CN105452861A - 评估细胞因子风暴反应的体外方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了测定刺激细胞因子风暴反应的体外方法，其包括以下步骤：a.共培养PBMC和匹配的分化的内皮细胞，以提供代表人体内反应的系统，和b.将所述共培养的细胞系统暴露于测试试剂，c.分析所述系统中存在的在所述共培养的系统暴露于所述测试试剂之后释放的一种或多种细胞因子，以及d.任选地，与对一种或多种对照试剂的反应相比较，评估对所述测试试剂的反应。

Description

评估细胞因子风暴反应的体外方法
本公开涉及体外预测测试化合物，特别是推定的生物治疗剂，在人类患者中引起不利的细胞因子反应和/或细胞因子风暴反应(stormresponse，又被称为CRS)的潜力的改进方法。
2006年3月，在诺斯威奇帕克(NorthwickPark)医院进行的涉及生物治疗药剂TGN1412的健康人类志愿者试验中出现了严重的不良事件。试验的至少6名志愿者由于给予治疗剂之后的不良事件而住院，其中大部分具有多器官功能障碍。
据报道，这些志愿者经历了导致血管性水肿、皮肤和黏膜肿胀的细胞因子释放综合征(又被称为细胞因子风暴和细胞因子释放综合征)，类似于严重过敏反应中的补体级联作用。患者用类固醇来治疗以减轻炎症，并更换血浆试图从其循环中去除TGN1412。后来证实，这些志愿者经历了细胞因子风暴，并且自相矛盾的是，在给予TGN1412之后几小时，他们的白细胞几乎完全消失。
TGN1412在向人类给药之前已在动物中进行了试验。然而，认为在相关方面，治疗剂在人中引发不同于试验动物的反应。已推测在人中观测到的反应仅在具有记忆T细胞的动物中出现。然而在实验室条件“无菌条件”下饲养的动物基本上都没有记忆T细胞，因而未引发相同的反应。现在来看，在实验室研究中所使用的动物种类几乎没有记忆T细胞，因而未引发相同的反应，如此例如，小鼠似乎没有引发细胞因子风暴反应。还在分离的人类T细胞和灵长类动物上测试了TGN1412，并未暗示随后在人类中观测到的问题。然而，我们现在知道TGN1412需要内皮细胞(或其它)界面以活化免疫细胞(参见下文)。
细胞因子风暴系由免疫(或其它)细胞释放的细胞因子变得过度并损伤了组织和器官。在一些患者中，反应如此严重从而导致死亡。
每一血管腔表面内衬的内皮层是首先接触活化的循环白细胞的细胞。内皮层与白细胞之间的相互作用可导致炎性反应深度放大。Stebbings等1的开拓性研究表明，为了从人外周血单核细胞(PBMC)体外观测抗-CD28超级激动剂TGN1412的细胞因子反应，该现象是必须的。
目前存在数量有限的体外测定法可检测细胞因子对诸如TGN1412的抗-CD28超级激动剂的反应。这些测定法使用细胞组分的混合物，包括：
·脐静脉内皮细胞(HUVEC)和PBMC1，
·在被添加至PBMC之前，在塑料平板上1或合成微珠上2固定的抗体(固定；例如，通过使抗体的水溶液蒸发，留下抗体/药物粘附于表面结构)，或
·人全血的培养物3。
显然，人组织生物测定法需要细胞组分的混合物，如由以下发现所证明：TGN1412和相关分子并不活化分离的PBMC或HUVEC制备物，但是当PBMC和HUVEC在一起培养时TGN1412引起强烈的细胞因子反应1,3,4。然而，本发明人认为，这种类型的生物测定法及其他文献报道的生物测定法有重大缺陷，因为它们依赖于混合来自一个供体的内皮细胞(在HUVEC的情况下；胎儿细胞)和另一供体的PBMC。此外，常规混合的组织生物测定法并未适当地描绘在某些情况下一些细胞因子3-5抗体如TGN1412具有深度细胞因子风暴效应，而一些细胞因子抗体如Campath引起严重但是更温和且可控制的反应。因而，现有技术中基于细胞的测定法获得的结果未充分反映出同一治疗剂在体内反应中观测到的相同趋势。
这一问题在最近Findlay等人4的文章中进行了研究，其认为“PBMC.HUVEC共培养物并未完全反映出所报道的体内测量结果或体外固定的TGN1412刺激释放，表明存在触发释放不同细胞因子的释放的替代刺激机制”(第142页第1栏第一段)。
Findlay等人接着推测这可能是由于以下一种或多种：
1.“HUVEC与衰老密切相关且分离自缺氧血管。因而，它们不可能提供内皮相互作用的最佳模型。此外，来自不同器官和血管的内皮细胞显示值得注意的异质性，并且HUVEC可能不具有最大化共刺激所必需的组织特异性特征，例如，介导体内T细胞的粘附和迁移的高内皮微静脉。
2.最大化刺激需要除了在HUVEC培养物中存在的那些之外的细胞类型。
3.共培养物中IL-2的低水平产生导致驱动T细胞增殖的连续消耗，反之在固定化测定中，更高水平的产生导致饱和水平且在上清液中积聚。
4.与共培养相比，在固定化测定中最有可能存在不同的细胞因子释放机制，可能涉及不同的T细胞亚群，并且加之在共培养中，IL-6、IL-8和TNFα的释放通过与释放IL-2和IFNγ不同的机制发生，如对TNFα反应通过HUVEC产生IL-6。”
第2点在随后的文章中进行了研究。本领域技术人员自2006年就试图解决这一问题，至今仍未找到通用的可预测体内结果的合适的标准测定法。
这在测试用于可能的治疗剂的能力留下了空白。因而，当前急切的未满足的需求是开发合适的人组织试验测定法，其将例如，预测由诸如TGN14126的生物治疗剂诱导的细胞因子风暴，和/或测试开发新的药物或小分子以及基于与免疫途径相互作用的蛋白或干细胞的疗法的功效。
本发明人已发现改进的测定法，其似乎提供了类似于在给予TGN1412的人类中观测到的结果，因而满足了安全性测试领域未满足的重大需求，特别是生物药物。与目前现有的测定法不同，本发明还允许直接检测与体内临床表现有关的细胞群，即来自患者目标群体的内皮和PBMC。
虽然现有技术测定法可用于验证对TGN1412的细胞因子信号，但是本发明人推测由于现有技术测定法使用来自不匹配供体的细胞，它们易于产生假阳性反应和假阴性反应。后者可能由混合来自不匹配供体的组织造成，这可活化/抑制每一个体供体的天然免疫反应。这可通过本发明人近期数据来说明，该数据表明在全血/HUVEC混合的组织生物测定中使用至少10％的供体血液观测到深度炎性活化3。
确实不可能将HUVEC细胞与在测定中使用的诸如PBMC的其它组织相匹配，因此需要替代系统。
发明简述
本公开提供了测定刺激细胞因子风暴反应的体外方法，其包括以下步骤：
a.共培养PBMC和匹配的分化的内皮细胞，以提供代表人体内反应的系统，和
b.将所述共培养的细胞系统暴露于测试试剂，
c.分析所述系统中存在的在所述共培养系统暴露于所述测试试剂之后释放的一种或多种细胞因子，以及
任选地，与对一种或多种对照试剂的反应相比较，评估对所述测试试剂的反应。
本发明人已确定了用于本文所公开的测定法的BOEC(外周血来源的过度生长内皮细胞)可由血样制备，且PBMC也可由例如同一样品(或来自同一供体的另一血样)制备。
有利地，本发明人已发现本测定系统可预测体内反应，并且可能是研究和药物安全性评估的有力工具。在与用当前产业标准测定法，其利用不匹配的HUVEC和PBMC共培养物或人全血，的比较研究中，本发明人发现本公开的测定法更精确地预测了引起细胞因子风暴反应的某些药物的“等级次序”。
本发明人之前还表明，与BOEC形成对比，源自其他类型干细胞的内皮细胞(即胚胎干细胞来源的内皮细胞；hESC-EC)具有深度妥协免疫反应8，这使它们不适合于任何类型的基于体外细胞测定来预测细胞因子风暴反应。
重要地，对于安全给予患者且不会诱导细胞因子风暴的阴性对照抗体，本公开的生物测定法(BOEC加上PBMC，而不是任一单独的细胞类型)并未检测出阳性结果。
有利地，可使用将本文所公开的测定法来研究细胞因子反应的强度。并不能以这种方式使用现有技术测定法如HUVEC共培养测定法。
此外，当材料例如BOEC和PBMC取自单一受试者如人受试者时，可将该测定法用于研究个体个人对特定治疗剂或测试试剂的反应。
因而，在一实施方案中，本文所公开的测定法可用于个性化药物治疗环境来预测用于特定人的治疗剂的适当性。
公开详述
使用通常源自诸如人组织和/或血液的样品的材料，本文所使用的体外方法是完全在人体或动物体外实施的方法。
本文所使用的细胞因子风暴(又被称为高细胞因子血症)是由细胞因子与免疫细胞之间的不适当阳性信号且最终释放细胞因子而导致的可能致命的免疫反应。在患者中，这引起高热、肿胀且发红、极度疲劳、恶心，并且在某些情况下是致命的。认为在细胞因子风暴期间释放超过150种已知的炎性介质，通常在本公开的体外测定法中测定一种或多种合适的细胞因子，例如测定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种细胞因子，如细胞因子独立地选自IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8(CXCL8)、IL-2、IL-10、IFNγ、IL-12p70和GM-CSF(例如IL-6、TNFα、IFNγ、IL-2和IL-8)。
本测定法的读取结果并不限于细胞因子，而是可为表明细胞活化的任何释放因子，和/或表明活化和/或炎症的任何细胞反应(如增殖)。
尽管仅测定了一种细胞因子，但是特别适合于在测定中伴随地包括细胞因子风暴的阳性对照，以给出反应的背景。
因而，在一实施方案中，测定法包括一种或多种对照，例如阳性和/或阴性对照，如阳性对照，特别是抗-CD28超级激动剂，如TGN1412-或ANC28(如TGN1412)和/或抗-CD52抗体，如阿仑单抗(Campath)，其在测定中引起人体的细胞因子反应并活化细胞。相反地，抗体如CD20抗体Arzerra，在测定中不会任意地引起人体深度细胞因子风暴或活化细胞共培养物。
ANC28是CD28超级激动剂，且为TGN1412反应的一种模型。根据本公开，可在测定中使用TGN1412，且获得的结果同样地预测了CRS反应。
在一实施方案中，可针对所使用的特定超级激动剂优化测定法，如在测定中可作为对照，例如ANC28可与本文所述实施例的培养基一起使用。
TGN1412可与含有约2％人血清的培养基一起使用。
本领域技术人员仅使用常规技术，就能够稍稍调整和优化用于与培养基和血清相关的特定系统的条件。
PBMC易于从志愿者捐献的血液中获得。
本文所使用的匹配的分化的内皮细胞系指与PBMC血液匹配的、HLA匹配的、性别匹配的或完全匹配的内皮细胞。本文所使用的完全匹配，意指自体的，即PBMC和内皮细胞来自同一供体。
在一实施方案中，PBMC和内皮细胞源自来自单一供体的同一样品。
本发明人已表明，本文所述的分化的内皮细胞在关键方面表现类似于来自成熟血管的内皮细胞。这些包括(i)在剪切力的方向对齐，(ii)释放内皮细胞激素内皮素-1，以及(iii)表达内皮细胞标志物(例如CD31和VE-钙粘蛋白)。
因而，本文所使用的“分化的内皮细胞”为在一种或多种关键方面表现类似于来自成熟血管的内皮细胞，例如在剪切力方向对齐，释放内皮细胞激素如内皮素-1，和/或表达一种或多种内皮细胞标志物，如CD31和/或VE-钙粘蛋白。
本文所使用的PBMC系指外周血单核细胞。在一实施方案中，所述方法中所使用的PBMC在全血中，即未被分离。在一实施方案中，在所述方法中使用分离的PBMC。
血管的内皮细胞难以得到，仅可获自外科手术或尸体解剖中切出的组织。因而在一实施方案中，内皮细胞来自组织细胞，例如活组织检查。
然而，可在本公开的测定法中方便地使用由祖细胞生长出的内皮细胞(又被称为外周血来源的过度生长内皮细胞；BOEC9-11)。这是有利的，因为其允许测定中的细胞以方便且简单的方式相匹配，由于这些细胞可由血样生长而来，因而无需尸体解剖组织和细胞库材料(如HUVEC)。
认为BOEC源自循环中的祖细胞，且可能参与血管生长修复9。但是，体外生长时，这些细胞具有明显的内皮细胞表型，并且可用于研究来自患者的内皮细胞且提供了关于疾病的新信息11,12，以及如本公开中与自体PBMC共培养生长时，推测患者对药物的反应。
本文所使用的BOEC系指由人血液或其他身体来源中的群体所培养的分化的内皮细胞。
本领域描述了许多培养BOEC的方法。包括培养时间长短在内的培养BOEC的准确方法是可以改变的，只要测定中所使用的细胞表现出分化的内皮表型。这种表型的良好目测指示为鹅卵石形状/以下所讨论的形态，且本领域技术人员可识别。
内皮的其他合适来源包括体细胞。
在一实施方案中，内皮细胞由多能干细胞制备，所述干细胞被诱导分化成内皮细胞。
本发明人已表征了这些细胞具有天然内皮的经典特点，并且重要的是进行了概念验证实验，其表明存在同一供体PBMC时，BOEC对抗-CD28超级激动剂积极反应。
在一实施方案中，可培养内皮细胞来提供以伸长和对齐为特征的表型，例如来证实它们的身份，可以作为质量控制步骤。该培养在复杂剪切条件下进行13。
然而，在本公开的测定方法中所培养的内皮细胞通常具有被描述为鹅卵石的外形，例如，如附图所示。这是因为它们在“静置”培养条件下培养。
在一实施方案中，所述内皮细胞在容器中长成融合层，例如在实验室使用的塑料平板的孔中或器皿中。
细胞的数量根据背景而相关考虑，例如，如果容器中的空间有限的话。
在一实施方案中，每个测试样品(每种测试治疗剂)使用5,000至50,000个内皮细胞，例如10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000或45,000。
本文所使用的共培养，系指其中内皮细胞和PBMC在彼此存在下(即物理接触)培养一段时间。在一实施方案中，在约24小时的时间之后，将PBMC添加至内皮细胞培养物中。
在一实施方案中，共培养可在自体血清中使用，这是来自获得PBMC及任选地内皮细胞的血样的血清。
在一实施方案中，在基质蛋白存在下共培养细胞，所述基质蛋白例如纤维连接蛋白、明胶、基质胶、胶原蛋白或类似物。
在一实施方案中，在不存在基质蛋白时进行共培养。
在一实施方案中，细胞因子释放的分析在添加测试试剂之后1至36小时的一个或多个时间点进行，例如添加测试试剂之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时。
在一实施方案中，本公开的步骤b)还包括将共培养的细胞系统暴露于在系统中诱导细胞因子风暴的试剂，之后将所述系统暴露于诱导的反应的测试抑制剂。已知的细胞因子风暴抑制剂包括OX40抑制剂。在一实施方案中，所述测定法可包括对照抑制剂，如OX40抑制剂。
因而，在一实施方案中，本公开的方法可还包括在本文所公开的体外共培养的细胞系统中鉴别细胞因子风暴抑制剂的步骤。所述方法还包括以下一个或多个步骤：开发并测试所述化合物，进一步地，配制所述化合物，请求监管审批所述化合物的药物用途，营销并出售所述化合物，以及将所述化合物给予有需要的患者。进一步扩展到所述方法的直接产品，即由所述方法鉴别的细胞因子风暴抑制剂。
本公开还扩展至利用在本文所述的方法中产生的数据来支持注册申报，例如IND或NDA申报或在其他地区或国家的等同程序。
一方面，提供了共培养PBMC和匹配的分化的BOEC的体外方法，以及由此获得的细胞群或可由此获得的细胞群。
一方面，提供了用于本公开的匹配的生物测定法的源自BOEC的内皮细胞群。
还提供了包括代表人体内细胞因子风暴反应的PBMC和匹配的分化的内皮细胞的共培养系统的试剂盒。
本公开另一方面为适于使用的PBMC和匹配的分化的内皮细胞的共培养系统在代表人体内细胞因子风暴反应的体外生物测定法中的用途。
实施例
实施例中所采用的抗-CD28通常系指ANC28。后者是可商购获得的抗体。
本文所提供的某些附图已经过调整以给出结果0等于指示检出限，因为被分析的样品以1:10稀释，并且该“校正”在这种情况下是可接受的，因为这是适当的。
图1A-G接种于胶原蛋白包被的平板5-20天后，从PBMC共培养物出现的BOEC克隆(示出第8天；无克隆(A；左)和第16天，克隆出现时(A；右)。BOEC表达CD31、VE-钙粘蛋白和F-肌动蛋白。核在剪切力条件下培养4天时用DAPI(b，c)染色(B)，并且在流动为单向/薄层的孔边缘处(B；边缘)而非流动为不定向/非薄层的中央(b；中央)处对齐。BOEC还在静置条件下生长并表达CD31、VE-钙粘蛋白和F-肌动蛋白(C)。BOEC并不表达CD45(D)。BOEC用Lonza-EGM2+10％FBS培养24小时时释放内皮素(ET)-1(E)，并且在相似的条件下与HUVEC和人肺微血管内皮细胞)HMVEC相比较。数据为平均值±SEM(BOECn＝8)(HMVECn＝4)(HUVECn＝6)。
图2BOEC加PBMC单一培养和共培养生物测定数据。将PBMC添加至匹配的BOEC。在24小时之后将PBMC添加至匹配的BOEC。对于单一培养，添加载体介质来代替PBMC。同时处理培养物+/-载体、ANC28(ANC28.1/5D10；TGN-样超级激动剂)(10μg/ml)，Campath(10μg/ml)，阿瓦斯汀(10ug/ml)或Arzerra(10μg/ml)24小时。数据为平均值±SEM(A-C；n＝5来自5个供体的BOEC和PBMC)。(A)示出具有平均所有供体反应的综合数据。(B)来自同一个体的PBMC和BOEC共培养处理的实验的数据在图2B中按供体分别示出，且被命名为‘供体’A、供体C、供体F、供体Q和供体Z。(C)为了清楚，所有测定条件的个体供体数据以单独的图示出。处理之间的统计显著性通过单因素方差分析ANOVA接着Bonferroni多重比较检验来确定(*p<0.05)(在A、B中示出)，单一/共培养之间的统计显著性通过双因素方差分析ANOVA(*p<0.05)接着Bonferroni事后检验来确定。
患者C随后使用MSD测定进行了重复测试，并且暴露于CD-28超级激动剂之后显示细胞因子反应的迹象。
明显地，并非所有供体对CD-28超级激动剂的反应程度都是一样的。这表明可使用测定法来评估患者对推荐疗法反应的活力/强度。
2C中示出的数据具有n＝8(即分析的样本数更多，以及对供体C的新分析)。
图3A-BHUVEC(A)和混合供体的BOEC(B)加PBMC单一培养和共培养生物测定数据。24小时之后，将PBMC添加至HUVEC(A)或来自不同供体的BOEC(B)。对于单一培养，添加载体介质。同时处理培养物+/-载体，ANC28(TGN1412-样超级激动剂)(10μg/ml)，Campath(10μg/ml)，阿瓦斯汀(10μg/ml)或Arzerra(10μg/ml)24小时。数据为平均值±SEM(A；n＝3)(B；n＝3)。处理之间的统计显著性通过单因素方差分析ANOVA接着Bonferroni多重比较检验来确定(*p<0.05)。
图4非内皮细胞(人肺成纤维细胞(HLF))：PBMC单一培养和共培养生物测定数据。将PBMC添加至HLF。对于单一培养，添加载体介质。同时处理培养物+/-载体，抗-CD28(TGN-样药物ANC28)(10μg/ml)，Campath(10μg/ml)，阿瓦斯汀(10ug/ml)或Arzerra(10μg/ml)24小时。数据为平均值±SEM(n＝2，来自2个分离物)。
图5A-C来自MSD分析的细胞因子释放数据。使用MSD10-spot9-plex促炎性测定法(参见方法部分)来实施测量。数据为平均值±SEM(n＝5，来自5个匹配的供体)。5个供体之间的统计检验通过单因素方差分析ANOVA接着仅比较药物与各自对照反应的Dunnett多重比较检验来完成(*p<0.05)。
材料和方法:
培养基和溶液:
通过在Lonza-EBM2基础培养基(Lonza,Belgium)中添加Lonza-EGM2SingleQuot补充物和生长因子来制备Lonza-EGM2培养基。未获知‘SingleQuot补充物和生长因子’中的添加物浓度信息，但是供应商信息说明包括以下：hEGF，庆大霉素-两性霉素-B100,R3-IGF-1，抗坏血酸，VEGF，hFGF-B，肝素，氢化可的松。改进了培养基配制物，因为FBS供应商被弃用，用50mlFBS(HycloneHYC-001-330Y)替换以提供Lonza-EGM210％FBS。将所有的补充物分别添加至培养基中。将培养基等分成每日用量并于4℃避光保存。
根据厂商说明书，在0.02N冰醋酸中制备浓度为50μg/ml的1型鼠尾胶原蛋白溶液。用于BOEC分离和供养的平板和烧瓶表面用5.2μg/cm2胶原蛋白溶液包被，并在用PBS洗涤三次且添加培养基/细胞溶液/悬浮液之前，于37℃、5％CO2下孵育1小时。
分离外周血来源的过度生长内皮细胞:
按少量改进的别处公开的方法12来分离BOEC。简言之，从健康志愿者采集血液(48ml)(伦理守则:08/H0708/69)并制备PBMC。将试管倒置8次，然后在最大加速度和制动率下，于室温以1600RCF离心30分钟。接着将试管再倒置8次，以允许血沉棕黄层与血浆/血清部分相混合。然后将来自8个管的该混合部分小心地合并于50mlfalcon管中并添加10％FBS/PBS以得到50ml的最终体积。然后在最大加速度和中等制动下，将细胞以520RCF离心10分钟。弃去上清液并将颗粒重悬于10ml10％FBS/PBS中。将该方法再重复两次，得到总共三份洗涤液。在最后离心之前，将10ul细胞悬液添加至血球计中用于计数。在最终洗涤之后，将细胞随后重悬于含10％FBS的Lonza-EGM2中以得到3-5×107/细胞/孔(4ml)，并添加至胶原蛋白(BD,Oxford,UK)包被的6-孔板(Nunc,Denmark)的孔中(参见以上)。将平板于37℃、5％CO2中孵育。24小时将培养基小心地去除之后，用Lonza-EGM210％FBS洗涤细胞，并在各个孔中添加4ml新鲜Lonza-EGM210％FBS。每隔24小时重复该过程连续4天，然后每隔24小时重复该过程而不洗涤，直至第7天。第7天之后，每隔一天更换培养基，无需洗涤，直到出现克隆。内皮细胞克隆一般在地7至20天出现。克隆一旦出现，允许在不超过四天的时间扩增它们。通过胰蛋白酶(TrypLE1×)以2ml胰蛋白酶/孔消化来去除克隆。用4mlLonza-EGM210％FBS来中和胰蛋白酶，并将6ml细胞/胰蛋白酶混合物收集于50mlfalcon管中，在最大加速度和中等制动设置下，于室温以190RCF离心5分钟。接着将细胞接种、扩增并在如上所述用胶原蛋白预先处理的T25或T75培养瓶(Nunc,Denmark)中供养。
本研究中所使用的人脐静脉内皮细胞由皇家兽医学院(伦敦)的CarloineWheeler-Jones教授馈赠。
分离和培养人外周血单核细胞：
PBMC的分离为标准实验室方案，可使用许多改进的方法来完成。在此将来自健康志愿者的外周血样(20ml)采集于含有柠檬酸钠的50ml离心管中(柠檬酸钠:血液的比率为1:9)。将柠檬酸化的血液于37℃用RPMI:LonzaEGM2培养基以1:1的比率稀释。将血液(6ml)于Histopaque1077(Invitrogen,UK)(3ml)中分层，并在最大加速度和中等制动设置下，于室温以400RCF离心30分钟。使用Pasteur移液管小心地从每个管中去除外周血细胞血沉棕黄层。将PBMC转移至15ml离心管(最多7ml/管)并用RPMI:LonzaEGM210％FBS(1:1)补足至14ml。将管于室温下以200RCF离心15分钟，以去除任何残留的Histopaque。弃去每个管中的上清液。将细胞颗粒合并于含有20ml新鲜培养基的50mlfalcon管中，并在与最后洗涤相同的条件下再次离心。去除上清液，并将细胞颗粒重悬于1ml培养基中且用血球计计数。将PBMC以1×105细胞/孔接种于具有/不具有预先接种BOEC(以70-80％融合)的96-孔板中(Nunc,Denmark)。
人肺成纤维细胞的培养：
人肺成纤维细胞由AndrewThorley博士馈赠并供养于具有以下补充物的Dubeccos改良的eagle培养基(DMEM；LifeTechnologies)中：青霉素-链霉素(具有10,000单位青霉素和10mg链霉素/ml，在0.9％NaCl中)(Sigma,UK)，L-谷氨酰胺(Sigma,UK)，非必需氨基酸(Invitrogen,UK)以及10％FCS(Invitrogen,UK)。
双重细胞自体测定方案:
对于双重细胞测定，如上所述，从健康志愿者分离BOEC。一旦到第三代且融合，就将细胞接种于1％明胶包被的96孔板(Nunc,Denmark)中，并允许过夜贴壁。然后召回患者，并如上所述将PBMC分离且添加至BOEC。然后在第0天添加诱导细胞因子风暴的药物：TGN-样抗-CD28超级激动剂(ANC28.1.5D10,又被称为ANC28)(10μg/ml)，赫赛汀(抗-EGFR2:traztuzumab)(10μg/ml)和Campath(抗-CD52:阿仑单抗)(10μg/ml)。包括阿瓦斯汀(抗-VEGFA:贝伐单抗)(10μg/ml)和Arzerra(抗-CD20:奥法木单抗)(10μg/ml)作为细胞因子释放诱导的阴性对照。接着孵育平板24小时。收集上清液并于-20℃保存用于进一步ELISA分析，于-80℃保存用于MSD平台分析。
CXCL8的测量：
根据制造商的说明书，通过ELISA(DuosetCXCL8Kit,DY208E；R&DSystems,AbingdonUK)来测量CXCL8(IL8)。
使用MSD平台的细胞因子阵列
为进一步分析用生物制剂刺激之后由匹配的BOEC和PBMC共培养物以及各自的单一培养物释放的细胞因子，使用MSD(MesoScaleDiscovery,USA)平台分析。人促炎性9-PlexMULTISPOT96-孔-10spotMSD平板购自MSD(Gaithersburg,Maryland)(商品目录号N05007A-1)。将样品以1:10稀释于Lonza-EGM210％FBS/RPMI混合物中并添加至MSD平板。根据制造商的说明书进行免疫测定。平板使用MSCSectorImager2400读取并使用MSDWorkbench软件分析。所分析的细胞因子为IL-2、CXCL8(IL-8)、IL-12q70、IL-1β、GM-CSF、IFNγ、IL-6、IL-10和TNFα。
统计分析
在实验之前设计统计分析方案。使用GraphPadPrism5软件进行分析。特异性试验的详细说明在附图说明中给出。
结果
BOEC的特征：
培养从健康志愿者分离的PBMC第7天至第20天时出现BOEC。如其他人所示，在静培养时，BOEC显示典型的内皮细胞“鹅卵石”形态(图1A)且表达必要的内皮细胞标志物CD31，VE-钙粘蛋白(图1B)，但无白细胞共同抗原CD45(图1D)。来自血管的内皮细胞对剪切力具有典型的表型反应。为了进一步表征BOEC为典型内皮，我们在复杂的剪切模式下培养其4天。在定向/层流剪切区域的BOEC显示典型的伸长且对齐的内皮细胞表型(图1B)，而生长在湍流剪切的区域或静置下生长的那些BOEC外观上通常为鹅卵石(图1C-D)。BOEC还以与来自脐静脉的内皮细胞(HUVEC)或肺微血管的内皮细胞(HMVEC)相似的水平释放内皮肽内皮素-1(ET-1)(图1E)。在我们的研究中，BOEC显示这些典型的特征。
同一供体BOEC:PBMC生物测定法来检测诱导生物抗体的细胞因 子风暴：
在对照培养条件下，PBMC释放低水平的CXCL8。来自同一供体的BOEC比PBMC释放相对更多的CXCL8(图2)。与对照条件下任一单独的细胞类型相比，同一供体BOEC和PBMC的共培养物对CXCL8释放水平没有可辨别的影响。对于同一供体有用的内皮细胞:PBMC生物测定法，其应当揭示已知引起人体细胞因子风暴的治疗抗体的细胞因子释放，而不是在人体使用中观测到细胞因子反应通常为轻微的治疗抗体的细胞因子释放，且并不限于在人体中应用的治疗。在我们的概念验证研究中，我们测试了两个阳性对照抗体，TGN1412-样抗-CD28超级激动剂(ANC28)和CD52抗体阿仑单抗(Campath)。我们测试了在治疗中使用但不会引起细胞因子风暴反应的三个阴性对照抗体，(i)赫赛汀，其与人表皮生长因子受体2相结合；(ii)阿瓦斯汀，其与血管内皮生长因子A相结合；以及(iii)Arzerra，其与CD20相结合。作为单一培养物治疗时，单独的PBMC或BOEC培养物对任何测试抗体都不反应。类似地，PBMC和BOEC的共培养物与赫赛汀、阿瓦斯汀或Arzerra并不增加CXCL8的释放水平。然而，用TGN1412-样抗-CD28超级激动剂或用Campath刺激时，PBMC和BOEC的共培养物增加CXCL8的释放水平，其中TGN1412>Campath。这与对这些药物预期的细胞因子风暴严重性相关5,16(图2)。
HUVEC或混合的供体BOEC加PBMC单一培养和共培养测定
为了比较用当前现有技术测定法1,3,17对来自同一供体测定的数据，我们使用作为检测器内皮细胞模型的HUVEC实施了平行实验。PBMC再次低水平释放CXCL8，且不被任何所测试的生物治疗剂增加(图3A)。HUVEC释放的CXCL8基础水平相对更高，且不被抗-CD28超级激动剂或Campath增加。HUVEC倾向于对非细胞因子风暴诱导药物阿瓦斯汀和Arzerra反应(图3A)。不能进一步研究对这些不同结果的基本原理，因为与BOEC不同，HUVEC供体不易进一步追踪和研究。将PBMC添加至来自不同供体的BOEC时出现类似的结果。重要的是，HUVEC和PBMC(来自两个供体)的共培养物对TGN1412-样超级激动剂(ANC28)和Campath反应。这完全捕获对该测定法早已知晓的内容，因为TGN14121期试验被用作临床前阶段测试生物治疗剂的黄金标准1,17,18。由于我们最近使用全血表明3，在当前研究中，我们发现对于来自一个供体的细胞的一个复制品，将PBMC添加至HUVEC单层导致活化CXCL8释放，这似乎最大化活化系统并导致测定法不能检测出细胞因子风暴。在对照或其他条件下的这种免疫激活反应似乎是由于混合了来自不同供体的组织，且严重限制了HUVEC或其他类似的测定，但是通过我们的“同一供体”测定可完全避免。
非内皮(人肺成纤维细胞)：PBMC测定
为阐明对TGN1412-样抗-CD28超级激动剂反应的细胞之间的相互作用是内皮细胞特异性的，且内皮细胞是这种类型的测定中理想的干细胞后代，我们使用人肺成纤维细胞作为平台实施了相同的测定。与来自两个供体的PBMC相比，人肺成纤维细胞所释放的CXCL8水平相对更高。细胞因子释放在对用任何所测试的生物制剂处理的任一细胞类型中并未增加。在一起培养时，人肺成纤维细胞和PBMC最大化地活化CXCL8释放，且并未检测出对任何所测试的生物制剂反应的细胞因子风暴(图4)。
使用MSD多重平台进一步分析细胞因子风暴:
为进一步评估本测定法精确检测出细胞因子风暴反应的潜力，我们测量了9种细胞因子(IL-2、IL-8、IL-12q70、IL-1β、GM-CSF、IFNγ、IL-6、IL-10和TNFα)，其中7种(IL-2、IL-1β、IL-8、IL-6、IFNγ、IL-12p70和TNFα)在2006年给予TGN1412时16显示临床细胞因子风暴的患者中进行测量(图5A-C)，并且是与细胞因子风暴相关的关键细胞因子。在我们的同一供体BOEC:PBMC共培养测定中，接受IL-12p70的所有细胞因子对用TGN1412-样抗-CD28超级激动剂治疗的反应都增强。在匹配的供体共培养物中，Campath还显示倾向于提高IL-8、IL-6和GM-CSF释放。该数据用于i)证实我们使用超灵敏MSD平台的室内CXCL8数据，以及ii)阐明匹配的供体BOEC:PBMC共培养物检测出针对抗-CD28超级激动剂的细胞因子风暴的能力，并且描绘了该作用来自更弱毒性的药物如Campath，以及阴性对照抗体如阿瓦斯汀和Arzerra。
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在此感谢DanielReed博士对支持本研究工作所作出的贡献。

Claims (16)

1.测定刺激细胞因子风暴反应的体外方法，其包括以下步骤：
a.共培养PBMC和匹配的分化的内皮细胞，以提供代表人体内反应的系统，和
b.将所述共培养的细胞系统暴露于测试试剂，
c.分析所述系统中存在的在所述共培养系统暴露于所述测试试剂之后释放的一种或多种细胞因子，以及
d.任选地，与对一种或多种对照试剂的反应相比较，评估对所述测试试剂的反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为与PBMCHLA匹配的、血液匹配的、和/或性别匹配的。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述内皮细胞为与PBMC供体匹配的。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述内皮细胞源自内皮组织，例如活组织检查。
5.如权利要求2或3所述的方法，其中所述内皮细胞源自外周血来源的过度生长内皮细胞。
6.如权利要求2、3或5所述的方法，其中能够培养所述内皮细胞以提供以伸长和对齐为特征的表型。
7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中与一种或多种对照试剂相比较来评估所述试剂的反应。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述对照试剂选自TGN1412抗-CD28抗体和抗-CD52抗体，如阿仑单抗。
9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所测量的细胞因子为CXCL8。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤b)包括将共培养的细胞系统暴露于在所述系统中诱导细胞因子风暴的试剂，之后使将所述系统暴露于诱导的反应的测试抑制剂。
11.如权利要求10所述的方法，其还包括在体外共培养的细胞系统中鉴别细胞因子风暴的抑制剂的步骤。
12.PBMC与匹配的分化的外周血来源的过度生长内皮细胞共培养的体外方法。
13.由权利要求12所述的方法获得的或可由权利要求12所述的方法获得的细胞群。
14.用于权利要求1至11中任一权利要求所述的匹配生物测定法中的内皮细胞群，其源自外周血来源的过度生长内皮细胞。
15.包括代表人体内细胞因子风暴反应的PBMC和匹配的分化的内皮细胞的共培养系统的试剂盒。
16.代表人体内细胞因子风暴反应的PBMC和匹配的分化的内皮细胞的共培养系统在体外测定法中的用途。
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