CN106190976A - 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 - Google Patents

一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

一种NK细胞培养基，按重量份数计，包括无血清基础培养基94～98份、血浆7～10份、抗CD3单克隆抗体0.6～1.6份、类胰岛素一号增长因子2～4份、PBS缓冲液20～30份、乌贼墨1～4份、红花多糖2～6份、大蒜素2.5～4.5份、苜蓿多糖1～3份、桂皮醛2～4份。本发明中的无血清基础培养基、血浆、抗CD3单克隆抗体和类胰岛素一号增长因子共同组成为了NK细胞生存所需的人体骨髓的环境。而红花多糖、大蒜素、苜蓿多糖和桂皮醛均有利于提高NK细胞的活性，从而增强了NK细胞的杀伤性，而乌贼墨内还有IL‑2,IL‑2可诱导NK细胞的活化和分化，从而有利于提高NK细胞的增殖效率，并活化后的NK细胞能够合成和分泌多种细胞因子，进而直接抑制肿瘤细胞分化增殖。

Description

一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞 (natural killer cell，NK) 是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。NK 细胞的功能主要是通过一下方式实现的。 NK细胞自然杀伤活性 ：NK 细胞识别靶细胞 (某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞、寄生虫等 )，接着 NK 细胞释放穿孔素，细胞毒因子，活化的 NK 细胞释放 TNF 因子，从而达到裂解和杀伤靶细胞的可能。NK 细胞毒作用 (ADCC 效应)，主要是 NK 细胞表面具有 FcγR Ⅲ A，主要结合人IgG1和IgG3 的Fc段 (Cγ2、Cγ3 功能区 )，在针对靶细胞特异性 IgG 抗体的介导下可杀伤相应靶细胞。活化的 NK 细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。NK 细胞通过自然杀伤和ADCC 发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。
因此，现有技术中为了能够获取更多数量的NK细胞，所以研究人员通过体外培养的方式来进行大规模的繁殖，但是，由于体外环境与人体内的环境不完全相同，所以导致NK细胞的免疫活性并不是很高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有利于提高NK细胞的免疫活性的NK细胞培养基及NK细胞的培养方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种NK细胞培养基，按重量份数计，包括无血清基础培养基94～98份、血浆7～10份、抗CD3单克隆抗体0.6～1.6份、类胰岛素一号增长因子2～4份、PBS缓冲液20～30份、乌贼墨1～4份、红花多糖2～6份、大蒜素2.5～4.5份、苜蓿多糖1～3份、桂皮醛2～4份。
作为优选，按重量份数计，包括无血清基础培养基96份、血浆8.5份、抗CD3单克隆抗体1份、类胰岛素一号增长因子3份、PBS缓冲液25份、乌贼墨2.5份、红花多糖4份、大蒜素3.5份、苜蓿多糖2份、桂皮醛3份。
由于无血清基础培养基、血浆、抗CD3单克隆抗体、类胰岛素一号增长因子共同组成为了NK细胞生存所需的人体骨髓的环境。
由于乌贼墨内还有IL-2,而在NK细胞表面有IL-2亲和性受体，IL-2可诱导NK细胞的活化和分化，从而有利于提高NK细胞的增殖效率，并活化后的NK细胞能够合成和分泌多种细胞因子，进而直接抑制肿瘤细胞分化增殖。
同时，在乌贼墨中还存在大量的抗肿瘤的肽聚糖，分别是：SIPG02-A、SIPG02-B、SIPG02-C，他们在NK细胞培养的过程中就会很自然的依附在NK细胞的表面，这样在利用NK细胞抑制肿瘤细胞的时候，抗肿瘤的肽聚糖也能够进一步协助NK细胞提高免疫能力。
再者，NK细胞培养基内部还含有大量的氨基酸和金属元素，而这些又是NK细胞分化和增殖的过程中所不可或缺的物质，从而进一步提高了NK细胞的活化性能。
再者，桂皮醛和红花多糖在NK细胞培养的过程中能够促进细胞因子分泌，从而进一步提高了NK细胞杀伤活性。
另外，苜蓿多糖可以显著地增强NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性，而大蒜素能够改变NK细胞S+G2/M1周期比例，同时，其可以促进NK细胞分泌IFN-γ，而IFN-γ又大大提高了NK细胞的杀伤性能。
作为优选，所述无血清基础培养基为Lonza X-VIVO 15无血清细胞培养基。
Lonza X-VIVO 15无血清细胞培养基是由美国Lonza公司生产的，其一般保存在2～8℃，同时，其化学成份明确，不含任何外源生长因子、人造细胞增殖刺激因子或不明成分的添加剂；尤其适用于活化的人和鼠淋巴细胞第二信号系统的研究；另外，X-VIVO 15TM经过优化使之适合于无血清条件下肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周血及人类肿瘤中分离纯化的CD3+细胞的增殖。同时还用于维持人类单核细胞、巨噬细胞及细胞系、细胞和自然杀伤细胞（NK）的生长。
作为优选，所述乌贼墨经过黑色素代谢酶处理。
通过黑色素代写酶的处理之后，乌贼墨中的黑色素就可以很好地被除去，从而在保证NK细胞正常分化增殖的情况下，又可以减少黑色素对NK细胞培养过程中的干扰。
一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、采集健康人的外周血，并用稀释液对外周血进行稀释，获得稀释血；
S2、向离心管一中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓慢加入稀释血；
S3、将离心管一放入到18℃的恒温室中进行离心30min～45min；
S4、用吸管轻轻吸取S3的离心管一中的PBMC层移入到离心管二中；
S5、向离心管二中加入足量稀释液进行洗涤，并离心5min～7min后去除上清液，获得洁净的PBMC细胞；
S6、将PBMC细胞进行磁珠分选，获得 NK 细胞；
S7、将获得的NK细胞转移到上述NK细胞培养基中，并将NK细胞培养液放置在培养箱中进行培养。
作为优选，S1中外周血与稀释液的体积比为1：2～3。
作为优选，S2中的Ficol与稀释血的体积比为1:2～4。
作为优选，S3和S5的离心转速为1500r/min～1800r/min。
在该种离心转速的离心下能够快速地将所需要的细胞分离出来，从而大大提高了NK细胞提取的效率，并且在这个过程中又不容易造成NK细胞的破损。
作为优选，S7中培养箱的温度为2～8℃，且其的二氧化碳的浓度为5～6%。
作为优选，S7中NK细胞的培养时间为13～15天。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1. 无血清基础培养基、血浆、抗CD3单克隆抗体、类胰岛素一号增长因子共同组成了NK细胞生存所需的人体骨髓的环境。
2.乌贼墨、红花多糖、大蒜素、苜蓿多糖和桂皮醛均有利于提高NK细胞的活性，从而增强了NK细胞的杀伤性；
3.使用由黑色素代谢酶处理过的乌贼墨可以有效的降低黑色素对NK细胞培养过程中所造成的干扰。
附图说明
图1是NK细胞的培养流程图。
具体实施方式
以下结合附图1对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
NK细胞培养基:
无血清基础培养基94g、血浆7g、抗CD3单克隆抗体0.6g、类胰岛素一号增长因子2g、PBS缓冲液20g、乌贼墨1g 、红花多糖2g、大蒜素2.5g 、苜蓿多糖1g和桂皮醛2g；
NK细胞的培养：
S1、采集健康人的10ml外周血，并用20ml稀释液对外周血进行稀释，获得稀释血；
S2、向离心管一中加入10mlFicoll，并沿倾斜的管壁缓慢加入稀释血；
S3、将离心管一放入到18℃的恒温室中以1500r/min转速进行离心30min；
S4、用吸管轻轻吸取S3的离心管一中的PBMC层移入到离心管二中；
S5、向离心管二中加入足量稀释液进行洗涤，并以1500r/min离心5min后去除上清液，获得洁净的PBMC细胞；
S6、将PBMC细胞进行磁珠分选，获得 NK 细胞；
S7、将获得的NK细胞转移到上述NK细胞培养基中，并将NK细胞培养液放置在温度为2～8℃，且二氧化碳的浓度为5%的培养箱中进行培养13天。
实施例二：
NK细胞培养基:
无血清基础培养基98g、血浆10g、抗CD3单克隆抗体1.6g、类胰岛素一号增长因子4g、PBS缓冲液30g、乌贼墨4g 、红花多糖6g、大蒜素4.5g 、苜蓿多糖3g和桂皮醛4g；
NK细胞的培养：
S1、采集健康人的10ml外周血，并用30ml稀释液对外周血进行稀释，获得稀释血；
S2、向离心管一中加入7.5mlFicoll，并沿倾斜的管壁缓慢加入稀释血；
S3、将离心管一放入到18℃的恒温室中以1800r/min转速进行离心45min；
S4、用吸管轻轻吸取S3的离心管一中的PBMC层移入到离心管二中；
S5、向离心管二中加入足量稀释液进行洗涤，并以1800r/min离心7min后去除上清液，获得洁净的PBMC细胞；
S6、将PBMC细胞进行磁珠分选，获得 NK 细胞；
S7、将获得的NK细胞转移到上述NK细胞培养基中，并将NK细胞培养液放置在温度为2～8℃，且二氧化碳的浓度为6%的培养箱中进行培养15天。
实施例三：
NK细胞培养基:
无血清基础培养基96g、血浆8.5g、抗CD3单克隆抗体1g、类胰岛素一号增长因子3g、PBS缓冲液25g、乌贼墨2.5g 、红花多糖4g、大蒜素3.5g 、苜蓿多糖2g和桂皮醛3g；
NK细胞的培养：
S1、采集健康人的10ml外周血，并用15ml稀释液对外周血进行稀释，获得稀释血；
S2、向离心管一中加入5mlFicoll，并沿倾斜的管壁缓慢加入稀释血；
S3、将离心管一放入到18℃的恒温室中以1670r/min转速进行离心37min；
S4、用吸管轻轻吸取S3的离心管一中的PBMC层移入到离心管二中；
S5、向离心管二中加入足量稀释液进行洗涤，并以1650r/min离心6min后去除上清液，获得洁净的PBMC细胞；
S6、将PBMC细胞进行磁珠分选，获得 NK 细胞；
S7、将获得的NK细胞转移到上述NK细胞培养基中，并将NK细胞培养液放置在温度为2～8℃，且二氧化碳的浓度为5.5%的培养箱中进行培养14天。
实施例四：
NK细胞培养基:
无血清基础培养基98g、血浆8.5g、抗CD3单克隆抗体1.6g、类胰岛素一号增长因子3g、PBS缓冲液25g、乌贼墨4g 、红花多糖4g、大蒜素4.5g 、苜蓿多糖1g和桂皮醛2g；
NK细胞的培养：
S1、采集健康人的10ml外周血，并用20ml稀释液对外周血进行稀释，获得稀释血；
S2、向离心管一中加入6.7mlFicoll，并沿倾斜的管壁缓慢加入稀释血；
S3、将离心管一放入到18℃的恒温室中以1670r/min转速进行离心30min；
S4、用吸管轻轻吸取S3的离心管一中的PBMC层移入到离心管二中；
S5、向离心管二中加入足量稀释液进行洗涤，并以1800r/min离心6min后去除上清液，获得洁净的PBMC细胞；
S6、将PBMC细胞进行磁珠分选，获得 NK 细胞；
S7、将获得的NK细胞转移到上述NK细胞培养基中，并将NK细胞培养液放置在温度为2～8℃，且二氧化碳的浓度为5%的培养箱中进行培养14天。
将实施例一至实施例四所获得的带有NK细胞的NK细胞培养基，加入到含有等量人体的肿瘤细胞的培养基中，并放置在37℃的环境下，培养6h，并每2h对含有人体的肿瘤细胞的培养基进行检测，得到如下肿瘤细胞凋亡率的数据：
时间/h 0 2 4 6
实施例一 0% 45% 82% 95%
实施例二 0% 52% 89% 98%
实施例三 0% 47% 84 97%
实施例四 0% 48% 86% 96%
所以，本发明的实施例一至实施例四所培养出来的NK细胞具有很强的免疫活性，对肿瘤细胞具有很强的杀伤能力，适合用于各类肿瘤疾病的治疗。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种NK细胞培养基，按重量份数计，包括
无血清基础培养基 94～98份
血浆 7～10份
抗CD3单克隆抗体 0.6～1.6份
类胰岛素一号增长因子 2～4份
PBS缓冲液 20～30份
乌贼墨 1～4份
红花多糖 2～6份
大蒜素 2.5～4.5份
苜蓿多糖 1～3份
桂皮醛 2～4份。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞培养基，按重量份数计，包括
无血清基础培养基 96份
血浆 8.5份
抗CD3单克隆抗体 1份
类胰岛素一号增长因子 3份
PBS缓冲液 25份
乌贼墨 2.5份
红花多糖 4
大蒜素 3.5
苜蓿多糖 2
桂皮醛 3份。
3.根据权利要求2所述的一种NK细胞培养基，其特征在于：所述无血清基础培养基为Lonza X-VIVO 15无血清细胞培养基。
4.根据权利要求2所述的一种NK细胞培养基，其特征在于：所述乌贼墨经过黑色素代谢酶处理。
5.如权利要求1至4所述的任意一项权利要求所述的一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、采集健康人的外周血，并用稀释液对外周血进行稀释，获得稀释血；
S2、向离心管一中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓慢加入稀释血；
S3、将离心管一放入到18℃的恒温室中进行离心30min～45min；
S4、用吸管轻轻吸取S3的离心管一中的PBMC层移入到离心管二中；
S5、向离心管二中加入足量稀释液进行洗涤，并离心5min～7min后去除上清液，获得洁净的PBMC细胞；
S6、将PBMC细胞进行磁珠分选，获得 NK 细胞；
S7、将获得的NK细胞转移到上述NK细胞培养基中，并将NK细胞培养液放置在培养箱中进行培养。
6.根据权利要求5所述的一种NK细胞的培养方法，其特征在于：S1中外周血与稀释液的体积比为1：2～3。
7.根据权利要求5所述的一种NK细胞的培养方法，其特征在于：S2中的Ficol与稀释血的体积比为1:2～4。
8.根据权利要求5所述的一种NK细胞的培养方法，其特征在于：S3和S5的离心转速为1500r/min～1800r/min。
9.根据权利要求5所述的一种NK细胞的培养方法，其特征在于：S7中培养箱的温度为2～8℃，且其二氧化碳的浓度为5～6%。
10.根据权利要求5所述的一种NK细胞的培养方法，其特征在于：S7中NK细胞的培养时间为13～15天。
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