CN109609584A - 间充质干细胞免疫调节能力的检测方法 - Google Patents

间充质干细胞免疫调节能力的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法。本发明提供的间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，将原始样本与待评价的间充质干细胞进行共培养，得到待测样本，与原始样本相比，通过检测待测样本中的淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF‑α的变化量和淋巴细胞增殖能力的变化量来评价间充质干细胞的免疫调节能力。该方法可以对某种间充质干细胞的免疫调节能力进行评价，如果，淋巴细胞亚群的比例、淋巴细胞分泌TNF‑α和淋巴细胞增殖的变化量越大，说明该间充质干细胞的免疫调节能力更强，质量更好。本发明不仅提供了检测方法，同时也适合差异化用药。

Description

间充质干细胞免疫调节能力的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质、神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞和心肌细胞等多向分化的潜能。具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
间充质干细胞不仅能促进损伤组织的再生与修复，还拥有良好的免疫调节能力，此外还可以作为基因治疗的载体。
制备间充质干细胞的方法种类繁多，例如组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法等，但是目前的研究大多着眼于间充质干细胞的临床治疗应用，并不存在一个良好的评价机制来鉴定诸多制备方法制备得到的间充质干细胞免疫调节能力的好坏。因此，开发一种可以有效评价间充质干细胞免疫调节能力的方法具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，以缓解现有技术中间充质干细胞的质量良莠不齐，没有有效检测方法的技术问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，分别检测待测样本中的淋巴细胞亚群的比例、淋巴细胞分泌TNF-α的能力和淋巴细胞增殖的能力；
所述待测样本为原始样本与间充质干细胞共培养后得到；
与原始样本相比，所述淋巴细胞亚群的比例变化越大，所述淋巴细胞分泌TNF-α越受到抑制并且所述淋巴细胞增殖越受到抑制，所述间充质干细胞免疫调节能力越强。
进一步地，所述淋巴细胞亚群包括Treg细胞、Th1细胞和Th17细胞；
优选地，所述间充质干细胞提高所述Treg细胞在淋巴细胞亚群中的比例；
优选地，所述间充质干细胞降低所述Th1细胞在淋巴细胞亚群中的比例；
优选地，所述间充质干细胞降低所述Th17细胞在淋巴细胞亚群中的比例。
进一步地，所述Treg细胞表型为CD4+CD25+CD127-。
进一步地，所述Th1细胞表型为CD3+CD8-INF-γ+。
进一步地，所述Th17细胞表型为CD3+CD8-IL-17+。
进一步地，采用流式细胞仪定量分析的方法检测所述淋巴细胞亚群的比例。
进一步地，将原始样本与抑制剂处理过的间充质干细胞共培养，添加刺激剂活化淋巴细胞，检测待测样本上清液中的TNF-α浓度，其中，所述抑制剂抑制间充质干细胞的增殖和蛋白合成；
优选地，所述抑制剂包括丝裂霉素；
优选地，所述刺激剂包括PHA。
进一步地，将原始样本与经钴-60照射3000rad处理过的间充质干细胞共培养，添加刺激剂活化淋巴细胞，检测待测样本中淋巴细胞增殖的能力；
优选地，所述刺激剂包括PHA。
进一步地，所述间充质干细胞和所述原始样本的细胞数量比为(0.05-5)：1。
进一步地，所述原始样本包括PBMC。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，将原始样本与待评价的间充质干细胞进行共培养，得到待测样本，与原始样本相比，通过检测待测样本中的淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF-α的变化量和淋巴细胞增殖能力的变化量来评价间充质干细胞的免疫调节能力。本发明提供的方法可以对某种间充质干细胞的免疫调节能力进行评价，如果，淋巴细胞亚群的比例、淋巴细胞分泌TNF-α和淋巴细胞增殖的变化量越大，说明该间充质干细胞的免疫调节能力更强，质量更好。本发明不仅提供了检测方法，同时也给出了三个全面具有代表性的检测指标，该方法只需通过对三个指标的检测，即可高效对间充质干细胞的质量进行评价，该检测方法简单、高效，操作简单，成本低同时适合差异化用药。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明实施例1中有血清和无血清培养的脐带间充质干细胞对淋巴细胞亚群比例的影响统计结果图；
图1B为本发明实施例1中有血清和无血清培养的骨髓间充质干细胞对淋巴细胞亚群比例的影响统计结果图；
图2A为本发明实施例2中有血清和无血清培养的脐带间充质干细胞对淋巴细胞分泌TNF-α的影响统计结果图；
图2B为本发明实施例2中有血清和无血清培养的骨髓间充质干细胞对淋巴细胞分泌TNF-α的影响统计结果图；
图3A为本发明实施例3中有血清和无血清培养的脐带间充质干细胞对T淋巴细胞的增殖作用统计结果图；
图3B为本发明实施例3中有血清和无血清培养的骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的增殖作用统计结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，分别检测待测样本中的淋巴细胞亚群的比例、淋巴细胞分泌TNF-α的能力和淋巴细胞增殖的能力，其中，待测样本为原始样本与间充质干细胞共培养后得到；
与原始样本相比，淋巴细胞亚群的比例变化越大，淋巴细胞分泌TNF-α越受到抑制并且淋巴细胞增殖越受到抑制，间充质干细胞免疫调节能力越强。
间充质干细胞具有很强的自我更新能力和多向分化潜能从而具有促进损伤组织再生修复的能力，除此之外它对机体的免疫功能也具有很强的调控作用。间充质干细胞通过直接的物理接触，以及最为重要的旁分泌作用产生多种生长因子、粘附分子、趋化因子等募集、动员或抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞直至整个免疫系统，从而介导了固有免疫应答和适应性免疫应答。
本发明提供了一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，将原始样本与待评价的间充质干细胞进行共培养，得到待测样本，与原始样本相比，通过检测待测样本中的淋巴细胞亚群的比例变化量，淋巴细胞分泌TNF-α的变化量和淋巴细胞增殖能力的变化量来评价间充质干细胞的免疫调节能力。本发明提供的方法可以对某种间充质干细胞的免疫调节能力进行评价，如果，淋巴细胞亚群的比例、淋巴细胞分泌TNF-α和淋巴细胞增殖的变化量越大，说明该间充质干细胞的免疫调节能力更强，质量更好。本发明不仅提供了检测方法，同时也给出了三个全面具有代表性的检测指标，该方法只需通过对这三个指标的检测，即可高效对间充质干细胞的质量进行评价，该检测方法简单、高效，操作简单，成本低同时适合差异化用药。
在本发明中，原始样本包括PBMC(peripheral blood mononuclear cell，外周血单核细胞)，其他满足检测上述三项的试剂也可以作为本发明的原始样本。该方法不仅可以作为衡量间充质干细胞产品品质的方法，也可以作为针对个体筛选更有效药物的手段，实现差异化用药。
在一个优选地实施方式中，淋巴细胞亚群包括Treg细胞、Th1细胞和Th17细胞。
Treg细胞(调节性T细胞，Regulatory T cell)细胞是CD4+T细胞的一个亚群，总量约占T细胞的5％。TGF-β可以刺激初始CD4+T细胞，并诱导其生成Treg细胞。Treg细胞在机体中起负性免疫调节作用，对辅助性T细胞的亚群起抑制作用。Treg细胞也能抑制其他的免疫反应，以及炎症反应的激活等过程。
Th1细胞，初始CD4+T细胞经IL-12刺激后可分化成Th1细胞，该类细胞是较早被发现的CD4+T细胞中的其中一个亚群。Th1细胞能帮助机体防御病毒、细胞内细菌及真菌感染，其主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等促炎细胞因子。这些细胞因子可通过激活巨噬细胞、自然杀伤细胞及CD8+T细胞，通过调节细胞免疫反应，增强免疫细胞对细胞内病原体的杀伤能力，引起迟发型超敏反应，导致组织损伤。
Th17细胞是一类新型的CD4+T细胞亚群，其分化机制和功能特征与Th1及Th2细胞不一样。Th17细胞能够分泌一些细胞因子，主要有IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21等。IL-6与TGF-β或联合IL-1、IL-21和IL-23等，共同诱导初始CD4+T细胞，使其进一步分化为Th17细胞，以促进机体对胞外病原体的免疫应答。
在一个优选地实施方式中，间充质干细胞提高Treg细胞在淋巴细胞亚群中的比例，间充质干细胞降低Th1细胞在淋巴细胞亚群中的比例，间充质干细胞降低Th17细胞在淋巴细胞亚群中的比例。
在一个优选地实施方式中，Treg细胞表型为CD4+CD25+CD127-。CD4+CD25+CD127-含义为Treg细胞表达CD4分子和CD25分子，但是不表达CD127分子。
在一个优选地实施方式中，Th1细胞表型为CD3+CD8-INF-γ+。CD3+CD8-INF-γ+含义为Th1细胞表达CD3分子和INF-γ分子，但是不表达CD8分子。
在一个优选地实施方式中，Th17细胞表型为CD3+CD8-IL-17+。CD3+CD8-IL-17+含义为Th17细胞表达CD3分子和IL-17分子，但是不表达CD8分子。
在一个优选地实施方式中，采用流式细胞仪定量分析的方法检测所述淋巴细胞亚群的比例。将间充质干细胞与原始样本共培养，用流式细胞仪定量分析CD4+CD25+CD127-的Treg细胞的比例，检测CD3+CD8-INF-γ+的Th1、CD3+CD8-IL-17+的Th17细胞增殖情况。
在一个优选地实施方式中，将原始样本与抑制剂处理过的间充质干细胞共培养，添加刺激剂活化淋巴细胞，检测待测样本上清液中的TNF-α浓度，其中，抑制剂抑制间充质干细胞的增殖和蛋白合成。TNF-α是一种重要的细胞因子，通过检测TNF-α的分泌情况，可以从另一方面说明Th1细胞的生长情况。
在一个优选地实施方式中，抑制剂包括丝裂霉素。选择丝裂霉素抑制干细胞的分裂增殖和蛋白合成，效果良好，使用方便。
在一个优选地实施方式中，刺激剂包括PHA(植物血凝素)。选择PHA作为淋巴细胞活化刺激剂，应用范围广并且效果明显。
在一个优选地实施方式中，将原始样本与经钴-60照射3000rad处理过的间充质干细胞共培养，添加刺激剂活化淋巴细胞，检测待测样本中淋巴细胞增殖的能力。
体外培养的MSCs能够抑制混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)中植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)或抗CD3和抗CD28抗体刺激引起的T淋巴细胞的增殖，这种抑制作用对不同的T细胞亚群均有效，并且是细胞剂量依赖性的。在MSCs与T淋巴细胞相互作用的过程中，细胞间接触、可溶性因子介导及致炎症因子诱导的作用均十分必要。将间充质干细胞与原始样本共同培养，再检测由刺激剂活化的淋巴细胞的增殖能力，进一步反应间充质干细胞的免疫调节能力。
在一个优选地实施方式中，刺激剂包括PHA。
在本发明一个优选地实施方式中，间充质干细胞和原始样本的细胞数量比为(0.05-5)：1。本发明提供了共培养中间充质干细胞与原始样本细胞数的优选效靶比，既可以检测出间充质干细胞的免疫调节能力，又避免了试剂的浪费。间充质干细胞和原始样本的细胞数量比典型但非限制性的为0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、2:2、3:1、4:1或5:1。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1间充质干细胞对特定淋巴细胞亚群的影响结果
本实施例中所用间充质干细胞为无血清和有血清分别体外培养的脐带间充质干细胞及无血清和有血清分别体外培养的骨髓间充质干细胞。
间充质干细胞与PBMC共培养，用流式细胞仪定量分析CD4+CD25+CD127-的Treg的比例，检测CD3+CD8-INF-γ+的Th1、CD3+CD8-IL-17+的Th17细胞增殖情况。
实验步骤：将2mL浓度为1×108L-1的MSC接种于24孔板中(预先用25μg/L的丝裂霉素于37℃预处理30min，抑制其过度分化)，待第3天完全贴壁后加入1mL浓度为2×109L-1的T淋巴细胞，用PMA(25μg/L)和离子霉素(1g/L)共同刺激T细胞作为实验组；将未加入刺激剂的单独T细胞作为对照组；2组均加入BFA阻滞剂(0.5g/L)阻断高尔基的蛋白转运作用，在37℃、5％CO2培养箱中培养4h。收集淋巴细胞，先进行表面抗体染色(CD3、CD8)，避光室温孵育15min后,每管加入Reagent A(固定液)再孵育15min，用PBS洗涤1次,最后加入Reagent B(破膜剂)以及胞内抗体(CD127、IFN-γ、IL-17)室温反应15min，PBS洗涤后按照流式细胞术标准三色荧光检测法上机检测。
有血清和无血清培养的脐带、骨髓间充质干细胞均通过上述的方式与PBMC共培养，检测对特定淋巴细胞亚群的影响结果。
有血清和无血清培养的脐带间充质干细胞结果如图1A所示，脐带间充质干细胞可上调淋巴细胞中Treg的比例、下调Th1和Th17的比例。
有血清和无血清培养的骨髓间充质干细胞结果如图1B所示，骨髓间充质干细胞可上调淋巴细胞中Treg的比例、下调Th1和Th17的比例。
实施例2间充质干细胞对淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验结果
本实施例中所用间充质干细胞与实施例1中相同。
将间充质干细胞分为5.0×104/孔、1.0×105/孔、2.0×105/孔3个浓度，按不同浓度分别将细胞悬液接种于96孔培养板中，于37℃，体积分数为5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，24h后，以终浓度为30μg/mL的丝裂霉素于30℃处理30min，吸弃丝裂霉素，用含10％FBS的RPMI-1640培养液洗涤培养板一次。在各细胞孔中均加入1.0×106/孔的PBMC悬液及终浓度为2.5μg/mL的PHA，以刺激淋巴细胞增殖。以加入PHA的淋巴细胞为对照，于37℃，体积分数为5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，72h后，分别收集各组培养上清，检测培养上清中TNF-α的浓度。
有血清和无血清培养的脐带、骨髓间充质干细胞均通过上述的方式检测对淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验结果。
有血清和无血清培养的脐带间充质干细胞结果如图2A所示，结果显示脐带间充质干细胞可显著抑制淋巴细胞TNF-α的分泌，且随脐带间充质干细胞数量的增加抑制作用更加明显。
有血清和无血清培养的骨髓间充质干细胞结果如图2B所示，显示可以抑制淋巴细胞TNF-α的分泌。
实施例3间充质干细胞对淋巴细胞增殖抑制试验
本实施例中所用间充质干细胞与实施例1中相同。
分别采用不同细胞量的间充质干细胞(2.5×104、5.0×104、2.5×105、5.0×105)，接种于96孔板中，用钴-60照射3000rad。然后与PBMC(5.0×104)共培养，用终浓度为2.5μg/mL的PHA刺激其增殖，以加入PHA的单独淋巴细胞为对照，于37℃，体积分数为5％CO2、饱和湿度培养箱中培养68h后，加入10μL/孔CCK-8溶液继续孵育4h，酶标仪450nm处测定吸光度(A)值，检测脐带间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖能力的影响。
有血清和无血清培养的脐带、骨髓间充质干细胞均通过上述的方式检测对淋巴细胞增殖抑制试验。
有血清和无血清培养的脐带间充质干细胞结果如图3A所示，试验结果表明，脐带间充质干细胞对T淋巴细胞的增殖具有抑制作用。
有血清和无血清培养的骨髓间充质干细胞结果如图3B所示，对T淋巴细胞的增殖具有抑制作用。
通过上述实验的结果可以看出，采用间充质干细胞与淋巴细胞共培养的方法，检测干细胞对淋巴亚群的影响、对分泌因子的抑制、对淋巴细胞增殖的抑制，可以作为间充质干细胞免疫调节能力的一种衡量，比较不同培养方法(有血清、无血清)、不同来源的干细胞(脐带、骨髓)的差别。本发明实施例中用于待检测的原始样本中，无血清培养的间充质干细胞免疫调节能力优于有血清培养的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞的免疫调节能力优于脐带间充质干细胞。说明本发明提供的方法可以有效对不同方法和来源的间充质干细胞的免疫调节能力进行检测和评价。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞免疫调节能力的检测方法，其特征在于，分别检测待测样本中的淋巴细胞亚群的比例、淋巴细胞分泌TNF-α的能力和淋巴细胞增殖的能力；
所述待测样本为原始样本与间充质干细胞共培养后得到；
与原始样本相比，所述淋巴细胞亚群的比例变化越大，所述淋巴细胞分泌TNF-α越受到抑制并且所述淋巴细胞增殖越受到抑制，所述间充质干细胞免疫调节能力越强。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述淋巴细胞亚群包括Treg细胞、Th1细胞和Th17细胞；
优选地，所述间充质干细胞提高所述Treg细胞在淋巴细胞亚群中的比例；
优选地，所述间充质干细胞降低所述Th1细胞在淋巴细胞亚群中的比例；
优选地，所述间充质干细胞降低所述Th17细胞在淋巴细胞亚群中的比例。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述Treg细胞表型为CD4+CD25+CD127-。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述Th1细胞表型为CD3+CD8-INF-γ+。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述Th17细胞表型为CD3+CD8-IL-17+。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，采用流式细胞仪定量分析的方法检测所述淋巴细胞亚群的比例。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将原始样本与抑制剂处理过的间充质干细胞共培养，添加刺激剂活化淋巴细胞，检测待测样本上清液中的TNF-α浓度，其中，所述抑制剂抑制间充质干细胞的增殖和蛋白合成；
优选地，所述抑制剂包括丝裂霉素；
优选地，所述刺激剂包括PHA。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将原始样本与经钴-60照射3000rad处理过的间充质干细胞共培养，添加刺激剂活化淋巴细胞，检测待测样本中淋巴细胞增殖的能力；
优选地，所述刺激剂包括PHA。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞和所述原始样本的细胞数量比为(0.05-5)：1。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述原始样本包括PBMC。
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