CN106148266A - 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫细胞体外培养领域，公开了一种免疫细胞用培养基及构成该培养基的添加剂。本发明所述的培养基将活性多糖和壳寡糖作为必须的添加成分，在不向培养基中添加血清的情况下可以使免疫细胞得到高效增殖，且提高免疫细胞的细胞毒作用。

Description

一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂

技术领域

本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及一种免疫细胞用培养基及构成该培养基的添加剂。

背景技术

生物治疗是继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式。生物治疗是通过调动宿主天然防卫机制或给予天然产生的靶向性很强的物质来达到临床治疗效果，生物领域中的一个重要方法就是免疫细胞疗法，即将分离的自身免疫细胞在体外通过细胞因子诱导，扩增出大量具有高度细胞毒性的异质细胞群，再回输到体内发挥治疗作用。此类免疫细胞的种类包括了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)等，在众多的免疫细胞中，CIK细胞由于有杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多种耐药细胞同样敏感以及对正常骨髓造血前提细胞毒性更小等优良特点，广泛的应用于临床。

CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注细胞的数量和杀伤活性。CIK细胞中最具细胞毒活性的是CD3+CD56+细胞(NKT细胞)，NKT细胞表面能够同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性又具备NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点，然而NKT细胞在正常的外周血中含量极低，仅为1％左右。根据实验观察，清除一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞，而1cm³大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。因此，在体外培养中，提高CIK细胞的绝对数量和其中的NKT细胞的比例对提高临床治疗效果至关重要。

传统细胞培养基含有异源血清成分，如牛血清。由于不同批次牛血清活性和因子的不一致，细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，制品中残留的牛血清易引起接种者对血清的过敏反应，导致产品和实验结果的重现性差。若使用患者自身血清，必须较大量地使用患者的血液，造成患者的负担增大。因此，人们希望在不使用或尽可能减少血清使用量的培养基中使免疫细胞增殖。

目前传统的免疫细胞制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，用适合于淋巴细胞的培养液，加入适量的细胞因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的免疫细胞，但最终获得的免疫细胞的增殖倍数和细胞毒性都不够理想。

发明内容

本发明的目的是解决上述技术问题。为此，本发明提供了一种免疫细胞用无血清培养基及构成该培养基的添加剂。本发明所述的培养基在尽可能不向培养基中添加血清的情况下可以使免疫细胞得到迅速增殖。

本说明书中，“免疫细胞”是指与免疫应答有关的所有细胞，主要包括T细胞、B细胞、杀伤细胞(K细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、单核巨噬细胞等。其中T细胞和B细胞又称为免疫活性细胞，因这类细胞受抗原刺激而被活化，分裂增殖、发生特异性免疫应答。

作为在本发明的培养基中培养的免疫细胞，主要是指识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、K淋巴细胞、NK淋巴细胞等。

本发明的培养基中进一步含有活性多糖和壳寡糖。其中，活性多糖优选香菇多糖、褐藻多糖和海带多糖，进一步优选香菇多糖。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，是自然界中唯一大量存在的碱性氨基酸寡糖。

培养基中的活性多糖浓度优选0.5～20mg/L，进一步优选2～10mg/L；壳寡糖浓度优选1～40mg/L，进一步优选5～36mg/L。

本发明的培养基中进一步含有血清替代物。当本发明的培养基为无血清培养基时，可以最好的发挥本发明的效果。在本发明中，血清替代物优选KSR(一种商业化的带血清培养添加剂)、N2(一种商业化的血清替代添加剂，成分为胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠)和B27(一种用于培养神经细胞的无血清培养添加剂)的至少一种，但不限于这几种。进一步优选N2作为血清替代物。

培养基中的血清替代物浓度优选0～20重量％，进一步优选10～15重量％。

本发明的培养基中进一步含有抗氧化剂。抗氧化剂具有程序性抑制细胞死亡作用。优选维生素C、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和2-巯基乙醇的至少一种，进一步优选2-巯基乙醇。

培养基中的抗氧化剂浓度优选0.01～20mg/L，进一步优选0.1～15mg/L。

本发明的培养基中进一步含有细胞生长因子。通过细胞生长因子对免疫细胞的诱导作用，实现免疫细胞的增殖。细胞生长因子优选转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)。

培养基中的细胞生长因子浓度(含有多种时，为其总浓度)优选0.05～100mg/L，进一步优选0.5～10mg/L。

本发明的培养基中进一步含有缓冲盐。缓冲盐可维持本发明的培养基的pH值保持在6.8～7.2之间。缓冲盐优选碳酸氢钠、磷酸盐和HEPEs。进一步优选HEPEs。

培养基中的缓冲盐浓度优选0.05～5重量％，进一步优选0.1～3重量％。

本发明的培养基中进一步含有动物血清白蛋白。已知白蛋白可以增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤，进一步促进培养细胞的增殖。此外，白蛋白在血液中担负着药物的传递等作用。血清白蛋白优选牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和重组人血清白蛋白(rHSA)的至少一种，进一步优选人血清白蛋白(HAS)。

培养基中的动物血清白蛋白浓度优选2～20g/L，进一步优选5～15g/L。

本发明的培养基除用于免疫细胞的增殖或保持的培养外，还可以对免疫细胞进行诱导培养。用于免疫细胞诱导培养时，可以进一步添加分化诱导剂。作为分化诱导剂，可选细胞因子、集落刺激因子、类固醇激素等，可以单独使用也可联合使用。如在本发明实例一中，CIK细胞的诱导培养基中加入的分化诱导剂为白介素2(IL-2)、白介素1α(IL-1α)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CD3激发型单抗，其分化诱导剂的添加量与以往相同。

本发明的培养基除含有上述活性多糖和壳寡糖及血清替代物、进一步优选含有上述抗氧化剂、细胞生长因子、动物血清白蛋白和缓冲盐的一种以上之外，还可以与公知的细胞用培养基同样。因此基本上通过在公知的基础培养基、优选无血清培养基中添加上述两种必须成分、进一步优选一种以上上述优选的成分，可以获得本发明的培养基。

以往公知的无血清基础培养基有：MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、RPMI1640培养基、Ham’s F-12培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基等。本发明中优选IMDM培养基。

本发明的培养基中的免疫细胞培养可以按照与以往同样的方法进行，通常在37℃、5％CO2浓度和饱和湿度的环境下进行。

本发明的有益效果在于：

本发明所述培养基中添加活性多糖、壳寡糖和多种生物因子，可以高效扩增免疫细胞，提高了免疫细胞的生长速度和细胞毒性作用。此外，本发明的培养基中不含有血清，大大避免了含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷，为免疫细胞的临床治疗提供了很好的工具。

附图说明

图1是表示实施实例一中，不同实验条件下的CIK细胞的增殖倍数变化示意图。

图2是表示实施实例一中，不同实验条件下的CD3+CD4+T细胞的表达变化示意图。

图3是表示实施实例一中，不同实验条件下的CD3+CD8+T细胞的表达变化示意图。

图4是表示实施实例一中，不同实验条件下的CD3+CD56+T细胞的表达变化示意图。

图5是表示实施实例一中，不同实验条件下的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率变化示意图。

图6是表示实施实例二中，不同实验条件下的CIK细胞的增殖倍数变化示意图。

图7是表示实施实例三中，不同实验条件下的CIK细胞的增殖倍数变化示意图。

图8是表示实施实例四中，不同实验条件下的DC细胞的增殖倍数变化示意图。

图9是表示实施实例五种，不同实验条件下的NK细胞的增殖倍数变化示意图。

具体实施方式

下面结合实施实例对本发明作进一步的阐述，在实施实例中未注明具体实验方法的，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施实例一、CIK细胞的培养

Ⅰ、CIK细胞用培养基的配制

1.M-0培养基的配制

以终浓度计，在IMDM培养基中加入N210％(v/v)、2-巯基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生长因子7.5mg/L、青/链霉素100U/mL。调节培养基pH至7.1，用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存备用。

在细胞培养时，以终浓度计，向M-0培养基中依次加入IFN-γ1000U/mL、CD3激发型单抗20mg/L、IL-1α100U/ml、IL-21000U/mL和GM-CSF1000U/mL。

2.M-1培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入活性多糖6mg/L。

3.M-2培养基(即本发明的无血清培养基)的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入壳寡糖20mg/L、活性多糖6mg/L。

Ⅱ、CIK细胞的诱导培养

CIK细胞的制备方法如下：

1.用常规方法从人外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，用M-0培养基悬浮，并调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下孵育2h。

2.收集悬浮细胞并调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，转移至F75培养瓶中，加入1000U/mL的IFN-γ，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24h；

3.第二天加入CD3激发型单抗、IL-2、IL-1α、IFN-γ、GM-CSF，并分别加入M-0、M-1和M-2培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下连续培养7～15天，离心收集即可获得的CIK细胞。

其中，加入培养基中的CD3激发型单抗的浓度为20mg/L，IL-2的浓度为1000U/mL，IL-1α的浓度为100U/mL、IFN-γ的浓度为1000U/mL、GM-CSF的浓度为1000U/mL；

4.步骤3.过程中，每隔3天换液一次，换液前后进行细胞计数，并根据细胞浓度补加相应培养基和IL-2至相应浓度。

Ⅲ、CIK细胞活性、细胞增值倍数和细胞表型的比较分析

分别在第3、6、9、12、15天收集各组培养的CIK细胞用于各项检测。以下从几个方面比较M-0、M-1和M-2组获得的CIK细胞的差异性。

1、细胞活性的比较

将第3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2组培养的CIK细胞用0.4％的台盼蓝染色，然后用全自动细胞计数仪进行计数，其中，死细胞被染成蓝色，活细胞不被染色。具体情况见表1.

表1 不同实验条件下，CIK细胞活性的变化

由表1可以看出，各组细胞活性均大于95％，但M-2组高于M-1组，高于M-0组，各组间没有显著性差异(P＞0.05)。

2、细胞增殖倍数的比较

将各组取得的CIK细胞用0.4％的台盼蓝染液染色后进行细胞计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的增殖倍数。具体情况见表2和图1。

表2 不同实验条件下，CIK细胞增殖倍数的变化

由表2和图1可以看出，随着培养时间的延长，三组细胞均在增长，但在每个时间节点上，M-2组的增殖倍数都大于M-1组，更大于M-0组，三组在第15天时，增殖倍数达到高峰，且在培养15天时，相比M-0组，M-2组的CIK细胞增殖倍数提高了近4倍。

3、细胞免疫表型的比较

分别在第3、6、9、12、15天取各组的CIK细胞，离心，调整细胞密度为1×10⁶/mL,PBS洗涤2次，制备细胞悬液。分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC抗体10μl，同时设同型对照管，分别加入IgG1-PerCP、IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC，于室温暗处孵育20min，PBS洗涤两次，进行流式细胞检测。具体情况见表3和图2-4.

表3 不同实验条件下，CIK细胞免疫表型的变化

由表3和图2-4可以看出，随着培养时间的延长，三组细胞中的CD3+CD8+细胞及CD3+CD56+细胞比例都在增加，在培养第15天达到峰值；其中，CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞中，M-2组均明显高于M-1和M-0组，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；CD3+CD4+细胞中，M-2组高于M-1组和M-0组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Ⅳ、细胞对肿瘤杀伤活性的比较(MTT法)

本实施实例是对CIK细胞进行细胞毒性检测，以培养的CIK细胞作为效应细胞，K562肿瘤细胞作为靶细胞。按以下步骤进行：

96孔板内接种对数生长期的K562肿瘤细胞并培养24h，之后按效靶比例10：1、20∶1以及40∶1比例加入各组培养第15天的CIK细胞，每孔设4个复孔，并设未与肿瘤细胞反应的两组CIK细胞为效应细胞空白对照，共同培养24h后加入10μl新鲜配制的5mg/mL的MTT，共同培养4h后，离心吸弃上清液，每孔加入100μl的DMSO振荡溶解10min，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值，计算杀伤率。具体情况见表4和图5

杀伤率按如下公式计算：

杀伤率＝[1-(试验孔A值-效应细胞A值)/靶细胞对照孔A值]×100％

表4 不同实验条件下，CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

由表4和图5可以看出，在不同效靶比作用下，CIK细胞的杀伤作用与效靶比呈正相关，在相同效靶比条件下，M-2组的杀伤率明显高于M-1和M-0组，且组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

实施实例二、CIK细胞的培养

Ⅰ、CIK细胞用培养基的配制

2.M-0培养基的配制

以终浓度计，在IMDM培养基中加入KSR 10％(v/v)、2-巯基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生长因子7.5mg/L、青/链霉素100U/mL。调节培养基pH至7.1，用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存备用。

在细胞培养时，以终浓度计，向M-0培养基中依次加入IFN-γ1000U/mL、CD3激发型单抗20mg/L、IL-1α100U/ml、IL-21000U/mL和GM-CSF1000U/mL。

2.M-1培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入活性多糖2mg/L。

3.M-2培养基(即本发明的无血清培养基)的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入壳寡糖5mg/L、活性多糖2mg/L。

Ⅱ、CIK细胞的诱导培养

CIK细胞的制备方法同实施实例一。

Ⅲ、CIK细胞活性和细胞增值倍数比较分析

分别在第3、6、9、12、15天收集各组培养的CIK细胞用于各项检测。以下从几个方面比较M-0、M-1和M-2组获得的CIK细胞的差异性。

1、细胞活性的比较

将3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2组培养的CIK细胞用0.4％的台盼蓝染色，然后用全自动细胞计数仪进行计数，其中，死细胞被染成蓝色，活细胞不被染色。具体情况见表5.

表5 不同实验条件下，CIK细胞活性的变化

由表5可以看出，各组细胞活性均大于95％，但M-2组活性均高于M-1组和M-0组，各组间没有显著性差异(P＞0.05)。

2、细胞增殖倍数的比较

将各组取得的CIK细胞用0.4％的台盼蓝染液染色后进行细胞计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的增殖倍数。具体情况见表6和图6。

表6 不同实验条件下，CIK细胞增殖倍数的变化

由表6和图6可以看出，随着培养时间的延长，三组细胞均在增长，但在每个时间节点上，M-2组的增殖倍数都大于M-1组和M-0组，且增殖倍数最高。

实施实例三、CIK细胞的培养

Ⅰ、CIK细胞用培养基的配制

3.M-0培养基的配制

以终浓度计，在DMEM/F12培养基中加入KSR 10％(v/v)、2-巯基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生长因子7.5mg/L、青/链霉素100U/mL。调节培养基pH至7.1，用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存备用。

在细胞培养时，以终浓度计，向M-0培养基中依次加入IFN-γ1000U/mL、CD3激发型单抗20mg/L、IL-1α100U/ml、IL-21000U/mL和GM-CSF1000U/mL。

2.M-1培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在DMEM/F12培养基中再加入活性多糖10mg/L。

3.M-2培养基(即本发明的无血清培养基)的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在DMEM/F12培养基中再加入壳寡糖36mg/L、活性多糖10mg/L。

Ⅱ、CIK细胞的诱导培养

CIK细胞的制备方法同实施实例一。

Ⅲ、CIK细胞活性、细胞增值倍数和细胞表型的比较分析

分别在第3、6、9、12、15天收集各组培养的CIK细胞用于各项检测。以下从几个方面比较M-0、M-1和M-2组获得的CIK细胞的差异性。

1、细胞活性的比较

将3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2组培养的CIK细胞用0.4％的台盼蓝染色，然后用全自动细胞计数仪进行计数，其中，死细胞被染成蓝色，活细胞不被染色。具体情况见表7.

表7 不同实验条件下，CIK细胞活性的变化

由表7可以看出，各组细胞活性均大于95％，但M-2组高于M-1组，高于M-0组，各组间没有显著性差异(P＞0.05)。

2、细胞增殖倍数的比较

将各组取得的CIK细胞用0.4％的台盼蓝染液染色后进行细胞计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的增殖倍数。具体情况见表8和图7。

表8 不同实验条件下，CIK细胞增殖倍数的变化

由表8和图7可以看出，随着培养时间的延长，三组细胞均在增长，但在每个时间节点上，M-2组的增殖倍数都大于M-1和M-0组，且细胞增殖倍数最高。

实施实例四、DC细胞的培养

Ⅰ、DC细胞用培养基的配制

1.M-0培养基的配制

以终浓度计，在IMDM培养基中加入N210％(v/v)、2-巯基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生长因子7.5mg/L、青/链霉素100U/mL。调节培养基pH至7.1，用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存备用。

在细胞培养时，以终浓度计，向M-0培养基中依次加入IL-4500U/mL、GM-CSF 1000U/mL、和TNF-α500U/mL。

2.M-1培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入活性多糖6mg/L。

3.M-2培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入壳寡糖20mg/L、活性多糖6mg/L。

Ⅱ、DC细胞的诱导培养

DC细胞的制备方法如下：

1.将实施实例一步骤Ⅱ1.中剩下的贴壁细胞分别加入含有IL-4和GM-CSF的M-0、M-1和M-2培养基，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下继续培养；

其中，加入IL-4的终浓度为500U/mL，加入GM-CSF的终浓度为1000U/mL；

2.步骤1.过程中，每隔2天换液一次，换液前后进行细胞计数，并根据细胞浓度补加相应的培养基和细胞因子；

3.在培养的第六天，分别向M-0、M-1和M-2培养基培养的细胞中加入500U/mL TNF-α；

4.在培养的第八天，收获DC细胞。

Ⅲ、DC细胞活性和细胞增值倍数的比较分析

分别在第2、4、6、8天收集各组培养的DC细胞用于各项检测。以下从几个方面比较M-0、M-1和M-2组获得的DC细胞的差异性。

1、细胞活性的比较

将第2、4、6、8天收集M-0、M-1和M-2组培养的DC细胞用0.4％的台盼蓝染色，然后用全自动细胞计数仪进行计数，其中，死细胞被染成蓝色，活细胞不被染色。具体情况见表9.

表9 不同实验条件下，DC细胞活性的变化

由表9可以看出，各组细胞活性均大于94％，三组之间M-2组细胞活性最高，且各组间没有显著性差异(P＞0.05)。

2、细胞增殖倍数的比较

将各组取得的DC细胞用0.4％的台盼蓝染液染色后进行细胞计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的增殖倍数。具体情况见表10和图8。

表10 不同实验条件下，DC细胞增殖倍数的变化

由表10和图8可以看出，随着培养时间的延长，三组细胞均在增长，但在每个时间节点上，M-2组的增殖倍数都大于M-1组，更大于M-0组。

实施实例五、NK细胞的培养

Ⅰ、NK细胞用培养基的配制

1.M-0培养基的配制

以终浓度计，在IMDM培养基中加入N210％(v/v)、2-巯基乙醇0.7mg/L、人血清白蛋白10g/L、HEPEs 1％(v/v)、生长因子7.5mg/L、青/链霉素100U/mL。调节培养基pH至7.1，用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存备用。

在细胞培养时，以终浓度计，向M-0培养基中依次加入IL-2800U/mL、IL-1210mg/L和TNF-α10mg/L。

2.M-1培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入活性多糖6mg/L。

3.M-2培养基的配制

在M-0培养基的基础上，以终浓度计，在IMDM培养基中再加入壳寡糖20mg/L、活性多糖6mg/L。

Ⅱ、NK细胞的诱导培养

NK细胞的制备方法如下：

1.用常规方法从人外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，用M-0培养基悬浮，磁珠法对PBMC进行纯化(磁珠用抗CD3抗体进行固定)。

2.将纯化后的细胞转移至F25培养瓶中，分别加入M-0、M-1和M-2培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养7～15天；

3.步骤2.中每隔3天换液一次，换液前后计数进行细胞计数，并根据细胞密度补加相应培养基和细胞因子。

4.在培养的第15天，离心收获NK细胞。

Ⅲ、NK细胞活性和细胞增值倍数的比较分析

分别在第3、6、9、12、15天收集各组培养的NK细胞用于各项检测。以下从几个方面比较M-0、M-1和M-2组获得的NK细胞的差异性。

1、细胞活性的比较

将第3、6、9、12、15天收集M-0、M-1和M-2组培养的NK细胞用0.4％的台盼蓝染色，然后用全自动细胞计数仪进行计数，其中，死细胞被染成蓝色，活细胞不被染色。具体情况见表11.

表11 不同实验条件下，NK细胞活性的变化

由表11可以看出，各组细胞活性均大于95％，但相同的时间节点上，M-2组、M-1组略高于M-0组，各组间没有显著性差异(P＞0.05)。

2、细胞增殖倍数的比较

将各组取得的NK细胞用0.4％的台盼蓝染液染色后进行细胞计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的增殖倍数。具体情况见表12和图9。

表12 不同实验条件下，NK细胞增殖倍数的变化

由表12和图9可以看出，随着培养时间的延长，M-0、M-1和M-2各组细胞均在增长，其中M-2组细胞增殖最快，增殖倍数近20倍，M-1组次之，M-0组细胞增殖最慢。

Claims (15)

1.一种免疫细胞用培养基，其特征在于，该培养基含有活性多糖和壳寡糖。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该培养基为无血清培养基。

3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，该培养基含有血清替代物。

4.根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于，血清替代物包括KSR(一种商业化的带血清培养添加剂)、N2(一种商业化的血清替代添加剂，成分为胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠)和B27(一种用于培养神经细胞的无血清培养添加剂)等代血清培养添加剂，但不限于这几种，其中优选地是N2。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，活性多糖包括香菇多糖、褐藻多糖和海带多糖，但不限于这几种，其中优选香菇多糖。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，活性多糖在培养基中的浓度为2～10mg/L，壳寡糖在培养基中的浓度为5～36mg/L。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的培养基，其特征在于，该培养基进一步含有抗氧化剂。

8.根据权利要求7中所述的培养基，其特征在于，上述抗氧化剂为2-巯基乙醇。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的培养基，其特征在于，该培养基进一步含有生长因子。

10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，上述生长因子为转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的培养基，其特征在于，该培养基进一步含有缓冲盐。

12.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于，上述缓冲盐为HEPEs。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的培养基，其特征在于，该培养基进一步含有动物血清白蛋白。

14.根据权利要求13所述的培养基，其特征在于，上述动物血清白蛋白为人血清白蛋白(HSA)。

15.免疫细胞的培养方法，其特征在于，该方法包括在权利要求1-14中任一项所述的培养基中培养免疫细胞。