JP5899388B1 - 臓器ヒト化マウス - Google Patents

Abstract

マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養して得られる胚性幹細胞、並びに当該胚性幹細胞を用いて作出されたマウス。

Description

本発明は、マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスから採取された胚性幹細胞（ES細胞）及び臓器がヒト化されたマウスに関する。

従来、ヒト臓器のモデルマウスの作製に関し、例えば、肝臓のモデルマウスとして、Heckel らは、アルブミン(Alb)プロモータにurokinase型のプラスミノーゲンアクチベーター(Plau)遺伝子を連結したコンストラクト（Alb-Plau)が導入されたトランスジェニックマウス（Tg(Alb-Plau)について報告した（非特許文献１：Heckel et al. Cell 62:447-456, 1990））、しかしながら、このマウスは生後4日目までに腸管等の出血で死亡するため実験に使用することができない。これに対し、Tg(Alb-Plau)の中で、生き残る個体の系統の樹立に成功し、肝細胞が分裂中にAlb-Plau 遺伝子を欠損した肝細胞によって肝臓が再生された例が報告されている（非特許文献２：Sandgren et al. Cell 66:245-256, 1991）。また、メタロチオネインプロモーターにlacZ遺伝子を連結したコンストラクトが導入されたマウス、すなわち、ドナーとなる肝細胞をマーカー遺伝子であるlacZで標識したトランスジェニックマウス（Tg(MT-nLacZ)マウス）の成体肝細胞をTg(Alb-Plau)に移植し、成功した例がある（非特許文献３：Rhim et al. Science 263:1149-1152, 1994）。

さらに、免疫不全マウスにヒト肝細胞の移植を行った例がある。例えば、Rag2-/- 遺伝子欠損免疫不全マウスに対し肝細胞を移植し、B型肝炎ウイルス（HBV）の感染実験を行った例（非特許文献４：Dandri et al. Hepatology 33:981-988, 2001）、あるいはTg(Alb-Plau)と免疫不全マウスであるSCIDを交配し、免疫不全となったSCIDマウス（Tg(Alb-Plau)）にヒト肝細胞を移植し（Tg(Alb-Plau);SCID））、C型肝炎ウイルスの感染実験を行った例（非特許文献５：Mercer et al. Nature Med. 7:927-933, 2001）などがある。

さらに、Tatenoらは、肝臓に障害を持つアルブミン エンハンサー/プロモーター ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス（uPAマウス）とSCIDマウスとを掛け合わせ、どちらの形質もホモ接合体であるuPA/SCIDトランスジェニックマウスを作製した（非特許文献６：Tateno et al. Amer. J. Pathol 165:901-912, 2004）。この報告では、ヒト肝細胞のTg(Alb-Plau;SCID)への移植法の改良について記載されており、Futhan処理によってヒト肝細胞からの補体の影響を排除して高キメラでも死亡率を低下させている。

さらに、Rag2遺伝子を欠損した免疫不全マウスをモデルとして遺伝子治療への可能性を実証した研究も報告されている（非特許文献７：整形・災害外科「分子レベルからみた整形外科疾患シリーズIV体細胞クローン技術と再生医療」Vol.45, NO.11, PAGE.1040-1041, 2002）。

しかし、これらのモデルマウスでは、宿主であるマウスの肝臓細胞が残り、100%の細胞がヒト由来の細胞に置換された肝細胞モデルではない。また、必ずしもヒト由来細胞が再生されるわけではなく、ヒト由来の細胞を移植せざるを得ない。さらに、マウス由来の肝臓細胞が残存していると、ヒトの肝機能の検証が不十分となる。
他方、生殖系列へ伝達するNOGマウス由来ES細胞株の樹立のため、分化シグナル阻害剤（PD0325901、CHIR99021）を用いることで、ES細胞を樹立する試みもなされている（非特許文献８：日本実験動物学会総会講演要旨集 Vol. 58th, Page 210, 2011）。

しかしながら、NOGマウスは繁殖が難しい点で、実験用に多数のマウスを得ることが困難である。
また、本発明者は、以前、免疫不全マウスから採取された胚性幹細胞から、肝臓がヒト化されたモデル動物を作出することに成功した（特許文献１：WO2013/145331)。

国際公開第2013/145331号パンフレット

Heckel et al. Cell 62:447-456, 1990 Sandgren et al. Cell 66:245-256, 1991 Rhim et al. Science 263:1149-1152, 1994 Dandri et al. Hepatology 33:981-988, 2001 Mercer et al. Nature Med. 7:927-933, 2001 Tateno et al. Amer. J. Pathol 165:901-912, 2004 整形・災害外科「分子レベルからみた整形外科疾患シリーズIV体細胞クローン技術と再生医療」Vol.45, NO.11, PAGE.1040-1041, 2002 日本実験動物学会総会講演要旨集 Vol. 58th, Page 210, 2011

本発明は、免疫不全マウスではなく免疫応答が正常なマウス由来の胚から、臓器がヒト化されたマウスを提供することを目的とする。より詳細には、マウス主要組織適合抗原（MHC）クラスI遺伝子が破壊され、代わりにヒト主要組織適合抗原クラスI遺伝子を持つマウスから採取された胚性幹細胞（ES細胞）及び臓器がヒト化されたマウスを提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスの胚を作製し、これをGSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養して得られる胚性幹細胞を用いることで、臓器がヒト化されたマウスを作出することに成功した。
このマウスの胎児期の卵黄嚢血管にヒト肝細胞を移植することで、従来のような免疫不全マウスを用いなくてもヒト肝細胞が生着することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養して得られる胚性幹細胞。
（２）H2-D分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインが、それぞれヒトHLA-A分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインに置換された、（１）に記載の胚性幹細胞。
（３）受領番号がNITE ABP-02068で示される、（１）又は（２）に記載の胚性幹細胞。
（４）エストロゲン受容体遺伝子及びジフテリアトキシン遺伝子が導入された、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の胚性幹細胞。
（５）細胞中に内在する成長ホルモン遺伝子がヒト由来のものに置換された、（４）に記載の胚性幹細胞。
（６）さらに、細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子がヒト由来のものに置換された、（５）に記載の胚性幹細胞。
（７）細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子が、Cyp3a11、Cyp3a13、Cyp3a25及びCyp3a41からなる群から選択される少なくとも１つである（６）に記載の胚性幹細胞。
（８）前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の胚性幹細胞を用いて作出されたマウス。
（９）前記（４）〜（７）のいずれか１項に記載の胚性幹細胞を用いて作出されたマウス。
（１０）抗エストロゲン剤の投与により肝細胞障害を引き起こす、（９）に記載のマウス。
（１１）前記（９）に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与して当該マウス由来肝細胞を除去したことを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウス。
（１２）ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである（１１）に記載のマウス。
（１３）前記（１２）に記載のマウスからなる、ヒト肝臓疾患モデルマウス。
（１４）マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、マウス由来の胚性幹細胞の製造方法。
（１５）H2-D分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインが、それぞれヒトHLA-A分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインに置換された、（１４）に記載の方法。
（１６）前記（９）に記載のマウスに抗エストロゲン剤を投与することを特徴とする、肝臓障害モデルマウスの作出方法。
（１７）前記（９）に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与してマウス由来肝細胞を除去することを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウスの作出方法。
（１８）ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである、（１７）に記載の方法。

本発明により、免疫応答が正常なマウス由来の胚性幹細胞であって、ヒトの細胞移植に最適なマウスの確立のための胚性幹細胞が提供される。本発明の胚性幹細胞は、肝臓をヒト化する場合は肝機能に関する種々のヒト遺伝子を導入することができ、ヒト化肝臓モデルマウスを樹立させることができる。従って、本発明の胚性幹細胞から樹立されたマウスは、ヒトの各種臓器の細胞移植に利用でき、100％のヒト化を可能とする点で極めて有用である。

図１は、HHBマウスの作出のために使用されるMHCクラスI分子を示す図である。 図２は、種々の変異型loxを示す図である。 図３は、ヒト成長ホルモン遺伝子をES細胞に導入するための置換ベクターの構築図である。 図４は、ヒト薬物代謝酵素遺伝子をES細胞に導入するための置換ベクターの構築図である。 図５は、ジフテリアトキシン遺伝子のES細胞への導入からマウス肝細胞死までの経過を説明する図である。 図６は、ヒト肝細胞をマウスの胚に移植する部位を示す図である。 図７は、iPS細胞から肝細胞への分化誘導過程を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、正常マウスにおいて、マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子由来のドメインに置換されたマウスの胚から樹立された胚性幹細胞であり、さらに、この胚性幹細胞から、臓器がヒト化されたマウスを確立したというものである。
一般に、マウスの胎児にヒトの細胞を移植すると、その細胞はマウス体内で生着するため、作製されたマウスは、細胞レベルではヒト化されたマウスということになる。
しかしながら、このようなヒト化マウスは、宿主であるマウス由来の細胞が残存するため、臓器がヒト由来のものにすべて置き換わったわけではなく、当該臓器の機能解析や研究を行う上では必ずしも最適化されたマウスであるとは限らない。また、最適化マウスを作製するには、種々の遺伝子改変を行う必要があるが、マウス個体を用いて行うことはできない。

そこで本発明においては、100％の細胞がヒト化された肝臓を有するマウスを樹立するため、ヒト化に最適の遺伝子改変マウスを樹立する。この遺伝子改変マウスは、個体発生の初期からヒト化を目指すべく鋭意検討を行った結果、正常およびHHBマウスより胚性幹細胞（以下「ES細胞」という）を樹立することに成功した。そのES細胞を用いてキメラマウスを作製し、生殖系列に伝わる生殖キメラマウスの作製にも成功した。
本発明においては、HHBマウスから目的のES細胞を樹立することに成功したが、後述のとおり、正常マウスからも、目的のES細胞を樹立することに成功した。。

本発明のマウスは、マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子由来のドメインに置換されたマウスである。
MHCクラスI分子は、重鎖であるα鎖と、軽鎖であるβ2-ミクログロブリン鎖の2つが非共有結合した二量体であり、これにペプチド抗原が結合して三量体として細胞表面に発現する。クラスI分子はα1〜α3の3つの細胞外領域、細胞膜貫通領域及び細胞内領域のドメインからなる。このうち、マウス由来の分子をヒト由来の分子に置換する対象となるドメイン（鎖）は、α鎖（α1〜α3鎖）及びβ2-ミクログロブリン鎖である。本発明においては、全てのドメインをヒト型に置換することができるが、α３ドメインをマウス型とし、α３以外のドメインをヒト型に置換することが好ましい（図１）。
本発明の好ましい態様では、本発明のマウスは、マウスのクラスH2-D遺伝子及びb2-microglobulin遺伝子を破壊するとともに、ヒトのHLA-A2.1遺伝子のうちα１及びα２ドメインを導入したマウスである。この態様では、a3ドメインだけは、マウス由来のドメインである。このマウスを「HHBマウス」という。

また本発明においては、長期間にわたり肝臓機能を維持させるとともに安全性を確認するため、ヒト正常肝臓を有するマウスを樹立する。さらに、肝臓疾患を有するヒト患者と同じ症状の疾患モデルを樹立するとともに病態を解析するために、ヒト変異肝臓を持つマウスを樹立する。さらに、汎用性の高い新規治療法を開発するためにヒト疾患に対し最適化されたモデルマウスを樹立する。

２．マウスの作製
本発明のマウスは、マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子由来のドメインに置換されたマウスの胚を用いて作出されたマウスである。
このマウスは、H2-D及びb2-microglobulin遺伝子がともにノックアウトされ、その上でヒトHLA-A2.1遺伝子により置換されている。好ましくは、α１及びα２ドメインはヒト由来の遺伝子によりコードされ、α３ドメインはマウス由来の遺伝子によりコードされる（図１）。図１（左パネル）に示す分子をコードする遺伝子を「HHD遺伝子」といい、HHD遺伝子を有するマウスを「HHBマウス」という。HHBマウスはすでに確立されている（Pascolo, S., Bervas, N., Ure, J.M., Smith, A.G., Lemonnier, F.A. and Perarnau, B. HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8+ T lymphocytes from b2 microglobulin (b2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db b2m double knockout mice. J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997）。

このH2-D及びb2-microglobulin遺伝子がノックアウトされたマウスの作製手法、及び当該遺伝子についての詳細は、Pacolo et al. J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997に記載されているが、一般には当分野において周知の方法、例えば、ターゲッティングベクターを用いる方法により、作製することができる（Capecchi, M. R., Science, (1989) 244, 1288-1292）。この方法は、マウスES細胞におけるH2-D及びb2-microglobulin遺伝子とターゲッティングベクター上の遺伝子との相同組換えを利用したものである。
なお、HHBマウスは、熊本大学生命資源研究・支援センターから入手することもできる。これらのマウスと、市販のC57BL/6マウスとを戻し交配することにより、C57BL/6マウスと同一系統の遺伝的背景を有するH2-D欠損（-/-）マウス及びb2-microglobulin欠損（-/-）マウスをそれぞれ得ることができる。

H2-D遺伝子及びb2-microglobulin遺伝子の両者が欠損したダブルノックアウトマウスの作製は、まず、C57BL/6-H2-D欠損マウスとC57BL/6-b2-microglobulin欠損マウスとを交配してF1を得、次にF1同士を交配してF2マウスを得る。そして、この中からH2-D欠損（-/-）及びb2-microglobulin欠損（-/-）の両欠損マウス（C57BL/6-H2-D^-/-: b2-microglobulin^-/-マウス）を選択すればよい。C57BL/6-H2-D^-/-: b2-microglobulin^-/-マウスの選択手法として、例えばH2-Dおよびb2-microglobulinの両方の遺伝子を欠損していることをPCR法またはサザンブロット法で確認することができる。

さらにHHD遺伝子をマウス受精卵に注入してトランスジェニックマウス（Tg(HHD)マウス）を得る方法は、Pacolo et al. J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997に記載されている。このマウスとC57BL/6-H2-D^-/-: b2-microglobulin^-/-とを交配することにより、C57BL/6-H2-D^-/-: b2-microglobulin^-/-:Tg(HHD) (すなわちHHBマウス)を得ることができる（図１）。
HHD遺伝子以外にも、マウスH2-D分子のうちの全部のドメインをヒト型に置換することも、α３ドメイン以外のドメインをマウス型のままにしておくことも可能であり、このようなドメインをコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。

３．ES細胞の樹立
本発明のES細胞は、上記のようにして得られたマウスから採取した胚をGSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養することにより、得ることができる。
例えば、HHBマウスを用いる場合、まず、受精後のHHB雌マウスから受精卵又は２細胞期胚を培養することにより得るか、あるいは胚盤胞を直接得る。受精は自然交配、または体外受精法による。体外受精では、メスマウスを過剰排卵させ得た卵子と、オスマウスから採取した精子とを培養することにより行う。
次に、採取した胚盤法または内部細胞塊を、動物細胞の培養用培地中、GSK-3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で約１〜３週間、好ましくは14-18日培養する。

GSK-3（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3）は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼであり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に作用する酵素である。GSK-3阻害剤としては、CHIR99021（入手先：和光純薬）、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）（入手先：和光純薬）などが挙げられる。GSK-3阻害剤の培地中への添加量は、0.1〜10μM(マイクロモラー)、好ましくは0.3〜3μMである。GSK-3阻害剤の培地中への添加時期は特に限定されるものではないが、胚盤法の培養開始時から添加することが好ましい。

MEK阻害剤は、MAP Kinase Kinase (MEK) 活性を阻害し、ERK1/ERK2の活性化を抑制するプロテインキナーゼ阻害剤である。MEK阻害剤としては、例えばPD0325901（入手先：和光純薬）、U0126（入手先：Promega）などが挙げられる。PD0325901阻害剤の培地中への添加量は限定されるものではなく、例えば3μMである。
培養条件は限定されるものではなく、例えば約37℃、５％CO₂の雰囲気中で行う。継代培養は３〜４日間隔で、マウス胚繊維芽細胞（MEF）フィーダー上又はコラゲナーゼＩでコーティングしたプレート上で行ってもよい。

培地としては、例えばGMEM培地（Glasgow's Minimal Essential Medium）、DMEM（ダルベッコの改変イーグル培地）、RPMI1640培地培地などが挙げられる。培養培地には、KSR（Knockout Serum Replacement）、ウシ胎児血清（FBS）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、β-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン等）などから選択し、適宜添加することができる。
所定期間培養後、EDTA又はコラゲナーゼIVを含む培地でインキュベートすることによりES細胞を回収する。回収されたES細胞は、必要によりフィーダー細胞の存在又は非存在下で培養することにより複数回継代することもできる。なお、フィーダー不含条件での内部細胞塊の培養は、MEFで馴化された培地中で行なうことができる。

培養されたES細胞は、一般にそれらのマーカー遺伝子を用いて同定することができる。ES細胞のマーカー遺伝子としては、例えばOct3/4、アルカリ性ホスファターゼ、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4などが挙げられる。マーカー遺伝子又は遺伝子産物の存在は、PCRやウエスタンブロッティング等の任意の手法により検出すればよい。
また、本発明のES細胞が目的のものであるか否かは、BALB/cであるかどうかをSNPマーカーの検出により、あるいはPCRまたはサザンブロット法による解析により確認することもできる。例えば、マウスのSNPのデータベースがhttp://www.broadinstitute.org/snp/mouseに公表されており、このデータベースを用いてSNP情報を照合すればBALB/cであることを確認でき、本発明のES細胞であると判断する。

このようにして得られたES細胞は、「HHB10」と称し、2015年6月17日付（受領日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。その受領番号は、「NITE ABP-02068」である。

上記ES細胞の詳細情報は以下の通りである。
GSK阻害剤およびMEK阻害剤によるES細胞の樹立法については既に論文が公表されているが、得られたES細胞は、元の系統の遺伝的性質を受け継いでおり、それぞれ特有の特徴を含んでいる。

予備実験において、従来使用されるGMEM-KSR 培地を用いてES細胞の樹立を試みたが、増殖の非常に悪い株しか樹立できず、この株を用いてキメラマウスを作製しても50％程度のキメリズムしか得られず、germlineにも寄与しなかった。これに対し、本発明においては、ESの未分化状態維持のために有効とされるGSK3のインヒビターとMEKのインヒビターを培地に加えることで、目的とするES細胞を樹立することができた。本発明のES細胞は、増殖力が高く、キメリズムも高い。その理由は、従来法を用いて作製されたES細胞と比較して、未分化状態をよく保っているからである。ES細胞の分化に働く重要なシグナルの一つは、FGF4からFGFリセプターを介するERK/MEKの経路である。すなわち、ERKは分化のシグナルとして働く。また、GSK-3はb-カテニンをリン酸化することでWntシグナルを刺激し、分化を誘導する。従って、強力なMEKインヒビターであるPD0325901とGSK3インヒビターの2つのインヒビター(2i)を用いることにより、本発明のES細胞は分化を抑制し多分化能を維持することができる。

４．遺伝子改変
ヒト化に最適の遺伝子改変マウスを樹立するには、成体になったマウスではなく、ES細胞の段階で内在遺伝子をヒト型に置換するか、あるいはヒト遺伝子をES細胞に導入した後、その遺伝子改変及び/又は遺伝子導入ES細胞からマウスを作出する必要がある。
そこで本発明において、ES細胞に目的の遺伝子を導入し、あるいはES細胞に内在する遺伝子をヒトの遺伝子に置き換えるため、バクテリオファージ由来の組換えシステムであるCre-loxPシステム、ビブリオ菌由来の組換えシステムであるVCre-Vloxシステム、Creのホモログを利用した組換えシステムであるDre/roxシステム、あるいはこれらの組換えシステムを改変したシステムによる相同組み換えを利用する。

1oxP（locus of crossing (X-ring) over, P1）は34塩基(5'- ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT -3')からなる配列であり（配列番号１）、5'末端から13塩基(逆反復配列１という)、及び3'末端から13塩基の配列(逆反復配列２という)が、それぞれ逆反復配列を構成し、「GCATACAT」により示される8塩基のスペーサーと呼ばれる配列が上記逆反復配列１及び２に挟まれている（図２）。「逆反復配列」とは、スペーサーを境界として、一方の側の配列と他方の側の配列とを互いに向き合わせたときに相補的であるような配列を意味する。

Cre（causes recombination）とは、遺伝子組換えを起こさせる組換え酵素（リコンビナーゼともいう）を意味し、上記反復配列を認識し、スペーサー部の「cataca」を粘着末端とする切断様式で切断する。
ところで、バクテリアの中では、2カ所の1oxP間で組換えが起こり、挿入または削除反応が起こる（図２）。哺乳類細胞で挿入反応を起こすことができれば、後に任意の遺伝子を挿入できるので、応用性は格段に広がる。哺乳類細胞では核が大きいため、一旦削除されたloxPを持つ環状DNAは拡散してしまい、挿入反応は殆ど観察されない。

そこで、本発明者は、挿入反応を起こすために1oxP配列に変異を導入し、一旦遺伝子がゲノムに挿入されると挿入された遺伝子は削除できない（ゲノムから脱離しない）ようにすることを考え、このため複数種類の変異型1oxP（lox66、lox71、lox511、lox2272）を設計した（図２）。これらの変異型1oxPは公知である（WO01/005987号公報、特開2007-100号公報）。

また本発明においては、Vloxと呼ばれるシステムも利用することができる。Vloxとはビブリオ菌由来の組換えシステムであるVCre-Vloxであり（Suzuki, E., Nakayama, M. VCre/VloxP and SCre/CloxP: new site-specific recombination systems for genome engineering. Nucleic Acid Res. 2011, 1-11）、Vlox43L、Vlox43R、Vlox2272などが利用可能である（図２）。

1oxP及び変異型1oxP並びにVloxシステムの塩基配列を以下に示す（図２）。
1oxP：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT（配列番号１）
lox71：TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT（配列番号２）
lox66：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTA（配列番号３）
lox511：ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTAT（配列番号４）
lox2272：ATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTAT（配列番号５）
Vlox：TCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGA（配列番号６）
Vlox43L：CGTGATTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGA（配列番号７）
Vlox43R：TCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAATACCT（配列番号８）
Vlox2272：TCAATTTCTGAGAAGTGTCTTTCTCGGAAATTGA（配列番号９）

さらに本発明においては、Dre/roxシステムを採用することができる。
Dreとは、D6-部位特異的DNAリコンビナーゼであり、下記rox部位の配列を認識する酵素である（Sauer, B. and McDermott, Nucic Acid. Res. 32: 6086-6095, 2004)。このリコンビナーゼ及びrox認識配列を利用した組換えシステムをDre/roxシステムと呼ぶ。このシステムはCre-loxシステムと密接に関係しているが、認識するDNA特異性が異なっている。

lox及びroxの塩基配列を以下に示す。
rox: 5’-TAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTA-3' （配列番号１０）
3’-ATTGAAATTTATTACGGTTAATAAATTTCAAT-5' （配列番号１１）
lox: 5’-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3' （配列番号１２）
3’-TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA-5'（配列番号１３）

本発明においては、前記の通りヒト正常組織、例えばヒト肝臓組織を有するマウスを樹立することを目的としており、組織疾患（例えば肝臓疾患）モデルマウスを樹立することも目的とする。そこで、本発明においてはマウス肝細胞の細胞質において毒素を発現させてマウス肝細胞死を誘導できるよう、ES細胞に遺伝子操作を行う。また、ヒト正常肝臓を有するマウスを作出するにはヒト肝細胞を移植して増殖させる必要があることから、ES細胞において、マウス成長ホルモン遺伝子をヒトの成長ホルモン遺伝子で置換する。また、薬物代謝などの機能を解析するため、マウス薬物代謝酵素遺伝子をヒトの薬物代謝酵素遺伝子で置換する。

肝細胞死を導入したマウスは肝機能を消失するので、このマウスは肝臓障害モデルとして利用できるほか、ヒト正常肝細胞を移植することで、肝臓がヒト化されたマウスを得ることができる。
図３は、マウス成長ホルモン（GH)遺伝子をヒトGH遺伝子に置換するための相同組み換えベクターの構築図である。

また、図４は、薬物代謝酵素遺伝子であるCyp遺伝子をヒトCyp遺伝子に置換するための相同組み換えベクターの構築図である。
マウス遺伝子から上記ヒト遺伝子への置換は、WO01/005987号公報に記載の遺伝子トラップ法に準じて行なうことができる。例えば、前記の通り作製されたベクターを用い、2段階の遺伝子トラップを行う。

第1段階は通常の遺伝子トラップ法である。この通常の遺伝子トラップでは、ES細胞に前記トラップベクターを導入し、ES細胞内に本来的に存在する内在性遺伝子をトラップする。これにより、ES細胞中の内在性遺伝子は破壊される。次に、ヒト遺伝子をプラスミド（置換ベクター）上でlox配列（例えば1ox66等）の下流につなぎ、第２段階の遺伝子トラップを行う（図３、４）。
第２段階の遺伝子トラップでは、1ox66の下流に連結されたヒト遺伝子（hGH、hCyp等）をES細胞に導入する。これにより、第１段階で導入されたトラップベクターの1ox71部位が、第２段階で導入したベクターのlox66との間で組換えを起こし、「（lox71/66)-(ヒト遺伝子)-(loxP)」で構成されるカセットを含む改変した遺伝子を導入できる。なお、ヒト遺伝子とloxPとの間には、ピューロマイシン耐性遺伝子(puro）を連結することができる。

この方法によれば、内在性マウス遺伝子をヒト遺伝子で置換することができる。図３及び４に置換アレルの図を示す。
ここで、図３及び４において、Ex1、Ex2、Ex3及びEx4は、それぞれマウス成長ホルモン遺伝子およびマウスCyp3a13遺伝子のエキソン１〜４を表し、pAはポリA配列を表し、FrtはFLPの認識部位、PGK-neoはPGKプロモーターが連結されたネオマイシン耐性遺伝子、P-puroは、PGKプロモーターが連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を表す。

他の臓器の場合も、臓器移植の対象となり得る臓器である限り上記肝臓の場合と同様である。すなわち、臓器又は組織特異的プロモーターに、Cre-ERT2を接続した遺伝子を作製し、この遺伝子を、CAG-lox-EGFP-lox-DT-Aなどのベクター（後述のコンストラクト１）とともにHHBのES細胞に導入すればよい。
例えば心臓がヒト化されたマウスを作製する場合は、心筋特異的プロモーターであるαMHC(α-myosin heavy chain)プロモーターにCre-ERT2を接続した遺伝子（MC: α-myosin heavy chain-Cre-ERT2）を作製し、この遺伝子をCAG-loxP-EGFP-loxP-DT-A (CD)とともにHHB ES細胞に導入すれば、HHB:MCCDマウスを作製できる。このマウスの胎児の心臓にヒト心筋細胞を移植し、その後タモキシフェンを投与すれば、マウス心筋筋細胞は死滅し、ヒト心筋細胞のみが生き残った心臓ヒト化マウスを作製できる。ヒト心筋細胞を胎児期に移植しておけば、ヒト心筋細胞は拒絶反応を回避できるため、成体になった後にタモキシフェンを投与するかあるいは冠状動脈を結紮することにより心筋梗塞モデルを作製し、その後ヒト心筋細胞を移植することもできる。

５．キメラマウスの作製
キメラマウスの作製は標準的な方法で行うことができる。
まず、上記樹立されたES細胞、又は遺伝子が導入若しくは置換されたES細胞を、8細胞期胚と凝集させるか、あるいは胚盤法に注入する。このようにして作製された胚をキメラ胚というが、このキメラ胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラマウスを作製する。
例えば、キメラ胚の作製は、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、所定日数後に卵管又は子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、ES細胞を凝集または注入し、キメラ胚を作製する。

ここで、「胚」とは、個体発生における受精から出生までの段階の個体を意味し、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞などを包含する。8細胞期胚を用いる場合には受精から2.5日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から3.5日目にそれぞれ卵管又は子宮から初期発生胚を回収することができる。
ES細胞と胚を用いて集合体を作製する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。「集合体」とは、ES細胞及び胚が同一空間内に集まって形成する集合体を意味し、ES細胞が胚に注入された形態、胚を個々の細胞にばらして、ES細胞とともに凝集する形態のいずれをも意味する。

マイクロインジェクション法を採用する場合は、回収した胚に、ES細胞を注入して細胞の集合体を作製する。また、凝集法を採用する場合は、ES細胞を、透明帯を除去した正常胚にふりかけて凝集させればよい。
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内に移植し、その後出産させることによりキメラマウスを作製することができる。

このようなキメラマウスの中から、ES細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。選択した雄のキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ES細胞に由来するマウスの被毛色が現れることにより、多能性幹細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。

６．ヒト化マウスの作製
（１）ヒト化に最適の遺伝子改変マウスの作製
遺伝子が導入又は置換されたES細胞を用いて樹立されたトランスジェニックマウス、すなわち遺伝子改変マウスは、後述するとおり、100％ヒト化した臓器（例えば肝臓）を持つマウスの樹立のための基本となるマウスである。
胎児の卵黄嚢静脈からのヒト肝細胞の移植により拒絶反応を回避できることを明らかにしたので、正常およびHHBマウスのES細胞を用いる。

(i)正常マウス：
すでに樹立されている近交系マウスであれば、すべてに応用できる。本発明においては、正常マウスの胎児の卵黄嚢静脈にヒトの臓器由来の細胞を移植することを特徴とする、当該臓器がヒト化されたマウスの作製方法を提供する。
(ii) HHBマウス：
本発明においては、上記近交系マウスのほかにHHBマウスを使用することができる。HHBマウスは、C57BL/6マウスの遺伝的背景にH2-Dおよびb2-microglobulin遺伝子欠損を導入し、かつHHD遺伝子を導入したマウスである。

（２）肝臓障害モデルマウスの作製
肝臓障害モデルマウスは、抗エストロゲン剤の投与により、毒素を発現させてマウス肝細胞を除去する（死滅させる）ことで、肝機能が失われた障害モデルマウスを作製することができる。
マウス肝細胞の死滅のために、また、マウス肝細胞の細胞質においてCre-ER^T2を発現させるために、以下のコンストラクト１及び２を作製する。Cre-ER^T2とは、Cre組換え酵素遺伝子と、ほ乳類体内で産生されるエストロゲンが結合しないように改変した変異型エストロゲンレセプター遺伝子とを連結したベクターである。

コンストラクト１：
CAG-ATG-lox-EGFP-lox-DT-A
コンストラクト２：
SAP-Cre-ER^T2
コンストラクト1は、CAGプロモーターの直下に、(i)ATG、(ii)loxで挟まれたEGFP、及び(iii) DT-A (diphtheria toxin fragment A)を接続したものである。

EGFPの開始コドンとrox上流のATGはフレームが合うように設計する。また、DT-Aの開始コドンは除去し、rox上流のATGとフレームが合うように設計する。
コンストラクト2は、肝細胞特異的な血清アミロイドP成分 (serum amyloid P component: SAP)のプロモーター直下に、Cre-ER^T2を接続したものである。
これらのコンストラクト１及び２を本発明のES細胞に共導入することにより、タモキシフェン投与後部位特異的組み換えがおこり、肝細胞特異的にジフテリア毒素が発現して細胞死を誘導することができる。

すなわち、非ステロイド性の抗エストロゲン剤として、例えばタモキシフェン（Tamoxifen）は、エストロゲンレセプターに、エストロゲンと競合的に結合し、抗エストロゲン作用を示すことによって抗腫瘍活性を有する物質である。Dre-ER^T2を発現させたヒト化マウスにタモキシフェンを投与すると、タモキシフェンによりDre-ER^T2が核に移行する。2つのrox間における組換えが起こり、ジフテリアトキシン遺伝子のプロモーターが機能する。これにより、毒素DT-Aが発現し、マウスの肝細胞が死滅する（図５）。
タモキシフェンの投与回数及び投与時期は、肝細胞を死滅できる限り特に限定されるものではないが、例えば以下のように行なう。
胎生18.5日目よりタモキシフェンを0.1g/200g餌の割合で、粉餌に混ぜ与える。２日後に産子が行われる、ここで普通餌３日間投与する。その後、再び同じ濃度の餌を１週間与え、その後普通餌３日間投与する。その後は、再び同じ濃度の餌を与え続ける。

（３）肝細胞がヒト肝細胞に置換されたヒト化マウスの作製
肝細胞がヒト肝細胞に置換されたマウスは、上記の通り抗エストロゲン剤の投与によりマウス肝細胞を除去するとともに、ヒト肝細胞をマウスに移植することにより、肝細胞がヒト肝細胞に置換されたヒト化マウスを得ることができる。
ヒト正常肝臓を持つマウスを樹立することは、長期間に渡る肝臓機能の維持と、安全性を確認するために必要である。

(i) マウス成長ホルモン遺伝子がヒト遺伝子に置換されたES細胞の作製
移植後のヒト肝細胞が増殖できるようにするために、マウス成長ホルモン遺伝子をES細胞の段階でヒト遺伝子に置換する。
具体的には、前記の通りES細胞の遺伝子置換を２つのステップで行う。
第1のステップにおいて、SAP-Cre- ER^T2およびCAG-lox-EGFP-lox-DT-A を導入した正常細胞（ES:SAP-Cre-ER^T2;CAG-lox-EGFP-lox-DT-A(ES:SCCD)という）およびHHB ES細胞（HHB ES:SAP-Cre-ER^T2;CAG-lox-EGFP-lox-DT-A(HHB ES:SCCD)という）を用いて相同組換えを行い、マウス成長ホルモン遺伝子を開始コドンのところで破壊するとともに、この領域にlox71-PGK-neo-loxPが組込まれたES細胞（ES: SCCD;Gh^neo）またはHHB ES細胞（HHB ES:SCCD;Gh^neo）を樹立する。
第２のステップにおいて、このES細胞と置換ベクターを用い、neo遺伝子の代わりにヒト成長ホルモン遺伝子cDNAが組込まれたES細胞（ES:SCCD; Gh^hGHまたはHHB ES:SCCD; Gh^hGH）を樹立できる。
このようにして樹立されたES細胞を用いて、ヒト成長ホルモンを産生するマウスを得ることができる。

(ii) マウス肝細胞及び未分化肝細胞の除去
タモキシフェンの投与回数及び投与時期は上記と同様である。

(iii) 移植するヒト肝細胞の作製
移植するヒト肝細胞は、iPS細胞から誘導することができる。
ヒト肝細胞は、ヒトiPS細胞から、支持細胞や細胞外マトリックスを用いて効率的な内胚葉及び肝臓分化誘導方法を確立することができる。
iPS細胞は、Oct、Sox、Klf、Myc、Nanog、Linなどのファミリーメンバーを含む３〜６個の転写因子（核初期化因子）をコードする遺伝子を体細胞に導入することにより誘導することができる（Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2, 3081-9 (2007); Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-62.）。

Octファミリーメンバーとしては、例えばOct3/4、Oct1A、Oct6などが挙げられ、Oct3/4が好ましい。
Sox（SRY関連HMGボックス）ファミリーメンバーとしては、例えばSox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15などが挙げられ、Sox2が好ましい。
Klf（Kruppel様因子）ファミリーメンバーとしては、例えばKlf1、Klf2、Klf4、Klf5などが挙げられ、Klf4が好ましい。
Mycファミリーメンバーとしては、c-Myc、N-Myc、L-Mycなどが挙げられ、c-Mycが好ましい。
Nanogは、胚盤胞の内部細胞塊で最も高く発現し、分化細胞では発現しないホメオボックスタンパク質である。
Linファミリーメンバーとしては、例えば未分化ヒトES細胞のマーカーであるLin28が挙げられる。

より具体的には、転写因子としては、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの組み合わせが好ましいが(Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006))、その他にも、Oct3/4、Sox2及びKlf4の組み合わせ、あるいはOct3/4、Sox2、Klf4及びL-Mycの組合せも使用することができる。

体細胞としては、例えば皮膚細胞、肝臓細胞、繊維芽細胞、リンパ球などが挙げられる。
体細胞への遺伝子導入法は、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルスベクターによる導入などが挙げられ、特に限定されるものではない。ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスなどが挙げられる。市販のベクター、例えばセンダイウイルス（DNAVEC）を利用することもできる。

ベクターを用いる場合、導入する遺伝子が発現し得るように、プロモーター及びエンハンサーなどの調節配列と機能し得る形で連結することもできる。プロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーターなどがある。これらのベクターはさらに、薬剤耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等）などのポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカー（例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子など）、IRES（internal ribosome entry site）、ターミネーター、複製起点などを含めることができる。

体細胞（例えば、0.5×10⁴〜5×10⁶細胞／100mmディッシュ）を、約37℃にて、MEFフィーダー上またはフィーダー不含の条件で、上記核初期化因子を含むベクターをトランスフェクトして培養すると、約１〜４週間後にiPS細胞が誘導される。
培地としては、例えばGMEM培地（Glasgow's Minimal Essential Medium）、DMEM（ダルベッコの改変イーグル培地）、RPMI1640培地、OPTI-MEMI培地などが挙げられる。培養培地には、KSR（Knockout Serum Replacement）、ウシ胎児血清（FBS）、activin-A、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、レチノイン酸、デキサメサゾン、β-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、グルタミン酸、ピルビン酸ナトリウム及び抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）などから選択し、適宜添加することができる。

所定期間培養後、ES細胞の培養のときと同様に、EDTA又はコラゲナーゼIVを含む培地でインキュベートすることにより細胞を回収する。フィーダー不含条件では、細胞をマトリゲルコーティングプレート上、MEFで馴化された培地中で行なうことができる。

iPS細胞からヒト肝細胞へは、３つの段階を経て分化誘導するのが一般的である。原則として、
(a) 多能性幹細胞から内胚葉系への誘導、
(b) 内胚葉系から未熟肝細胞への誘導、及び
(c)未熟肝細胞から成熟肝細胞への誘導である。
上記(a) においてはactivin AやWntシグナルが、(b)においてはFGFやBMPが、そして(c)においてはHepatocyte growth factor、Oncostatin、Dexamethasoneが重要と考えられている。

但し、上記(b)及び(c)のステップは適宜DMSOやレチノイン酸、FGF４やhydrocortisoneおよびに代替することが可能である。
ヒト肝細胞の移植時期は、胎生15.5日目、または生後８週前後の成体マウスである。
ヒト肝細胞の移植細胞数は、10⁵から10⁶個であることが好ましい。
ヒト肝細胞の移植ルートは、胚の場合は卵黄嚢静脈（yolk sac vessel）から注入して移植する（図６）。成体の場合は、脾臓内に注入する。

(iv) ヒト肝細胞の増殖
マウス成長ホルモン遺伝子がヒト成長ホルモン遺伝子に置換されたES細胞を用いて樹立されたマウスは、ヒト成長ホルモンを産生することができる。このヒト成長ホルモンが、移植したヒト肝細胞に働き、その成長を促し、正常なサイズのヒト肝臓を持つヒト化肝臓マウスを樹立できる。
マウス肝細胞がすべて（100％）ヒト肝細胞に置き換わったことの確認、すなわちマウス肝細胞が存在しないことの確認は、マウス肝臓で発現する遺伝子の発現をRT-PCR法等により解析することで行なうことができる。

（４）ヒト化肝臓マウスの評価
肝臓がヒト化されたことは、以下の事項を単独で又は適宜組み合わせて検査することで確認することができる。

(i)肝機能の検証
肝機能を検証するための検査項目としては、例えば以下の項目が挙げられる。検査期間は限定されるものではないが、1年以上行なうことが好ましい。
タンパク関連：総タンパク、ALB, TTT, ZTT, CRP, Haptoglobin, C3, C4
非タンパク性窒素成分：全ビリルビン,直接ビリルビン
糖質：グルコース
脂質：トリグリセリド、総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、 ApoAI、ApoCII
酵素：乳酸脱水素酵素(LDH)、アスパラギン酸アミノ基転移酵素 (AST (GOT))、アラニンアミノ基転移酵素(ALT (GPT))、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、クレアチンキナーゼ(CK)、アルカリホスファターゼ(AP)、アミラーゼ(AML)
その他：カルシウム、Fe、無機リン酸
ICG検査：インドシアニン・グリーン（ICG）を経静脈的に投与し、血中のICG濃度を経時的に測定し、肝臓の色素排泄機能を検査する。ICGは血中のリポ蛋白に結合して肝に輸送され、類洞を通過する間に肝細胞に摂取され、抱合を受けることなく胆汁に排泄されるので、肝細胞ではなく、肝臓全体の臓器としての機能を解析できる。
CT検査：肝臓の形態的な変化を検査する。

(ii) 薬物代謝
PCR array法を用いて、以下の薬物代謝関連酵素を解析する。
・チトクロームP450: CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP21A2, CYP24A1, CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1, CYP27A1, CYP27B1, CYP2A13, CYP2R1, CYP2S1, CYP2B6, CYP2C18, CYP2C19, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A11, CYP3A13, CYP3A43, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A25, CYP3A41, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP7A1, CYP7B1, CYP8B1.
本発明においては、CYP3A11、CYP3A13、CYP3A25及びCYP3A41から選ばれる少なくとも１つが好ましい。
なお、マウスの細胞に内在する薬物代謝関連酵素遺伝子は、冒頭以外のアルファベットを小文字で標記する。例えば、ヒトにおける「CYP11A1」遺伝子はマウスでは「Cyp11a1」遺伝子、ヒトにおける「CYP3A11」遺伝子はマウスでは「Cyp3a11」遺伝子と表記する。

・アルコールデヒドロゲナーゼ: ADH1A, ADH1B, ADH1C, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, DHRS2, HSD17B10 (HADH2).
・エステラーゼ: AADAC, CEL, ESD, GZMA, GZMB, UCHL1, UCHL3.
・アルデヒドデヒドロゲナーゼ: ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, ALDH3A1, ALDH3A2, ALDH3B1, ALDH3B2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH6A1, ALDH7A1, ALDH8A1, ALDH9A1.
・フラビン含有モノオキシゲナーゼ: FMO1, FMO2, FMO3, FMO4, FMO5.
・モノアミンオキシゲナーゼ: MAOA, MAOB.
・プロスタグランジン-エンドペリオキシドシンターゼ: PTGS1, PTGS2.
・キサンチンデヒドロゲナーゼ: XDH.
・ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ: DPYD.

(iii) 肝細胞機能のin vitroでの検証
肝細胞は、内胚葉由来であるので、内胚葉系および肝細胞で発現する遺伝子の経時的な発現、グリコーゲンの蓄積、チトクローム酵素の発現等を調べることで、ヒト肝臓の機能を有するか否かを検証することができる。
内胚葉系および肝細胞で発現する遺伝子の経時的な発現は、Oct3/4, T, Gsc, Mixl1, Foxa2, Hex, Hnf4a, Hnf6, Afp, Alb, Ttr, αAT等で検証できる。その検証手法は、例えば一般的なノザンブロット法、RT-PCR法、ウエスタンブロット法である。
肝細胞の分泌能力は、ALB, transferrin, alpha1-antitrypsin, fibrinogenの培養液中の濃度測定で検証できる。その検証手法は、例えば一般的なウエスタンブロット法あるいはEIA (enzyme-immuno assay)法である。

グリコーゲンの蓄積は、PAS (periodic acid-Schiff)染色で検証できる。過ヨウ素酸はグルコース残基を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。
チトクローム酵素の発現は、主要な５つであるCYP3A4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19及びCYP2D6の解析で検証できる。その検証手法は、例えば一般的なノザンブロット法、RT-PCR法、ウエスタンブロット法である。

（５）ヒト患者由来の肝細胞により置換された肝臓疾患モデルマウスの作製
本発明のマウスに、ヒト患者由来の肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与してマウス由来肝細胞を除去することにより、ヒト肝臓疾患モデルマウスを得ることができる。
ヒト変異肝臓を持つマウスを樹立することは、ヒト患者と同じ症状の疾患モデルの樹立と病態解析のために必要である。そして、ヒト疾患最適化モデルが樹立され、汎用性の高い新しい治療法を開発するために利用することができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、iPS細胞からの肝細胞の誘導、ヒト家族性アミロイドポリニューロパチーの患者、ヒトプロピオン酸血症の患者からのiPS細胞の樹立、誘導したヒト肝細胞を用いてのマウスへの移植実験等に関して、倫理委員会、動物実験委員会、第２種組換えDNA実験安全委員会に申請し、すべて認可された。

ES細胞の樹立
本実施例では、ヒト肝細胞移植に最適なヒト化最適マウスの確立のため、HHBマウス胚からES細胞株の樹立を行い、マウス系統も確立した。

（１）HHBマウスの樹立とそのES細胞株の樹立
HHBマウスを用いて、体外受精を行い、33個の胚盤胞胚を得、ESの未分化状態維持のために有効とされるGSK3のインヒビターであるCHIR99021、及びMEKのインヒビターであるPD0325901を培地に加え(GMEM-KSR-2i培地)、ES樹立を試みた。
具体的には、体外受精にてHHBの胚を採取した。胚盤胞33個をKSOM培地で胚盤胞になるまで４日間培養し、48well(ゼラチンコートのみ)に１つずつ胚を入れた。使用培地はKSR-GMEM-2i培地である。その培地組成として、G-MEM (Glasgow minimum essential medium) の中に、 1 X MEM nonessential amino acids, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1 mM Sodium pyruvate, 1% Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone), 14% Knockout^TM SR (KSR), 1100 uints/ml Leukemia inhibitory factor (LIF), 2 μM PD0325901及び 3 μM CHIR99021 が含まれている。培養期間は１４日間行ない、途中で培地を２回交換した。１４日後から１８日後にかけて、ICMが増えてきたwellからフィーダー細胞つきの24 wellに植え継ぎを行った。さらに、順次、12well、6 well、6-cm dishへと植え継ぎを行い、最終的に、増殖速度及び形態とも全く問題のないES株を21系統樹立することが出来た。

（２）HHB ES細胞株を用いたキメラマウス作製とHHBマウス系統の樹立
樹立できたES株のうち12のセルラインを用い、B6メスとBDF1オスの交配により得られたモルラ胚とアグリゲーションを行うことで、キメラマウス作製を行った（表１）。
３つのESライン（HHB-3, HHB-9及びHHB-10）で得られた100％キメラから、生殖系列への伝達を確認した。
なお、得られたES細胞のうち、10番目のセルラインを「HHB10」と称し、2015年6月17日付（受領日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。その受領番号は、「NITE ABP-02068」である。

マウス肝細胞死の誘導
（１）マウス肝細胞死の誘導のためのコンストラクトの作製
肝細胞を特異的に死滅できる遺伝子改変マウスを作製するため、2種類のコンストラクトを作製した。
コンストラクト1 (CAG-ATG-lox-EGFP-lox-DT-A)はCAG promoterの直下に、ATG、loxで挟まれたEGFP、及びDT-A (diphtheria toxin fragment A)を接続している。
EGFPの開始コドンとrox上流のATGはフレームが合うように設計した。また、DT-Aの開始コドンは除去しrox上流のATGとフレームが合うように設計した。
コンストラクト2 (SAP-CreER^T2)は肝細胞特異的な血清アミロイドP成分 (serum amyloid P component: SAP)のプロモーター直下にCre-ER^T2を接続している。加えて、SAP promoterの上流にはpuromycin耐性遺伝子を接続している。
具体的手法は以下の通りである。

(1-1) コンストラクト1
コンストラクト１は、以下のように作製した。
(i) p6SEAZをPstI、pSP-rox2をKpnIで制限酵素処理し、T4 Polymerase (TaKaRa)でブラントエンドにした。その後、EcoRIで制限酵素処理を行い、ライゲーションし、pSP-lox-EGFP-loxを作製した。
(ii) pSP-lox-EGFP-loxとpBSK-atg-rox2（合成DNA, Biomatik社 ）をEcoRIとSmaIで制限酵素処理を行い、ライゲーションし、pBSK-atg-lox-EGFP-loxを作製した。
(iii) pBSK-atg-lox-EGFP-loxとP71hAXC-DTをBamHIとPstIで制限処理を行い、ライゲーションし、pBSK-atg-lox-EGFP-lox-DT-Aを作製した。
(iv) pCAGGS-EGFPをKpnIで、pBSK-atg-lox-EGFP-lox-DT-AをSpeIで制限酵素処理し、T4 Polymerase (TaKaRa)でブラントエンドにした。その後、Hind IIIで制限酵素処理を行い、ライゲーションをしCAG-atg-lox-EGFP-lox-DT-Aを作製した。

(1-2) コンストラクト2
コンストラクト２は、以下のように作製した。
(i) pkSAP-CrePPをtemplateとし、開始コドンからストップコドン手前までをPCRで増幅した。Reverse PrimerにはBamHIsiteを付加した。
PCR kit TaKaRa Ex Taq
Fw Primer CCATGGCCCCCAAGAAGAAAA（配列番号１４）
Re Primer CGGGATCCATGAGCCTGCTGTT（配列番号１５）
pGEM-T Easy Vectorと上記のPCR産物をライゲーションし、T easy-Dreを作製した。
(ii) pkSAP-CrePPとT easy-CreをSalIとEcoRIで制限酵素処理をし、ライゲーションを行い、T Easy SAPを作製した
(iii) 前記T Easy Cre とT easy-SAPをSacIIとNotIで制限酵素処理をし、ライゲーションを行い、T easy-SAP-Creを作製した。
(iv) T Easy-SAP-CreとpkSA-CremER^T2PPを用いて、BamHIとNotIで制限酵素処理し、ライゲーションを行い、T easy-SAP-CremER^T2を作製した。
(v) pkSAP-CrePPとT easy-SAP-CremER^T2をSalIとNotIで制限酵素処理し、ライゲーションを行い、pKSAP-CreER^T2を作製した。
(vi) pKSAP-CreERT2をSpeIで、pFPacpaF2をKpnIで制限酵素処理を行い、T4 polymerase (TaKaRa)でブラントエンドにした。その後、pKSAP-CreER^T2をSalI、pFPacpaF2をXhoIで制限酵素処理を行い、ライゲーションをしPuro-SAP-CreER^T2を作製した。

（２）エストロゲン受容体遺伝子及びジフテリアトキシン遺伝子のES細胞への導入
ヒト遺伝子を挿入時に、効率よく発現させるための条件検討を行った（Li, Z. et al., Transgenic Res. 20:191-200, 2011. DOI 10.1007/s11248-010-9389-2２）。
PGK-puromycinカセット及びIRESの有無により、どの組み合わせのときが最も発現効率が良いかを解析した。
相同組換えベクターを用いて、通常の方法（Zhao, G., Li, Z., Araki, K., Haruna, K., Yamaguchi, K., Araki, M., Takeya, M., Ando, Y. and Yamamura, K. Inconsistency between hepatic expression and serum concentration of transthyretin in mice humanized at the transthyretin locus. Genes Cells 13: 1257-1268, 2008.）によりあらかじめマウスtransthyretin(Ttr)遺伝子の第１エクソンを破壊した。このとき第１エクソンのATGが破壊され、その部分にlox71-PGK-beta-geo-loxP-poly A-lox2272が組込まれた標的組換えクローンを得た。

次いで、２種類の置換ベクターを作製した。置換ベクター１は、lox66-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxPを含んでいる。置換ベクター２は、lox66-IRES-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxPを含んでいる。これらの置換ベクターをそれぞれ標的組換えクローンに、Cre発現ベクターとともに電気穿孔法にて導入した。

その結果、lox71/66-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxPクローン（ I(-)P(+)と略称）及びlox71/66-IRES-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxPクローン（ I(+)P(+)と略称）を得た。この２つのクローンはいずれもPGK-puroを持つが、I(-)P(+)はIRESを持っていない。
この２つのクローンにCAG-FLPを電気穿孔法にて導入し、Frt間のPGK-puroを削除し、I(-)P(-)およびI(+)P(-)クローンを作製した。
上記４つのESクローンからマウスを作製し、発現解析を行ったところ、I(-)P(+)での発現が最も高く、I(-)P(-), I(+)P(+), I(+)P(-)の順に発現が低下することが分かった。また、I(-)P(+)の場合は、肝臓でのヒトTTR（トランスチレチン）の発現は、コントロールマウスにおけるマウスTtr（トランスチレチン）の発現レベルとほぼ同じであることが分かった。
その結果、PGK-puromycinが存在し、IRESが存在しない組み合わせが、挿入したヒト遺伝子の発現効率が最も良いことを明らかにした。

ヒト成長ホルモン遺伝子による置換
相同組換えベクターを用いて、実施例２と同様に通常の方法によりあらかじめマウスgrowth hormone (Gh)遺伝子の第１および第２エクソンを破壊した。このとき第１エクソンのATGが破壊され、その部分にlox71-PGK-beta-geo-loxP-poly A-lox2272が組込まれた標的組換えクローンを得た。次いで、置換ベクターを作製した。置換ベクターは、lox66-ゲノムhGH遺伝子-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxPを含んでいる。この置換ベクターを標的組換えクローンに、Cre発現ベクターとともに電気穿孔法にて導入した。
その結果、マウスのGh遺伝子がヒトGH遺伝子で置換されたESクローンを得た。

ヒト薬物代謝酵素遺伝子による置換
通常の方法によりあらかじめ相同組換えベクターを用いて、マウスCyp3a13遺伝子の第１エクソンを破壊した。このとき第１エクソンのATGが破壊され、その部分にlox71-PGK-beta-geo-loxP-poly A-lox2272が組込まれた標的組換えクローンを得た。次いで、置換ベクターを作製した。置換ベクターは、lox66-hCYP3A4 cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxPを含んでいる。この置換ベクターを標的組換えクローンに、Cre発現ベクターとともに電気穿孔法にて導入した。
その結果、マウスのCyp3a13遺伝子が、ヒトCYP3A4遺伝子で置換されたESクローンを得た。

肝臓ヒト化マウスの作製
ヒトiPS細胞からのヒト肝細胞の分化誘導方法をほぼ確立し、マウス肝細胞死の誘導のためのコンストラクトの作製も行った。

（１） ヒトiPS 細胞からの肝細胞の分化誘導
ヒトiPS細胞から、効率的な内胚葉および肝臓分化誘導方法を構築した。
iPS細胞からヒト肝細胞に分化させるために、初日から２日目まではRock inhibitorを含む培地で培養した。その後、３日目から４日目までDMEM 培地を用いて培養した。このDMEM 培地は以下を含む：4,500 mg/l glucose, activin A (100 ng/ml), CHIR99021 (3mm)、 bFGF (50 ng/ml)。
次いで、４日目から１３日目までは4,500 mg/l glucose, Dexamethazone 1mm, Hepatocyte growth factor 10mm を加えて培養した。
最後に、１５日目から３０日目まで以下を含むDMEM 培地で培養した：10% KSR, Dexamethazone 1mm, Hepatocyte growth factor 10mm oncostatin M (30ng/mL)。

（２）iPS由来ヒト肝細胞の移植方法の検討
肝臓をヒト化するために必要な、マウス肝臓に効率よくiPS由来肝細胞を導入する方法の確立を目的として、iPS由来ヒト肝細胞を胎生期16.5日目または17.5日目のマウス胎仔の羊膜上に存在する卵黄嚢血管（yolk sac vessel）を経由して導入する方法を開発した（図６）。

上記（1）の項で作製した肝細胞を移植に用いた。
この培養方法により、培養4日目にSox17陽性の内胚葉が、培養7日目にAFP陽性の未熟な肝臓細胞が、培養16日目にはALBUMIN陽性の成熟肝細胞が分化誘導された。
また、肝臓細胞はマウス特異的プライマーを用いたRT-PCR解析によりマウス遺伝子の発現を認めないことから、100％がヒト由来のものであることが分かった。
肝細胞を移植し、１４日目に肝臓を体外に取り出し、抗ヒトcytokeratin8/18抗体を用いて免疫染色を行ったところ、ヒト肝細胞が生着していることを確認した。また、４週間後に同様の解析を行ったところ、ヒト肝細胞のコローニーサイズが拡大していること、肝小葉構造の中にヒト肝細胞を組入れられていることがわかった。

変異ヒト化肝臓マウスの樹立
本実施例では、FAP及びPAのモデルマウスの繁殖を行った。

（１）ヒト患者からの変異肝細胞の誘導
(i) 家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)：樹立済み
FAPは、トランスサイレチン(transthyretin: TTR)遺伝子の点突然変異により引き起こされる常染色体優性遺伝病である。例えば、FAPでは、トランスサイレチンのアミノ酸配列において、３０番目のアミノ酸がバリンからメチオニンに置換されている(Val30Met)。このVal30Met変異を持つ患者から採取した線維芽細胞を用いてiPS細胞を樹立した。
そして、このiPS細胞から、これまでに述べた方法と同じ方法で、肝細胞へ分化誘導できることが分かった。

(ii) ヒトプロピオン酸血症(PA)の患者からのiPS細胞の樹立
PAは、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ（propionyl CoA carboxylase ：PCCA） 遺伝子の異常により引き起こされる常染色体劣性遺伝病である。例えば、PAでは、PCCAのアミノ酸配列において、５２番目のアルギニンがトリプトファンに置換されている(Arg52Trp)。この変異を持つ患者から採取した線維芽細胞を用いてiPS細胞を樹立した。そして、このiPS細胞から、これまでに述べた方法と同じ方法で、肝細胞へ分化誘導できることが分かった。

（２）変異ヒト化肝臓マウス（FAP及びPAのモデルマウス）の樹立
変異ヒト化肝臓マウスの樹立は、ヒト化肝臓マウス（正常人由来のiPSから誘導した肝細胞を移植して作製したマウス）の作製方法と同様に、FAPおよびPA患者由来のiPS細胞から分化誘導して得た肝細胞を本発明のマウスに移植することにより樹立することができる。

本発明により、HHBマウス由来のES細胞が提供される。本発明のES細胞を用い作製された胚にヒト細胞移植することにより、目的臓器（例えば肝臓）がヒト化されたマウスを作出することができ、ヒトの臓器機能を調べることができる。

微生物の表示：「HHB10」
受領番号：NITE ABP-02068
原寄託日（受領日）：2015年6月17日
国際寄託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8

配列番号１〜１５：合成DNA

Claims (18)

1. マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養して得られる胚性幹細胞。
2. H2-D分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインが、それぞれヒトHLA-A分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインに置換された、請求項１に記載の胚性幹細胞。
3. 受託番号がNITE BP-02068で示される、請求項１又は２に記載の胚性幹細胞。
4. エストロゲン受容体遺伝子及びジフテリアトキシン遺伝子が導入された、請求項１〜３のいずれか１項に記載の胚性幹細胞。
5. 細胞中に内在する成長ホルモン遺伝子がヒト由来のものに置換された、請求項４に記載の胚性幹細胞。
6. さらに、細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子がヒト由来のものに置換された、請求項５に記載の胚性幹細胞。
7. 細胞中に内在する薬物代謝酵素遺伝子が、Cyp3a11、Cyp3a13、Cyp3a25及びCyp3a41からなる群から選択される少なくとも１つである請求項６に記載の胚性幹細胞。
8. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の胚性幹細胞を用いて作出されたマウス。
9. 請求項４〜７のいずれか１項に記載の胚性幹細胞を用いて作出されたマウス。
10. 抗エストロゲン剤の投与により肝細胞障害を引き起こす、請求項９に記載のマウス。
11. 請求項９に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与して当該マウス由来肝細胞を除去したことを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウス。
12. ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである請求項１１に記載のマウス。
13. 請求項１２に記載のマウスからなる、ヒト肝臓疾患モデルマウス。
14. マウスMHCクラスIのH2-D分子のうち全部又は一部のドメインが、ヒトMHCクラスIのHLA-A分子のドメインに置換されたマウスの胚を、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、マウス由来の胚性幹細胞の製造方法。
15. H2-D分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインが、それぞれヒトHLA-A分子のα１ドメイン、α２ドメイン及びβ２ミクログロブリンドメインに置換された、請求項１４に記載の方法。
16. 請求項９に記載のマウスに抗エストロゲン剤を投与することを特徴とする、肝臓障害モデルマウスの作出方法。
17. 請求項９に記載のマウスにヒト由来肝細胞を移植するとともに、抗エストロゲン剤を投与してマウス由来肝細胞を除去することを特徴とする、肝臓がヒト化されたマウスの作出方法。
18. ヒト由来肝細胞が、肝臓疾患を有する患者由来のものである、請求項１７に記載の方法。