse empíricamente y está dentro de las capacidades de un experto en la técnica. La cantidad de agente tóxico requerido para producir resultados que imiten más de cerca la afección humana correspondiente puede determinarse mediante el uso de una serie de ratones deficientes de Fah expuestos a dosis incrementales del agente tóxico. Los ejemplos de agentes tóxicos incluyen, pero no se limitan a, alcohol, acetaminofén, fenitoína, metildopa, isoniazida, tetracloruro de carbono, fósforo amarillo y faloidina.

En modalidades donde se va a usar un ratón deficiente de Fah como modelo de enfermedad hepática maligna, la neoplasia maligna puede producirse mediante exposición a un agente transformador o por introducción de células malignas. El agente transformante o las células malignas pueden introducirse con la introducción colonizadora inicial de hepatocitos humanos o, preferentemente, después de que los hepatocitos humanos hayan comenzado a proliferar en el animal huésped. En el caso de un agente transformador, puede ser preferente administrar el agente en un momento en que los hepatocitos humanos han proliferado activamente. Dichos agentes transformadores pueden administrarse sistémicamente al animal o localmente en el propio hígado. Las células malignas pueden inocularse directamente en el hígado. Como ejemplo, un ratón deficiente de Fah se trasplanta con hepatocitos humanos. Después del injerto de los hepatocitos humanos, se administra al ratón un agente transformador o se le inocula con células malignas. Alternativamente, el agente transformador o las células malignas pueden administrarse junto con los hepatocitos humanos. Después de que se ha desarrollado una neoplasia maligna en el ratón, que puede determinarse mediante uno cualquiera de una serie de métodos conocidos en la técnica, el ratón deficiente de Fah puede usarse como modelo para el cáncer hepático humano.

VIII. Vectores que codifican la uroquinasa

En algunas modalidades de los métodos descritos en el presente documento, a los ratones deficientes de Fah se les administra un vector que codifica uroquinasa antes del trasplante de hepatocitos humanos. En una modalidad, la uroquinasa (también conocida como activador del plasminógeno uroquinasa (uPA)) es la forma secretada de uroquinasa humana. En otra modalidad, la uroquinasa es una forma modificada, no secretada de uroquinasa (véase, la Patente de Estados Unidos No. 5,980,886). Se contempla cualquier tipo de vector adecuado para la expresión de uroquinasa en ratones. Dichos vectores incluyen vectores plasmídicos o vectores virales. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores de a Dn , vectores de adenovirus, vectores retrovirales, vectores retrovirales pseudotipados, vectores de AAV, vector de leucemia del mono gibón, vectores de VSV-G, VL30, vectores mediados por liposomas y similares. En una modalidad, el vector viral es un vector de adenovirus. El vector de adenovirus puede derivarse de cualquier adenovirus adecuado, que incluye cualquier serotipo de adenovirus (tal como, pero sin limitarse a, Ad2 y Ad5). Los vectores de adenovirus pueden ser vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación o vectores adenovirales sin intestino. Los vectores no virales pueden estar constituidos por plásmidos, fosfolípidos, liposomas (catiónicos y aniónicos) de diferentes estructuras. En otra modalidad, el vector viral es un vector de AAV. El vector de AAV puede ser cualquier vector de AAV adecuado conocido en la técnica.

Los vectores virales y no virales que codifican uroquinasa son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un vector de adenovirus que codifica la uroquinasa humana se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,980,886 y por Lieber y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92(13):6210-4, 1995). La Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2005-176129 y la Patente de Estados Unidos No. 5,585,362 describen vectores de adenovirus recombinantes y la Patente de Estados Unidos No. 6,025,195 divulga un vector de adenovirus para la expresión específica del hígado. La Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2003-0166284 describe vectores de virus adenoasociados (AAV) para la expresión específica del hígado de un gen de interés, que incluye la uroquinasa. Las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,521,225 y 5,589,377 describen vectores AAV recombinantes. La Publicación de PCT No. WO 0244393 describe vectores virales y no virales que comprenden el gen de activador del plasminógeno de uroquinasa humana. Un vector de expresión capaz de un alto nivel de expresión del gen de la uroquinasa humana se divulga en la Publicación de PCT No. WO 03087393.

Los vectores que codifican uroquinasa pueden incluir opcionalmente secuencias de control de expresión que incluyen promotores, potenciadores, terminadores de transcripción apropiados, un codón de inicio (es decir, ATG) delante de un gen que codifica proteínas, señal de corte y empalme para intrones y mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción adecuada de ARNm y codones de parada. Generalmente, las secuencias de control de expresión incluyen un promotor, una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción.

El vector de expresión puede contener un origen de replicación, un promotor, así como genes específicos que permiten la selección fenotípica de las células transformadas (tal como un casete de resistencia a antibióticos). Generalmente, el vector de expresión incluirá un promotor. El promotor puede ser inducible o constitutivo. El promotor puede ser específico de tejido. Los promotores adecuados incluyen el promotor de timidina quinasa (TK), metalotioneína I, poliedro, enolasa específica de neuronas, tirosina hidroxilasa, beta-actina u otros promotores. En una modalidad, el promotor es un promotor heterólogo.

En un ejemplo, la secuencia que codifica la uroquinasa se ubica corriente abajo del promotor deseado. Opcionalmente, también se incluye un elemento potenciador, y generalmente puede ubicarse en cualquier lugar del vector y aún tener un efecto potenciador. Sin embargo, la cantidad de actividad aumentada generalmente disminuirá con la distancia.

El vector que codifica la uroquinasa puede administrarse mediante una variedad de rutas, que incluyen, pero no se limitan a, por vía intravenosa, intraperitoneal o por infusión intravascular a través de la vena porta. La cantidad de vector administrado varía y puede determinarse mediante el uso de experimentación de rutina. En una modalidad, a los ratones FRG se les administra un vector de adenovirus que codifica la uroquinasa a una dosis de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de placa. En una modalidad preferente, la dosis es de aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de placa.

En una modalidad ilustrativa, a los ratones FRG se les administra un vector de adenovirus que codifica la uroquinasa humana. Los vectores de adenovirus tienen varias ventajas sobre otros tipos de vectores virales, tales como que pueden generarse con títulos muy altos de partículas infecciosas; infectan una gran variedad de células; transfieren genes de manera eficiente a las células que no se dividen; y rara vez se integran en el genoma huésped, lo que evita el riesgo de transformación celular por mutagénesis insercional (Douglas y Curiel, Science and Medicine, marzo/abril de 1997, páginas 44-53; Zern y Kresinam, Hepatology:25(2), 484-491, 1997). Los vectores adenovirales representativos que pueden usarse para codificar uroquinasa se describen por Stratford-Perricaudet y otros (J. Clin. Invest. 90: 626-630, 1992); Graham y Prevec (en Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7: 109-128, 1991) y Barr y otros (Gene Therapy, 2:151-155, 1995).

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o modalidades particulares. No se debe interpretar que estos ejemplos limitan la invención a las características o modalidades particulares descritas. Ejemplos

Como se describe en los siguientes ejemplos, el injerto y la expansión de hepatocitos humanos es muy eficaz en ratones FRG. Los hígados de FRG son macroscópicamente normales en tamaño y forma y el examen histológico no revela diferencias significativas con los ratones Fah-1- inmunocompetentes. Además, los ratones FRG crecen bien y son completamente fértiles cuando se les administra NTBC.

En una modalidad, en ratones FRG, la extensión de la enfermedad hepática y la presión selectiva pueden controlarse al administrar y retirar la NTBC (Grompe y otros Nat. Genet. 10:453-460, 1995). La retirada de NTBC proporciona una ventaja selectiva para los hepatocitos humanos trasplantados. Ser capaz de controlar fácilmente la extensión de la enfermedad hepática hace la cría de animales y la cirugía mucho más fáciles. Además, la mutación por deficiencia de Fah es una deleción y no puede volver al tipo salvaje mediante la inactivación del transgén. Por lo tanto, la competencia de las células de ratón revertidas endógenas no existe en los hígados con genes inactivados para Fah. Esto significa que los ratones FRG pueden injertarse con hepatocitos humanos a cualquier edad y que el trasplante en serie es factible. También es importante que los ratones FRG puedan repoblarse en gran medida sin la administración de un inhibidor del complemento, cuyos estudios previos han demostrado que es necesario para prevenir la enfermedad renal cuando la repoblación con células humanas supera el 50 % (Tateno y otros Am. J. Pathol. 165:901-912, 2004). Esto no solo es de importancia práctica en la cría de animales, sino que también elimina una fuente potencial de interferencia farmacológica.

La eficiencia de repoblación de los hepatocitos humanos en ratones FRG puede exceder aproximadamente el 70 % (el 70 % o más de los hepatocitos en el hígado del ratón son humanos). Un rendimiento medio de un solo ratón FRG repoblado es de aproximadamente 30-45 millones de hepatocitos humanos. Los hepatocitos expandidos de un solo ratón FRG pueden usarse para repoblar hasta 100 ratones receptores secundarios de FRG, en un proceso denominado trasplante en serie.

El trasplante en serie puede lograrse en el nuevo sistema descrito en el presente documento. El trasplante en serie no solo permite la expansión extensa de los hepatocitos humanos, sino que también proporciona un medio para expandir las células humanas del mismo genotipo a través de varias generaciones de ratones receptores. También significa que siempre se dispone de una fuente de hepatocitos humanos de alta calidad para trasplantes posteriores. En el presente documento se demuestra que son factibles al menos cuatro rondas de trasplante de hepatocitos. Además, la viabilidad de los hepatocitos humanos aislados de trasplantes en serie puede exceder aproximadamente el 80 % y los hepatocitos se adhieren fácilmente a las placas recubiertas de colágeno. En base a una estimación de una eficacia de injerto del 10 % (100 000 células) y una cosecha final de aproximadamente 15 millones de hepatocitos humanos expandidos después de la repoblación, se puede lograr una expansión in vivo de al menos 150 veces en cada ronda. Por tanto, la expansión total de hepatocitos humanos en ratones FRG puede superar los 500 millones de veces.

El injerto y la expansión de hepatocitos humanos es posible en ratones FRG mediante el uso de hepatocitos humanos aislados de una variedad de fuentes y de calidad variable. Las fuentes de hepatocitos humanos incluyen, pero no se limitan a, donantes de cadáveres, resecciones de hígado y fuentes disponibles comercialmente. Como se muestra en el presente documento, el injerto y la expansión de hepatocitos humanos fue exitosa mediante el uso de donantes de cualquier edad. Además, en el presente documento se demuestra que los hepatocitos humanos se expanden con éxito en ratones FRG incluso cuando los hepatocitos se criopreservaron previamente. Esta es una ventaja significativa sobre los sistemas que requieren un trasplante inmediato después del aislamiento de los hepatocitos.

Ejemplo 1: Generación de ratones Fah-l-IRag2rl-lIl2rg¡1-(FRG)

Se generaron varias cepas de ratones con genes inactivados para Fah inmunodeficientes. Al cruzar la mutación de Fah sobre información previa de desnudos, nodlscid o Rag1-I- no tuvo éxito. Para generar una cepa de ratón Fah-1-inmunodeficiente que carece por completo de linfocitos T, linfocitos B y células NK, pero sin un defecto de reparación del ADN, se generaron ratones Fah-I-IRag2-I-IIl2rg-1-(FRG). Ratones macho Fah-I-129S4 (Grompe y otros Genes Dev. 7:2298-2307, 1993) se cruzaron con ratones hembra Rag2-I-IIl2rg-1-(Taconic). Todos los animales se mantuvieron con agua potable que contenía 2-(2-nitro-4-trifluoro-metilbenzoil)-1,3 ciclohexanodiona (NTBC) a una concentración de 1,6mgIL (Grompe y otros Nat. Genet. 10:453-460, 1995). Para confirmar los genotipos de cada animal, se llevó a cabo un genotipado basado en PCR en 200 ng de ADN genómico aislados del tejido del dedo del pie (Grompe y otros Genes Dev. 7:2298-2307, 1993; Traggiai y otros Science 304:104-107, 2004).

Los ratones FRG crecieron bien y eran completamente fértiles si se les administraba continuamente NTBC en el agua que bebían. Los hígados de ratón FRG eran macroscópicamente normales en tamaño y forma, y el examen histológico no mostró diferencias entre los ratones Fah-I- convencionales y los ratones FRG. Al igual que en los ratones Fah-I-convencionales, la retirada de NTBC dio como resultado una lesión hepatocelular gradual en los ratones FRG y, finalmente, en la muerte después de 4-8 semanas (Overturf y otros Nat. Genet. 12:266-273, 1996). Ejemplo 2: Ensayos de histología y detección de injertos

Histología e inmunocitoquímica

La inmunohistoquímica FAH se realizó como se describió anteriormente (Wang y otros Am. J. Pathol. 161:565-574, 2002). Brevemente, los tejidos de hígado y riñón fijados en formalina tamponada con fosfato al 10 %, pH 7,4, se deshidrataron en etanol al 100% y se embebieron en cera de parafina a 58 °C. Se tiñeron secciones de 4 pm desparafinizadas con hematoxilina y eosina. Para la inmunohistoquímica, las secciones se trataron con H²O² al 3 % en metanol para bloquear la peroxidasa endógena. El bloqueo de avidina y biotina también se realizó antes de la incubación con anticuerpos primarios. Las secciones se incubaron con anticuerpo de conejo anti-FAH o anticuerpo HepPar (DAKO) durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de incubación de anticuerpo secundario conjugado con HRP. Las señales fueron detectadas por diaminobencidina (DAB).

Ensayo enzimático de FAH

Se incubó el fumarilacetoacetato con fracciones de hígado citosólico del hígado del receptor y se midió la velocidad de desaparición espectroscópicamente a 330 nm. Se usaron hígados de tipo salvaje y de Fah-I- como control positivo y negativo, respectivamente. El fumarilacetoacetato se preparó enzimáticamente a partir de ácido homogentísico (Knox y otros Methods Enzymol. 2:287-300, 1955).

PCR genómica para la secuencia de Alu

El ADN genómico se aisló del hígado mediante el uso del estuche de tejido DNeasy (Qiagen). Las secuencias de Alu humanas se amplificaron mediante PCR de acuerdo con procedimientos estándar con los siguientes cebadores 5'-GGCGCGGTGGCTCACG-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-TTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 2).

RT-PCR para la expresión de genes específicos de hepatocitos

El ARN total se aisló del hígado mediante el uso del mini estuche RNeasy (Qiagen). El ADN complementario se sintetizó mediante transcriptasa inversa con un cebador oligo-dT. Los cebadores que se muestran en la tabla 1 se usaron para la amplificación de ADNc específico de humano o ratón.

Tabla 1

Medición de albúmina humana

Se recolectaron pequeñas cantidades de sangre una vez a la semana de la vena safena izquierda con un capilar sanguíneo heparinizado. Después de una dilución de 1000 o 10 000x con solución salina tamponada con Tris, se midió la concentración de albúmina humana con el estuche de cuantificación de ELISA de albúmina humana (Bethyl) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Inmunocitoquímica fluorescente

Se suspendieron los hepatocitos de hígados de ratón humanizados en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y se sembraron en placas de 6 pocillos revestidas con colágeno tipo l. Las células unidas se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 minutos y se bloquearon con leche desnatada al 5 %. Se usaron anti-FAH de conejo, anti-albúmina humana de cabra (Betil), anti-albúmina de ratón de cabra (Betil) como anticuerpos primarios a una dilución de 1/200. Como anticuerpo secundario se usaron anti-IgG de cabra ALEXA™ Fluoro 488 (Invitrogen) o anti-IgG de conejo ALEXA™ Fluoro 555 (Invitrogen). Las imágenes se capturaron con un microscopio AXIOVERT™ 200 mediante el uso de una cámara digital Nikon.

Análisis FACS

Después de la disociación de los hígados de receptores, las células parenquimatosas se incubaron a 4 °C durante 30 minutos con anticuerpos a antígeno leucocitario humano antihumano (HLA)-A, B, C (BD Pharmingen) conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-H2-K(b) de ratón conjugado a ficoeritrina (PE) (BD Pharmingen). Luego se enjuagaron con PBS dos veces y se analizaron con un citómetro de flujo FACS CALIBUR™ (Becton Dickinson). Se usaron IgG conjugada con FITC y conjugada con PE como controles negativos.

Hibridación de fluorescencia in situ

Las sondas de ADN genómico total se generaron mediante traducción de muescas del ADN genómico total de ratón y humano. La incorporación de Cy3-dUTP se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen). La concentración final de la sonda fue de 200 ng/pl. Los portaobjetos con células adheridas se trataron con ARNasa a 100 mg/ml durante 1 hora a 37 °C y se lavaron en SSC 2X durante tres enjuagues de 3 minutos. Después de las etapas de lavado, los portaobjetos se deshidrataron en etanol al 70, 90 y 100 % durante 3 min cada uno. Los cromosomas se desnaturalizaron a 75 °C durante 3 minutos en formamida al 70 %/SSC 2X, seguido de deshidratación en etanol helado al 70 %, 90 % y 100 % durante 3 minutos cada uno. Los cócteles de sonda se desnaturalizaron a 75 °C durante 10 minutos y se prehibridaron a 37 °C durante 30 minutos. Las sondas se aplicaron a los portaobjetos y se incubaron durante la noche a 37 °C en una cámara húmeda. Los lavados posteriores a la hibridación consistieron en tres enjuagues de 3 minutos en formamida al 50 %/SSC 2X y tres enjuagues de 3 minutos en tampón PN (Na2HPO4 0,1 M, NaH2PO4 0,1 M, pH 8,0, NONIDET™ P-40 al 2,5 %), todos a 45 °C. A continuación, se contratiñeron los portaobjetos con Hoechst (0,2 ug/ml), se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron bajo fluorescencia UV (Zeiss).

Ejemplo 3: aislamiento y criopreservación de hepatocitos humanos

Se aislaron hepatocitos humanos de hígados de donantes que no se usaron para trasplante de hígado de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente (Strom y otros Cell Transplant. 15: S105-110, 2006). Brevemente, se perfundió el tejido hepático con solución salina equilibrada de Hanks sin calcio y magnesio (Cambrex) suplementada con EGTA 0,5 mM (Sigma) y HEPES (Cellgro), seguido de digestión con 100mg/L de colagenasa XI (Sigma) y 50 mg/L de desoxirribonucleasa I (Sigma) en medio esencial mínimo de Eagle (Cambrex) a través de la vasculatura existente. Las células se lavaron tres veces con medio esencial mínimo de Eagle más suero bovino de ternera al 7 % (Hyclone) a 50 x g durante 2 minutos. Los hepatocitos sedimentados se transfirieron a VIASPAN™ frío (una solución universal de lavado aórtico y almacenamiento en frío para la preservación de órganos intraabdominales; también conocida como solución de la Universidad de Wisconsin, o UW).

Los hepatocitos enviados se transfirieron a la solución VIASPAN™ suplementado con suero fetal bovino al 10 % y dimetilsulfóxido al 10 % a 5 x 106 hepatocitos por ml. Los criotubos se envolvieron densamente con toallas de papel, se almacenaron a -80 °C durante un día y finalmente se transfirieron a nitrógeno líquido. Para descongelar, las células se recalentaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se añadió DMEM gradualmente para minimizar la velocidad de cambio de la concentración de DMSO.

Ejemplo 4: Repoblación de hígado de ratón FRG con hepatocitos humanos

Se ha demostrado que la sobreexpresión de uroquinasa mejora el injerto de hepatocitos en varios sistemas (Lieber y otros Hum. Gene Ther. 6:1029-1037, 1995). Por tanto, se realizaron experimentos para determinar si sería beneficiosa la administración de una uroquinasa que expresa adenovirus antes del trasplante de hepatocitos humanos. El vector adenoviral que expresa la forma secretada de uroquinasa humana (activador del plasminógeno de uroquinasa; uPA) se ha descrito previamente (Lieber y otros Proc. Natl. Acad. Sci. ^e E.UU. 92:6210-6214, 1995 y Patente de Estados Unidos No. 5,980,886).

Los hepatocitos de donantes se aislaron y trasplantaron 24-36 horas después del aislamiento. En la mayoría de los casos, las células se conservaron en solución VIASPAN™ y se mantuvieron a 4 °C durante el transporte. Sin embargo, en dos experimentos, se trasplantaron hepatocitos criopreservados. La viabilidad y la calidad de los hepatocitos del donante fue muy variable con eficacias de siembra en placa que oscilan entre el 10 % y el 60 %. Para el trasplante, se usó el siguiente protocolo general. Loa ratones FRG machos o hembras adultas (de 6 a 15 semanas de edad) se les administró una inyección intravenosa (retroorbital) de adenovirus de uPA (5 x 109 unidades formadoras de placa (PFU) por ratón) 24-48 horas antes del trasplante. Se inyectaron intraesplénicamente un millón de hepatocitos humanos viables (determinados por exclusión con azul tripán) en 100 pl de medio esencial modificado por Dulbecco mediante una aguja de calibre 27. La NTBC se retiró gradualmente durante los siguientes seis días (1, 6 mg/L a los días 0-2; 0,8 mg/L a los días 3-4; 0,4 mg/L a los días 5-6) y se retiró por completo una semana después del trasplante. Dos semanas después de suspender la NTBC, a los animales se les volvió a administrar el fármaco durante cinco días y luego se retiró nuevamente.

En tres trasplantes separados, se observó un injerto primario de hepatocitos humanos en ratones FRG en receptores que habían recibido primero el adenovirus de uPA. Por tanto, el régimen de pretratamiento con uPA se usó en la mayoría de los experimentos de trasplante posteriores.

En total, se usaron con éxito hepatocitos humanos de nueve donantes diferentes y no se produjeron fallos de injerto después de la introducción del régimen de adenovirus de uPA. De estos, siete se aislaron de hígados de donantes de órganos con muerte cerebral y dos se aislaron de resecciones quirúrgicas de hígado. Las edades de los donantes variaron de 1,2 a 64 años (tabla 2).

Tabla 2

En todos los experimentos, al menos un receptor se injertó significativamente (>1 % de células humanas) con hepatocitos humanos mediante el uso de este protocolo, independientemente del lote de células usado. El injerto se demostró mediante diferentes métodos que incluyen histología, análisis de ADN, ensayo enzimático y, en experimentos posteriores, albúmina de suero humano. En los trasplantes controlados por los niveles de albúmina, 17 de 43 (39,5 %; rango de 12 a 67 %) receptores primarios se repoblaron (tabla 2 y Figura 3). De estos, siete estaban altamente repoblados (30-90 %) y alcanzaron niveles de albúmina >1 mg/ml. No sólo se injertaron hepatocitos de hígados cadavéricos, sino también de resecciones hepáticas. Además, las células criopreservadas también se injertaron con éxito.

En ratones altamente injertados (>30 % de repoblación), el peso de los ratones FRG trasplantados se estabilizó durante la segunda retirada de NTBC, mientras que pocos compañeros de camada pequeños inmunodeficientes heterocigotos para Il2rg Fah-I-/Rag2rl-/Il2rg-1-) que dieron las mismas células continuaron con pérdida de peso (Figura 1a). Esta estabilización de peso en ratones triple mutantes sugirió que los hepatocitos humanos trasplantados reemplazaron las funciones de los hepatocitos de receptores Fah-1- enfermos. Tras la estabilización completa del peso (2-3 meses después del trasplante inicial), se recolectaron los hígados de receptores. Macroscópicamente, los hígados de FRG eran de forma y peso normales y sin nódulos macroscópicos. La PCR genómica para secuencias de ADN de Alu específicas para humanos fue positiva en hígados de receptores de FRG, mientras que los heterocigotos de Il2rg fueron todos negativos (Figura 1b). Para confirmar directamente la función hepatocítica de las células de repoblación, se analizó la actividad de la enzima FAH (Knox y otros Methods Enzymol. 2:287-300, 1955).

Los hígados de los ratones receptores tenían cantidades considerables de actividad enzimática de FAH, que igualaba o excedía el hígado normal de ratón (Figuras 1c-e). Como FAH se expresa exclusivamente en hepatocitos completamente diferenciados, esto sugirió que los hepatocitos humanos trasplantados no estaban desdiferenciados o anormales cuando se injertaron en el hígado de ratón. La inmunotinción de FAH confirmó que más del 70 % del parénquima hepático se repobló con hepatocitos humanos positivos a FAH (Figura 1f y Figura 1g).

El examen histológico e inmunohistoquímico se realizó mediante el uso de hígados de receptores adicionales (Figura 2a y Figura 2b). Los hepatocitos humanos positivos a FAH aparecieron completamente integrados en la estructura del hígado del receptor. En varios receptores, los hepatocitos injertados ocuparon más del 80 % del parénquima sin alterar la organización del hígado del receptor (Figuras 2b, 2e y 2f). Los hepatocitos humanos en expansión clonal podrían distinguirse claramente de los hepatocitos de ratón morfológicamente, por tamaño y por su citoplasma pálido (Figura 2c y Figura 2d). El tamaño de los hepatocitos humanos era relativamente grande y su citoplasma parecía brillante, probablemente debido a la acumulación de glucógeno como se informó anteriormente (Meuleman y otros Hepatology 41:847-856, 2005). Los hepatocitos positivos a FAH también fueron positivos para el anticuerpo HepPar, que marca específicamente los hepatocitos humanos, pero no la contraparte de ratón (Figura 2e y Figura 2f). En contraste, las áreas negativas a FAH mostraron necroinflamación y contenían hepatocitos displásicos consistentes con los hallazgos en ratones Fah-1- convencionales después de la retirada de NTBC.

Para examinar si los hepatocitos humanos repoblados expresaban genes específicos de hepatocitos maduros, se realizó la RT-PCR sobre el ARN mensajero extraído de hígados de receptores. Los genes de albúmina humana (ALB), FAH, transferrina (TF), transtiretina (TTR), tirosina aminotransferasa (TAT) y UGT1A1 se expresaron abundantemente en los hígados de receptores (Figura 3a, Figura 6c y Figura 7). La funcionalidad de los hepatocitos también se evaluó al medir la concentración sanguínea de albúmina humana. Se usó un estuche ELISA específico para albúmina humana y el umbral de detección fue de 0,05 |jg/ml mediante el uso de muestras diluidas 1:100. La albúmina humana se detectó por primera vez entre 4 y 10 semanas después del trasplante en receptores primarios. Aunque inicialmente hubo alguna fluctuación en los niveles, las concentraciones luego aumentaron de manera relativamente constante durante varias semanas más (Figura 3b y Figura 3c).

Puede ser necesario un inhibidor de proteinasa farmacológico para mantener viables a largo plazo los ratones altamente repoblados; el complemento humano producido por los hepatocitos del donante podría dañar el riñón del receptor (véase, Tateno y otros Am. J. Pathol. 165:901-912, 2004). Por lo tanto, se observaron varios (n=3) ratones altamente repoblados durante un período prolongado. Estos ratones no perdieron peso sin NTBC durante 4 meses y su concentración de albúmina humana permaneció estable. Además, sus riñones eran macroscópicamente e histológicamente normales en el momento de la recolección (Figura 2g).

Ejemplo 5: Trasplante en serie de hepatocitos humanos

Una de las limitaciones de los modelos de xenorrepoblación hepática descritos anteriormente es la incapacidad de expandir aún más los hepatocitos humanos injertados. Para probar la factibilidad del trasplante en serie en el sistema de ratón FRG, el hígado de un receptor primario altamente repoblado (~70 % de células humanas) se perfundió y se recolectaron hepatocitos parenquimatosos mediante el uso de un protocolo de digestión con colagenasa estándar.

Los ratones repoblados con células humanas se anestesiaron y se canuló la vena porta o la vena cava inferior con un catéter de calibre 24. El hígado se perfundió con EBSS sin calcio y magnesio suplementado con EGTA 0,5 mM y HEPES 10 mM durante 5 minutos. La solución se cambió a EBSS suplementada con 0,1 mg/ml de colagenasa XI (sigma) y 0,05 mg/ml de ADNasa I (sigma) durante 10 minutos. El hígado se trituró suavemente en la segunda solución y se filtró a través de una malla de nailon de 70 jm y 40 jm secuencialmente. Después de centrifugación a 150 x g durante 5 minutos, el sedimento se lavó adicionalmente dos veces a 50 x g durante 2 minutos. El número y la viabilidad de las células se evaluaron mediante la prueba de exclusión con azul tripán.

Se inyectaron un millón de células viables suspendidas en 100 j l de DMEM en el bazo del receptor mediante una aguja de calibre 27. El trasplante de hepatocitos en receptores secundarios de FRG se realizó sin separar los hepatocitos humanos positivos a Fah y de ratón negativos a Fah. En contraste con las células usadas para el injerto primario, la viabilidad de los hepatocitos humanos recolectados de esta manera fue>80 % y se unieron fácilmente a placas de cultivo recubiertas de colágeno (Figuras 4c-e). Después del injerto del receptor secundario, el trasplante en serie continuó de forma similar en los receptores terciarios y cuaternarios. En cada generación, la albúmina humana en sangre de algunos ratones receptores, pero no de todos, se volvió altamente positiva (Figura 4a). El porcentaje de ratones altamente repoblados fue mayor en los receptores de trasplantes en serie (17/28 en comparación con 7/43) y la tasa de aumento de albúmina fue más constante (Figura 3e). Esto puede indicar que el paso en serie de hepatocitos enriquece a la mayoría de los hepatocitos humanos trasplantables o simplemente puede reflejar la mayor calidad y viabilidad de las células recolectadas recientemente de un ratón donante. La PCR genómica de las muestras de hígado de ratones positivos a albúmina mostró la presencia de ADN humano en cada generación (Figura 4b). La repoblación hepática por hepatocitos humanos también se confirmó mediante inmunotinción fluorescente contra FAH (Figuras 4c-e). El examen histológico mostró que los hepatocitos humanos injertados eran morfológicamente similares en cada generación y eran claramente positivos a FAH (Figuras 4f-h). Ejemplo 6: la repoblación de hepatocitos no es el resultado de la fusión celular

Un informe reciente de repoblación hepática con células de primates en ratones transgénicos de uroquinasa demostró que la fusión celular podría potencialmente explicar la aparente "repoblación de hepatocitos" (Okamura y otros Histochem. Cell Biol. 125:247-257, 2006). Dado que en ese estudio se usaron ratones transgénicos a uPA, estos hallazgos plantearon la posibilidad de que la fusión celular fuera también el mecanismo en otros informes de humanización del hígado de ratón. También se ha observado fusión celular entre células hematopoyéticas y hepatocitos en los ratones deficientes de Fah (Wang y otros Nature 422:897-901, 2003). La fusión celular entre células humanas y de ratón disminuiría enormemente el valor de los hígados de ratón humanizados para aplicaciones farmacéuticas. Para confirmar que los hepatocitos repoblados eran verdaderamente de origen humano, se realizó una doble inmunotinción contra albúmina y FAH específicas de ratón o humanas. La mayoría de los hepatocitos positivos a albúmina de ratón (>95 %) fueron de hecho negativos para FAH y la mayoría de los hepatocitos positivos a FAH fueron negativos para albúmina de ratón (Figuras 5a-c). Por otro lado, casi todos (>90 %) los hepatocitos positivos a albúmina humana también fueron positivos a FAH, mientras que los hepatocitos restantes fueron doblemente negativos (Figuras 5d-f).

La albúmina es una proteína secretada y, por lo tanto, las células pueden parecer positivas a anticuerpos al absorber albúmina heteróloga de otras células. Para confirmar aún más la falta de fusión celular, se usaron para la citometría de flujo, anticuerpos anti-complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humanos y de ratón. Se confirmó que cada anticuerpo era específico de especie (Figuras 5g-j). No se encontraron hepatocitos positivos para los marcadores de superficie de ambas especies en hígados altamente repoblados (Figura 5k y Figura 5l).

Finalmente, se realizó hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas de genoma completo humano y de ratón en hepatocitos de receptores de trasplantes altamente repoblados. Se hibridaron hepatocitos de ratones primarios (ratón quimérico #531) y terciarios (ratón quimérico #631) altamente repoblados con ADN genómico total humano o de ratón. Se puntuó el porcentaje de células positivas para la sonda humana o la sonda murina (tabla 3). Los controles fueron hepatocitos puros humanos y de ratón o una mezcla igual de hepatocitos humanos y de ratón. Si las células humanas que se encuentran en los hígados quiméricos fueran el producto de la fusión celular, muchos hepatocitos serían doblemente positivos para las sondas tanto humanas como de ratón y, por tanto, los porcentajes de células positivas para el ADN de ratón y humano superarían el 100 %. En cambio, la suma de los porcentajes se acercó mucho al 100 %, como sucedió en la mezcla de hepatocitos humanos y murinos. Además, se detectaron hepatocitos humanos en los bazos de ratones altamente repoblados (Figura 2h) a pesar del hecho de que el bazo está desprovisto de hepatocitos murinos que podrían servir como compañeros de fusión para células humanas. Por lo tanto, las células doble positivas (productos de fusión) no contarían para la mayoría de las células humanas.

Tabla 3

Tomados en conjunto, estos resultados indican que los eventos de fusión, si ocurrieron, fueron raros y que la mayoría de las células de repoblación eran de origen puramente humano incluso cuando se realizó un trasplante en serie. Por lo tanto, los hepatocitos humanos expandidos en ratones FRG tienen solo propiedades genéticas y bioquímicas humanas.

Ejemplo 7: Caracterización funcional del metabolismo de fármacos en ratones humanizados

Se examinó la expresión basal y la inducción de genes específicos del hígado humano en ratones quiméricos. La evaluación del metabolismo de la testosterona y la actividad de etoxirresorufina-O-deetilasa (EROD) en hepatocitos cultivados se llevó a cabo como se describe por Kostrubsky y otros (DrugMetab. Dispos. 27:887-894, 1999) y Wen y otros, (Drug Metab. Dispos. 30:977-984, 2002), respectivamente. El aislamiento de ARN, la síntesis de ADNc y la PCR en tiempo real se llevaron a cabo según lo descrito por Komoroski y otros, (DrugMetab. Dispos. 32:512-518, 2004). Los cebadores, obtenidos a partir de Applied Biosystems, eran específicos para CYP1A1 (Hs00153120_m1), CYP1A2 (Hs00167927_m1), CYP3A4 (Hs00430021_m1), CYP3A7 (Hs00426361_a1), CYP2B6 (Hs00167937_g1), CYP2D6 (Hs00164385_a1) humanos, proteína asociada a resistencia a múltiples fármacos MRP2 (Hs00166123_m1), bomba de exportación de sales biliares BSEP, (Hs00184829_m1), Ca r (Hs00231959_m1), albúmina (Hs00609411_m1), HNF4a (Hs00230853_m1), ciclofilina (Hs99999904_m1) y actina de ratón (Ma00607939_s1).

Se establecieron cultivos de hepatocitos aislados y se expusieron a inductores prototípicos de los genes del citocromo P450. Los resultados demostraron que los niveles de expresión génica basal de citocromo (CYP1A1, CYP1A2, CYP2B6, CYP3A4, CYP3A7), transportador (BSEP, m Rp 2) y enzimas conjugadoras de fármacos (UGT1A1) eran exactamente los encontrados en hepatocitos humanos adultos normales cultivados (Figura 6c, Figura 7). Además, el patrón de genes inducidos por compuestos tales como beta-naftoflavona (BNF), fenobarbital (PB) y rifampicina (Rif) fue el esperado en células humanas normales. Además de los niveles de expresión de ARNm de los genes del metabolismo de fármacos humanos, se midió la actividad enzimática de los miembros de la familia CYP1A y 3A humana. Se sabe que la actividad de la etoxirresorufina-O-deetilasa (EROD) está mediada por CYP1A1 y 1A2 en el hígado humano. Los resultados muestran que la actividad de EROD fue inducida de forma específica y robusta por la exposición previa a BNF en células de hígado de ratón humanizadas (Figura 6a). Por el contrario, la exposición previa a PB o rifampicina indujo específicamente la conversión de testosterona en 6-betahidroxiltestosterona, una medida específica del metabolismo mediado por CYP3A4 (Figura 6b). Por tanto, los hepatocitos de los hígados de FRG repoblados eran indistinguibles a partir de los hepatocitos adultos humanos normales en estos ensayos estándar del metabolismo de fármacos.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método de expansión de hepatocitos humanos in vivo, que comprende:

i) trasplantar hepatocitos humanos aislados en un ratón Rag2-l-lIl2rg-1-, en donde

el ratón es deficiente para la expresión de Fah;

ii) permitir a los hepatocitos humanos expandirse durante al menos dos semanas; y

iii) recolectar hepatocitos humanos del ratón,

en donde el ratón es homocigoto para deleciones o una o más mutaciones puntuales en el gen Fah.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el ratón es un ratón Fah-l-IRag2rl-lIl2rg¡1- (FRG).

3. El método de la reivindicación 1, en donde el ratón es un ratón FahpmIRag2-I-IIl2rg-1 (FpmRG).

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde un vector que codifica la uroquinasa humana se administra al ratón antes de trasplantar los hepatocitos humanos.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el vector es un vector de adenovirus o un vector de virus adenoasociado.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde al ratón se le administra 2-(2-nitro-4-trifluoro-metil-benzoil)-1,3 ciclohexanodiona (NTBC) antes del trasplante de hepatocitos.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la NTBC se administra a una dosis de 0,05 mglkgldía a 0,10 mglkgldía.

8. El método de la reivindicación 6 o 7, en donde al ratón se le administra además la NTBC durante al menos tres días después del trasplante de hepatocitos, o al menos seis días después del trasplante de hepatocitos.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde se permite a los hepatocitos humanos expandirse durante al menos seis semanas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde los hepatocitos humanos aislados se inyectan en el bazo o en la vena porta del ratón.

11. El método de la reivindicación 1, en donde los hepatocitos humanos expandidos se recolectan del hígado del ratón.

12. El método de la reivindicación 1, en donde los hepatocitos humanos se obtuvieron o aislaron del hígado de un donante de órganos, se obtuvieron o aislaron de una resección quirúrgica o se derivaron de una célula madre, monocito o amniocito.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además el agotamiento de los macrófagos del ratón antes del trasplante de hepatocitos.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende además expandir los hepatocitos humanos recolectados mediante trasplante en serie.

15. Un ratón modificado genéticamente cuyo genoma es homocigoto para deleciones o una o más mutaciones puntuales en los genes Fah, Rag2 e Il2rg, de manera que las deleciones o mutaciones puntuales dan como resultado la pérdida de expresión de las proteínas FAH, RAG-2 e IL-2Ry funcionales, en donde el ratón es inmunodeficiente y presenta una función hepática disminuida.

16. El ratón de la reivindicación 15, en donde las deleciones o mutaciones puntuales dan como resultado la pérdida completa de linfocitos B, linfocitos T y células NK.

17. El ratón de la reivindicación 15 o 16, en donde el ratón es un ratón FRG o un ratón FpmRG.

18. El ratón de la reivindicación 15-17, en donde el ratón expresa la uroquinasa humana.