CN106566843B - 一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的构建方法及其应用 - Google Patents
一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的构建方法及其应用，该模型是将BALB/c背景的复制型HBV转基因小鼠与同背景的Rag‑1基因敲除小鼠杂交，筛选出表达HBsAg的成年和幼年Rag‑1‑/‑小鼠；然后，分别给成年和幼年的该小鼠回输同背景的野生型未致敏的小鼠脾淋巴细胞，构建年龄依赖的急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎小鼠模型。该模型可以用于探索清除病毒和病毒持续感染的细胞与分子机制，寻找乙肝免疫治疗新靶点，筛选抗乙肝药物。本发明提供的模型制备方法具有重复性好，病毒学和生化及病理学检测指标稳定性、可靠性显著，成本适中的优点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体地，涉及一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的构建方法及其应用。
背景技术
乙肝病毒(HBV)感染在我国依然是较为严重的公共卫生问题，95％的成年人感染HBV后可以自然清除，而围产期感染者有90％会慢性化，结果导致肝纤维化和肝硬化，甚至肝癌。目前认为乙肝发病机制主要是机体清除乙型肝炎病毒而引发的细胞免疫病理改变，机体对病毒的免疫应答有赖于一系列免疫活性细胞的相互作用。人乙肝病毒的自然宿主仅限人、黑猩猩和树鼩，因此，黑猩猩虽被认为是最理想动物模型，但面临伦理和经济的限制。鸭可以感染DHBV，但与树鼩、旱獭一样，都是由于非纯系动物难以研究免疫系统对病毒的作用而在致病机理研究方面受到很大的限制。由于对小鼠的免疫学研究比较深入，而且与人比较很相似，但是由于小鼠并不感染HBV，只能采用转基因技术实现完整的HBV基因组在小鼠肝脏细胞特异性地表达，HBV转基因小鼠曾经成为较为理想的乙肝免疫发病机制研究模式动物。
1995年Chisari FV小组报道了高复制HBV转基因小鼠，复制水平与慢性HBV患者相当，才有力地推动了乙肝发病机制的研究。解放军第四五八医院全军肝病中心于2000年(熊一力等，高表达乙型肝炎病毒转基因小鼠的制备，传染病信息，2000，13(4)：164-5)采用受精卵显微注射法利用1.3倍D基因型HBV基因组建立了复制型HBV转基因小鼠，经过10多年的优化培育，目前已稳定传至35代(孔祥平等，复制型HBV转基因小鼠遗传稳定性研究，中国生物工程杂志，2008，28(5)：17-21)，Southern检测肝内有HBV复制中间体存在(陈阳述等，Southern Blot检测HBV(ayw)转基因小鼠组织HBV复制中间体，解放军医学杂志，2011，36(9)：959-961)。利用蛋白质组学比较复制型HBV小鼠与正常小鼠的肝脏细胞蛋白质表达(Ding C,et al.Hepatocytes proteomic alteration and seroproteome analysis ofHBV-transgenic mice,Proteomics,2009,9:87-105)，发现部分的酶表达异常。发现HBV小鼠原代肝细胞对酒精所致损伤更敏感(陶鑫等，复制型H BV-T g小鼠原代肝细胞的培养，华南国防医学杂志，2011,25(2)：97-100)，目前已在国内的广泛应用。
目前公认的乙肝研究模式动物是人源化小鼠模型，利用新一代免疫缺陷小鼠输注人胎肝细胞和人CD34造血干细胞，可以把小鼠的肝脏细胞与免疫系统都改造为人源的。这样不仅可以实现乙肝病毒自然感染，而且可以研究病毒与人免疫系统之间的相互作用(程亮等，从动物模型看乙型病毒性肝炎致病机制的研究进展，生命科学，2010，338-343)。目前已经利用FAH-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠完成了肝细胞嵌合的人源化的建模(Bissig KD,Wieland SF,Tran P,et al.Human liver chimeric mice provide a model forhepatitis B and C virus infection and treatment,J Clin Invest.2010,120(3):924-30)，实现在小鼠体内的乙肝病毒感染，而由于完全人源化小鼠的建模制备技术要求高，费用昂贵，尚在研究中(孔祥平等，复制型HBV转基因小鼠的建立与应用，解放军医学杂志，2011,36(9)：954-958)。总之，在研究病毒与机体之间相互作用中，目前仍难以提供有规模、价格适中的小鼠模型，国内人肝嵌合小鼠以及完全人源化小鼠未见正式报道。
近年来发现对于不同年龄的Rag-1-/-/HBV小鼠的免疫重建的结局类似在人不同年龄感染HBV的结局(Publicover J,et al.IL-21is pivotal in determining age-dependent effectiveness of immune responses in a mouse model of humanhepatitis B,J Clin Invest，2011,121(3)：1154-1162)。幼年小鼠仅产生HBcAb，不能产生HBsAb，清除外周血中的HBsAg，类似婴幼儿HBV感染后病毒持续感染而慢性化，而成年小鼠则产生HBsAb和HBcAb，清除外周血中的HBsAg，类似成年人急性自限性感染。该小鼠模型模拟了人类幼年和成年感染HBV后病毒清除的差异。利用该小鼠模型新近发现NKT细胞可能在HBV感染早期的免疫激活，控制病毒感染慢性化中起重要作用(Zeissig S,etal.Hepatitis B virus-induced lipid alterations contribute to natural killer Tcell-dependent protective immunity,Nat Med,2012,18(7):1060-1068)。
但是，截至目前为止，还未见BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的构建方法。
本发明的另一个目的是提供一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将BALB/c背景的复制型HBV转基因小鼠与同背景的Rag-1-/-小鼠杂交，筛选出成年和幼年Rag-1-/-/HBV小鼠；
(2)分离野生型BALB/c小鼠脾淋巴细胞，分别回输给成年和幼年Rag-1-/-/HBV小鼠，构建成年龄依赖的急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎小鼠模型。
Publicover J,et al(2011)构建的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型是C57背景HBVTg小鼠，而本发明的目的是构建BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型，不同背景的小鼠在构建模型时，需要解决的技术问题和达到的目标是不同的。C57背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型需要达到的目标是，更适合于观察细胞免疫反应，尤其是研究病毒特异性CTL在HBV免疫治疗中的作用。而BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型需要达到的目标是，更适合于观察体液免疫指标，如乙型肝炎表面抗原的血清学转换；HBcAb的定量检测可以反应体内抗病毒免疫反应的动态变化。在目前以强调慢性乙型肝炎功能性治愈为理想治疗终点的情况下，是否能实现HBsAg的血清学转换成为衡量治疗结果的重要指标，因此，构建BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型有C57遗传背景小鼠不可取代的优点。
本发明构建的年龄依赖的急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎小鼠模型，HBsAg、HBsAb、HBcAb等检测指标灵敏度高、重复性好；急性乙型肝炎小鼠模型有90％能清除HBsAg，慢性乙型肝炎小鼠模型有90％能形成耐受。
Rag1-/-小鼠表现严重的T/B细胞早期发育阻滞，表现为没有成熟T/B淋巴细胞。将原来的HBV转基因小鼠通过与Rag-1-/-小鼠杂交，形成Rag-1-/-/HBV小鼠不含有T、B淋巴细胞。这样再过继输入未经过免疫的、同遗传背景的、野生型小鼠脾脏淋巴细胞重建小鼠免疫系统，可以模拟乙肝病毒初次感染的状态，类似于人的急性HBV感染。
与目前的人源化小鼠模型相比，本发明构建的年龄依赖的乙肝小鼠模型可以较快在国内实现规模化，制备较简便，价格适中。因此，有必要在国内开展基于BALB/c背景的Rag-1-/-/HBV转基因小鼠免疫重建年龄依赖的小鼠模型建立的研究。将原有1.3倍D基因型复制型HBV转基因小鼠(BALB/c背景)与从美国引进BALB/c背景的Rag-1-/-小鼠，杂交得到Rag-1-/-/HBV小鼠并批量生产。
所述步骤(1)中复制型HBV转基因小鼠和Rag-1-/-小鼠为8～9周龄，雌雄均可，杂交后在F1代中筛选HBsAg+、Rag-1+/-小鼠，雌雄F1代繁殖产生F2代，理论上有四分之一Rag-1-/-小鼠，其中还有HBsAg-小鼠，只有用雌雄均为HBsAg+、Rag-1-/-小鼠再繁殖，筛选出的HBsAg+、Rag-1-/-小鼠才能作为实验用鼠。
所述步骤(2)中野生型BALB/c小鼠采用8～9周龄，雌雄均可。分离脾淋巴细胞时，脾脏用一次性注射器活塞于200目无菌尼龙膜磨碎，用40％和70％percoll浓度梯度离心，分离淋巴细胞，细胞浓度为2×107～2×108个/ml，优选1×108个/ml。浓度太低，注射体积过大，浓度太高，则容易引起误差。回输细胞个数，成年为1×107～5×107，优选5×107/只；幼年为1×107～2×107，优选2×107/只。
淋巴细胞回输的方式采用尾静脉注射。成年Rag-1-/-/HBV小鼠选用8～9周龄，幼年鼠选用15～20日龄，优选20日龄。鼠龄太大，回输细胞后清除HBsAg的比例增大，接近成年，太小难以完成尾静脉注射。
本发明构建的BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的应用范围，包括以下方面：
(1)比较两种小鼠模型肝脏免疫细胞数量与功能的差异，探索病毒持续感染的细胞与分子机制；
(2)利用慢性乙型肝炎小鼠模型可以在新佐剂(DC-Chol等)疫苗、细胞因子(IL-12等)、Toll样受体激动剂(GS-9620等)和中药(清热解毒等)中筛选抗HBV药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将8～9周野生型BALB/c小鼠脾淋巴细胞分别回输给8～9周龄和15～20日龄同背景的T、B淋巴细胞缺失的Rag-1-/-/HBV小鼠，构建成年龄依赖的急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎小鼠模型，具有重复性好，无死亡，操作方法简便、安全、成本适中，可进行大规模实验的优点。建成的急性乙型肝炎模型在回输后1～2周，90％以上的小鼠能清除HBsAg，4周后，部分小鼠可检测到HBsAb，在回输后HBcAb由高变低，与成年人感染并清除乙肝病毒的过程极为相似，该模型可进行相关机制研究；建成的慢性乙型肝炎小鼠模型只有不到10％的小鼠可部分清除HBsAg，幼年鼠在回输后HBcAb由低变高，与婴幼儿感染乙肝病毒并慢性化的过程十分相似，可进行机制研究和新药筛选，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为Rag-1基因PCR产物电泳，其中，1为Rag-1-/-对照，2为Rag-1+/+对照，3～9为待测样品。
图2为小鼠回输脾淋巴细胞3天后肝脏HE染色。
图3为Rag-1-/-/HBV小鼠ALT变化。
图4为回输细胞后成年鼠和幼年鼠HBsAg随时间变化曲线。
图5为回输细胞后成、幼年鼠HBsAb随时间变化。
图6为回输细胞后成、幼年鼠产生HBcAb的比率。
图7为回输细胞后成、幼年鼠HBcAb随时间变化。
图8为治疗前后各组小鼠HBsAg变化。
图9为治疗后各组小鼠产生HBsAb水平。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
动物材料：BALB/c背景的Rag-1-/-小鼠购自Jackson实验室；BALB/c背景的HBV转基因小鼠由本中心于2000年(熊一力,贾彦征，王洪敏等，高表达乙型肝炎病毒转基因小鼠的制备，传染病信息，2000，13(4)：164-5)采用受精卵显微注射法利用1.3倍D基因型HBV基因组建立，饲养条件：在IVC笼中饲养，温度23±1℃，12小时昼、夜节律，饮用无菌去离子水。
试剂：Tissue DNA Kit购自OMEGA；percoll分离液购自Pharmacia；乙型肝炎病毒表面抗原测试盒购自上海科华生物科技有限公司；乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒购自DiaSorin；乙型肝炎病毒核心抗体定量测定试剂盒(夹心)购自北京万泰生物药业股份有限公司；ExTaq购自TaKaRa；谷丙转氨酶(ALT/GPT)测定试剂盒购自南京建成科技有限公司；CD45R/B220PE、IgM APC、CD3e PE-CyTM5、CD4PE、CD8a FITC购自BD公司，台式高速离心机(TG16-WS)购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，酶标仪(MultiskanFC)购自Thermoscientific。
实施例1
Rag-1-/-/HBV小鼠的繁殖：将Rag-1-/-小鼠与HBV转基因小鼠杂交，获得F1代Rag-1+/-/HBV小鼠。F1代雌雄个体相互交配获得F2代，其Rag-1基因型可能为Rag-1+/+、Rag-1+/-和Rag-1-/-，从中筛选出实验所需的Rag-1-/-/HBV小鼠，再经流式细胞术检测，确认其是否含成熟的T/B淋巴细胞，得到的小鼠用于生产保种及实验研究。
Rag-1-/-/HBV小鼠的鉴定：包括Rag-1基因检测和HBsAg检测。
Rag-1基因检测：Rag-1基因采用PCR方法检测，剪取小鼠尾组织2～5mm，用TissueDNA Kit试剂盒提取DNA，以此为模板，用3条引物进行PCR。3条引物序列如下：
P1：5’-GAGGTTCCGCTACGACTCTG-3’；
P2：5’-CCGGACAAGTTTTTCATCGT-3’；
P3：5’-TGGATGTGGAATGTGTGCGAG-3’；
PCR体系组成(25μl)：DNA模板2μl；dNTP 2μl；10×buffer 2.5μl；P1 2.4μl；P21.2μl；P3 2.4μl；Ex Taq酶0.5μl；双蒸水12μl。
PCR条件：94℃,2min；(94℃,30s，58℃,45s，72℃,45s)35循环，72℃,2min；10℃,2h。
2％琼脂糖凝胶100V电泳1h，470bp单一条带为Rag-1+/+，530bp单一条带为Rag-1-/-，530bp和470bp两条带为Rag-1+/-，如图1所示，3、5、8、9为Rag-1+/-，4为Rag-1-/-，6、7为Rag-1+/+。
HBsAg检测：眼眶采血，37℃放置1小时，3000rpm离心10min分离血清，生理盐水稀释10倍，用上海科华乙肝表面抗原试剂盒，按说明书采用ELISA方法检测进行，OD450在0.105以上为HBsAg阳性，如表1所示，5号为阴性，其余均为阳性。
表1小鼠HBsAg水平(OD450)
| 鼠号 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| HBsAg | 2.325 | 1.963 | 0.026 | 2.544 | 2.387 | 2.638 | 2.221 |
T、B淋巴细胞检测：T、B淋巴细胞采用流式细胞术检测，引颈处死小鼠，摘取小鼠胸腺，分离胸腺淋巴细胞，用美国BD公司CD3、CD4、CD8抗体检测CD3+细胞比例、CD3++CD4+细胞比例、CD3++CD4+细胞比例和CD4++CD8+细胞比例，观察T细胞发育情况；分离骨髓淋巴细胞，用美国BD公司IgM和PB220抗体检测B细胞比例，观察B细胞发育情况；分离脾脏淋巴细胞，检测成熟T、B淋巴细胞比例，用杂合子小鼠和野生型小鼠作对照，如表2所示。
表2不同RAG-1基因型小鼠T、B淋巴细胞比例
从上述实验结果可知，BALB/c背景的Rag-1-/+HBsAg+和Rag-1+/+HBsAg+小鼠各器官的T、B淋巴细胞数量无明显差别。Rag-1-/-HBsAg+和Rag-1-/-HBsAg-小鼠各器官T、B淋巴细胞数量无明显差别，说明HBV基因对Rag-1基因无明显影响作用。Rag-1-/-HBsAg+和Rag-1+/+HBsAg+小鼠各器官的T、B淋巴细胞数量相差大，说明Rag-1-/-HBsAg+小鼠中Rag-1基因的缺失，导致了T、B淋巴细胞早期发育阻滞。
实施例2
小鼠模型的制备：分离8～10周野生型BALB/c小鼠脾淋巴细胞是用10ml注射器活塞在200目尼龙布上研磨，细胞悬液1500rpm离心8min,弃上清，1×PBS重悬细胞，小心加在40％和70％percoll分离液上，1500rpm离心20min，离心管内分6层，从上向下依次为PBS、死细胞、40％percoll、活的脾细胞、70％percoll和红细胞，吸取活的脾细胞，用1×PBS洗1次，计数，调浓度。经尾静脉回输1×107个淋巴细胞给20日龄，5×107个淋巴细胞给8～9周龄同背景Rag-1-/-/HBV小鼠。
细胞回输后肝脏病理变化：脾细胞回输后3天，杀鼠取肝脏，用4％甲醛固定，常规HE染色，成年Rag-1-/-/HBV小鼠肝脏有大量炎性细胞侵润(图2A)，幼年Rag-1-/-无明显炎性细胞侵润(图2B)。
Rag-1-/-/HBV小鼠脾细胞回输后血清ALT、HBsAg、HBsAb和HBcAb检测：分别于回输前2天，回输后第1、2、3、4、8、12、16、20、24周眼眶采血，分离血清，检测ALT和HBsAg，1个月后检测HBsAb。成年鼠ALT在3天到1周明显升高，随后降到转输前水平，幼年鼠ALT无明显变化，如图3。成年鼠HBsAg在1周开始下降，2周后降至起始水平的5％左右，幼年鼠HBsAg无明显变化，如图4。成年鼠在1个月有HBsAb产生，一直持续至24周，如图5。成年、幼年小鼠回输后均100％产生HBcAb，如图6。
应用例1
病毒的免疫清除与HBcAb的关系：分别于成年、幼年小鼠回输脾淋巴细胞前(0天)、及回输后14、42、63天眼眶采血，37℃放置1小时，3000rpm离心10min分离血清，用乙型肝炎病毒核心抗体定量测定试剂盒(夹心)，按说明书采用ELISA方法进行检测，幼年鼠在回输后HBcAb由低变高，成年鼠在回输后HBcAb由高变低，如图7。
定量检测HBcAb的结果表明其与肝脏的炎症相关，因此，HBcAb的水平可以代表机体对病毒的固有免疫反应的程度大小。严重肝脏损伤时，HBcAg从肝脏细胞中释放出来，激活B细胞，从而引起HBcAb的水平升高；反之，肝脏炎症小的时候，释放到细胞外的HBcAg比较少，对B细胞刺激程度低，因而，HBcAb的水平自然就低。Min-ran LI等(2016medcine)利用肝脏病理检测的结果，观察其与HBcAb水平的关系，直接的观察到肝脏固有免疫与C抗体水平的关系,Rong fan等(2016Gut)观察到定量检测HBcAb的水平可以预测慢乙肝抗病毒治疗的结果。为了更好地理解HBcAb的定量值在HBV感染自然史中的意义，Song LW等(2015CMI)检测了PBI，OBI,IT,IC,LR,ENH等不同类型的HBV感染阶段与类型。结果发现HBsAg定量检测平均值在5500IU/ml的IT+IC+LR+ENH的抗HBc水平比HBsAg阴性的PBI+OBI的抗HBc值高出1000倍。而且抗-HBc的水平与ALT高度相关。表明在HBV感染的不同期，血清中抗HBc的水平由宿主的免疫状态决定,随着免疫耐受的打破，进入病毒清除期，HBcAb的水平也同步升高。我们利用Rag/HBV小鼠免疫重建也观察到成年小鼠重建后HBcAb的水平是从高到低的变化，而幼年小鼠重建后是从低到高的变化。说明成年小鼠中重建后病毒被清除，机体针对病毒的免疫反应也随之降低，因此造成的肝细胞损伤逐步减少，表现为HBcAb的水平随时间延长而逐步降低。但是在幼年小鼠中经过免疫重建后病毒未能清除，导致机体抗病毒的固有免疫反应持续存在，持续造成肝细胞损伤，导致HBcAg的释放，刺激B细胞，引起HBcAb的持续升高增强。对照HBcAb的定量检测与HBV感染史，可以发现在幼年Rag/HBV小鼠经过免疫重建后HBcAb的逐步升高，类似慢性乙型肝炎病毒的感染时HBcAb的变化。
应用例2
以DC-Chol为佐剂的乙肝疫苗对模型的抗病毒作用：将20只幼年回输成年BALB/c脾细胞8周的模型小鼠根据HBsAg水平分为2组，实验组每只腹腔注射DC-Chol佐剂的HBsAg5μg，体积为250μl，对照组每只腹腔注射250μl缓冲液，每周1次共4次。于初次注射后2、4、8周眼眶采血，分离血清，检测HBsAg。4周和8周测HBsAb。实验组在治疗2～8周，HBsAg的水平降至10％左右；而对照组在治疗2周和4周，HBsAg水平与治疗前无显著差异，在治疗8周，HBsAg高于治疗前，如图8。实验组在治疗4周和8周，全部小鼠产生HBsAb，对照组无一产生HBsAb，如图9。
Claims (5)
1.一种BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将BALB/c背景的复制型HBV转基因小鼠与同背景的Rag-1-/-小鼠杂交，在F2代筛选出Rag-1-/-/HBV小鼠；
(2)分离野生型BALB/c小鼠脾淋巴细胞，分别回输给8-9周龄成年和15-20日龄幼年Rag-1-/-/HBV小鼠，构建成年龄依赖的急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述野生型BALB/c小鼠为8～9周龄。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中回输给8-9周龄成年和15-20日龄幼年Rag-1-/-/HBV小鼠的脾淋巴细胞的浓度为2×107～2×108个/ml，回输给8-9周龄成年Rag-1-/-/HBV小鼠的脾淋巴细胞的个数为1×107～5×107个/只，回输给15-20日龄幼年Rag-1-/-/HBV小鼠的脾淋巴细胞的个数为1×107～2×107个/只。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中回输给8-9周龄成年和15-20日龄幼年Rag-1-/-/HBV小鼠的脾淋巴细胞的浓度为1×108个/ml，回输给8-9周龄成年和15-20日龄幼年Rag-1-/-/HBV小鼠的脾淋巴细胞的个数分别为5×107个/只和2×107个/只。
5.权利要求1所述的BALB/c背景的年龄依赖的乙型肝炎小鼠模型系统的应用，包括以下方面：
(1)比较两种小鼠模型肝脏免疫细胞数量与功能的差异，探索病毒持续感染的细胞与分子机制；
(2)利用慢性乙型肝炎小鼠模型在新佐剂疫苗、细胞因子、Toll样受体激动剂和中药中筛选抗HBV药物。
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| CN106566843A (zh) | 2017-04-19 |
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